第一篇：分子生物学检查在猝死综合症患者法医学尸体检验中的应用
【摘 要】猝死综合症用来泛指急死后是用传统检查技术手段未能发现致死病变的情况。由于原因不明，其诊
断和病因学的研究均十分困难。猝死综合症的诊断是法医学尸体检验实践中的难题之一。近年来，随着分子生物学
技术和遗传学研究的不断深入，对于一些与猝死有关的发现不断报道，有希望用于法医学实践，用于将此类猝死进
一步分型，并
为进一步的深入研究提供准确的流行病学资料。
【关键词】猝死综合症；长qt综合征；分子生物学检查
【中文图书号】d919．
4【文献标识码】b
【文章编号】1007—9297(2007)03—0229—04
the role of bio-molecular analysis in unexplained sudden cardiac deatilcu1 li-juanl，y1 xu-ful，chen ∞一
gangl，xu tong-lil，shen dan-hal，wang qing2．school ofpreclinic and forensic medicine，sichuan university,chengdu 610041：2．pi-xian’s people poscrate 611730
【abtract】sudden unexpected natural death is a sudden death without any fatal disease after routine autopsy． e
cause of most sudden death is presumed to be associated with some unknown cardiac abnormality． some of ab normity
can be test by bio-molecular techniques． is methods should be concemed by forensic pathologist．
【key words】sudden cardiac death，long qt syndrome，bio-molecular analysis
心源性猝死是引起死亡最常见原因，大多数案
例中通过全面的法医学检查都可以明确死亡原因。
然而仍有大约30％的青少年猝死前没有任何症状
且尸体解剖也没有明显的形态学变化，通常把这种
尸体解剖结果阴性的猝死称为不明原因的猝死
(sudden unexplained death，以下简写为sud)。一些
具有遗传性的潜在致命性心脏病变如qt间期延长
综合征(1ong qt syndrome，以下简写为lqts)，多形
性室性心动过速(catecholaminergic polymorphie yen．
tricular tachycardia，以下简写为cpvt)等，引起的猝
死尸体解剖阴性，法医病理学鉴定不能明确死因，但
是随着分子学技术的发展和在法医病理学的应用，为这类sud的死亡原因和死亡机制的确定提供了
分子学检验的基础。
一、青少年中sud的比例
1996年，maron[1等对134名平均年龄为17岁的运动员猝死资料尸体解剖阴性的sud占3％。
2001年，意大利学者corradot21调查了273例平均
年龄为24岁的猝死者，尸体解剖阴性的sud占
6％。puranikt~2005年对澳大利亚241例尸体解剖
阴性的sud则占29％。eckartf~等调查美国6 300
000名18—35岁126名在军役军人猝死案例，平均
年龄19岁，其中108名士兵猝死发生在训练中．尸
体解剖阴性率高达4o％。
二、几种遗传性心脏病与sud
潜在的致命性、遗传性心脏离子通道疾病如
lqts，多形性室性心动过速和brugada综合征(bru．
gada syndrome)等引起的猝死，法医学尸体解剖没有
任何异常发现，法医病理工作者对这些尸体检查阴性的猝死案例无法确定死因。然而随着分子学的进步，[作者简介]崔丽娟(1982一)，女，汉族，山西省侯马人，四川大学华西基础医学与法医学院硕士研究生，研究方向：法医病理学。
teh+86-***；e—maihsmileclj@126．corn
[通讯作者]易旭夫，四川大学华西基础医学与法医学院副教授，tel：+86—28—85501553；e—maihyixufu@tom．corn
· 230 ·
可
以通过对猝死者心脏离子通道的分子学检查，阐明
了这些引起不明原因死亡的疾病的潜在致病机制。
先天性lqts是一种以心肌细胞复极化延迟、qt间期延长为特征的心脏离子通道病变。qt间期的延长增加了发生晕厥、惊厥和心源性猝死的危险
性。一般情况下心肌细胞复极化延迟引起的qt间
期延长并不引起严重后
果，但当患者在重体力活动、游泳、情绪激动或突然刺激等情况下心脏正常电活
动节律失去控制．导致致命性心律失常。大多数患者
在短暂的晕厥后心律可自动恢复正常，但有5％的患者可转变成致命性心律失常，发生猝死。
由于lqts的患者心电图表现正常或仅见qt
间期延长．尸体解剖结果阴性，阻碍了对此病变的流
行病学调查和尸检诊断。近年来一些学者发现lqts
是由于编码心肌细胞电活动的离子通道蛋白的基因
变异引起的一种常染色体显性遗传病，lqts存在的基因变异主要是kcnq1(lqt1)阀，kcnh2(lqt2)
问，scn5a(lot3)阐，kcne1(lqt5)[91和kcne
2(lqt6)[-01五个基因。尸体检材的相关基因变异的检
验可以解释一部分的猝死综合症．并对死者的近亲
属采取相应的预防性干预措施。
cpvt是另一种具有遗传性且可发生晕厥和猝
死的心律失常综合症。主要发生在青少年男性。
cpvt患者的心电图和心肌电生理检查可完全正
常．猝死者尸体解剖没有任何阳性发现。laitinen
【“】通过对尸检提取标本进行分子生物学检查，发现
存在rvr2基因的变异，临床确诊的cpvt案例
5o％检出rvr2基因变异(cpvt1型)，少部分检出
casq2基因变异(cpvt2型)。40岁以下有家族遗
传史的cpvt发生猝死的危险性比没有家族遗传史的cpvt发生猝死的危险性大33％。而且其中6o％
是ryr2基因的变异。
三、尸体分子学检查在法医病理学中的应用和
前景
1999年ackerman mj【 2】报道了第一例应用分
子生物学检查对阴性尸检做出死亡原因诊断案例。
该案例中死者为一19岁女性在游泳时发生猝死．生
前身体健康，尸体解剖没有任何异常发现。家族中各
成员均没有晕厥、惊厥、心悸和猝死等症状。尸体解剖
为阴性结果。尸检提取检材分子生物学检查检出
kcnq1(lqt1)基因变异，证实死者患有遗传性
lqts，并以次确定死亡原因。2001年ackerman mj
【 3]对一名17岁男性猝死者发现kcnq1基因变异
法律与医学杂志2007年第14卷(第3期)
进行报道。尸体解剖和常规毒物检测结果阴性，其近
亲属心电图检查正常。心脏组织pcr检测，发现
kcnq1基因735—739gcgct碱基缺失。kcnq1基
因编码心脏钾离子通道蛋白，该蛋白由676个氨基
酸组成，碱基缺失使通道蛋白第191～282个氨基酸
改变．该离子通道失去六个重要的跨膜结构域中的四个结构域和离子孔道。进一步证实lqts导致的猝死是由于kcnq1基因变异导致钾离子通道结构
异常从而发生致命性的心律失常引起的。对死者家
族中其他成员进行基因检测，发现其弟弟、母亲、姨
妈和外婆均为变异基因携带者但没有任何临床症
状．心电图检查正常。自从该案例报道后对不明原因
死亡的尸体进行心脏离子通道的分子病理学检查逐
渐受到法医工作者重视。
2004年．marco[ 41报道了一名22岁女性在睡眠
中发生猝死的案例。现场勘验未发现搏斗痕迹，尸体
解剖无阳性发现．死前六月曾阴道分娩一健康婴儿，产前心电图检查示qt间期延长。心脏组织分子生
物学检查发现第1 1号染色体长臂15．5区带上kc．
nq1基因变异．证实死者患有遗传性lqts。家族史
调查发现家族中曾有一人14岁时发生睡眠中猝死。
一级亲属无临床症状和心电图检查均正常。基因检
测发现其中3名为携带者。该案例表明对于青少年
猝死不能仅限于尸体解剖、病理组织学和毒理学检
查．尸体分子学检查在明确死因上起着非常重要的作用。2004年，chugh[ 5】等对1990—2003年年龄在2o岁以上的270名心源性猝死者调查，结果显示其
中有12例为不明原因的猝死，其中17％尸体解剖
阴性的心源性猝死案例临床资料高度提示疑为
lqts致死。回顾性分子生物学研究发现存在kc．
nh2基因的变异，进一步明确死亡原因为lqts。
心律失常性右心室发育不良(arrhythmogenic
right ventricular dysplasia以下简写为arvc)是以右
心室肌进行性被纤维或脂肪组织取代为特征的一种
心肌病变。由于本病可以引起猝死，特别是在青少年
中，目前已受到人们的普遍重视。kalliopi[-61等学者
研究证明该病具有家族性特点，属常染色体显性遗
传。病变与ryr2，tgfi32，盘状球蛋白基因，dsp和
pkp2五种基因变异有关。通过抽查8o名arvc患
者。其中10％存在dsg2基因变异。pcr基因检测发
现dsg2基因的变异主要表现为碱基替换、缺失、插
入和无意义突变。碱基替换表现在五个碱基26oa—
g，298g-÷c，797a-÷c，877a g，991g-_+a；缺失表
现在2036delg：插入为1253到1257insatga；无意
法律与医学杂志2007年第14卷(第3期)
义突变表现为1672c>t。临床表现有：持续性室速，心悸．心前区疼痛但冠状动脉造影正常，也有的患者
没有任何临床症状或仅表现为毛发和皮肤异常；心
电图特征有：完全性右束支传导阻滞，不完全性右束
支阻滞，t波倒置，qrs波低电压，st段抬高，pq间
期延长(>200 ms)，持续性室速合并左束支传导阻
滞。非持续性室速，孤立性单态性室性早搏等。显微
镜下观察：心内膜活检光镜下观察正常心肌的范围
47±8％。脂肪组织范围为20±13％，纤维组织的范
围为24±11％。心肌细胞胞浆呈空泡化改变，超微
结构示闰盘问桥粒减少。通过对其中两个患者家庭
成员的调查发现．家庭1中患者的四个子女中有两
个存在dsg2基因(797a>g)变异，其中只有一个
临床检查阳性表现为：非持续性室性心律失常，心电
图v1一v2t波倒置。二维超声心动图示右心室腔扩
大。家庭2中患者的母亲有dsg2基因变异但没有
临床症状。患者和其妹妹有基因变异(988g>a／
1881—2a>g)且临床表现阳性。心电图v1一v4t波
倒置。二维超声心动图示右心室腔扩大。左束之传导
阻滞，家庭中其他成员临床检查阴性。由于arvc
导致的猝死。在判断死因上法医学鉴定尚没有特异的方法。有时通过尸体解剖和组织病理学检查并不
能确定为arvc。应用尸体分子学检查基因的变异
情况可以区别于其他心肌病引起的死亡。
综上所述，绝大多数猝死案例中通过系统的全
面的尸体解剖可以明确死亡原因和死亡机制．但是
也有一些猝死没有明显的发病诱因和任何征兆而突
发死亡，且通过现场勘察、毒理学分析和尸体解剖等
均没有任何阳性发现。给法医病理工作者确定死因
带来很多困难。随着尸体分子学检查的发展和应用。
对尸体解剖阴性的不明原因死亡的尸体进行分子学
检查，一定程度上为法医工作者明确死亡原因和死
亡机制在基因水平上提供了有力的证据。而且通过
对猝死者尸体分子学检查还可以避免其家族中其他
可能患有同样疾病的成员发生猝死，2003年 behrt17／
等人调查了32例不明原因猝死者的一级亲属共
109名，检查发现其中22％的人患有lqts。200
5年，tan 也发现因lqts和cpvt引起的猝死者中
28％的一级亲属患有相同的疾病。可见像由lqts
和cpvt引起猝死的病变，死者死前没有任何明显的症状且通过现场勘查、尸体解剖和毒理学分均没
有明显的致命性损害。通过尸体分子学检查可以在基因水平上明确诊断从而确定死亡原因。同时还可
以通过对尸体分子学检查在基因水平上对家族中其
· 231 ·
他可能患有lqts和cpvt的成员做出早期诊断和
早期治疗，从而降低其发生猝死的危险性。
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(收稿：2006—07—15；修回
第二篇：分子生物学在微生物检验中的应用(精)
分子生物学在微生物检验中的应用
南京军区福州总医院全军临床检验研究所
兰小鹏 世纪是以分子生物学为代表的生命科学的时代，近年来,随着现代生物技术的快速发展,人类基因组计划的完成,尤其是生物化学、免疫学、生物仪器及计算机理论与技术的进步，分子生物学技术在医学、遗传学、法医学、生物学等各个领域广泛应用, 新的诊断技术和方法不断涌现并被广泛应用于微生物检测，为传染病的流行病学调查、基因的多样性、微生物的生物学特性、微生物的致病性和药物的耐受性、微生物的生物降解能力等各个方面提供了重要的信息。一．核酸杂交法
最初应用于微生物检测的分子生物学技术是基因探针方法,它是用带有同位素标记或非同位素标记的DNA 或RNA 片段来检测样本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸杂交有原位杂交、打点杂交、斑点杂交、Sorthern杂交、Northern杂交等,核酸分子探针又可根据它们的来源和性质分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等。其原理是通过标记根据病原体核酸片段制备的探针与病原体核酸片段杂交,观察是否产生特异的杂交信号。核酸探针技术具有特异性好、敏感性高、诊断速度快、操作较为简便等特点。目前,已建立了多种病原体的核酸杂交检测方法,尤其是近年来发展起来的荧光原位杂交技术(FISH)更为常用。二．质粒DNA图谱分型技术
细菌质粒分析是较早被使用的对病原微生物流行病学进行调查的分子分型技术。这种技术包括萃取质粒DNA ,通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA。由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同,通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也将不同,因此,与流行病相关的分离株能够被分类分型。质粒图谱分析的再现性和分辨力可通过限制性内切酶消化质粒而提高。虽然2个不相关质粒有相同的分子量, 但性内切酶位点的位置和频率是不同的。但质粒是可移动的非染色体遗传物质,细菌能自发的失去或很容易的获得,结果流行病相关的菌株可以展示不同质粒指纹图谱。许多质粒带有抗性决定因子的基因,存在于转位子上,而转位子很容易丢失或获得,这同样可以迅速改变质粒DNA组成。产生图谱的再现性也会由于质粒空间存在的不一致性(超螺旋的、断口的和线形的)而被影响,而凝胶电泳时具有不同迁移速度。大多数病原微生物有质粒,但没有质粒的就不能用此技术分型。此外,由于有些分离株中含有1个或2个质粒,会使菌株间的分辨力降低。三染色体DNA 限制性内切酶分析技术
染色体DNA经限制性核酸内切酶消化,消化后的片段再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。用限制性内切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因组DNA可以产生大量短的片段。电泳后,将获得一系列被分离的DNA图谱。通过比较图谱,就可以进行菌相似性研究。几乎所有的病原微生物分离株都可以通过这种方法分型,但由于基因组DNA巨大,酶切后产生的片段众多,且含有大量的重叠片段,这将导致菌株间图谱一致性分析产生困难。但若细菌只含一个或少量核糖体操纵子, 则只产生1～ 2条带, 这限制区分密切相关菌株的能力。RFLP分析分辨力低于脉冲场凝胶电泳分型技术（PFGE）, 且比较复杂图谱(数百条带)的难度较大。四．DNA 的脉冲场凝胶电泳分型技术
脉冲场凝胶电泳分型技术（PFGE）是使用对染色体有很少酶切位点的限制性核酸内切酶消化细菌DNA ,产生大的DNA片段(10～800 kb),这些大片段不能通过常规电泳方法进行有效分离。在电场方向周期改变(脉冲)的凝胶电泳条件下,DNA片段根据大小有效分离。PFGE产生的染色体DNA图谱比用那些高频率切割的限制性内切酶产生的图谱更为简单清晰。理论上,所有的细菌都能使用PFGE 进行分型分类,结果具有极高的再现性和分辨率, 常作为分子生物学分型方法的“金标准”使用。PFGE 也有一些局限,例如所需时间长,使用的试剂非常昂贵,要求专门的仪器等。另外,很小的电泳条件的不同就可以改变每条光谱带间距离,使用不同凝胶进行电泳得到的结果也比较复杂,这为不同实验室间的结果比较带来一定麻烦。五．聚合酶链反应技术
聚合酶链反应(PCR)技术自1985年发明以来,因其高度灵敏性和良好的特异性受到了人们的高度重视,各种各样以PCR 为基础的DNA序列的扩增和检测方法得到了迅猛发展,几乎已应用于基础研究的各个领域。各种衍生技术如反转录PCR(RTR)、多重PCR、巢式PCR、PCR单链构象多态性(PCRSSCP)、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增的多态性DNA 技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep-PCR)、荧光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于临床感染性疾病的诊断,又可用于监测其疗效，PCR及其衍生的技术近年来在病原微生物分型研究上得到了广泛应用。
1.随机扩增的多态性DNA 技术
随机扩增的多态性DNA 技术（RAPD）是一种典型PCR衍生技术, 在低复性温度下用短任意序列引物(10～15m ers)扩增有密切同源性的基因组DNA序列, 模板上任意引物杂交点的数目和位置因种的不同株而异, 理论上特定株形成特定图谱。基因组在这些杂交区段如发生了DNA片段缺失、插入或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化。通过电泳对扩增产物DNA片段的多态性进行检测、分析就可以反应出不同菌株基因组的DNA特点,从而对他们进行分型，RAPD是目前最简单的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于Rep－PCR，RAPD技术的使用范围也非常广,分辨结果也有较好的实验室再现性。虽然RAPD技术简单、快速, 但由于其对引物和DNA浓度、DNA模板质量、凝胶电泳和DNA聚合酶类型的变化高度敏感, 故RAPD的重复性不够理想。虽然RAPD的分型结果在不同实验室间变化较大,分辨力不如PFGE技术,但在疾病暴发流行时,PAPD仍是一种分析相关菌株和排除不相关菌株的良好技术。2.重复序列PCR技术
重复序列PCR技术（Rep－PCR是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物靶序列,进行PCR扩增,通过对PCR产物电泳结果的比较,分析菌株间基因组存在的差异。这些重复序列在原核生物界广泛存在,在一些细菌属和种中是保守的。在这种方式获得的图谱中,光谱带的大小和数量的不同代表着不同菌株重复序列间的距离和重复序列的数量。已成功地用于分型的细菌重复DNA序列有肠道菌重复基因间共有(ERIC)序列、重复基因外回纹序列(REP)和BOX序列的分析，与其他分类技术相比,这种技术有更高的分辨力。研究表明,虽然有时Rep-PCR分辨力稍低,但与PFGE获得的结果却有很好的相关性。3.免疫PCR 免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR)是1992 年Sano 等建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合在一起,它的基本原理是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应, 用PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子,电泳定性,根据特异性PCR产物的有无,来判断待测抗原是否存在。目前,国内外报道的免疫PCR的敏感性一般比现行的ELISA 法高102 ～105 倍。由于PCR产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比,因此免疫PCR 还可用于抗原的半定量试验。
PCR－ELISA是PCR与ELISA技术结合的检测方法，其综合了PCR、分子杂交和ELISA三种技术的优点，主要用于检测样品中的特定基因。它引入地高辛(或生物素)标记的dNTP或引物进行PCR扩增,利用酶标抗地高辛抗体(或酶标记亲和素)进行ELISA检测,代替了用于常规PCR产物检测的电泳方法,方便快捷,易于处理大量样品,且其灵敏度比使用琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍,当有适当的标准品时,还可进行定量测定。六．DNA 序列测定
与检测全染色体的PFGE、Rep－PCR和RAPD分析相比,DNA测序只检测细菌或真菌株间潜在变化序列的很小一部分。用于辨别菌株的被测序DNA区域必须满足以下条件:DNA区的结构必须是可变序列，两侧为高度保守区;DNA序列的可变性必须能足以区分特定种的不同株;DNA序列不能水平转移到其它株。对细菌和真菌, 极少序列满足这些条件。相反,DNA测序被认为是病毒分型的 “金标准”。DNA测序费用高、需要很高的技术条件, 而且自动化DNA 测序仪十分昂贵。
七．基于16SrRNA的检测技术
自Woese 等于1987年首次运用rRNA分析以来,rRNA数据库快速扩大起来,成为研究细菌多样性、进化、系统发育中被广泛采用的序列。16SrRNA存在于所有原核生物细胞中,它们相对稳定且有较高的拷贝数(每个细胞几千个拷贝),其序列中含可变区及高度保守区,因此可设计群、属、种特异性的探针。现阶段各种常见细菌的16SrRNA基因几乎全部测序完成,16S rRNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列,逐渐成为细菌鉴定、分类的“金标准”。目前, 16SrRNA 检测技术已在医学界得到广泛应用,可以用现有病原菌标准菌株制作DGGE(变性梯度凝胶电泳)标准marker , 然后对疑似“病原菌”扩增16SrRNA进行DGGE分析,这样可以做到快速检测。八．生物芯片
生物芯片技术是将生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵,当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后,利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析。微生物检测基因芯片是指用来检测样品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的特点,微生物检测基因芯片在微生物病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用。目前,许多细菌、病毒等病原体的基因组测序已经完成,将许多代表各种微生物的特殊基因制成1张芯片,经反转录就可检测样本中有无病原体基因的表达及表达水平,由此判断病人感染病原、感染进程以及宿主反应等。这样就大大提高了检测效率。基因芯片诊断病原菌的原理基于细菌的16SrRNA基因的高度保守性,由于RNA易于降解,因此多采用检测16SrRNA 所对应染色体上的16SrDNA序列。对16SrDNA而言,如果出现3 个碱基以上的差异就可以断定细菌不属于同一种属,因此可用于细菌的分类和鉴别。对病毒和耐药性病原菌的检测是通过将待测的特定基因(病毒特异性基因和耐药基因)经体外转录、PCR、逆转录、末端标记等处理成标记有荧光分子的核酸分子,然后与芯片上的探针进行杂交,用计算机对杂交信号进行处理,依信号和强度即可得出核酸含量。
液态芯片（Suspension Array Technology，SAT），又称微球蛋白芯片（Protein Bead arrays，PBA），是近年来出现的一种新的芯片技术，也是唯一被美国食品和药品监督管理局（FDA）批准的用于临床诊断的生物芯片。其原理是用两种荧光染料按照不同比例将直径为5.6um的微球（beads/microfluorospheres）染成100种染色，每种颜色的微球共价结合一种生物探针，可以是抗原、抗体、配体，也可以是核酸或酶，分别针对一种待检物。混合载有100种不同颜色的微球，就可以在一个反应孔里同时完成100种不同的生物反应。随后微球成单列通过两束激光照射的管道，计算机采集并处理每种颜色微球的荧光强度变化就可以分别对每个待测物进行定性或定量的检测，该系统可用于多种微生物抗原、抗体和特定基因的联合检测，与固态芯片相比，液态芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优越性，因此不少学者看好液态芯片的应用前景。九．生物传感器
生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断技术相结合而成的一种新技术,是现代临床检验诊断发展的一个新方向。由于生物传感器检测准确、操作简便等特点,近年来已经在许多领域取得了很大的进展,在生物分子相互作用、药物筛选、临床诊断、食物检测等领域获得了广泛的应用，其中临床中用于病原体检测的以DNA生物传感器最为常见。尽管生物传感器作为一种新的传感元件近年来得到了很大的发展,许多光化学、电化学以及压电晶体都相继在生物传感器中得到应用。与常规的核酸和蛋白质检测相比,具有检测准确、操作简单等特点,但由于它存在灵敏度不够、容易受杂质干扰等缺点,随着研究的进一步深化和技术方法的改进,这些问题将会得到解决。
十.蛋白质指纹图谱技术 蛋白质指纹图谱技术是随着蛋白质组学兴起的一种新技术，其中表面增强激光解吸电离飞行时间质谱蛋白芯片技术(SELDI-TOF-MS，下称SELDI-TOF-MS)是由T.William Hutchens 和 Tai-Tung Yip等科学家在上世纪90年代早期所创立的一种蛋白指纹图谱分析技术，并获得了2002年诺贝尔化学奖，为研究蛋白质的结构、属性、功能提供了高效而可靠的技术平台。其原理是利用各种方法（共价键、电荷等）将蛋白“富集”到芯片表面，在激光的轰击下，蛋白解吸附并电离成带电粒子，并在电场作用下飞行，其飞行单位距离的时间取决于其所带电荷数量和其分子量之比（质荷比），从而达到分离和分析蛋白质的目的。该技术是目前最有前途的比较蛋白质组分析方法，为蛋白质组学研究提供了一个利器，具有独特的优势和能力：可直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析、可同时快速发现多个生物标记物、具有高通量的验证能力、能发现低丰度蛋白质（灵敏度高达fmol/ml），与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质，可在同一系统中集发现和检测为一体，SELDI在微生物检验方面将发挥重要的作用。十一.适体技术
1990年,Tuerk和Gold[1]分别独立研制了一种新型的体外筛选技术,即指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX),用于研究小分子核酸与靶物质相结合的部位、序列及空间构像。适体（aptamer），又称适配分子或适配子，实质是运用SELEX技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。
由于适体分子可用酶、放射性核素、荧光物质及生物素等标记以作为检测分子，它协同传统的单克隆抗体在流式细胞技术、生物传感器、荧光偏振、分子灯塔和毛细管电泳等检测技术上得到了广泛的运用。
适体与抗体相比，具有针对靶分子的范围广、亲和力和特异性高、性能稳定、便于修饰等诸多优点。利用针对微生物的特定蛋白和基因的适体对微生物进行鉴定和分型以及耐药基因的检测方面，适体将具有良好的前景，有的学者认为，未来适体有可能取代抗体。
十二.结语
长期以来,人们试图找到一种既简便又快速、又有足够分辨力的技术来鉴别和区分各种病原微生物，各种新方法和新技术不断涌现，但每一种方法都有其局限性，为了弥补各自的不足，使用一种以上的技术即采用多种方法联合使用的策略,一种技术的缺点会被其他技术的优点所代替。选择检测方法应考虑到自身所拥有的条件,检测所要求达到的灵敏度,而提高灵敏度和去除假阳性是检测方法发展的趋势。近年来,随着计算机技术的不断发展,临床病原菌检测将向着简便、快速、高通量、自动化的方向发展。分子生物学技术通过自动化仪器的使用,将在病原菌诊断、鉴定和耐药基因检测方面越来越广泛地应用于临床。
第三篇：分子生物学技术在医学检验中的应用进展
分子生物学技术在医学检验中的应用进展
[摘要] 分子生物学技术是医学检验的重要诊疗手段。本文概述医学检验中常用的分子生物学技术，列举其在临床病原微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、免疫系统疾病诊断中的具体应用，分析分子生物学技术应用中应注意的问题，并对发展趋势进行预测。
[关键词] 分子生物学技术；医学检验；应用；
进展分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科，分子生物学技术即建立在核酸生化基础上的一类研究手段，现已广泛应用于医学检验中。研究内容也从DNA鉴定、扩展到核酸及表达产物分析，技术不断进步为原微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、免疫系统疾病诊断提供重要依据和创新思路。现就分子生物学技术在医学检验中的应用进展进行综述，试分析应注意的问题及预测发展趋势。
医学检验中常用的分子生物学技术概述
分子生物学技术的核心是聚合酶链反应(PCR)，能在最短的时间内扩增。由此衍生出新PCR技术，如原位PCR技术、实时定量PCR、链置换扩增技术、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技术、核酸探针技术、生物传感器、SELEX技术、循环核酸分析技术都极大的完善了检验技术，直接解释生命规律，在临床诊断和治疗中意义重大。
分子生物学技术在临床中的具体应用
2.1 病原微生物检验 PCR和生物芯片技术用于病原微生物检验术与传统的培养鉴定、免疫测定相比，其具有高的敏感性，较短的耗时和更广的适用范围[1]。PCR通过向反应管中加入特异性引物可同时鉴定出单种或多种病原体，即便存在大量死菌也能得到准确结果，不受混合标本和微生物生长时间的限制。生物芯片技术则以其更高的灵敏性和高效率，同时检测出上百种病原微生物，可用于快速查找样本的耐药基因指导临床用药。
2.2 肿瘤及遗传病诊断 研究证实肿瘤及遗传病几乎都存在着一定的基因缺陷，只要找到人体中与基因相互作用的结合点，从基因水平诊断就能准确诊断。通过基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突变，通过分子蛋白质组学、生物传感器和流式细胞术诊断肿瘤特异性标志物。在遗传病中，分子生物技术能识别患病家族基因存在的特定多态性，常用技术有DNA限制性片段长度多态性分析，单链构象多态性分析，荧光原位杂交染色体分析，酶基因调控和微阵列技术。
2.3 免疫系统疾病诊断 免疫系统疾病诊断关键是确定基因水平上的调控表达。如在人类免疫缺陷病毒的研究中，分子生物纳米技术即以抗体为基础，用免疫分析和磁性修饰的方法来检测免疫物质，通过酶、荧光剂、同位素把特异的抗体抗原与纳米磁性微球固定，既能自动检测人免疫缺陷病毒1型和2型抗体，为人类防治病毒性疾病提供了有力的武器。
分子生物学技术在检验应用的新进展
现阶段分子生物学新技术的发展方兴未艾，给人们提供了探索人类生命科学的工具，推动了检验学发展。分子生物技术最显著的医学成就是对遗产病中的致病基因的准确定位及克隆，早在1998年就完成了遗传性耳聋的基因克隆；2003年SARS肆虐时，科学家就研制出专门诊断该病的基因芯片；2004年后实现了用多重PCR技术对我国新生儿多发的地中海贫血、苯丙酮尿症、G6DP缺乏症的产前和病例诊断；近年来，遗传标记技术的进步，结合现有分子学研究技术，加速了遗传基因图谱的制作和相关疾病的基因检测和鉴定，从而为医学检验的加速发展提供了有效的载体。
存在问题及发展趋势
现阶段面临的问题主要是技术相对复杂和仪器要求太高、药品和反应盒昂贵等[2]，限制了临床推广。首先，合理选用检验项目的问题，分子生物学方法具有高特异性和高灵敏性，但临床中仍要根据实际需要选用经济合理的检验项目，如结核菌培养和涂片镜检就能达到目的，不必舍廉选贵，增加患者负担。其次，疾病诊断过度依赖检验结果问题，应将临床资料综合考虑，不能仅靠分子生物学技术检验结果就妄下诊断，忽略标本取样和检验过程中的操作不当及病程发展规律造成的假阳性或是假阴性，贻误病情。再者，上级部门管理不足问题，国家相关部门要担任监管的职责，参考国际惯例，制定符合我国医学检验现状的实验操作管理规章制度，严格培训检验人员，规范试剂的准入和仪器的管理，最大程度保证检验结果的可信度。
虽然分子生物技术在临床推广应用中存在着许多尚待解决的问题，但是它仍然显现出了快速发展的趋势。未来其发展会倾向于：①现有、仅停留在实验室的分子生物学技术逐步向临床实用型改进，降低实验投入、简化操作步骤，推进实验过程全自动化的实施降低人为因素对结果的影响，根据临床实际修正技术，提高检验的特异性和敏感性。②积极推进实验室建设，加大仪器和检验人员的培训投入，为分子生物学的临床应用提供必要的基础保障，以先进的、可持续性的实验检验手段为临床提供可靠的依据。
参考文献
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王耿新 刘德亮 王志群 陈献业
山东省青岛市肿瘤医院 青岛 266042
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）又称体外基因扩增技术或 DNA 扩增技术。自 1985 年美国 PE-Cetus 公司的 K.B Mullis 等人首创了 PCR 技术之后，它以相当惊人的速度被广泛地应用于医学及分子生物学等各个领域。现今，PCR 技术已成为一种对标本中特定的 DNA 片段进行分析研究和检测鉴定的重要方法。近20 年来 PCR 技术在生物医学等各个研究领域和临床应用中发挥了重大的作用，在病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及治疗等方面都作出了相应的贡献。
1.PCR 技术的基本原理与特点 [1-2]
PCR 技术的基本原理是模仿 DNA 体内复制的机制，在体外进行扩增特异的 DNA 片段。它主要是由三个基本步骤组成的循环反应。首先是变性，用加热的方法使双链 DNA 解链成两股单链；其次是复性，用降温的办法使这两股单链按碱基互补的原则分别与加入的两条人工合成的寡聚核苷酸链（引物）结合成双链；最后是延伸，在合适的缓冲液、镁离子及脱氧核苷酸存在的条件下，用 DNA 聚合酶进行催化，按碱基配对的原则合成互补链。引物从 3 '端进行延伸，合成的方向为 5 '端（一条人工合成的引物）至 3 '端，从而合成与模板 DNA 结构相同的片段。重复上述三步骤，变性→复性→引物延伸的过程，经过约 30 个周期的循环（每三个步骤为一周期，约需 2-3 分钟），1-2 小时就能将所需基因扩增几百万倍，使极微量的所需 DNA 达到极易检测的水平。其扩增效率公式为： Y=（1+X）n，式中 Y 为扩增数目，X 为放大效率，n 为循环次数。
PCR 技术具有敏感性高、特异性强、操作简便、快速省时等特点。其灵敏度可达到 Pg 级，甚至达到 fg 级 [3] 水平，而被扩增的基因片段能与原基因片段保持不变。PCR 技术操作简便、快速而易掌握，并且对标本要求不高。用过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动 DNA 扩增仪，整个 PCR 过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，用极微量的粗制标本就可获取目的产物。
2.常用的几种 PCR 及主要用途 [4-5]
2.1 定量 PCR ：用于 mRNA 定量及转录水平的研究。
2.2 抗原捕获 PCR（AC-PCR）：用于病毒感染的检测。
2.3 不对称 PCR（Asymmetric PCR）：用于制备探针或测序。
2.4 彩色 PCR（CCA-PCR）“用于检测某些多型别病毒的混合感染。
2.5 原位逆转录 PCR（In Situ RT-PCR）：定位检测细胞中 RNA 病毒感染。
2.6 逆转录 PCR（RT-PCR）：用于克隆 cDNA、检测 RNA 病毒、cDNA 探针。
2.7 反向 PCR（inverted PCR）：用于扩增已知基因片段两侧的未知序列。
2.8 膜 PCR（membrane-bound PCR）：可去除污染的杂质或 PCR 产物残留，检测低丰度靶 DNA。
2.9 间接原位 PCR（Indirect In Situ PCR）：定位检测细胞中 DNA 病毒感染，是目前应用较广泛的一种原位 PCR 技术，其特异性比直接 PCR 强。
3.PCR 技术在医学检验中的地位
现代医学研究证明，人类疾病多数是直接或间接与基因有关 [6]，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等。在医学实验诊断中我们经历了生化和免疫诊断的发展过程，由于各类扩增技术的出现使我们进入了基因诊断的新时代并成就了现代意义基因诊断的崛起。这将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断，从本质上认识疾病和诊断疾病。在各类扩增技术中，PCR 的地位尤为突出。目前，全世界利用 PCR 技术诊断感染性疾病每年达几千万人次，其费用早已大幅下降，说明 PCR 有着巨大的潜在市场。美国临床检验标准化委员会于 1995 年颁布了关于感染性疾病分子诊断应用范围、条件和质量控制细则等准则文件 [7]。而国际临床化学学会于 1998 年又发布了关于分子扩增在临床诊断中应用的质量评估基础的文件并对 PCR 操作的各个环节进行了详细论述 [8]。由此可见，两个权威性文件也都肯定了 PCR 技术在医学检验方面的重要性。基因诊断可能将是以后的发展方向并作为疾病的常规诊断技术。
4.PCR 技术在医学检验中的应用
4.1 PCR 技术在肿瘤方面的应用
目前，肿瘤发病的分子机制尚不完全清楚。研究表明，人类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系。PCR 技术的肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。
据有关资料表明 [1，4] 前列腺癌、结肠癌和 Kaposi 肉瘤等与人巨细胞病毒（CMV）有关；鼻咽癌和 Burkitt 淋巴瘤与 EB 病毒有关；原发性肝癌与乙型肝炎病毒（HBV）有关；泌尿道肿瘤和食道肿瘤等与人乳头瘤病毒（HPV）有关。人类肿瘤病毒病因中较为重要的一类病毒是 HPV，其中大部分只与良性增生有关，只有 16、18、31、35、39 等十余型与恶性肿瘤关系密切。PCR 在检测 HPV，尤其是第 16、18 型有无感染，对子宫颈癌的早期诊断及预防有着显著的意义。
目前，已知肿瘤相关基因有上百多种，但较常见的是 ras 家族的 H-ras、K-ras 和 N-ras 三种癌基因。它们的结构相似，其表达产物是 P21 蛋白。在不同肿瘤中 ras 家族癌基因的 H-ras、K-ras 点突变多集中在第 12 和 61 号密码子上，而 N-ras 在第 13 号密码子上多发生突变。PCR 在癌基因的研究方面主要是 ras 基因与肿瘤的关系。现已查明与 ras 基因突变有关 [1，2，4，9，10] 的肿瘤有几十种。如：各种急性慢性白血病、精原细胞癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、结肠癌、子宫瘤等。Rb 基因 [11] 是人类最早（1986 年）发现的抑癌基因，其后又相继发现了 P53、WT1、NF1、DCC、MCC、APC、P16 和 P21 等抑癌基因。在遗传性视网膜母细胞瘤研究中发现位于 13 号染色体上 Rb 基因的缺失与癌变有关。在许多常见肿瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤中，常发现该基因失活 [11]。在对 P53 基因的研究中 [12-14] 发现该基因的突变和缺失是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤主要有子宫颈癌、肝癌、成骨肉瘤等。遗传学改变主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因发生突变、缺失、增加和易位等而导致了细胞癌变。PCR 不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估等。
近年，刚兴起的荧光定量逆转录（RT）-PCR [10] 在肿瘤诊断、治疗和微转移以及微小残留病灶检测等方面具有广泛的应用价值。研究表明，癌细胞或癌前期细胞在进入血液循环以后，通过定量 RT-PCR 检测外周血肿瘤特异性标志物 mRNA，可进行实体肿瘤的筛查，检测肿瘤术后及淋巴转移阴性的病人外周血肿瘤细胞的数量，以便估计肿瘤的复发和转移，制订合理的治疗方案。另外，定量 RT-PCR 还可用于肿瘤耐药基因（MDR1）[10] 表达水平检测，为临床筛选化疗药物及治疗方法提供依据。
4.2 PCR 技术在遗传病方面的应用
PCR 技术首次临床应用 [10] 就是从检测镰状细胞和 β-地中海贫血的基因突变开始的。十几年来，该技术在遗传病诊断的临床应用方面获得了极大的成功。它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变，如倒位、缺失 / 插入、动态突变、部分高发的点突变及表达量的异常等都可通过基因分析直接检测用于临床进行诊断，像地中海贫血、血友病、杜氏肌营养不良症、脆 X 综合征、苯丙酮尿症等这些遗传性疾病。PCR 在遗传病诊断及遗传病预防与产前基因诊断方面具有明显的应用价值，PCR 产物直接测序已成为检测遗传病基因突变的常用方法。另外，PCR 在鉴定编码抗生素耐药性基因 [10]，尤其是在细菌不携带同源性序列且取单个菌落进行 PCR 扩增时，具有较高的特异性和敏感性。
4.3 PCR 技术在感染性疾病方面的应用 目前 PCR 在医学检验中对感染性疾病的诊断 [10，15] 极具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以检测到任何有限的病原体。一般实验室可检出 10-100 个基因拷贝，而目前，病原体抗原检测方法一般需要 10 5 ～ 10 7 个病原体才能检测到。PCR 技术的运用解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。再者，抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染时，也需要用 PCR 方法来确定。另外，病原体感染后的发病时间和病情轻重均与病原体数量有关。如艾滋病（AIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根据 HIV 检测的含量预知发病的时间。因为 AIDS 潜伏期的长短和临床症状的轻重与血液中的病毒量呈显著相关。在其它病毒性疾病中也多半存在类似情况，这均需 PCR 来定量说明。
PCR 在 HBV 定量研究中表明，HBV 载量与肝炎的发生、发展、预后以及与药物疗效有关，并证明定量 PCR 是鉴别 HBV 感染各期的良好工具。该技术能有效地确定血清 HBeAg 转阴和非活动性携带者病人的 HBV DNA 水平，而常规杂交法则对这些低病毒血症的 HBV DNA 探测不到。在抗病毒治疗中，通过定量 PCR 检测 HBV 的载量，来观察拉咪呋啶及多种联合用药治疗慢性乙型肝炎的疗效具有指导意义。
PCR 对某些传染性疾病疫苗接种后感染的鉴别也是极为重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接种后感染的病例时有发生，是疫苗引起的还是野生型腮腺炎病毒引起的，这就需要一种行之有效的方法来进行鉴别，以往的血清学、病毒培养及探针杂交等方法都很难做到。
过去，对结核病等其他分支杆菌病的诊断方法虽然很多，但均不够理想。简便易行的方法经常查不到抗酸杆菌，也无法鉴别结核杆菌与其他分支杆菌。用分支杆菌培养的方法且阳性率较低又耗时，而麻风杆菌在体外又不能培养，主要靠感染组织的涂片或切片镜检。其他方法，如血清学、气相色谱等方法的敏感性及特异性都不够理想，PCR 技术的运用使上述问题得到了解决。还有 PCR 技术在技术性病监控和性病病原体的检测方面也正在扩大，并列为监控手段和作为检测的金标准。
5.PCR 技术在医学检验应用中的问题 5.1 假阳性
通常 PCR 在医学检验应用中所面临的问题之一是扩增产物污染带来的假阳性，而实验室污染又是假阳性的主要因素。只要实验室被扩增产物污染，扩增片段随时都可能污染新的样本并又被同一 PCR 反应体系扩增出来而产生假阳性。解决的根本措施就是在封闭状态下进行扩增和产物分析。近年发展了一种荧光定量 PCR 技术，从根本上解决了 PCR 扩增产物污染和不能定量的问题。该技术把基因扩增 PCR、分子杂交和光化学融为一体，实现了对 PCR 扩增产物进行全过程的封闭，并进行实时动态检测和自动分析结果，进一步提高了其特异性。由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。
5.2 假阴性
PCR 假阴性的原因相对较为复杂，主要包括有仪器设备的质量、试剂开壳剂和操作问题、PCR 产物的电泳检测时间及有关 PCR 反应的关键环节等。PCR 仪本身的质量问题能使扩增效率下降或造成非特异性扩增而出现假阴性或假阳性。离心机的质量问题或使用不正确，可造成离心标本模板不能分离而产生假阴性。试剂开壳剂和操作问题造成标本 DNA 没有暴露出来，致使扩增无法进行而导致假阴性。PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，大于 48h 后带型不规则甚致消失不出现扩增条带而程现假阴性。PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量及 PCR 循环条件等，在这些环节中操作不当都可引起假阴性。另外，Mg 2+ 浓度和物理因素变性等对 PCR 扩增效率影响也很大。Mg 2+ 浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量。而变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率，最终都可导致 PCR 扩增失败。还有靶序列变异使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增也不会成功。
6.PCR 技术的应用前景 自从 PCR 技术诞生以来，随着其深入不断的发展与完善，许多与其相关的新类型及改良的新方法在不断的涌现，这些派生出的新类型和新方法解决了以往传统 PCR 的瓶颈问题。虽然，PCR 可对基因分析直接检测用于临床进行诊断，但大部分基因突变还是难以直接检测。近年来，分子诊断技术最大突破就是集扩增、检测和靶定量于一体的实时荧光 PCR 技术的问世。该技术的出现，对基因检测和基因分型的应用范围将进一步扩大，为 PCR 的临床应用带来曙光。因此，PCR 技术将有极大的发展空间和广泛的应用前景，它将对肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、寄生虫学和基因治疗等进一步研究及临床应用起着积极重要的作用。在现代医学检验中，PCR 的应用将更加广泛和深入。相信在不久的将来，随着 PCR 技术的更进一步完善，它将作为常规检验方法进行全面普及，发挥更大的作用，为全人类健康做出更大的贡献。
参考文献
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第四篇：分子生物学在医学检验中的临床应用及前景
分子生物学在医学检验中的临床应用及前景 班级：2013级科硕6班 专业：临床检验诊断学 姓名：姜世涛
学号：20*** 评分： 导师签名：
分子生物学是一门正在蓬勃发展的学科，新技术和应用条件的不断出现，为检验医学的发展提供了崭新的时代并提供新的机遇和挑战。分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科，分子生物学技术即建立在核酸生化基础上的一类研究手段，现已广泛应用于医学检验中，同时也逐渐渗入数理科学、结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学，研究内容也从DNA鉴定、扩展到核酸及表达产物分析，技术不断进步为微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、兔疫系统疾病诊断提供重要依据和创新思路。在结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学蓬勃发展形势下，分子诊断学技术将会取得突破性进展。一．利用分子生物学技术检测样品中核酸水平
PCR[1]技术是目前应用较广泛和成熟的临床检测方法，在法医学、常见传染病、性病、寄生虫和优生优育等领域有很高的应用价值，尤其对肝炎病毒的早期诊断。1．核酸分子杂交技术和基因芯片技术
核酸分子杂交技术也称为基因探针技术，利用核酸的变性、复性和碱基互补配对的原理，用已知的探针序列检测样本中是否含有与之配对的核苷酸序列的技术，是印迹杂交、基因芯片等技术的基础。目前基因芯片技术可广泛应用在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面。另外，现已获得一些微生物的全基因序列，包括百余种病毒，多种细菌(流感嗜血杆菌、产甲烷球菌及实验室常用的大肠杆菌等)和一些酵母等。因此，将一种或多种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块基因芯片上，可快速、简便地检测出病原体，判断侵入机体引起感染性疾病的病原微生物(病毒、细菌或寄生虫等)，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。2．单核苷酸多态性分析(SNP)技术
在人群中，个体基因的核苷酸序列存在差异性，称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于人的基因组中。如果在某个家庭中，某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种”遗传标记”来判断家庭成员或胎儿是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的”身份证”，因此，基因多态性分析技术已经广泛应用于群体遗传学研究、疾病连锁分析和关联分析、疾病遗传机制研究、肿瘤易感性研究、个性化用药等诸多方面。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析技术为临床检测提供了依据。SNP是一种最常见的遗传变异，在人类DNA多态性中，SNP约占90％。SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基。SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同在于：它不再以”长度”的差异作为检测手段，而是直接以序列的差异作为标记。由于SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于计算机分析结果，因此SNP检测已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。尽管SNP检测在搜寻疾病基因方面有潜在的价值，但实际应用中却比人们想象的要难得多，它需要花费大量的时间进行筛查，才能建立可靠的SNP分析图谱。3．microRNA是潜在的临床诊断工具 microRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNAs，其功能是负调控基因表达。在正常组织中，miRNA转录，加工，结合到靶mRNA的互补位点，通过抑制蛋白翻译或是改变mRNA的稳定性来抑制基因表达，维持细胞生长、增殖、分化和死亡的正常进行。不同miRNA的分布有组织特异性，因此在生理和病理条件下，miRNA的表达水平存在差异。成熟miRNA水平下降可能是由于miRNA生物合成的任何步骤的缺陷造成的，而这最终将导致不适当的miRNA的靶蛋白的表达。最后的结果可能导致过度增殖、侵入、凋亡的减少、不能正常分化或者去分化，引起肿瘤的形成。最近的证据表明，miRNA突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。目前已知的miRNA中，大约50％在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点，这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。例如，mir-125b一1，线虫lin一4的同源基因，在染色体的1lq24脆性位点，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中有缺失。若能确定多种肿瘤的miRNA表达谱特征库，可以帮助诊断和治疗肿瘤。由于miRNAs可以从福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA表达谱特征库建立成为可能。在此基础上，用特定的miRNAs表达差异图谱，还可以用于预测病人的预后。另外从治疗的角度，miRNA表达谱可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。
二、蛋白组学技术在临床检验中的应用 随着生物体全基因组序列的解析，特别是人类基因组序列草图的完成，基因组学研究重点不可避免地从结构基因组学转向功能基因组学，因此在上世纪90年代中期，蛋白质组学正研究成为基础研究的重要支柱。蛋白组学是在基因组学之后又一组学，其发展之迅速，是由于其能够较为全面的考察蛋白层面的表达情况，有利于获得各种蛋白、多肽因子等信息从而对相关机制进行更深入的研究[2]。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性，虽然可以通过PCR、基因芯片等方法显示生物体的基因水平，但mRNA水平(包括mRNA的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。由此可见，对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在生理和病理等不同条件下，其表达也不同。若能获得与某种疾病相关的蛋白水平的差异表达信息，将为临床诊断、治疗和预后提供有力依据。1．蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行”杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的”杂交”是指蛋白与蛋白之间如(抗体与抗原)在空间构象上能特异性的相互识别。例如免疫芯片，是一种特殊的蛋白质芯片，它在临床分子诊断学有着明显的发展潜力，如肿瘤标志的检测、不同激素的测定，自身免疫性疾病中多种自身抗体或抗原的检测和超敏反应中多种过敏原的筛查等。
2．液体芯片飞行时间质谱技术在临床检测中的应用根据探针标记和色谱分析的原理，液体芯片飞行时间质谱主要由两部分组成：磁珠部分即液体芯片部分；飞行时间质谱仪部分，用于获取磁珠捕获的蛋白质质量和含量，根据不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需时间不同，被测定的蛋白质以一系列波锋的形式出现，并由此绘制出待测蛋白的质谱图，可发现各样本间的蛋白质表达和含量的异同。
液体芯片一飞行时间质谱技术利用磁珠俘获肿瘤患者与健康对照体液中低丰度特异蛋白或多肽，经飞行时间质谱测定和软件分析，建立由两者差异表达蛋白或多肽组成的质谱图模型，用于预测未知样品的归属。液体芯片飞行时间质谱技术主要用于从复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液中发现潜在的生物标志物。一方面，该技术能够在生物液体中检测指示特异疾病的生物标志物模式或生物标志物谱，另一方面，该技术还可以鉴定单个的生物标志物候选物。在哈佛大学女子医院、纽约斯隆-凯特琳癌症研究所、麻省总医院、贝勒医学院等世界一流医院和医学研究所中，该技术已广泛应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈鳞癌、膀胱癌等的早期诊断研究中。应用该技术可协助诊断多种遗传性代谢紊乱疾病，如各种氨基酸代谢失常血症，包括胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症；短链核长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其他各种有机酸代谢失常疾病等。由于液体芯片飞行时间质谱技术具有准确度高、快速、高通量、灵敏度高、重复性好、分辨率高、检测费用低等特点，是极具潜力的临床肿瘤早期诊断工具。
三．分子生物芯片技术在医学检验中的应用
随着人类基因组计划(HGP)的完成，蛋白质组计划也已经启动，基因序列数据、蛋白序列和功能数据以惊人的速度增长，而传统的生物技术已经不能满足数据倍增的要求，生命科学需要更快捷、更准确的自动化的生物技术，而生物芯片在这种情况下应运而生。生物芯片(biochip)的概念虽源于计算机芯片但不同于计算机芯片。狭义的生物芯片即微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核昔酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。分析的基本单位是在一定尺寸的基片(如硅片、玻璃、塑料等)表面以点阵方式固定的一系列可寻找的识别分子，点阵中每一个点都可视为一个传感器的探头。芯片表面固定的分子在一定的条件下与被检测物进行反应，其结果利用化学荧光法、酶标法、同位素法或电化学法显示，再用扫描仪等仪器记录，最后通过专门的计算机软件进行分析。而广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件。生物芯片技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。经过十多年发展，生物芯片技术已日臻完善，其应用前景非常广阔，因其具有技术操作简易、自动化程度高、检测目的分子数量多、高通量等特点，为“基因组计划”时期基因功能的研究及科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具。在临床检验医学方面，生物芯片技术已经被应用于病毒、细茵的检测自身兔疫性疾病的兔疫标志物的检测。遗传性疾病的检测及肿瘤免疫标志物的单一检测及其联检等方面。甘志远等[3]通过呼吸道斑点试验芯片法检测呼吸道病毒抗体具有简便快速、灵敏度和特异度高等优点，是临床呼吸道病毒感染辅助诊断的有效方法。值得推广使用生物芯片具有操作简单、信息量大、节约试剂、减少误差、诊断快速的特点。在临床诊断、科学研究和流行病学筛选中具有广泛的应用前景，它的的诞生也为人们提供了一种高通量、高效率的肿瘤学研究手段[4-6]。五．分子生物纳米技术在医学检验中的应用
1.纳米科学技术是20世纪末期刚刚诞生并正在崛起的新科技。通过直接操纵和安排原子、分子创制新物质，纳米技术与医学相结合，促进了基础医学研究技术的完善、临床诊断技术的革新及治疗水平的提高[7]。通过应用纳米技术，在DNA检测时，检测方法更加简便、快速、准确。美国NASA Ames Center for Nanote Chnology与中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室合作，将碳纳米管用于基因芯片，样本需要量低于1000个NDA分子（传统DNA检测的样本需要量超过106个DNA分子）；需要的样品量更少，可免去传统的PcR扩增步骤；结果可靠、重复性好、操作简单、易实现检测自动化[8]。免疫分析加上磁性修饰已成功地用于各种生物活性物质和异生质，如药物、致癌物等的检测。将特异性抗体或抗原固定到纳米磁球表面，并以酶、放射性同位素荧光染料或化学发光物质为基础所产生的检测与传统微量滴定板技术相比具有简单、快速和灵敏的特点。霍美俊等[9]利用抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒，同时具有可在病毒感染的细胞周围特异性富集和磁颗粒可在交变磁场下感应升温的双重功能，将其作为磁感应热疗的靶向介质，有望研制出病毒感染性疾病磁感应热疗的靶向介质。为寻求一条快速诊断EV71病毒感染的新方法，纳米细胞分离技术的出现有助于解决生物医学中快速获取细胞标本的难题。应用纳米免疫磁珠检测早期肺癌患者循环血液中的肿瘤细胞，可监测肺癌的转移情况。2.六．分子生物学技术在临床检测应用中的问题
疾病的发生是由于人体受内外因素的影响，导致机体细胞、组织或器官功能紊乱，归根到底是核酸、蛋白等分子水平表达异常，由此可见，利用分子生物学技术进行临床检测是协助临床诊断和治疗的必不可少的工具。但由于分子生物学技术不仅对临床样品的处理有较高要求，而且对检测人员的技术水平也有要求，这就涉及到从标本收集、处理、检测和分析等多个环节的系统化和规范化，为此，我国已制定了临床实验室定量测定室内质量控制指南。
利用分子生物学技术进行临床监测，在某些情况下可能存在一定困难，例如与核酸相比，蛋白和多肽作为生物标志的一个优势是它们能够很容易的在血液、尿液和其他生物体液中找到。这些类型的样品很容易获得，并代表了含有丰富的具有潜在信息的生物学信息分子。但从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比核酸技术相对要复杂和困难，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于丰度低但功能重要的蛋白质很难进行大规模的研究。miRNA虽然是新兴的研究领域，但它们与疾病的相关性日益受到人们的重视，相信随着基础研究对miRNA不断深入的认识，miRNA必将成为临床检测中的手段之一。七．参考文献
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第五篇：无创性动脉硬化检查在健康体检中的应用
无创性动脉硬化检查在健康体检中的应用
【摘要】 目的 探究无创性动脉硬化检查在健康人群普查中的应用价值。方法 3949例体检客户为样本进行无创性动脉硬化检测及分析，应用欧姆龙科林动脉硬化诊断仪，观察检测结果。结果 应用欧姆龙科动脉硬化诊断仪检测后，≥70岁人群无创臂踝脉搏波传导速度（baPWV）值最高，21～29岁baPWV值最低，且随着年龄升高，baPWV值上升，异常检出率明显增加，差异有统计学意义（P
有≥1处阻塞左侧22例，右侧22例。结论 在健康人群体检中，应用动脉硬化检测技术效果显著，可以检测出健康人群是否患有动脉粥样化，预测心脑血管疾病，值得临床上广泛推广应用。
【关键词】 无创性动脉硬化检查；健康体检；应用效果
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.11.049
由于现代人生活水平在不断提高，高脂肪、高蛋白食物摄入量增加，不健康饮食习惯加上缺少运动锻炼导致很多人患上高血压、高血脂、脂肪肝等危害人体健康的疾病。为了进一步了解证明无创性动脉硬化检查在健康体检中的应用效果[1-3]，本院采用无创性动脉硬化诊断仪对健康体检人群进行检查，并取得良好的效果，现报告如下。资料与方法
1.1 一般资料 选取2016年1～12月本院健康体检中心3949例健康体检客户作为研究对象，其中男2217例，女1732例，年龄21～85岁，平均年龄（48.7±12.7）岁。每位研究对象病史以及症状表现均由诊断医师确认，其无用药治疗的疾病以及可以导致动脉粥样硬化的相关疾病，均无明显的心血管疾病以及肾脏功能不全等疾病，无吸烟史。
1.2 检测方法 采用日本欧姆龙科林动脉硬化诊断仪，对体检人群进行检测。利用baPWV以及踝臂血压指数（ABI）检测：嘱检测者取仰卧位，将压力感受器分别放置于左右两侧上臂肱动脉、脚踝动脉最明显的地方，记录测定结果。并用酶促法检测当天空腹血脂、血糖、血尿、肌酐等生化指标。
1.3 观察指标 观察所有对象当天的血脂、血糖、血压等指标，无创性动脉硬化检查结果。无创动脉硬化检查过程中，要求患者至少静息5 min，随后仰卧，将心电图电极放置在双手手腕部位，监测其心音，随后将箍带裹在患者的双臂和双踝，准确记录脉搏容积波形及血压值。其中baPWV为血管硬度，可作为动脉弹性及硬度的反应指标，可判断心脑血管疾病相关动脉壁硬化程度。
1.4 检测标准 ABI值依据2005年《美国心脏协会外周动脉阻塞性病变管理指南》作为检测标准[1]。疑似血管钙化ABI>1.3；正常：ABI 0.9～1.3；有可能动脉阻塞
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