微生物学读书汇报

第一篇：微生物学读书汇报

微生物与植物抗逆性

自然环境的各种因素是经常变化的，旱涝冷冻盐碱虫害病害以及大气、水质、土壤污染等不良环境条件即为逆境或胁迫。植物在长期的系统发育中逐渐形成了对逆境的适应和抵抗能力，这种适应和抵抗能力称为抗逆性。任何植物的抗逆性都不是骤然形成的。遇到逆境使，植物会做出反应，这个逐步适应的变化过程称为锻炼。

在农业生产中，对作物产量影响最大的是病虫害和干旱等。日愈严重的环境污染问题、食品安全问题对要求对现今农业生产中广泛运用的化学农药提出严峻挑战；在中国这样一个干旱缺水状况严重的农业大国，增强植物抗旱性是从事自然科学研究者研究的热点。微生物学的快速发张，微生物在农业生产、工业生产加工等各领域的广泛运用，为植物抗逆性研究提供了新的思路，新的可能。

微生物运用于植物病虫害的防治是现今“绿色农业”发展的新的出路。除了现在在广泛研究的运用“生物农药”等外部施用的生物制剂（大部分是微生物次生代谢产物或直接是微生物本身）防治植物病虫害，许多研究发现，与植物共生或是营寄生生活的真菌、细菌等都有增强植物抗病虫害能力的作用。许多感染植物的内生真菌能产生多种生物碱和真菌毒素如黑麦草碱、麦角碱、波胺和覃青毒素等，这些次生代谢物因对食草动物和昆虫等具有毒性，阻抑昆虫和食草动物的采食、抵抗病虫害等，从而能提高植物对多种食草昆虫的抗性。其中较为人熟知和运用较广的就是苏云金杆菌。有学者从黄瓜、小麦、白菜以及番茄四种植物茎中发现两株植物内生放线菌Lj20和St24，用其粗提物处理番茄植株后，测定了根、茎、叶中过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，发现 CAT、PPO和POD酶的活性都有所增强的。结果表明，Lj20和St24的代谢物不仅对病原菌具有直接抑制作用，而且可通过提高植物体内防御性酶活性来提高植物的抗病性。

内生真菌对植物抗逆性的增益作用既表现在生物胁迫(如阻抑昆虫和食草动物的采食、抵抗 病虫害等)，也表现在非生物胁迫(如抗高温、抗干旱等)方面。与植物共生或是营寄生的微生物除了对病原菌、害虫有直接的抑制甚至杀灭的作用之外，还可以诱导植物产生许多的抗性因子。植物产生的植物效应因子如丝氨酸蛋白酶、几丁质脱乙酰基酶、22kD木聚糖酶等。有学者研究木霉发现，木霉能产生的挥发性和非挥发性的抗菌次生代谢产物多达几百种，能对细菌、真菌类引起的植物病有有效的防治作用，还可以诱导植物免疫形同基因表达，实现对病害的防治。木霉菌诱导植物抗性可通过以下三种途径实现：增强MAMPs分子（植物效应因子）激发的免疫反应；减少效应因子诱发的感病性；提高效应因子激发的免疫反应。Sml是从绿木霉分泌物中分离出的一种富含半胱氨酸的疏水蛋白，不仅对植物和微生物无毒，还能诱导睡到、棉花和玉米活性酶的释放以及多种防御反应基因的表达，如MAPK基因可受木霉菌特异性诱导，而MAPK表达的MAPK蛋白是络氨酸受体激酶信号通路中重要的效应物质，可调控多个基因的表达。研究表明，植物受到干旱胁迫时，会产生特定的渗透物质，如脯氨酸、甜菜碱等，一些寄生在植物中的菌类可以分泌特定物质诱导植物相应基因表达，从而提高植物的抗逆性。

自然界存在着大量的对人类有益的充满潜力的微生物。然而，我们除了不断的发掘其用途同时，也应该注意对生态的维持。微生物大都处在生态系统的基础地位，在物质循环中的扮演至关重要的角色。对微生物的利用不是不知节制地发掘最大的益处，而是在确保生态平衡的基础上寻求人类生存的有利因素。

第二篇：微生物学读书报告

读书报告

——环境条件对微生物生长的影响

微生物的生长和繁殖受环境影响非常之大。微生物的数量极其巨大惊人，仅仅是人体身上就存在着2千克左右的微生物；其生长范围极其广泛，有高等微生物在的地方就有微生物在。而且微生物与人类的关系十分密切，像一把双刃剑，给人类带来利益的同时也带了残酷的破坏。那么，为了让微生物这种资源得到更好的利用，了解环境与微生物的存活关系将有助于人们控制微生物的活性，杀死有害微生物，更好利用有益微生物。

影响微生物生长环境因素主要有物理、化学等方面。

高温、常温、低温对微生物生长都有着很大的影响。温度影响着微生物体内酶的活性，影响着微生物的代谢……依照温度将微生物分类有嗜温，嗜热，嗜冷等种类，嗜热微生物就对发酵工业有着很重要的用途。高温有利于非气体物质在发酵液中的扩散和溶解；高温可以还可以降低冷却发酵产生热量所需要的成本；嗜热微生物生产的酶制剂的反应温度和耐热性都比嗜温微生物高尤其是DNA聚合酶有较强的热稳性。低温可以降低酶促反应的速度因此限制微生物的生长，于是我们可以利用低温度对微生物代谢活动的影响，在生产实践中用低温来保藏微生物菌种和食品等。寒冷温度适宜蔬菜制品的储藏；冷藏温度用于果蔬、鱼肉、禽蛋、乳制品的保存；冷冻温度则可以使食品冷冻成为固态加以保存，同时也用作菌种保藏。就像家里的电冰箱一样，根据不同的需要将不同的食品放在不同温度下进行储藏。高温可破坏细胞的部分组成成分，可引起蛋白质和核酸的不可逆变性，还可使质膜热溶解从而内含物泄漏死亡。可见，高温对微生物有着致命的杀伤力，高温灭菌成了一种普遍的灭菌方法，其主要有干热灭菌法，湿热灭菌法，这些对物品的保存起着相当重要的作用。

水分是微生物细胞的主要成分，也是微生物的正常生长的条件。大多数微生物在高渗环境会使细胞原生质脱水，发生质壁分离因而抑制微生物的生长，而且一些微生物在完全干燥的情况下是不能生长的。在干燥和高渗压的条件下会更好的对易被微生物感染的物品进行保存。

其次，环境的酸碱度，氧气和氧化还原电位和辐射对微生物的生命活动有很大的影响。pH值会改变微生物蛋白质的性质，会影响菌体细胞膜的带电荷性质，改变环境营养物的可给性和有害物的毒性。而氧气则是对微生物的生长有着直接的影响，大多数微生物利用氧气参与细胞的代谢，在水中氧气的可溶性是十分有限的，因此，在静止的液体中氧气的可利用性可能会成为影响微生物生长的限制性因子，不同的微生物对氧的需求与否是不同的，氧气对厌氧微生物有这毒害作用，对好氧微生物来说就是必需的，因此清除环境中的氧分子可以抑制好养微生物的生长。可利用这种方式对食物进行真空包装，能够有效的消除好痒微生物引起的食物腐败过程，延长货架期。微生物对辐射是比较敏感的，控制辐射方式可以有效的控制微生物的生长。例如，紫外光可以做微生物育种的诱变剂；利用一些辐射的强穿透性可用于食物的灭菌，也可延长食物的货架期。

利用化学因子对微生物的影响，人们制造出了化学杀菌剂和抑制剂，据用途和模式主要有消毒剂、防腐剂和化学治疗剂。其中，较为突出的醛类化学药剂因其杀菌效力高常常用于医用器械和用具；表面活性剂在临床上用于皮肤和黏膜的消毒；分离和培养某些菌体时在培养基中添加染色剂可以提高分离效果。还有很多的药剂都可杀死很多细菌。而防腐剂的利用更加充分，尤其在一些食品中。还有一类化学治疗剂，广泛的用于医疗事业，利用化学药剂对微生物的选择性毒性，很好得控制了由微生物引起的疾病，对人类做出了巨大贡献。

但是，在利用这些药剂的同是也要注意一些问题。例如，防腐剂在食品方面的利用对食品品质和对人们健康的影响。最近，食品的安全卫生问题引起了人们的广泛关注，虽然防腐剂可以延长食品的保存期，但是要注意方式与量的使用。并且，我国对抗生素的依赖已经达到了非常严重的地步，抗生素的滥用已经使微生物对很多抗生素产生了抗性，迫使人们用更大剂量的抗生素解决微生物造成的医疗问题，如此反复形成了恶性循环。由此，希望这种情况的到及时的制止。

利用微生物的一些性质，可以处理环境污染问题，解决一些医疗事故，制作加工食品，制造能源物质等，但是在利用的同时要注意方式和量，凡事不可过度，水能载舟亦能覆舟。凡事有利必有弊，利用对微生物生长环境的控制来控制微生物必定会有一些弊端，若是控制不当，导致微生物突变，而人类无法控制，那么，也许对人类对世界都会是灾难！所以，适当利用这些资源，使其为人类所用的同时，尽量将其“副作用”降到最低！

第三篇：微生物学实验

细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一 显微镜直接计数法

（一）目的要求

1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图15—2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。

图15—1 血细胞计数板构造

（一）图15—2 血细胞计数板构造

（二）A.正面图；B.纵切面图； 放大后的方格网，中间大方格为计数室

1.血细胞计数板；2.盖玻片；3.计数室

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则

1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）

同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母

2．仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。

（四）操作步骤

l．菌悬液制备

以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。

4．显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

5．清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（五）实验报告

l．结果

将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml

12345

第一室

第二室

2．思考题

(1)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差．力求准确?

(2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。

二平板菌落计数法

（一）目的要求

学习习近平板菌落计数的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。

（三）器材

1．菌种 大肠杆菌菌悬液。

2．培养基 牛肉膏蛋白陈培养基。

3．仪器或其他用具lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

（四）操作步骤

l．编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-

4、10-

5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀释

用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10?1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图15-3所示。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3，取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10-

4、10-5和10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

图15—3平板菌落计数操作步骤

4．倒平板．

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

5．计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-

4、10-

5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

五、实验报告

1．结果

2．将培养后菌落计数结果填入下表

稀释度10-410-510-6

Cfu数/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考题

(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?

(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?

三 光电比浊计数法

一、目的要求

1．了解光电比浊计数法的原理。

2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

二、基本原理

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。

光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

图15—4 比浊法测定细胞浓度的原理

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母培养液

2．仪器或其他用具 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。

（四）操作步骤

1．标准曲线制作

（1）编号 取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。

（2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。

（3）测OD值 将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表

管号12345678

细胞数106/ml

光密度（OD）

每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定

(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定

将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。

各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。

3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。

（五）实验报告

l．结果

每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数

2．思考题

(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点?

(2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?

(3)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?

四 大肠杆菌生长曲线的测定

(一)目的要求

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。

2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

(二)基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。

用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002换算出所测菌悬液的OD值。

图15—5 带侧臂试管的三角烧瓶

(三)器材

1．菌种 大肠杆菌

2．培养基 LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

图15—6 直接用试管测OD值

(四)操作步骤

1．标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定

用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

本操作步骤也可用简便的方法代替：

1．用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。

(五)实验报告

1．结果

(1)将测定的OD600值填入下表：

培养时间对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)绘制大肠杆菌的生长曲线。

2．思考题

(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？

(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。

(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

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第四篇：环境微生物学

一．绪论

1）微生物：微生物是肉眼看不见的，必须在电子显微镜或光学显微镜下才能看见的所有微小生物的总称。

2）微生物的特点：1个体极小2分布广种类繁多3繁殖快4易变异 3）原核微生物与真核微生物区别：真核微生物有发育完好的细胞核，原核微生物只有拟核。第一章

4）病毒：病毒是没有细胞结构，专性寄生在活的敏感宿主体内的超微小生物。

5）病毒的特点：只能在电子显微镜下看见。没有核糖体，没有酶系统，不具备代谢能力，必须专性寄生在活的敏感宿主细胞内。

6）病毒的分类：按专性宿主分类：动物病毒，植物病毒，细菌病毒，放线菌病毒，藻类病毒，真菌病毒。按核算分类：DNA病毒，RNA病毒。7）类病毒：类病毒是比病毒更加小的致病感染因子。

8）朊病毒：朊病毒是一种引起牛，羊疾病的感染因子（蛋白质感染颗粒）。9）病毒的繁殖过程：1吸附2侵入3复制与聚集4宿主细胞裂解和成熟噬菌体粒子的释放。10）噬菌体的溶原性：毒性噬菌体，侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解的噬菌体。温和噬菌体，侵入宿主细胞后，其核算附着并整合在宿主染色体上，和宿主的核酸同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长，不引起宿主细胞裂解。含有温和噬菌体宿主细胞被称作溶原细胞。溶原细胞内的温和噬菌体核酸，称为原噬菌体。

11）噬菌体：噬菌体是感染细菌，真菌，放线菌或螺旋体微生物的病毒。第二章

12）细菌的形态：球状，杆状，螺旋状和丝状。分别称为球菌，杆菌，螺旋菌和丝状菌。13）细菌：一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区的裸露DNA的原始单细胞生物。14）细菌的结构：细菌为单细胞结构，所有的细菌均有如下结构：细胞壁，细胞质膜，细胞质及其内含物，拟核。部分细菌有特殊结构：芽孢，鞭毛，荚膜，黏液层，衣鞘及光合作用片等。

15）细胞壁：细胞壁是包围在细菌体表最外层的，坚韧而有弹性的薄膜。16）原生质体：原生质体包括细胞质膜，细胞质及其内含物，拟核。

17）细胞质膜：细胞质膜是紧贴在细胞壁的内侧而包围细胞质的一层柔软而富有弹性的膜。（半渗透膜），含有蛋白质，脂质和多糖。脂质是由磷脂，甘油，脂肪酸和含氮碱组成。18）细胞质膜的生理功能：1,维持渗透压的梯度和溶质的转移2，膜上含有合成细胞壁和形成横膈膜组分的膜，故在膜的外表面合成细胞壁3，膜内的中间体含有细胞色素，参与呼吸作用。4，细胞质膜上含有酶，进行物质代谢和能量代谢5，细胞质膜上有鞭毛基粒，鞭毛由此长出，为鞭毛提供附着点。19）核糖体;合成蛋白质

20）拟核：细胞的核因没有核膜和核仁，故称为原始核或拟核。21）鞭毛：有细胞质膜上的鞭毛基粒长出穿过细胞壁伸向体外的一条纤细的波浪状的丝状物叫鞭毛。

22）细菌的染色方法简单染色法和复合染色法 23）革兰氏染色法：步骤1在无菌的条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。2用草酸铵结晶紫染色1MIN，水洗去掉浮色。3用碘-碘化钾溶液媒染1MIN，倾去多余染液。4用中性脱色剂如乙醇或丙醇脱色，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。5，用番红溶液复染1MIN，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。24）革兰氏染色的机制：1）革兰氏染色与细菌等电点有关系：革兰氏阳性菌的等电点比革兰氏阴性菌的等电点低，说明革兰氏阳性菌带的负电荷比革兰氏阴性菌多。革兰氏阳性菌的等电点低，与草酸铵结晶紫结合的牢固，对乙醇脱色抵抗力强，所以革兰氏阳性菌呈紫色。2，革兰氏染色与细胞壁有关：革兰氏阳性菌的脂质的含量很低，肽聚糖含量高，革兰氏阴性菌则相反，因此用乙醇脱色时革兰氏阴性菌的脂质被乙醇溶解，增加细菌细胞壁的孔径和通透性，乙醇很易进入细胞内将结晶紫和碘-碘化钾复合物提取出来，噬菌体呈现无色。3,*革兰氏阳性菌含特殊的RNA-Mg2+盐与革兰氏染色有关。25）放线菌：放线菌因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。分为三类营养菌丝，气生菌丝，孢子丝。

26）放线菌的结构：放线菌的菌体由纤细的，长短不一的菌丝组成，菌丝分枝，为单细胞，在菌丝生长过程中，核物质不断复制分裂，然后细胞不形成横膈膜，也不分裂，而是无数分枝的菌丝组成很细密的菌丝体。第三章

27）原生动物：原生动物是动物中最原始，最低等，结构最简单的单细胞动物。28）原生动物的营养类型：1全动性营养2植物性营养3腐生性营养

29）原生动物的繁殖：有性生殖和无性生殖（二分裂发，多分裂法，纵分裂或横分裂）30）原生动物的作用：所有原生动物在污水生物处理过程中都起着指示生物的作用。31）主要的原生动物：P71 32）微型后生动物：原生动物以外的多细胞动物叫后生动物。因有些后生动物体型微小，要借助光学显微镜方可看得清楚，故叫微型后生动物。33）藻类的繁殖;有性生殖和无性生殖。P84 34）真菌：真菌属低等生物，种类繁多，形态，大小各异，包括酵母菌，霉菌及各种伞菌。真菌属真核微生物，有单细胞和多细胞之分。

35）酵母菌：酵母菌是单细胞真菌。分发酵型和氧化型两种。氧化型的酵母菌则是无发酵能力或发酵能力弱而氧化能力强的酵母菌。球拟酵母菌，白色假丝酵母菌，类酵母的阿氏囊霉属，短梗霉属在石油加工业中起积极作用，如石油脱蜡，降低石油的凝固点等。处理废水及用酵母菌检测重金属。

36）酵母菌的繁殖：有性生殖和无性生殖（芽生殖和裂殖)37）霉菌：分为腐生和寄生

38）霉菌的繁殖：有性孢子和无性孢子繁殖，也可借助菌丝的片段繁殖。39）伞菌：无毒的有机废水可用于培养食用菌的菌丝体。40）酶：酶是由细胞产生的，能在体内或体外起催化作用的一类具有活性中心和特殊构想的生物大分子。

41）酶的分类：化学组分；单成分酶（只含有蛋白质）和全酶（蛋白质及辅基或辅酶的热稳定的非蛋白质小分子有机物或金属离子，全酶要在酶蛋白和辅酶同时存在起作用）

42）全酶的分类：1酶蛋白+非蛋白质小分子有机物2酶蛋白+非蛋白质小分子有机物+金属离子3酶蛋白+金属离子

43）酶的分类：六类，氧化还原酶，转移酶，水解酶类，裂解酶类，异构酶类和合成（连接）酶类。

44）酶的反应通式：氧化还原酶类：AH2+B=A+BH2

转移酶类：AR+B=A+BR

水解酶类：AB+H2O=AOH+BH

裂解酶类：AB=A+B

异构酶：---------葡萄糖=果糖（例）

合成酶：A+B+ATP=AB+ADP+Pi

或

A+B+ATP=AB+AMP+Pii 45）酶的特性：1酶具有一般催化剂的共性2酶的催化作用具有高度的专一性（只作用一种或以类物质）3酶的催化反应条件温和4酶对环境条件的变化极为敏感5酶的催化效率极高

46）酶促反应的动力学方程式：

E酶S底物ES中间产物P最终产物

47）酶的浓度对酶促反应速率的影响：下图

48)底物浓度对酶促反应速率的影响：P116 49)温度对酶促反应速率的影响：上图 50)PH对酶促反应速率的影响：P117 51)激活剂对酶促反应速率的影响：凡能激活酶的物质称酶的激活剂。分为无机离子激活剂和有机化合物两类。

52)抑制剂对酶促反应速率的影响：引起抑制作用的物质称为酶的抑制剂。抑制作用是指由于某些物质与酶的活性部位结合。分为不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。

53)培养基;根据各种微生物对营养的需要，包括水，碳源，能源，氮源，无机盐及生长因子等按一定的比例配置而成的，用以培养微生物的基质，称为培养基。

54)培养基配制的原则：1不同微生物，不同培养基2各种营养物的浓度及配比3调PH值4考虑加生长因子5培养基物美价廉

55)培养基的种类：按培养基组成物的性质分类：合成培养基，天然培养基（天然有机物配制而成的培养基），复合培养基。按物理性质分为;液体培养基，半固体培养基，固体培养基。根据培养基对微生物的功能和用途不同：选择培养基，鉴别培养基，加富培养基。56)营养物质进入微生物细胞的方式：单纯扩散，促进扩散，主动运输，基团转位

57)单纯扩散：单纯扩散是物理过程，不包括细胞的主动代谢。杂乱运动的，水溶性的溶质分子（水，无机盐，O2，CO2）通过细胞质膜中含水的小孔从高浓度区向低浓度区扩散，不与膜上的分子发生反应，这种扩散是非特异的，扩散速度慢。

58)促进扩散：细胞膜上的载体蛋白分子有和被运输物质特异结合的位置，这样载体在膜的外表面能够和物质结合，形成的底物-载体蛋白复合体，便从高浓度向低浓度区域扩散或越膜。由于被运输物质的浓度在膜的内表面较低，所以复合体倾向解离，被运输的物质就留在细胞内，而载体回到膜的外表面，只要存在需要运输物质的越膜浓度梯度，这个过程就将继续进行，从而加快了物质的运输速度。不消耗能量。

59)主动运输：当微生物细胞内积累的营养物质浓度高于细胞外的浓度时，营养物质就不能按浓度梯度扩散到细胞内，而是逆浓度梯度被“抽”进细胞内。这一过程需要渗透酶和消耗能量。渗透酶在此过程中起改变平衡点的作用，这种需要能量和渗透酶的逆浓度梯度积累营养物质的过程。60)基团转位：基团转位是存在于某些原核生物中的一种物质运输方式。与主动运输相比，有一个复杂的运输系统，被运输的物质发生了化学变化，主要用于糖的运输，运输总效果与主动运输相似，可以逆浓度梯度将营养物质移向细胞内，结果使细胞内结构发生变化的物质浓度大大超过未改变结构的同类物质的浓度。需要代谢能量。61)微生物的能量代谢：P135-P150

62）微生物的生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，微生物的细胞质量不断迅速增长，称为生长。

63）微生物的发育：从生长到繁殖这个由量变到质变的过程叫发育 64）代时：细菌两次细胞分裂之时的时间。65）生长曲线：

66)微生物的生存因子：微生物除了需要营养外，还需要环境中合适的生存因子，例如：温度，PH，氧化还原电位，溶解氧，太阳辐射，活度与渗透压，表面张力等。

67)根据微生物对温度的最适生长需求，可将微生物分为4大类：嗜冷菌，嗜中温菌，嗜热菌及嗜超热菌。

68)大多数细菌，藻类和原生动物的最适PH为6.5-7.5，他们对PH的适应范围为4-10。69)任何两种浓度的溶液被半渗透膜隔开，均会产生渗透压。

70)微生物之间的关系：微生物之间的关系有种内的关系和种间的关系。相同种内的关系有竞争和互助。不同种间关系有6种，竞争关系，原始合作关系，共生关系，偏害关系，捕食关系，寄生关系。

71)竞争关系：竞争关系是指不同的微生物种群在同一环境中，对食物等营养，溶解氧，空间和其他共同要求的物质互相竞争，互相收到不利影响。

72)原始合作关系：原始合作关系是指两种可以单独生活的生物共存于同一环境中，相互提供营养及其他生活条件，双方互为有利，相互受益。当两者分开时各自可单独生存。

73)共生关系：共生关系是指两种不能单独生活的微生物共同生活于同一环境中，各自执行优势的生理功能，在营养上互为有利而所组成的共生体，这两者之间的关系就叫共生关系。74)偏害关系：共存于同一环境的两种微生物，甲方对乙方有害，乙方对甲方无任何影响。一种微生物在代谢过程中产生一些代谢产物，其中有的产物对一种（或一类）微生物生长不利，或者抑制或者杀死对方。上述这种微生物与微生物之间的对抗关系叫偏害关系。分非特异性偏害和特异性偏害。

75)捕食关系：有的微生物不是通过代谢产物对抗对方，而是吞食对方，这种关系称为捕食关系。

76)寄生关系：一种生物需要在另一种生物体内生活，从中社区营养才得以生长繁殖，这种关系成为寄生关系。77)微生物在土壤中的分布：土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种植状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数 量较少，影响也小。土壤中微生物的水平分布取决于碳源。土壤中微生物的垂直分布与紫外辐射的照射，营养，水，温度等因素有关。78)遗传和变异是一切生物最本质的属性。

79)遗传有保守性，是微生物在它的系统发育过程中形成的系统。80)遗传可改变的一面是变异

81)遗传是相对的，变异是绝对的。82)遗传和变异的物质基础DNA：P203 83)基因突变：基因突变即微生物的DNA被某种因素引起碱基的缺失，置换或插入，改变了基因内部原有的碱基排列顺序，从而引起其后代表现型的改变。当后代突然变现和亲代显然不同的，能遗传的性状时，就称为突变。

84)自发突变：自发突变是指某种微生物的自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变。原因有多因素低剂量的诱变效应，互变异构效应。

85)诱发突变：诱发突变是利用物理或化学的因素处理微生物群体，促使少数个体细胞的DNA分子结构发生变化，在基因内部碱基配对发生错差，引起微生物的遗传性状发生突变。分物理诱变，化学诱变，复合处理及其协同效应，定向培育和驯化。

86)基因重组：两个不同形状个体细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异，产生新品种，此过程称为基因重组。

87)杂交;杂交是通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组；或者是通过双亲细胞的沟通，使部分染色体基因重组。

88)转化：受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因组里，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象，成为转化。

89)转导;通过温和噬菌体的媒介作用，把供体细胞内特定的基因携带至受体细胞中，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。

90)质粒：质粒在原核微生物中除有染色体外，还含有另一种较小的，携带少量遗传基因的环状DNA分子，称为质粒，也叫染色体外DNA。质粒在基因工程中常被用作基因转移的运载工具-载体。

91)基因工程：基因工程是指在基因水平上的遗传工程，又叫基因剪接或核酸体外重组。基因工程是用人工方法把所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在离体的条件下用限制性内切酶将离体DNA切割成带有目的的基因的DNA片段，每一段平均长度有几千个核苷酸，用DNA连接酶把它和质粒的DNA分子在体外连接成重组DNA分子，然后将重组体导入某一受体细胞中，以便外来的遗传物质在其中进行复制，扩增和表达，再进行重组体克隆的筛选和鉴定；最后对外源基因表达产物进行分离提纯，从而获得新品种。92)基因工程操作分5步：1先从供体细胞中选择获取带有目的基因的DNA片段（基因分离）； 2将目的DNA的片段和质粒在体外重组；（体外重组）3将重组体转入受体细胞（载体传递）；4重组体克隆的筛选与鉴定（复制表达）；5外源基因表达产物的分离与提纯（筛选，繁殖）

93）天然淡水水体是人类生活和工业生产用水的水源，也是水生动物和植物生长繁殖的场所。

94）水体自净过程;1有机污染物排入水体后被水体稀释，有机和无机固体物沉降至河底。2水体中好氧细菌利用溶解氧把有机物分解为简单有机物和无机物，并用以组成自身有机体，水中溶解氧急速下降至零，此时鱼类绝迹，原生动物，轮虫，浮游甲壳动物死亡，厌氧细菌大量繁殖，对有机物进行厌氧分解。3水体中溶解氧在异样菌分解有机物时被消耗，大气中的氧刚溶于水就被迅速用掉，尽管水中藻类在白天进行光合作用放出氧气，但复氧速率小于耗氧速率，氧垂曲线下降。在最缺氧点，有机物的耗氧速率等于河流的复氧速率。再往下游的有机物减少，复氧速率大于耗氧速率，氧垂1曲线上升。如果河流不再被有机物污染，河水中溶解氧恢复到原来的水平，甚至达到饱和。4随着水体的自净，有机物缺乏和其他原因（例如阳光照射，温度，PH变化，毒物及生物的抗洁作用等）使细菌死亡。据测定，细菌死亡数大约为80%-90%.95）碳循环：

96）脂质的转化：P274 97）氮循环：P278 98）显微镜的分辨率：指显微镜能分辨出物体两点间的最小距离

分辨力=0.61xλ/N.A.计算题

采用目镜为16X，物镜为40/0.65的光学系统，直径为0.3μm的微生物在显微镜下是否可分辨 解：

分辨率=0.61xλ/N.A.由题目知：N.A.=0.65

λ=0.55

分辨率=0.61x（0.55/0.65）=0.516μm>0.3μm

不可分辨

第五篇：微生物学实验报告

微 生 物 学 实 验 报 告（格式标准）

(生命科学专业)

教 师：黎 勇

目录索引

实验一 油镜的使用和细菌的简单染色法 3

实验二 细菌的革氏染色与芽孢染色 5

实验三 常用培养基的配制 7

实验四 酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 8

实验

五、微生物大小的测定与显微计数 10

实验六 环境中微生物的检测和分离纯化 11

实验七 细菌鉴定中常用的生理生化反应 12

实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 13

课程名称： 微生物学

实验班级：化生系生命科学本科

实验日期：

指导教师：黎勇 实验一 油镜的使用和细菌的简单染色法

〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。

〔基本原理〕

1.N²A=n²sinα

2.D=λ/2N.A

3.目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。

4.用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。

〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis.S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。

〔方法步骤〕：

（一）油镜的使用

镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中

聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形

在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油

油镜转入正下方

侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图

取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油

擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）

用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。

（二）细菌的简单染色法：涂片

干燥

火焰固定

染色

水洗

干燥

油镜观察

（三）细菌运动性的观察 取洁净盖玻片，四周涂上凡士林

滴加一小滴菌悬液

凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上

翻转观察

〔结果分析〕

1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制）

菌名：大肠杆菌

菌名：金黄色葡萄球菌

放大倍数：100³10（³5）

放大倍数：100³10（³5）

特殊结构：无 特殊结构：无

视野观察下微生物的形态

2、油镜使用时为什么必须干燥装片？

防止水油分层，光受到折射而影响油镜性能的发挥

〔实验讨论〕

首次实验中有几个要点：一是按无菌操作取用菌；二是涂片技术的掌握；三是油镜使用技术。凡实验中学生的所思所想，如无菌操作技术要点、自行处理实验材料、失败与思考等均可进行讨论（如涂片时蒸馏水不宜过多、取用菌时防止菌被灼烫变形、取菌宜少不宜多等均是可以讨论的内容）。

实验二 细菌的革氏染色与芽孢染色

〔目的要求〕观察细菌菌落的特征；掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操作步骤；在油镜下观察细菌个体形态；学习环境中微生物的检查方法，并加深对微生物分布广泛性的认识

〔器材用具〕E.coliB.subtilisS.aureus.的斜面培养物（18－24小时）以及菌落平板各一个；染液：草酸铵结晶紫、划兰氏染液、卢戈氏碘、95%的乙醇、蕃红；无菌水、显微镜、载片、滤纸、液体石蜡是、、擦镜纸、接种环。

〔方法内容〕：

（一）实验室环境中微生物的检查

（二）革兰氏染色法 涂片固定

冷却

结晶紫染色1min 水洗

碘媒染1min 95%乙醇30-60s 水洗

番红复染2－3min

水洗

干燥

油镜镜检

（三）芽孢染色 涂片固定

孔雀绿加热染色（勿干）5min 水洗

番红复染1min

水洗

镜检

〔结果分析〕实验结果被染成紫色者即为革兰氏阳性，被染成红色者为革兰氏阴性；菌体染成红色，芽孢被染成绿色。

菌名：大肠杆菌

菌名：金黄色葡萄球菌

放大倍数：100³10（³5）

放大倍数：100³10（³5）

染色反应：红色（阴性）染色反应：紫色（阳性）

菌名：枯草芽孢杆菌

放大倍数：100³10（³5）

染色反应：紫色（阳性）

图1 视野观察下细菌的革兰氏染色反应

图2 枯草芽孢杆菌芽孢形态图

〔实验讨论〕

严格掌握脱色程度，是成败的关键。若脱色时间过度，则阳性菌初时之紫色脱出，复染成红色，误成阴性，反之脱色时间不足，阴性菌在初染时的紫色未能脱出，复染时不能染成红色，误以为阳性菌；涂片不能厚；卢弋氏碘即用即配。

作业

1、绘出所观察到到细菌的视野图，并说明染色反应。

2、哪些因素会影响到革兰氏染色结果的正确？其中是关键的一步是什么？ 菌龄及培养条件和染色技术是最主要的，关键是脱色。

3、怎样对未知菌进行革兰氏染色，以证明你的结果的正确？

与已知菌混合涂片比较。

实验三 常用培养基的配制

〔目的要求〕了解培养基的配制原理；了解培养基常规配制程序；了解培养基过程各环节的要求和注意事项。了解半合成培养基的配制原理，学习掌握肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基的配制方法。

〔器材用具〕等配各种培养基的组成成分，琼脂、1N NaoH溶液 1N HCl天平或台秤高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸报纸等。

〔方法步骤〕

(一)玻璃器皿的洗涤和包装 以小组为单位清洗、控水，按9个为一组，分别用报纸包好并放入烘箱中等待灭菌。

(二)液体及固体培养基的配制过程

原料称量（按配方次序）

溶解

调节ｐH 过滤澄清

分装

塞棉塞和包札

灭菌

分别按教材配方配制牛肉膏蛋白胨、马铃薯液体及固体培养基。

(三)培养基的分装 用玻璃漏斗，橡皮管，小玻璃管及弹簧夹制作分装装置

选用15³150平口试管或150mL锥形瓶贴上标签

分装（至试管高度1/4-1/3，斜面制作用1/5，半固体用1/3）

要求：每人制作斜面3支。其余分装至锥形瓶中。

(四)棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎 分别制作试管及锥形瓶棉塞并塞好好以牛皮纸包装头部。

(五)培养基的灭菌 培养基用湿热法灭菌；皿用干热法分别灭菌。

(六)斜面和平板的制作（下次试验完成）

(七)培养基的无菌检查（下次实验完成）

(八)无菌水的制备 同时制作无菌生理盐水，置锥形瓶中备用。

〔结果分析〕

以斜面接种培养验证培养基配制效果；

以平板制作及接种24小时培养验证灭菌效果；

简述移液管包装的注意事项。

〔实验讨论〕

灭菌器的灭菌效果必须间隔一段时间，加以验证，主要方法除无菌检查外，还通过压力试纸同时灭菌来验证其压力与温度；培养基通常成批制作备用。但制作后，其贮藏时间有一定限制，一般室温条件下不超过三周；冰箱4℃条件下可贮藏半年，过期不能用。

作业：

1、记录培养基的成分和名称

2、分析所配制培养基的碳源、氮源、能源及无机盐、维生素的来源。所配制均为天然培养基，各成分主要来自有机质，微量元素可以由自来水提供。

3、什么是天然培养基？什么是半合成、合成培养基？

实验四 酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别

〔目的要求〕观察并掌握酵母菌霉菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。学习酵母死活细胞的鉴别方法。

〔材料用具〕酿酒酵母、红酵母、假丝酵母；(酿酒酵母和红酵母菌落平板各一个。酿酒酵母豆芽汁斜面及酿酒酵母醋酸钠斜面各一支，假丝酵母加盖片培养的平板)；7.6%孔雀绿染液，0.5%蕃红染液，苏丹黑染液，二甲苯，中性红染液，碘液；目镜测微尺、镜台测微尺；载片及盖片。

〔方法步骤〕

(一)菌落特征的观察

(二)个体形态与出芽

(三)子囊孢子的观察

(四)酵母死活细胞的观察。

〔结果分析〕描述酿酒酵母霉菌的菌落形态特征；绘图酿酒酵母的菌体、出芽方式及细胞细节；

（一）酵母的菌落湿润，大而隆起，颜色多样，正反面颜色一致，不透明，边缘整齐；

菌名：酿酒酵母

放大倍数：100³10（³5）

特殊结构：芽（出芽繁殖）

（二）霉菌

菌落特征：干燥，正反面及中央与边缘不一致；大而疏松。

（如右图）

菌名：青霉（Penicillium）

菌名：毛霉（Circinella）

放大倍数：100³10（³5）

放大倍数：100³10（³5）

特殊结构：分生孢子梗（帚状分枝）

特殊结构：孢子囊

菌名：曲霉（Aspergillus）

菌名：根霉（Rhizopus）

放大倍数：模式图

放大倍数：100³10（³5）

特殊结构：足细胞 特殊结构：假根

〔实验讨论〕

作业：

1、绘图说明所观察到的酵母菌、霉菌的形态特征。

实验

五、微生物大小的测定与显微计数

〔目的要求〕学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法；了解血细胞计数板的构造及计数原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

〔材料用具〕啤酒酵母；显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺；血球计数板；盖玻片，载玻片，滴管，试管，无菌水，〔方法步骤〕

(一)酵母细胞大小测定

(1)目镜测微尺的校正(2)细胞大小的测定

(二)显微计数法

(1)镜检计数室

(2)菌悬液制备及加样

(3)计数

(4)清洗计数板

〔结果分析〕结果记录入表中。

1、目镜测微尺的标定结果（精确到零点几小格）物镜倍数

（目镜均为10倍）目镜测微尺的格数（小格）

镜台测微尺的格数（小格）

目镜测微尺的每格的长度（μm）40倍

2、酵母菌大小测定结果 菌号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 目镜测微尺的格数（小格）长轴

短轴

酵母大小平均值＝±（保留小数点后2位）

长轴＝

3、血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果 实验次数 各中格中菌数 总菌数 稀释倍数平均值

菌数(个/mL)1

短轴＝

〔实验讨论〕

作业：

1.什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺校正。2..根据实验体会说明血细胞计数法的误差主要来自哪些方面？如何减少误差？ 3..在滴加菌液时，为什么要先置盖玻片然后滴加菌液？能否先加菌液再置盖玻片？ 4..用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？计算细胞数目时此法是否可以适用？ 实验六 环境中微生物的检测和分离纯化 〔目的要求〕

1、学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物的划线分离接种

2、学习掌握平板菌落计数法 〔基本原理〕

土壤是微生物生活的大本营，是生物多样性的重要场所，也是发扬微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多的菌株。划线法是常用的分离与纯化方法，通过无菌操作条件下，“渐划渐稀”的效应而得到菌落纯的菌株。

平板菌落计数法是将待测样品经过适当稀释，使其中的微生物充分分散形成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌量。这种方法为活菌计数法，广泛应用于生物制品及污染程度（含菌指数）的检测。

〔材料与用品〕

土样10g，无菌平皿（20套）及无菌水，牛肉膏蛋白胨平板（2只）；取液器（0.5mL及1mL各三支）；无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 〔方法步骤〕

1、周围环境中微生物的检测

平板分4个区做好标记

用未洗的手指及肥皂洗过的手指（1次、2次、3次，或其它）分别在四个区上涂抹

倒置到37℃培养24小时观察结果。

2、土壤中微生物分离纯化及平板计数

采土样（5－20cm）土10g，装入到已灭菌的牛皮袋（信封）中，封好袋口

1.0g加入99mL无菌水（三角瓶）中

1mL无菌吸管0.5mL加入到4.5mL无菌水试管中，吹吸三次，振荡均匀(10-3)。同法得10－4－10－6土壤溶液

用接种环沾取10-2土壤悬液在已经凝固的平板表面进行划线分离

分别取各浓度土壤悬液0.1mL对号均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨平板，用无菌涂棒涂匀（多涂几遍）。每个浓度做3个平板。〔结果分析〕

1、有较大片菌苔生长时，弃用。

2、选择平均菌落数在30－300之间的平板。只有一个浓度符合此范围时，以该平均菌落数为准；有两个浓度的平板菌落数在30－300之间时，按两者的总数平均决定，比值小于2，取平均，比值大于2则取较少的菌落总数。所有菌落数大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数；所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数（即当所有菌落数均不在30－300之间时，此实验的精确度要求下，可以最接近30或300的菌落数乘稀释倍数）。

〔实验讨论〕

土壤中的菌数量在哪个数量级？你分离的微生物主要有哪些种类？为什么？

105数量级，主要是细菌，也有酵母。主要通过其菌落特征来判断。细菌的菌落为湿润，其正反面颜色一般一致，普遍比较小。酵母的菌落湿润，大而隆起，颜色多样，正反面颜色一致，不透明，边缘整齐；而霉菌菌落特征：干燥，正反面及中央与边缘不一致；大而疏松。

实验七 细菌鉴定中常用的生理生化反应

〔目的要求〕了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应方法；通过对不同细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况，了解基代谢多样性；学习不同培养基基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。

〔实验原理〕各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。细菌的这种代谢方式可供鉴别细菌之用。用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称为细菌的生理生化反应。有些细菌能发酵葡萄糖，而不能分解乳糖；有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体；有的细菌则只产酸不产气。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫（ｐH4.4红色～ｐH6.2黄色），当发酵产酸时，培养基由紫色变黄，气体的产生则可由试管中倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。大肠杆菌不产生丁二醇，V.P.试验为阴性。其进行混合酸发酵，故甲基红试验为阳性。产气杆菌则进行丁二醇发酵，V.P试验为阳性，甲基红试验为阴性。

〔材料用具〕E.coli，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，产气杆菌，粪水中分离的未知菌种斜面，糖发酵培养基；超净工作台，恒温培养箱，试管，移液管，杜氏小管。甲基红试剂、V.P.试剂。

〔实验步骤〕各取4支相应的培养基，标记好发酵培养基的名称、所接菌种名及组号，1支接大肠杆菌，1支接变形杆菌，1支接未知斜面菌种，1支不接。

1、糖发酵试验

2、甲基红试验

3、V.P.试验

接种后37℃分别培养24h、48h、48h，观察实验结果，将实验结果填入表中。〔实验结果〕

表7－1 实验结果 编号 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 产气杆菌 未知菌 CK 葡萄糖发酵

乳糖发酵

甲基红实验

V.P.试验

〔实验讨论〕

如：讨论通过哪些生理生化反应可以区分大肠杆菌，产气杆菌？

大肠杆菌不产生丁二醇，V.P.试验为阴性。其进行混合酸发酵，故甲基红试验为阳性。产气杆菌则进行丁二醇发酵，V.P试验为阳性，甲基红试验为阴性。

实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 [目的要求]

1．掌握细菌、放线菌、酵母苗和霉菌稀释分离、划线分离等技术。

2．学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

3．学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。

4．学习习近平板菌落计数法。[基本原理]

土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线苗数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；白面曲(发面用的引子)或酒曲或果园土中分离酵母菌。

为了分离和确保获得某种微生物的单苗落，首先要考虑制备不同稀释度的苗悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品中各类微生物的相互干扰。细菌或放线苗在中性或微碱性环境较多．但细菌比放线萌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10%酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25-50μg mL以抑制细菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌灵30μ／mL以抑制霉菌)；酵母苗和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快。而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前须添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。四大类微生物的分离培养基、培养温度、培养时间见表所示。[材料与用品] 1.菌源 选定采土地点舌。铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内．封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。从面曲中分离酵母菌。也可用酒曲等替代。

2．培养基 肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(制平板和斜面，3．无菌水或无菌生理盐水 配制生理盐水．分装于250mL锥形瓶中，每瓶装99mL(或95mL分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠；分装试管，每管装约4.5-5mL(不超过试管高度的1／5)。

4．其他试剂与用品 无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒(刮刀)、称量纸、药匙、洗耳球、10％酚溶液。[实验步骤]

1．稀释分离法平板分离菌有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法：

(1)细菌的分离 1)制备土壤稀释液 称取土样1 g，在火焰旁加入盛有99mL并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中．振荡10一20min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10-2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10-2稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5 mL无菌水试管6支，按10-2......10-7顺序编号，放置在试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套 中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除下段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在于上，不能乱放在桌上)，将lmL移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸二次(吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸 的液面)，然后准确吸取0.5mL10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5mL无菌水的试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将0.5m10-2土壤稀释液注入4.5m1无菌水试管内，制成l0-3的土壤稀 释液，将此移液管通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。另取一只未用过的无菌移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽。右手持10-3稀释液试管在左手十敲打20～30次。混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已摇匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出o.5mL 10-3的稀释液。置第二支装有4.5 m1无菌水试管，制成10-4：土壤稀释液。用同法再制成 10-

5、10-

6、10一7的土壤稀释液(为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管)：最后用的移液管重新放人纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中．用3%-5%来苏尔浸泡l h后再灭菌洗涤。2)倾注法分离 取无菌培养皿6-9套，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，用原来的移液管从菌液浓度最小的10-7土壤稀释液开始吸取1mL稀释液，按无菌操作技术加到和应编号的无菌培养皿内。再依同方法分别吸取1mLl0-

6、10-5的土壤稀释液，各加到和应编号为10-

6、10-5的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45-50度左右，分别倾入到已盛有I0-

5、10-

6、10-7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，且皿盖上冷凝水太多，会影响分离效果；低于45％培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拔开，灼烧瓶口．用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约12-15 mL，将培养皿在桌面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀．混匀后静置桌上，待凝。3)培养 待平板完全冷凝后，将平扳倒置于35-37℃恒温培养箱中，培养24～48h观察结果。

(2)放线菌的分离

1)制备土壤稀释液 称取土样l g，加入盛有99m1并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中．并加人lo滴10％酚溶液(抑制细菌生长，可用l％的重铬酸钾溶液代替lo%酚溶液．效果更好)。振荡后静置5min，即成10-2土壤稀释液。

2)倾注法分离 按前法将土壤稀释液分别稀释为10-

3、10-

4、10-5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取lmL 10-

5、l0-

4、10-3土壤稀释液于对应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行培养皿。理盐水内，振荡20min，即成10-2的面曲稀释液。若选用果园上样，也依前法称取土样，制成10-2壤稀释液。3)涂布法分离 依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述l0-

6、l0-

5、10-4三个稀释度苗悬液0.1mL，依次滴加于对应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。4)培养 接种后，将平板倒置于30℃恒温培养箱中，培养2～3 d观察结果。

2划线分离法 菌种被其他杂苗污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20mL培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。(1)连续划线法 连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌。以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸人平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却．然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线。划线时平板面与接种环面成30～40°的角度，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线。接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温培养箱内培养(以免培养过程中皿盖冷凝水滴下，冲散巳分离的菌落)。培养后在划线甲板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。(2)分区划线法平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60一70°划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧死后，再在上次划线末尾处继续划线。取菌、接种、培养方法与连 续划线法相似。分区划线法划线分离的平板分4个区，其中第四区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第四区内划线与l、2、3区线条和接触，应使4区线条与l区线条和平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖．将平板转动60～70°，右手把接种环上多余苗体烧死，将烧红的接种环在子板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的苗体为菌源，由1区向2区作第二次早行划线。第二次划线完毕，同时再把平皿转动约60一70°，同样依次在5、1区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。

3．微生物菌落计数(平板菌落计数法)含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活苗细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目．推算出每克含菌样品中所含的活菌总数。每克菌样品中微生物的活细胞数＝(同一稀释度的3个平板上菌落平均数X稀释倍数)/含菌样品克数。一般由三个稀释度计算出的每克含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的 总活菌数均应很接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大，表示操作不精确。通常以第二个稀释度的平板上出现50个左右菌落为好。也可用菌落计数器计数。

4．平板菌落形态及个体形态观察 从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，区分细菌、放线菌、酵母茵和霉菌的菌落形态特征。并用接种环挑菌，看其与基质结合紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察。记录所分离的含菌样品中明显不同的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态。

5.分离纯化菌株转接斜面(斜面接种)在分离细菌、放线菌，酵母苗和霉菌的不同平板上选择分离效果较好，认为已经纯化的苗落各挑选一个用接种环接种斜面。将细菌接种于肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，酵母菌和霉菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上。贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及苗苔特征。置冰箱保藏。[实验报告] 1.简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。2.四大类微生物的分离方法及培养条件

3.分离的微生物平板菌落计数结果

4.样品中单菌落菌株的菌落培养特征与镜检形态 5.斜面培养条件及菌苔特征(包括纯化结果)。

[思考题] 1.稀释分离时．为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45～50℃左右才能倾入到装有菌液的培养皿内? 2.划线分离时为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉?划线时为何不能重叠? 1.3.在恒温箱中培养微生物时为何培养皿均需倒置? 4.分离某类微生物时培养皿中出现其他类微生物，请说明原因。应该如何进一步分离和纯化；经过-次分离的菌种是否皆为纯种，若不纯，应采用哪种分离方法最合适? 5.根据哪些菌落特征可区分细菌、放线苗、酵母菌与霉菌?它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系？