第一篇：钩藤临床应用研究概况
文献综述----
钩藤临床应用研究概况
摘要：钩藤，为茜草科钩藤属钩藤Uncaria rhyunchophylla(Miq.)Jacks.、大叶钩藤Uncaria macrophylla Wall.、毛钩藤Uncaria hirsute Havil.、华钩藤Uncaria sinensis（Oliv.）Havil.或无柄果钩藤Uncaria sessilifructus Roxb.的干燥带钩茎枝。药性甘，凉，归肝、心包经。可清热平肝，息风定惊，另本品有轻清疏泄之性，能清热透邪。主用于头痛，眩晕，肝风内动，惊痫抽搐。近代除继承了其传统应用外，在临床许多方面有了新的应用进展。本文对钩藤近20 年在临床应用方面的研究情况进行概述，以期对其今后的临床研究和应用提供借鉴。
关键词：钩藤临床应用研究概况
【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】
1对心血管系统疾病的治疗
1．1降血压作用
现代实验研究表明钩藤中钩藤碱、异钩藤碱、钩藤总碱及非生物碱均有降压及负性心率作用，其中以异钩藤碱为最强，降压强度的强弱顺序为异钩藤碱(平均动脉压降低42.0%)>钩藤碱(32.1%)>钩藤总碱(21.3%)>钩藤非生物碱(12.4%)，主要降压成分为异钩藤碱和钩藤碱。徐惠波等研究复方钩藤片能够明显地降低原发性高血压大鼠的血压，升高大鼠心钠素（ANP）含量。能明显降低心输出量，使静脉回流量减少和前负荷降低。提示中药钩藤的降压机制可能是通过舒张血管，降低心输出量起到降压作用。黄燮南等研究结果显示，在大鼠肠系膜血管床和尾动脉节段，钩藤碱和异钩藤碱呈剂量依赖性地抑制高K和去甲肾上腺素(NA)所致灌流压的升高。钩藤碱和异钩藤碱还能对抗血管紧张素I所致升压作用。这也充分说明，中药钩藤的主要成分钩藤碱和异钩藤碱可直接扩张小血管，且对多种激动剂所致血管收缩有效。
钩藤是平肝熄风代表方天麻钩藤饮的主药之一。张志民等观察天麻钩藤饮加减口服治疗100例高血压患者，与口服硝苯地平片、卡托普利片、吲达帕胺片60例作对照。14d为1个疗程，3个疗程观察疗效，2组均具有明显的降压作用，观察组降低舒张压作用优于对照组(P<0.05)。马振峰应用天麻钩藤饮等治疗317例高血压眩晕患者，痊愈93例占29.3%，显效195例占61.6%，好转29例占9.1%，总有效率100%。谭海彦等探讨天麻钩藤饮对肝阳上亢型高血压病患者血压的影响及其抗氧化应激的研究，选择60例分两组，与非洛地平[7][6][5]+[4][3][1][2]
组对照发现，两组药物降压疗效无显著差异，均明显降低血压P>0.05，而治疗组血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)升高较明显P<0.01，提示天麻钩藤饮对肝阳上亢型高血压病患者具有良好的降压效果，并能增加患者的GSH-PX活力，清除过多的氧自由基。
1.2.逆转心肌重构
钩藤水煎液能逆转SHR因高血压引起的左室厚这一不良心肌重构,钩藤治疗组大鼠的左室重/体重比明显低于对照组,已肥大的左室明显缩小,透射电镜下的超微结构基本恢复正常,同时心肌组织中原癌基因C-fos表达也明显受到抑制,由此推测钩藤此作用的机制可能与抑制原癌基因C-fos的表达有关。
1.3.抗心率失常 [8]
黄氏等的研究确定异钩藤碱减慢大鼠心率及抑制左室压最大变化速率和心肌收缩成分缩短速率等指标的血药浓度为(1·27±0·07~2·36±0·44)mg/L;血浆异钩藤碱浓度在0·73~3·68mg/L范围内呈剂量依赖性地减慢兔心率、延长窦房结传导时间、窦房结恢复时间、心房-希氏束间期、希氏束-心室间期以及心电图的P-R间期,其中对心率和房室传导的抑制作用明显,这说明异钩藤碱除减慢心率外,还可抑制房室及希氏束向蒲氏纤维的传导[10][9]。
2.对中枢神经系统的治疗
2.1 抗癫痫作用徐淑梅等[11]的研究发现1g·mL-1的钩藤醇提液能使毛果芸香碱致痫大鼠的离体海马脑CA 1区锥体细胞诱发群锋电位的幅度平均降低27%~64%，平均8.71min恢复(n=14，P<0.01)，提示钩藤对中枢神经系统的突触传递过程有明显的抑制效应，因而具有抗癫痫作用。何苗[12]等观察由蜈蚣、僵蚕、钩藤、制南星组成的复方中药对震颤大鼠癫痫小发作的作用，明显抑制了震颤大鼠平均每次癫痫小发作的持续时间(P<0.01)，在给药6天、停药1、2、3、4天后分别降到给药前水平的(71±9)%，(47±9)%，(52±11)%，(59±15)%及(68±18)%，停药1天后的作用显著强于丙戊酸钠(P<0.01)，四味中药可祛风解痉、化痰散结、清热平肝，具有明显的对抗震颤大鼠癫痫小发作的作用。吴东泽[13]用天麻钩藤煎治疗小儿腹型癫痫35例，治愈25例（71.43%），有效8例（22.86%），无效2例（5.71%），总有效率94.29%。
2.2 对脑缺血损伤的保护高丽娜等[14]以原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞进行缺血再灌注损伤处理，观察钩藤碱(Rsy)对星形胶质细胞损伤的保护作用，实验结果表明，钩藤碱0.02mg·mL、0.2mg·mL均能显著提高缺血再灌注损伤后星形胶质细胞的存活率(P<0.01)，显著降低细胞坏死率和细胞凋亡率，也能显著降低细胞LDH漏出率(P<0.01)。提示钩藤碱可能通过抑制星形胶质细胞凋亡和坏死而对脑缺血损伤产生保护作用。张博爱等
[15]-1-1通过天麻钩
藤饮对脑缺血后大鼠神经新生的研究，认为天麻钩藤饮作为一中药复合制剂对慢性脑缺血后大鼠的神经元保护机制是通过钩藤促进血管内皮生长因子（VEGF）与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的产生，进而发挥作用的。
2.3 双向调节中枢神经系统作用麦琴笑等[16]采用戊巴比妥钠阈下催眠实验小鼠和士的宁致小鼠惊厥观察绒毛钩藤对中枢神经系统的药理作用，结果示自主活动试验中，绒毛钩藤提取物(0.16g·kg)灌胃给药后，小鼠60min时的自主活动计数与生理盐水组相比，明显减少(P<0.01)。在戊巴比妥钠阈下催眠实验中，绒毛钩藤低(0.16g·kg)，中(0.32g·kg)剂量灌胃给药后，小鼠翻正反射消失的个数与生理盐水组比较，均明显增多(P<0.01)。士的宁致小鼠惊厥实验中,绒毛钩藤提取物灌胃给药后，与生理盐水组比较，中(0.32g·kg-1)剂量组小鼠死亡数目明显减少(P<0.01)，高(0.64g·kg-1)剂量组小鼠死亡数目明显增多(P<0.01)。提示绒毛钩藤在低剂量和中剂量对中枢神经系统有抑制作用，在高剂量对中枢神经系统有兴奋作用。-1-1-1
3.对头面部疼痛的治疗
3.1头痛郝中珍[17]用柴胡疏肝散加减治疗肝郁型头痛42例，认为钩藤甘微寒，在方中具
[18]起到平抑肝阳的功效，总有效率90.48%。纪东世
32例，治疗总有效率94%。
3.2 偏头痛应乔麟[19]用钩藤蜈蚣解痉汤治疗血管神经性头痛用钩藤川芎汤治疗偏头痛88例，总有效率90.91%。其认为偏头风
[20]与肝阳上亢和瘀血阻滞有关。祝华君采用加减天麻钩藤饮治疗偏头痛40例，并与单用氟
桂利嗪治疗的40例进行了比较，结果示前者治疗效果明显优于后者；分析认为加减天麻钩藤饮能较明显地改善患者血液流变学特性，说明钩藤在组方配伍后是治疗偏头痛的有效方剂之一。
3.3 三叉神经痛刘永胜[21]等用自拟中药方（石决明15g，生牡蛎20g，钩藤12g，白芍30g，川芎12g，丹参12g，甘草8g，荜茇3g）配合维生素B12穴位注射，结合治疗三叉神经痛&4例，总有效率91.67%，认为钩藤有较好的息风止痉功效。赵焕秋[22]等用自拟镇痛汤（川芎、葛根各35g，天麻、半夏、细辛各15g，荜茇13g，全蝎8g(研末冲服)，炒白芍55g，钩藤45g）治疗三叉神经痛60例，有效率为100%，治方以钩藤、天麻、全蝎三药相伍，取平肝熄风、解痉止痛、开瘀蠲痹之用。
3.其他
3.1 抑制血小板聚集和抗血栓的治疗
静脉注射钩藤碱可抑制实验性静脉血栓及脑血栓的形成，钩藤碱不影响血小板利用外
源性花生四烯酸(AA)合成血栓烷A2(TXA2)，但可抑制胶原诱导TXA2的生成，对正常血小板内cAMP浓度无明显影响，但明显抑制血小板聚集剂如凝血酶、ADP等所引起的血小板内cAMP的下降，浓度为0.65～1.30mmol/L时可抑制ADP及胶原所诱导的血小板因子的释放和活化，机制可能与抑制血小板膜释放AA等活性物质有关
3.2抗肿瘤的治疗
钩藤总碱可逆转KBv200细胞(口腔上皮癌细胞KB的多药耐药细胞)对长春新碱的耐药性，张氏等采用噻唑蓝法测定药物的体外杀伤作用，应用金氏公式进行联合用药分析，测得钩藤总碱5μg·mL对长春新碱在KBv200细胞的逆转倍数为16.8倍，说明其具有较强的逆转肿瘤细胞多药耐药的作用[24]-1[23]。
3.3对肠易激综合征的治疗
申霞[25]以钩藤30g、白术15g、茯苓15g、甘草10g组方治疗此症收到良好疗效，认为钩藤是一种钙通道阻滞剂，对肠道平滑肌有解痉作用，还有交感神经阻止、镇静、抗组织胺功效。葛帮雨[26]等用钩藤、薄荷、甘草配制成代茶饮治疗57例肠易激综合征患者，服用8周，总有效率为91.2%，半年随访复发率为36%。
3.4 对儿科疾病的治疗
黄益汉[27]介绍闽南泉州地区民间常用四味镇惊散由茯神6～9g，钩藤3～6g，蝉衣(去头
[28]足)3～6g，生地黄3～6g组成，治疗本证疗效显著。熊红英报道应用竹叶钩藤汤治疗小儿
盗汗50例，方用竹叶、通草各10g，钩藤15～20g，蝉蜕6g，浮小麦15g，总有效率达96%。
赵建民[29]用平肝熄风法治疗抽动-秽语综合症17例，基本方药为天麻、钩藤(后下)、玄参、天冬、黄芩、焦三仙各10g，珍珠母(先煎)、生龙骨(先煎)各20g，白僵蚕12g，白芍15g，川楝子、柴胡各6 g，全蝎、炙甘草3g。17例全部有效，其中症状完全消失，半年内无复发的显效者12例，症状明显缓解或发作频率减少的有效者5例。张莹莹[30]用自拟方钩藤郁金汤（钩藤15g（后入），郁金9g，天麻9g，生龙骨、生牡蛎各15g，白芍6g，菊花9g，甘草3g），从肝论治抽动秽语综合征30例，与氟哌啶醇对照，近期疗效与氟哌啶醇相当，远期疗效优于氟哌啶醇。
讨论：综上所述，临床中药钩藤多以复方入药，是治疗高血压病、脑血管性疾病、头痛、抽动症及小儿惊风等疾病的常用药物，还可用于三叉神经痛、面神经炎、颈椎病、痴呆、癫痫以及肿瘤等疾病的治疗，临床疗效明确，用药安全性高，至今鲜见副作用报道。近年来国内外对钩藤的药理研究已逐步从药材或有效部位进入到有效成分，从药效验证进入到机理摸索，确定了钩藤中的有效成分为钩藤碱、异钩藤碱等多种生物碱，其不仅具有高生物活性，且无证实有明显的副作用，这在治疗心血管疾病尤其是高血压方面有着相当大的优势，因此随着对中药钩藤的实验和临床研究的进展，其开发和利用也将会取得飞速的发展。参考文献：
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第二篇：临床教学工作概况
临床教学工作概况
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医院从1970年开始临床教学工作，临床教学工作包括进修和实习两个方面。进 修生主要来自周边县市医院及基层卫生院。实习生主要来自省内各医学院校。医院十 分重视临床教学工作，在医院分管领导下实行两级管理制：由科教科主管，医务科、护理部协同管理，各临床科室设有一名教学负责人落实教学计划，为了提高临床教学 工作的质量，医院不断改进教学工作，选派优秀教师进行带教，提供临床教学所必须 的教室，实验室、示教室和常规的教学仪器设备，以及宿舍、食堂等，满足学员的学习和生活需要。
一、进修生教学
医院根据进修生的进修目的、内容，制定出相应的进修计划，由各临床科室教学负责 人安排老师带教，完成进修生的进修计划。医院平均每年带教进修生30-50名。2003年至2007年，接受进修生204人。
为了保证进修生完成进修计划，医院制定了完善的《进修生管理制度》。
附录1 进修生管理制度
1、进修生必须是取得医师或护士执业证书，具有中专以上学历，在乡及乡级以上医 院工作两年以上的医务人员，申请进修专业与从事专业相一致，进修时间至少三个月 以上。
2、进修生入院前必须认真填写《卫生干部进修表》并加盖单位公章，连同毕业证、医师或护士执业证书原件及复印件一并送至科教科。
3、实行二级管理：进修生由科教科主管，医务科、护理部协同管理。科教科按照进 修生应具备的条件进行严格审核考试后送至相关科室；有关科室根据进修人员的进修 目的、内容，制定出进修计划。
4、进修生人入院后应严格遵守本院的各项规章制度，服从领导。进修时间、学习内 容和要求，一律由我院统一安排。中途不能自行转科。若中途停止进修，必须由选送 单位书面申请，经科教产批准，方可办理离院手续。
5、进修生须严格遵守本院的请假、销假制度。请假一天时间需由带教老师科室教学 负责人或科主任批准；一至三天时间需到科教科填写请假条，经科室教学负责人签字 报科教科审批同意；三天以上时间需由所在单位签出意见，经科教科批准方可办理（病假必经事先出示诊断证明）。假期止先到医院科教科销假后方可回科进修学习，否则不办理结业手续。
6、进修生在学习期间，应严格遵守各项医疗、护理操作规程，在带教老师指导下参 与查房、手术、各种讨论等日常医疗工作。进修人员不得超越权限擅自处理患者和做 不应由其实施的技术操作。若进修期间造成有过错医疗纠纷和医疗事故者，则取消进 修资格，不发结业证书，并由医院通知进修人员所在单位按国务院颁发的《医疗事故 处理办法》等文件规定处理，并对指导老师也给予相应的处理。
7、进修人员在工作中有显著成绩者予以表扬，载入鉴定表，对医疗作风恶劣或犯有 严重错误者，连同材料一起送回原单位处理。
8、科教科定期下科室了解进修进度、带教情况、进修生表现及要求，掌握进修生临 床教育整体情况，对存在问题及时发现，并妥善解决。
9、鉴定：进修生进修结束时，必须书写自我鉴定，科室负责人据其进修情况写出科 室意见，最后由科教科发放结业证。
二、实习生临床教学
根据各医学院校的教学大纲，安排教学计划，完成教学任务。签有协议的大专院校主 要有：华中科技大学同济医学院，武汉大学口腔医学院，武汉大学职业技术学院，三 峡大学医学院，郧阳医学院，湖北民族大学医学院，长江大学医学院、荆门职业技术 学院，湖北中医药高等专科学校，荆州职业技术学院、荆楚理工学院等。每年在院临 床实习生有300余名。2003年至2007年，接受实习生1545人。在组织管理方面，医院有分管领导主管，科教科负责各专业科室设专人负责，实行院科两级教学管理体 系，负责落实教学大纲和实习计划的完成，组织落实教学质量检查考核工作，落实教 学示教观摩及专病专题的讲座，坚持教学工作例会，管理如临床教学设施，为学生提 供良好的教学条件。确保证临床教学计划的完成，提高教学质量，制定了实习生管理 制度。
附录2 实习生管理制度
1、实习生进院后，由科教科组织学习医院各项规章制度，按教学大纲安排实习周 期，落实实习计划。
2、实习生在各科室教学组长的领导下，服从科室安排，由教学老师指导，按实习计 划进行学习，不得自行更改。
3、实习生严格遵守医院和病房的规章制度。上班不得迟到，早退、脱班、脱岗、私 自换班，每天提前15分钟进病房。轮科当天，每个同学都必须到新科室报到，由教 学组长安排实习。
4、严格执行请假制度：病假必须事先出示诊断证明（不得等病情痊愈后出示）。请 假一天时间需由带教老师及科室教学负责人或科主任批准；一至三天时间需到科教科 填写请假条，经科室教学负责人签字的科教科审批同意；三天以上时间需由学校实习科签字盖章批准，然后经科教科批准办理。假期止应先到医院科教科销假后，方可继 续实习。违反者取消实习资格。
5、实习生要加强安全意识，严格遵守各项医疗、护理操作规程。处理患者和实施技 术操作需在带教老师的指导下完成。若发生差错不得隐瞒，要立即报告带教老师及时 处理，避免发生严重后果。
6、实习生每实习完一个科室，由科室教学组长和带教老师组织进行相应的考试，书 写鉴定并签字，不得补写、代写。
第三篇：(一)OMOM胶囊内镜临床应用研究合作协议
OMOM胶囊内镜临床应用研究合作协议
甲方（配送）：
乙方（医院）：
甲、乙双方经平等、自愿和充分协商，就甲方产品—OMOM胶囊内镜设备与乙方合作建立多中心临床应用研究事宜，达成如下协议，共同遵守。
一、合作方式
甲方免费提供便携式胶囊内镜设备一套供乙方使用（另配两套记录仪），乙方采购甲方的胶囊。
（1）合作期限为两年，自甲方设备安装之日起算（即2013年／月／日－2015／
月／日）。前述期限届满后，是否续约由双方协商后，书面确定。
（2）首次胶囊采购：本协议签订后七日内乙方向甲方采购胶囊式内窥镜200颗，每颗
胶囊单价为2260元，共计452000 元。甲方收到胶囊式内窥镜款后七日内发出设备。再次胶囊采购：按乙方的需求数量供货，每颗胶囊单价为2260元，款到后两个工作日内货到乙方公司。两年合作期内，胶囊供货价及付款方式、期限不变，均按此协议执行。
（3）年终返利：乙方全年胶囊使用数量到达500颗以上，甲方按照乙方胶囊使用量的5%进行胶囊返利；乙方全年胶囊使用数量达到1000以上，甲方按照乙方胶囊使用量的10%进行胶囊返利。（返利胶囊不开发票、不算销量。）
二、甲方责任
甲方负责免费提供设备，并负责免费运输、培训，同时做好售后服务。但设备的所有权属于甲方。保障乙方检查使用记录仪试用数量。
第四篇：PBL教学模式在消化内科临床见习教学中的应用研究
PBL教学模式在消化内科临床见习教学中的应用研究
摘要：探讨基于问题的教学方法（PBL）在临床消化内科学教学中的可行性、对教学环境、教师、学生的要求，及实施的基本方法，从中发现其优势与不足，并提出改进措施，为促进我国医学教育改革，培养高素质医学人才提供参考和借鉴。
关键词：PBL教学模式 基本要素 临床教学 以学生为中心
当今时代知识的快速积累，技术革新的突飞猛进，科学的重大发现，使我们周围的世界发生着巨大的变化，随之而来人们是对于科学与健康、疾病与环境，很重视教育人才。本文探讨的基于问题的教学模式（Problem-Based Learning，PBL）是发达国家早在20世纪70年代就开始实践研究，认为是较为成功和有特色的教育模式。PBL教学的基本要素
PBL教学是基于问题、以学生为中心、以教师为引导的小组讨论式教学方法。该方法是美国神经学教授Barrows在加拿大McMaster大学医学院首次展开以问题为中心的临床教学，并获得很好的效果。
PBL教学法基本要素：（1）把问题作为出发点，问题就是学生专业学习中遇到的问题没有固定不变的解决方法。（2）着重于小组形式进行学习，很少老师来教。（3）学生为主导，教师引导。（4）每一个问题结束之后进行总结和讨论。PBL的理论在临床内科上面的教学
消化内科是医学生学习内科学的重要组成部分，从口腔到大肠涉及多个脏器，这些脏器疾病常见且相互关联，临床表现纷繁复杂，消化内科疾病存在复杂、多样、关联性强等特点。
2.1 PBL成功的重要点是设计的问题
教师在备课中应准备足够的综合性问题，如整体假设（导致……的可能原因是什么）；检验假设（……与……之间存在联系吗？）；寻求原因（如何评判……）；制定一个计划（我们的目标是什么？我们应该采用何种方式？我们应该问怎样的问题才能使这个假设成立或排除？）；假设现象（为何这些现象和正常情况不一样？他们提示了什么？）；检验过程（……的结果是什么？）；明确学习的需求（我知道什么？我需要知道什么？如何知道？）
2.2主要部分是学生
20名学生结合一个小组，选一个主持讨论，老师在旁边听学生的讨论和思路，给每个学生病例的详情，发病原因，送医院过程，然后讨论，作好笔记。接着给学生们另一张病例详情，包括病人病情的变化，学生继续探讨，然后再做详细记录。然后发第三张病例给学生，具体治疗方面的这些问题学生先进行思考，讨论，接着就结束了。下课之后学生可以上网、查阅相关资料对病例方面进行学习，第二次上课进行讨论的时候，先把检验的结果发给每一个学生，如影像学、病例结果，列出各种各样的问题，学生讨论。然后再给每个学生病例介绍，包括疾病的变化以及诊治，让学生记录并探讨诊治的原理等，结束后，学生继续寻找各种资料，了解病人诊断后的病情，让学生解答问题。
2.3考核与总结
PBL教学的评估大致分为终结性评估和形成式评估。终结性评估是以对学生的表现进行全面评估，决定学生能否进入下一阶段的学习，终结性评估之后通常不会给反馈意见。形成性评估是以指导今后学习为目的，督促学生反思，形成性评估之后需给学生反馈，帮助学生有所改进。
在PBL教学过程中带教老师的角色成渐退式，仅在关键时刻起到点拨、支架（scaffolding）与教练（coach）的作用，教师不再是唯一的知识库，而是知识建构的促进者（facilitator）、学科专家、信息的咨询者。
3内科临床教学PBL模式的优势
相比之下，基础医学课程教学中开展PBL教学受许多限制，如班级规模、教学条件、师资条件、学时的多少等，这些问题教师很难解决。
4讨论
PBL教学的成功开展对教师自身素质和教学艺术都有很高要求，带教老师不但对本专业、本学科的内容熟练掌握，还应扎实掌握相关学科知识，并具备提出问题和解决问题的能力、灵活运用知识的能力、严密的逻辑思维能力。同时带教老师还应有良好的组织管理能力，要善于调动学生积极性，寓教于乐，控制课堂节奏等技巧。
综上所述，在内科临床教学中采用以问题为导向的教学模式有利于培养学生的自主学习精神，突出了“课堂是灵魂，学生是主体，教师是关键”的教学理念。这种教学模式既能保证学生掌握系统理论知识，也能培养临床思维能力和良好的学习习惯，如PBL和LBL教学法结合应用，既充分发挥了学生的主观能动性，又能够通过基础知识的系统性学习，培养学生临床思维的主动性和鉴别诊断能力。
参考文献：
[1]虞燕波，梁金锐，刘力戈.PBL教学模式在内科临床教学的应用与思考[J].临床试验医学杂志，2013，12（6）：987-988.[2]郝吉庆.PBL教学法在临床医学教学中的应用与探索[J].安徽医药，2011，15（1）：129-130.[3]杨立新.PBL教学模式在内科临床教学中的应用[J].中国病案，2012，13（5）：57-59.[4]庄亮，黄钦，丘红等.PBL教学法在肿瘤学临床教学中的应用[J].医学与社会，2012，25（8）：88-89.[5]赵季红，石蕊，梁国庆等.PBL与LBL在心血管内科临床教学中的效果比[J].中华医学教育探索杂志，2013，12（12）：1240-1241.基金项目：2014年河南省高等教育教学改革省级研究项目，教高[2014-101号]。
第五篇：外周血循环DNA作为生物标志物在卵巢癌临床中的应用研究
外周血循环DNA作为生物标志物在卵巢癌临床中的应用研究试验方案
试验目的：外周血循环游离DNA作为生物标志物在卵巢癌临床应用的价值
试验类别：诊断试验
申办单位：苏州大学
研究单位：苏州大学附属第二医院
试验负责人：李凯
主要研究者：张荣
试验日期：2012年11至2017年11月
联系人：张荣
电话：0512-67784769
一、临床试验背景
卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，卵巢癌的死亡率居妇科肿瘤首位。70% 的患者发现时已是晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)，虽经积极治疗，5 年生存率也仅为15%~20%，若早期(Ⅰ期)发现，5 年生存率可达77% ~87%，若为分化良好的Ⅰ期患者，5 年生存率可达到94%[1]。因此，提高生存率的关键是早期诊断。特异而敏感的肿瘤标记物在辅助诊断卵巢癌中起重要作用。
近年来检测肿瘤患者外周血中游离DNA 的改变为肿瘤的早期诊断和复发监控提供了一种新的手段。游离DNA可存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中，是指一种游离于细胞之外的DNA，其中血液中的相应成分又称循环游离DNA或循环DNA。早在1947年Mandel等[2]就发现了人的血液循环中存在游离DNA。自1977 年leon等[3]发现肿瘤患者的血浆DNA 含量明显高于正常人后，关于肿瘤患者血中游离DNA的研究逐渐成为人们关注的热点。对游离DNA的定性研究显示, 肿瘤患者的血浆DNA 具有与肿瘤细胞DNA一致的基因异常[4-7]。
通过研究发现，原癌基因的突变，抑癌基因甲基化改变和微卫星不稳定性改变[8-9]，可以预测肿瘤患者的预后[10]。目前国外对血中游离DNA的研究多集中在肺癌、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等西方国家的“多发病”上，对卵巢癌的研究不多。Hagiwara等[11]对肺癌吸烟与不吸烟患者及健康人的游离DNA 分别进行了p53基因编码子248和249的突变检测，认为吸烟者游离DNA中p53基因突变可作为癌症的预测指标。Ryan等[12]对大量结肠癌患者的游离DNA研究表明，游离DNA中k-ras 基因突变的患者肿瘤复发率可达62.5%。欧洲癌症和营养学前瞻性队列研究收集了准健康者至其癌症发生后的游离DNA，进行了k-ras基因12位编码子和p53基因的突变检测，这一系列研究包括膀胱癌、肺癌、上消化道癌等，研究发现在肿瘤得到临床诊断前18.3个月，在血中游离DNA中就可检测到相应的基因突变，这种可预测性与肿瘤原发部位、类型和分期相关。
Frattini等[13]表明，游离DNA 定量、定性及定点的联合检测将提高肿瘤的临床诊断率。该研究观察了大肠癌患者手术前后的游离DNA 水平和游离DNA中k-ras和p16 的变化，发现术后游离DNA 水平逐渐下降，当肿瘤复发时快速升高，并重新可以检测到突变的k-ras和p16基因的甲基化。Melnikov[14]等用甲基化特异性PCR检测了卵巢癌患者手术的肿瘤组织和血浆中的甲基化差异，发现将BRCA1、HIC1、PAX5、PGR、THBS1基因合并检测，诊断卵巢癌的敏感性为85%，特异性为61%，其效率与直接应用肿瘤组织相当。Dobrzycka[15]等用PCR-RFLP的方法评价了血浆游离DNA与卵巢癌进展的关系，发现游离DNA的增加与肿瘤生存率降低有关。根据以上研究结果，我们希望可以通过类似的研究，发现卵巢癌患者游离DNA水平和相关基因的改变，获取相关中国人群血中游离DNA与卵巢癌病理变化的关系，为卵巢癌防治提供参考，并通过量化相关指标，提供可供复发监控的基因诊断方法。
目前研究充分表明了游离DNA 的变化与卵巢癌的关系密切。游离DNA 的发现及研究为疾病的非创伤性诊断、监测提供了可能，解决了肿瘤基因检测只能用肿瘤组织的标本限制，为肿瘤的诊断、治疗监控、预后随访等研究提供了简便途径。但是，由于游离DNA的微量存在，使得目前DNA 的提取比较困难，提取试剂昂贵。游离DNA 的检测方法不一，各自敏感度差异较大，游离DNA 检测的特异性低。因此，为方便游离DNA 的临床使用，需要建立实用性较强的检测方法。
本试验拟利用高保真DNA聚合酶的作用下巢式PCR和甲基化特异性的荧光定量PCR 检测游离血中游离DNA浓度，比较卵巢癌患者、卵巢良性囊肿患者、健康女性中血浆游离DNA 浓度的差别，并检测血中和卵巢癌手术标本中热点基因甲基化状态，以期发现外周血DNA的与卵巢癌组织的相关性。展望未来，卵巢癌游离DNA 的基础及临床研究必将成为受人瞩目的研究热点。
二、试验目的
评价血浆游离DNA作为生物标志物在卵巢癌诊断及预后方面的意义。
三、试验设计
本试验为回顾性队列研究。
四、受试者的选择和退出
1.入组标准： 年龄：20-80岁。性别：女。1）卵巢癌组：
具有病理学诊断依据的新发卵巢癌病例。签署知情同意书。2）良性卵巢囊肿组：
手术病理确诊的良性卵巢囊肿的病例。签署知情同意书。
2.排除标准：
1）合并其他恶性肿瘤患者。2）妊娠。
3）合并自身免疫性疾病。
3.受试者中途撤出标准。
1）研究者从医学角度考虑受试者有必要中止试验。2）患者自己要求停止试验。
五、病例数及分组方法
分为卵巢癌组、良性卵巢囊肿组及健康对照组。运用队列研究，卵巢癌组样本量50例，良性卵巢囊肿组50例，健康对照组50例。
六、临床试验步骤：
（一）收集标本 1.卵巢癌组
1)患者术前采集肘静脉血6ml，用EDTA抗凝。
2)术中取新鲜卵巢癌组织标本1*1*1cm3，置-80℃冰箱中保存。
3)卵巢癌患者于术后1周采血查血游离DNA浓度及完整性。之后按卵巢癌的随访标准，术后第一年每个月随访一次，术后第二年每三月随访一次，术后第3年每半年随访一次，术后第4、5年每年随访一次。每次随访时查血游离DNA浓度及完整性、血常规、生化常规，血CA-125，视临床情况行影像学或妇科彩超检查。共随访5年。
2.良性卵巢囊肿组：
1)患者术前采集肘静脉血6ml，用EDTA抗凝。
2)术中取新鲜卵巢良性囊肿组织标本1*1*1cm3，置-80℃冰箱中保存。
3)良性卵巢囊肿的病人于术后一月和术后半年各随访一次，以后每年随访一次，共随访5年。每次随访时测血浆游离DNA浓度及完整性、血CA-125，视临床情况行影像学或妇科彩超检查。
3.健康对照组：
采集肘静脉血6ml，用EDTA抗凝，测血浆游离DNA浓度及完整性。每年随访一次，共随访5年。
（二）血浆游离DNA浓度及完整性的检测 1.标本采集后2 h内送实验室。
2.常温下3000r/min离心10 min，小心吸取上清血浆转移至3 ml离心管中，3000r/min离心10 min，吸取上清，置-80℃冰箱中保存。
3.解冻血浆，血浆DNA抽提采用QIA amp Blood Mini Kit(Qiagen公司)，按说明书进行。4.游离DNA浓度及完整性测定：根据文献中给出的ALU基因的序列设计两对引物，一对引物为文献中已经给出的引物，扩增115bp长度，另一对引物自己设计，扩增长度为219bp，均由由上海生工合成。115bp:ALU 115-1：CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG，ALU 115-2：
CCCGAGTAGCTGGGATTACA。219bp: ALU 219-1：CACGCCTGTAATCCCAGCACTTT，ALU 219-2：ATCTCGGCTCACTGCAACCTCC。以提取的血浆DNA为模板，进行PCR扩增。以试剂盒内已知的标准品浓度可计算出实验标本的游离DNA浓度。计算血浆游离DNA完整性：血浆游离DNA完整性=ALU219-qPCR/（ALU115-qPCR+ ALU219-qPCR）。5.检测血中和卵巢癌手术标本中热点基因甲基化状态：利用高保真DNA聚合酶的作用下巢式PCR的方法，根据肿瘤相关基因（根据相关文献和NCBI中的序列信息）设计引物，做巢式PCR（高保真酶），将得到的PCR产物测序。根据测序结果再设计引物，进行甲基化特异性荧光定量PCR，提取健康人的、卵巢良性囊肿患者、卵巢癌患者手术前后的血浆游离DNA做模板，两端设计引物做荧光定量PCR，看不同组之间的游离DNA甲基化的数量是否有显著性差异。
6.随访观察：三组实验对象于随访期内定期抽血检测血浆游离DNA浓度及完整性。
（三）观察指标
各组血浆游离DNA浓度及完整性、卵巢癌相关基因甲基化状态。
七、统计分析 本试验统计分析选用符合方案数据集，即所有符合试验方案要求的受试者数据进行统计分析。采用Dunnett’s 多组对比、t检验、Spearman’s相关性（一致性）检验、ROC曲线分析和多分类 logistic回归双侧检验。
八、试验段质量控制和保证
本研究过程中，将由申请者指派的临床监查员定期对研究医院进行现场监查访问，以保证研究方案的所有内容都得到严格遵守和填写研究资料的正确。参加研究人员必须经过统一培训，统一记录方式与判断标准。整个临床试验过程均应在严格操作下进行。研究者应按病例报告表填写要求，如实、详细、认真记录CRF中各项内容，以确保病例报告表内容完整真实、可靠。临床试验中所有观察结果和发现都应加以核实，以保证数据的可靠性，确保临床试验中各项结论来源于原始数据。在临床试验和数据处理阶段均有相应的数据管理措施。
九、伦理学要求
本临床试验必须遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究规范、法规进行。在试验开始之前，须经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准认定该试验方案后方可实施。每一位患者入选本研究前，研究医师有责任以书面文字形式，向其或其指定代表完整、全面地介绍本研究的目的、程序和可能的风险。应让患者知道他们有权随时退出本研究。入选前必须给每位患者一份书面患者知情同意书（以附录形式包括于方案中）。研究医师有责任在每位患者进入研究之前获得知情同意书，并以研究档案保留其中。
资料保存：使用后销毁
参考文献：
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