大鼠脑液压冲击伤后细胞色素C表达的实验研究

第一篇：大鼠脑液压冲击伤后细胞色素C表达的实验研究

【摘要】 目的 为法医学上闭合性颅脑损伤的早期诊断和损伤时间推断提供依据。方法 建立大鼠脑液压冲

击模型。用免疫组化与图像分析技术分别检测伤后不同时间大鼠脑皮质、海马等部位细胞色素c(cytochrome c，cyt c)的表达。结果对照组大鼠脑内cyt c有微量表达，伤后15分钟表达开始增强，伤后3小时达高峰，1天后开始减弱，7天后基本恢复正常。结论 cyt c表达的规律性可望为闭合性颅脑损伤的早期诊断及损伤时间推断提供依据。

【关键词】 闭合性颅脑损伤；cyt c；免疫组织化学

【中图分类号】d919．4；r361 ．

2【文献标识码】a

【文章编号】1007—9297(2004)03—0219—0

3a study of the expression of cyt c after fluid percussion brain injury in rats．chen wei—jie，zhang kui—ming，du

xian—gang，xing yu，chen shi—wen，liao zhi—gang．west china school ofbasic medicine and forensic sciences

of sichuan university，chengdu，610041，china；people’sprocuratorateof ningde，fu jian 352100，china

【abstract】objective to search the objective evidence for the diagnosis on early brain injury and for estimating the time

since brain injury． methods some rats were hurt by fluid percussion，then sacrifice at different time after i~ury．the ex—

pression of cyt c was detected by immunohistochemistry，and the results were asesed by image analysis system ． results

there was a slight expression of cyt c in control group．in treat—group，he expresion of cyt c increased in 15 minutes after

i~ury，and it reached at peaks in 3 hours after injury，and it began to decrease in 1 day，but remain above control levels t．11 7

days． conclusion the regularity of cyt c expression might be a useful target for diagnosis of early brain injury，and it also

can be used in estimating the time since brain injury．

【key words】closed brain injury；cyt c；lmmunohistochemistry

颅脑损伤在法医病理学鉴定中十分常见。已有研醉，采用张永亮改进的dixon液压冲击装置[ 制造损伤

究表明，脑损伤后脑血管，特别是脑内小动脉及小静脉模型。分别于伤后15min、lh、3h、6h、12h、ld、4d、7d以

发生痉挛收缩，脑血流量减少，引起脑部缺血缺氧 卫j。4％多聚甲醛溶液进行主动脉灌注固定处死。在脑打击

细胞色素c(cytochrome c，cyt c)是呼吸链中的必要成处尾侧3mm部位作冠状切面，常规石蜡包埋、切片。

分之一，在线粒体复合物ⅲ、ⅳ之间传递电子。近来有 正常对照组大鼠饲养1d后直接处死，手术对照组

研究发现脑缺氧后神经元线粒体功能损伤并释放cyt 大鼠仅行颅骨钻孑l，不做液压冲击，术后2h处死。两组

c是神经元损害的中心环节。目前关于cyt c在闭 动物取材及组织后处理同实验组。

合性颅脑损伤的诊断与损伤时间推断方面的研究报道

三、主要试剂

较少。本研究对大鼠脑部进行液压冲击造成闭合性颅 兔抗鼠cyt c多克隆抗体(武汉博士德生物工程有

脑损伤，观

察伤后大鼠脑内cyt c的表达情况，以期为 限公司)。

闭合性颅脑损伤的早期诊断及损伤时间推断提供依据。山羊抗兔sp试剂盒、dab显色剂(北京中山生物

材料与方法 技术有限公司)。

一、实验动物分组

四、染色

健康雄性wistar大鼠50只，体重300～350 g(由四

川大学华西实验动物中

心提供)。随机分为10组，分别

对应于正常对照组，手术对照组，损伤后15min、lh、3h、6h、12h、ld、4d、7d组，每组5只。

二、动物模型的制备

实验动物经10％水合氯醛按0．3g／kg体重腹腔麻

he染色按常规操作进行，免疫组化染色按试剂说

明书进行，以pbs代替一抗作阴性对照。

五、图像分析及统计学处理

在皮质及海马区随机选取5个视野，用biomias图

像分析仪测量cyt c免疫阳性物面积及阳性细胞染色

强度。测定数值用±s表示，用spss 10．0 for windows

· 220 ·

进行统计分析。

实验结果

一、he染色观察

正常对照组和手术对照组无明显异常改变，实验组

见大脑皮质及蛛网膜下腔出血，脑实质小灶性出血。部

分神经元固缩，核小而深染，以挫伤灶周边分布居多；部

分神经元肿胀，弥散分布于脑实质内。伤后1h脑水肿

明显，伤后7d损伤周边见胶质细胞增生。

二、免疫组化染色结果

正常对照组和手术对照组大鼠脑皮质和海马神经

元均有cyt c低水平表达，光镜下，可见神经元胞浆内

有少许棕黄色免疫反应阳性物(见图1、2)。伤后

15min，大鼠脑皮质和海马神经元cyt c表达开始增强。

伤后3h，大鼠脑皮质和海马神经元cyt c表达达高峰，光镜下，可见神经元胞浆内有大片棕黄色免疫反应阳性

物沉积(见图3、4)。免疫反应高表达持续到伤后1d，随

后cyt c表达逐渐降低，伤后7d，基本恢复至对照组水

平。

三、图像分析

各组均进行了图像分析，结果见表1，2。

表1 大鼠脑皮质伤后不同时段cyt c的表达

table 1 expression of cyt c in the different periods in cerebral

cortex of rat brain after injury

*与对照组相比较p<0．05；**与对照组相比较p<0．0

1讨 论

根据ohm’s定律，脑血流量的调节主要依赖于灌

流压和血管阻力。在血压为6．15～13．85kpa范围内，脑血流量主要通过脑小动脉和微动脉血管壁平滑肌收

缩和舒张改变血管径而进行自动调节。于晓军等制作

大鼠闭合性脑损伤模型，用扫描电镜对血管铸型进行观

察，发现损伤组大鼠脑内小动脉痉挛收缩，管径明显小

于正常组大鼠脑血管管径_6 j。这可能是因为机械性外

力刺激脑部后，脑血管受机械性牵拉，血管平滑肌发生

法律与医学杂志2004年第11卷(第3期)

牵张性收缩反射的结果。脑血管痉挛收缩是外伤后脑

组织缺血缺氧的主要原因。

表2 大鼠海马伤后不同时段cyt c的表达

table 2 expression of cyt c in the different pe riod s

in hippocampus of rat brain after injury

*与对照组相比较p<0．05；**与对照组相比较p<0．01

脑组织以有氧代谢为主，几乎没有无氧代谢能力，对氧的需求量高。同时，脑组织中氧和atp的储备很

少。因而对缺氧的耐受性差，是机体对缺氧最敏感的组

织。缺氧后神经元线粒体atp含量迅速下降，线粒体

功能受损。线粒体功能障碍后，线粒体外膜通透性增

高，cyt c释放入细胞质，线粒体内cyt c减少，直接使

细胞呼吸链电子传递中断，导致神经元坏死。释放到胞

质中的cyt c还与apaf一1，caspase一9一起装配组成凋亡复合体，引起神经元凋亡_7 j。坏死和凋亡正是脑损

伤后神经元死亡的两种方式，只是发生的时间不同。坏

死在伤后不久发生，而凋亡在伤后数小时才开始发生。

ptrick g．sulliven等用western blot法研究脑损伤后神

经元cyt c的释放情况，发现伤后3h、6h、12h、24h神经

元胞浆中cyt c持续增强，72h后又有所下降，而线粒

体中cyt c的含量则随时间变化而不断下降_8 j。陈施

艳等制作大鼠缺血模型，发现大鼠在常温下缺血3h后，海马ca1区神经元有大量cyt c阳性表达，24h后表达

明显减少，72h后完全消失_9 j。本研究发现在大鼠脑液

压冲击伤后15min在鼠脑皮质、海马等部位cyt c表达

开始增强，3h达高峰，1d后开始减弱，7d后基本恢复至

对照组水平。cyt c主要表达于神经元胞浆内。与上

述研究基本一致，进一步证实了脑损伤后神经元凋亡的存在。

本研究发现在闭合性颅脑损伤后，神经元胞浆cyt

c表达早期即有增强。且伤后不同时间其表达强度和

范围亦有很大的差异。此可为闭合性颅脑损伤的早期

诊断和损伤时间推断提供一项辅助诊断依据。本研究

洼律与医学杂 2004年第1i卷(第3

结果来自动物宴骑．在凡颅脑 伤鉴定寓践巾的虚用尚

有待于进步6扦究

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作者单位1日儿1大学华西蓦础医学与法医学院法医病理教哥f

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2福建省宁德市人民检察院．3521011

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