第一篇：elisa酶联免疫吸附实验报告
e ｌis ａ酶联免疫吸附实验报告
得目验实.一ﻫﻫ酶联免疫吸附测定(enzyme—linｋed immunｏsorbeｎt assay 简称 EＬISA)就是在免疫酶技术(iｍmunoenzymatiｃ ｔechniｑuｅs)得基础上发展起来得一种新型得免疫测定技术，ＥLＩＳA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原）,生成抗原（抗体)-－待测抗体(抗原）-－酶标记抗体得复合物,再与该酶得底物反应生成有色产物。借助分光光度计得光吸收计算抗体（抗原）得量。待测抗体(抗原)得定量与有色产生成正比。
理原验实.二ﻫ用于免疫酶技术得酶有很多，如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶,6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ＥＬIＳA 法得酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化得就是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中得氧化作用使颜色加深,无法准确地定量.辣根过氧化物酶（HＲP）就是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素（protoｎｈeｍiｎ）区作辅基。酶得浓度与纯度常以辅基得含量表示。氯化血红素辅基得最大吸收峰就是 40３ｎm，HRP 酶蛋白得最大吸收峰就是 27５nm，所以酶得浓度与纯度计算式就是（已知 HＲP 得 A（１cm 4０3nm 1%)＝２5，式中 1%
指ＨRP 百分浓度为 100mｌ含酶蛋白 1g，即 10mg/ｍｌ,所以,酶浓度以 mg/mｌ 计算就是ＨRP 得 A(１cm 403ｎm mｇ／ｍl=2、5)ＨRP 纯度（ＲＺ)=A403nm／A275nm 纯度 RZ（Reiｎheｉt Ｚahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRＰ得 RＺ值在３、0 左右,最高可达 3、4.用于ＥLISA 检测得 HRP 得 RZ 值要求在３、０以上.):条三有理原本基得 ASILＥﻫﻫ1（就能可，面表体载相固于附吸地性理物以能体抗或原抗ﻫ是蛋白与聚苯乙烯表面间得疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;(2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学与酶学活性;)3(酶ﻫ结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物得颜色反应来判定就是否有免疫反应得存在,而且颜色反应得深浅就是与标本中相应抗原或抗体得量成正比例得,因此,可以按底物显色得程度显示试验结果。
ELＩSA 法就是免疫诊断中得一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起得传染病、寄生虫病及非传染病等方面得免疫诊断。也已应用于大分子抗原与小分子抗原得定量测定,根据已经使用得结果，认为 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点.不仅适用于临床标本得检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中得循环抗原，所以也就是一种早期诊断得良好方法。因此 EＬＩSＡ法在生物医学各领域得应用范围日益扩大,可概括四个方面：
1、免疫酶染色各种细胞内成份得定位。
2、研究抗酶抗体得合成。
3、显现微量得免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
ﻫ
基本方法一 用于检测未知抗原得双抗体夹心法:、1
液冲缓被包盐酸碳牰、9HP Ｍ５0、0 用：被包ﻫ将抗体稀释至蛋白质含量为１~10μg/ｍl。在每个聚苯乙烯板得反应孔中加 0、1ｍl，4℃过夜。次日,弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗３次，每次 3 分钟。（简称洗涤,下同)。
2、加样:加一定稀释得待检样品０、1ml 于上述已包被之反应孔中,置３７℃孵育１小时.然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔）．、３
体抗标酶得释稀鲜新入加,中孔应反各于:体抗标酶加ﻫ（经滴定后得稀释度）0、1ml。37℃孵育 0、5～1 小时，洗涤。
４、加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制得 TMB 底物溶液 0、1mｌ,37℃１0～３0 分钟。、5
ﻫ终止反应:于各反应孔中加入 2Ｍ硫酸 0、０5ml。
6、结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色得深浅,以“＋”、“—”号表示。也可测 O•D 值:在 ELISA 检测仪上,于４５0nm（若以 ABTS 显色，则 410nｍ)处,以空白对照孔调零后测各孔 O•D 值，若大于规定得阴性对照 OD 值得２、1 倍，即为阳性。
ﻫ基本方法二 用于检测未知抗体得间接法:、0 加孔每，ｌm／ｇμ０１～1 至释稀原抗知已将液冲缓被包用ﻫ１mｌ，4℃过夜。次日洗涤３次.↓做时同(。涤洗，时小 1 育孵℃７3 置,中孔应反之被包已述上于 lm1、0)体抗知未(品样检待得释稀定一加ﻫ
空白、阴性及阳性孔对照）
↓ﻫ于反应孔中，加入新鲜稀释得酶标第二抗体（抗抗体)０、1mｌ,37℃孵育 30—60 分钟,洗涤,最后一遍用 DDW洗涤。
↓ﻫ其余步骤同“双抗体夹心法”得 4、５、６。(物底与酶）二ﻫﻫ酶结合物就是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结得产物。就是 ELIＳＡ成败得关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异得免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同得酶选用不同得底物．技疫免ﻫ术常用得酶及其底物
酶 底物 显色反应 测定波长 *２94 色红橘 胺二苯邻 酶物化氧过根辣ﻫ四甲替联苯胺 黄色 ４６0＊* ９4４ 色棕 酸杨水基氨ﻫ邻联苯甲胺 兰色 425 2，2＇—连胺基—２(３-乙基-并噻唑啉磺酸—6）铵盐 蓝绿色 64２Ｐ（盐酸磷酚基硝－4 酶酯酸磷性碱ﻫNＰ)黄色 400 萘酚—AＳ—Mx 磷酸盐+重氮盐 红色 5００+糖萄葡ﻫ024,504 色黄 糖萄葡+ＰRH+STBＡ 酶化氧糖萄葡ﻫ甲硫酚嗪+噻唑兰 深蓝色 0５４，06３ 光荧)ＧｕM4（苷糖乳半基酮伞基甲 酶苷糖乳半-Ｄ—βﻫ
硝基酚半乳糖苷(ONＰG)黄色 420
ﻫ＊ 终止剂为 2mｏl/L H2ＳＯ４ **。剂止终得同不有物底得同不 ,酸檬柠 L/loｍ 2 为剂止终ﻫ可催化下列反应：
ＨRＰ+Ｈ2O2→复合物 复合物+ＡH２→过氧化物酶+H2Ｏ+Ａ AH2-—为无色底物, 供氢体;A—— 为有色产物。(ﻫ 法方种四得用常ＡSILE)三ﻫﻫ1．直接法测定抗原 ；面表体载在附吸原抗将ﻫ加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物。量原抗＝量解降得物底.物底加ﻫ 2。间接法测定抗体 ；面表体载相固于附吸原抗将ﻫ加抗体，形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体;ﻫ。量体抗=量解降得物底定测.物底加ﻫ3。双抗体夹心法测定抗原合复体抗-原抗成形,原抗加ﻫ;面表相固于附吸体抗得得获物动种一第疫免原抗将ﻫ物;;物合复体抗原抗体抗成形,体抗得得获物动种二第疫免原抗加ﻫ加酶标抗抗体(第二种动物抗体得抗体）。量原抗=量解降得物底。物底加ﻫ、4;面表体载相固在附吸体抗将ﻫ原抗定测法争竞ﻫ)1（）;原抗标酶入加ﻫ３（,)2(抗测待与原抗标酶入加ﻫ
原;ﻫ。量原抗知未=差得量解降物底孔品样与孔照对。物底加ﻫ三。仪器与材料 ﻫ1、聚苯乙烯微量细胞培养板（平板，40, 9６孔).、2 仪测检疫免联酶ﻫ、3兔抗羊酶物化氧过根辣ﻫIｇＧ，工作稀释度 1:１０00。
4、包被液::0、05mol／L pH９、6 碳酸缓冲液，4℃，保存, Ｎa２CO3 0、１5 克，ＮａHＣO3 0、２93克,蒸馏水稀释至 100 ml。
5、稀释液:０、0１ｍｏl／ＬpH7、4 PＢS--Tween-－20，4℃，保存、NaCｌ 8g，ＫＨ2PO4 0、2ｇ，Ｎa2HPO4、1２H2O 2、９g，Twｅen—２0,0、５mｌ、蒸馏水加至 1000ｍｌ。、6同:液涤洗ﻫ稀释液 7、封闭液:０、５%鸡卵清蛋白,pH7、4 PBS。
8、邻苯二胺溶液（底物):临用前配制 ０、1Ｍ 柠檬酸（2、1ｇ／100ml), ６、1ml 0、２M Na2HＰＯ４、１２H2O(7、163g／１00ml)6、4mｌ, 蒸馏水 12、５ml, 邻苯二胺１0mg, 溶解后, 临用前加 30%H２O２ ４0 微升。
9、终止液:2ｍol/ＬH2SO4。
骤步作操、四ﻫﻫ1、包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释，一般为 1～1０微克/孔，每孔加２00 微升，3７℃温育 1 小时
后，4℃冰箱放置１６～18 小时。、2将后最,次三复反,钟分三放静，液涤洗满加，体液中孔板尽倒:涤洗ﻫ反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。、3.时小一置放℃73，升微 002 液闭封加ﻫ４、洗涤同 2.、5℃73．照对液释稀作时同。升微 002 孔每,，释稀种几作清血检被将液释稀用:清血检被加ﻫ放置 2 小时。、６。2 同涤洗ﻫ、7。时小 1 ℃７３置放 ,升微 00２孔每，GgＩ兔抗羊酶物化氧过根辣加ﻫ、８.2 同涤洗ﻫ、9。钟分 51－-01 处暗温室,ｌm0０2 加液溶胺二苯邻:物底加ﻫ10、加终止液:每孔 50 微升。、１1.数读 mn09４录记仪测检疫免联酶用：果结察观ﻫ
第二篇：乙肝表面抗原ELISA检测程序
乙型肝炎病毒表面抗原ELISA法检测程序
1检验目的及原理
1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验
用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。
本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。方法性能参数
2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：
样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。(2)特异性：
使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。
标本
3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
3.4严重脂血、严重溶血原则上不会影响检测结果，但洗涤一定要彻底、干净。检测系统
4.1 组成
乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心ELISA试验试剂盒(英科新创科技有限公司)主要组成成份：包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、HBsAg样品稀释液（含BSA缓冲液）、浓缩PBS-T缓冲液、底物A（含H2O2）、底物B（含TMB）、终止液（含2 M H2SO4）、封板膜，自封袋。
试剂信息：以上构成仅对英科新创（厦门）科技有限公司的试剂盒有效，批准文号（国药准字S10910148），试剂储存于2-8℃避光保存，有效期六个月。4.2 试剂配制
（1）PBS-T缓冲液：取浓缩PBS-T缓冲液若干，以蒸馏水或去离子水按照20倍稀释成应用液。
试剂保存：室温。4.3主要仪器
Tecan Sunrise酶标仪、汇松PW-960酶标洗板机、20～200 ul可调式微量移液器、25～56℃可调式气浴恒温振荡器。校准
可调式微量移液器由武汉市技监局校准完成，酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责每年一次技术校准。检验程序
6.1 操作步骤
6.1.1、平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。
6.1.2、编号：取所需要数量微孔固定于支架，按序编号。6.1.3、稀释：每孔加入20 ul样品稀释液。
6.1.4、加样：分别在相应孔中加入100 ul待测样本血清、阴阳性对照血清或质控血清。6.1.5、温育：置37℃温育60分钟。
6.1.6、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。
6.1.7、加酶：在每一微孔中加入酶标记抗体50 ul。6.1.8、温育：置37℃温育30分钟。
6.1.9、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。
6.1.10、显色：每孔加底物A、底物B各50 ul，轻轻振荡混匀，37℃暗置30分钟。
6.1.11、终止：每孔加入终止液50 ul，混匀。
6.1.12、测定：用酶标仪双波长法450nm/630nm测定每一微孔OD值，记录结果。6.2 结果判断
6.2.1、临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照OD均值×2.1 阴性对照OD均值低于0.05时，以0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。
6.2.2、样品OD值S / CO ≥ 1者，结果阳性
样品OD值S / CO ＜ 1者，结果阴性
6.2.3、如果阴性对照OD均值 >0.1或阳性对照OD均值< 0.4时，则表明不正常的操作或试剂盒已经变质损坏不能使用，需要重新试验，若问题仍然存在，应该立即停止使用该批号产品，并与试剂厂商联系。
6.2.4、注意：
A.通过以上检测阴性的样品，由于方法学以及其他不可控因素影响，不能绝对保证样本中没有低滴度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。
B.过以上检测阳性的样品，应通过人Anti-HBs的中和试验予以确认。如果样品在确证试验中发生中和，则该样品可以视为HBsAg呈阳性，无需进一步检测。质量控制
7.1 室内质量控制
室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ng/ml、2 ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。
7.2室间质量控制：每年参加卫生部、湖北省以及武汉市临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的质量评价。
7.3尽可能排除干扰因素对试验的影响。干扰因素及变异的潜在来源
以下类型的冻融过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，IgM骨髓瘤，怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性，抗-HSV阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性。结果计算及测量不准确度
无结果计算及测量不确定度 生物参考区间
无 患者检验结果可报告区间
阴阳性 警告/危急值
阳性为警告 安全性预警措施
13.1所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，潜藏有传染成分。目前尚没有已知的方法，能够确保人源制品或灭活微生物无传染性。因此，所有取自人源材料必须视为潜在的污染物质。
13.2强烈建议严格按照有关血液滋生病原体的标准对检测系统所使用试剂和人源标本进行处理。对于含有或怀疑含有污染物的制剂材料适用生物安全2级或其他相应的生物安全措施。这些预防措施应包括但不局限于以下内容：
A.处理样本或试剂时，佩戴手套。B.不要用嘴吸液。
C.不要在处理这些材料的区域内吸烟，吃东西，饮水，使用化妆品或戴取隐形眼镜。D.使用杀菌消毒剂，如0.5％次氯酸钠、84或其他相应的消毒剂，对样本或试剂的所有溢出物进行清洁和消毒。
E.按照当地政府规定，对所有样本，试剂和其他潜在传染材料进行去污和处理。13.3安全预防措施：终止液含有较低浓度H2SO4,对皮肤、眼睛有损伤。如果溶液不慎接触眼睛，立即用清水冲洗。如果刺激依然存在，则请求医护人员帮助。临床意义
乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科。完整的病毒称为Dane颗粒，直径42 nm，球形，其外层包膜即HBsAg，由病毒S基因编码，是病毒衣壳蛋白，包括S、前S1和前S2蛋白；HBsAg是病毒感染的主要标志。除Dane颗粒外，感染者血液中还存在16 – 25 nm的球状和杆状体，是病毒组装过剩的HBsAg。
由于病毒变异和感染者机体免疫状态的差异，少数血清HBsAg阴性者，也可检出HBV DNA。
第三篇：ELISA原理及步骤(附教学视频)
ELISA的操作步骤
教学视频：http://v.youku.com/v_show/id_XMjI1MjUwNTk2.html
方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法：
1.包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二：用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30～60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
酶联免疫分析技术(ELISA)
一、酶联免疫分析的基本原理和方法类型
1971年瑞典学者Engva11, 荷兰学者Van Weerman等分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。其基本原理与RIA相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。
ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。
1.间接法
此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。见下图：
操作步骤：
①用已知抗原包被固相载体； ②加待检标本，经过温育(37℃2h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；
③加酶标抗抗体．再次温育(37℃2h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；
④加底物显色。终止反应后，目测定性．或用酶标仪测光密度值定量测定。
2． 双抗体夹心法
此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体．加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。见下图：
操作步骤： ① 用已知特异性抗体包被固相载体； ② 加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质； ③ 加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体； ④ 加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。
此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。
3． 竟争法
此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。
以测定抗原为例．将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。见下图：
操作步骤：
① 用已知特异性抗体包被固相载体； ② 测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原．与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分； ③ 加底物显色。
对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物显色反应较弱。分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值之比．计算标本中待测抗原含量。
二、ELlSA方法的技术要点
1． 固相载体和免疫吸附剂的制备
ELISA法最常用的固相载体是聚苯乙烯，其对蛋白质有较强的物理吸附性能，不影响抗体和抗原的免疫活性；且价格低廉，并可制成各种形状的制品。
与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包被时的温度和时间等多种因素的影响。
很多蛋白质、细菌脂多糖、脂蛋白、糖脂及变性的DNA等均易吸附在聚苯乙烯表面。用于包被的蛋白质浓度一般为1-10μg／m1，每个凹孔内加100—200μl。包被液的蛋白量过大，可能会造成蛋白质分子的多层化．在洗涤时一部分蛋白分子容易被洗掉。包被用抗原或抗体的最适工作浓度，最好是预先经过选择。
用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少量未饱和的吸附位点。其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地被非特异吸附，导致本底偏高。为此．常用1％—5％BSA，或含5％—20％小牛血清的pH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37℃作用1h，可以消除此种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。2． 抗原和抗体
如同免疫荧光技术和放射免疫测定一样，用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹心法，测定时可以将待检标本和酶标抗体同时加入，简化了操作程序。通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为满意。
3、常用的酶及其底物
在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。常用酶及其底物见表下：
第四篇：标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响
标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响
在临床检测中，常常遇到溶血的标本。溶血对ELISA检测乙肝表面抗原（HBsAg）究竟是否有影响，各文献报道很不一致，本文对标本溶血的原因及其对ELISA检测乙肝表面抗原的影响进行简要的讨论。1 标本溶血的原因
溶血是临床检验中最常见的一种干扰和影响因素。溶血可分为体内溶血和体外溶血［1］。体内溶血可由物理因素（如人工心脏瓣膜或大血管手术后）、化学因素（如恶性疟）和药物毒性反应等因素引起。体外溶血可由物理因素（抽血时负压过大、水浴温度过高、冰冻、振荡等机械性破坏）、化学因素（血样接触表面活性剂）和代谢因素（如遗传病引起红细胞脆性增加）引起。
在临床上常见的引起标本溶血的原因包括 ［2］ :由于病人严重脱水、低血容量休克等原因导致穿刺困难造成的溶血;由于抽血器具质量不合格如真空管负压不够或塑料试管质量较差导致的溶血;用干燥管采血为了尽快分离血清用竹签搅拌不当引起的溶血等。2 标本溶血对乙肝表面抗原检测的影响
一些研究没有发现标本溶血对HBsAg检测的影响。李穗芬 ［3］ 对20例HBsAg阴性和10例HBsAg阳性病人的溶血和非溶血标本包括10例OD值在临界值附近的标本进行了对照，结果非溶血和溶血标本的阴、阳性结果完全一致。20例HBsAg阴性和10例OD值在临界值附近的样本，溶血与对应非溶血标本OD值间差异没有显著性;10例HBsAg阳性样品，溶血标本OD值明显大于对应非溶血标本OD值。因此得出结论，标本溶血不影响HBsAg结果的判定，只是使HBsAg阳性标本的OD值提高。许斌等［4］ 对HBˉsAg强阳性样品的非溶血与溶血（Hb浓度为241g/L）标本的A值作了对照后未发现两者有统计学差异，得出结论:溶血对HBsAg的检测没有影响（严格意义上应表述为:溶血对HBsAg强阳性标本的检测没有影响）。单桂秋等［5］ 的研究也显示，HBsAg阳性样品的非溶血与溶血标本的A值间经t检验差异无显著性。
其他的一些研究则发现，溶血对HBsAg的检测有影响。钱厚明等 ［6］发现，在17例溶血标本中，初检的5例HBsAg阳性标本，经重新抽血复检后有2例仍为阳性，另3例转阴。认为是溶血导致了假阳性的出现。刘玉振等 ［7］ 研究发现，溶血对HBsAg的检测有影响，当红细胞浓度>25%造成的溶血可导致假阳性。龙宪和等［8］ 研究发现，无论在健康人还是乙肝病毒感染者中，溶血均导致了ELISA一步法检测HBsAg假阳性结果的出现，而采用二步法则可以保证结果判读无误。标本溶血对乙肝表面抗原检测影响的可能机制
溶血是由于各种原因造成红细胞破坏，胞内血红蛋白（Hb）等物质和细胞内液进入血清。溶血对ELISA的影响主要是反应孔对溶血血清中Hb的非特异性吸附和溶血时细胞内液对血清的稀释作用。单桂秋等［5］ 的实验也证明了溶 血对血清具有稀释作用。
在ELISA试验中，酶标反应板孔包被物的浓度是一个相对定值，抗原抗体反应存在最适比例和后带现象，因此，HBsAg浓度与A值只是在一定的范围内呈一定的线性关系;当HBsAg达到一定浓度时A值的变化进入平台期;当HBsAg浓度太高时，A值反而会降低。因此，溶血可以使HBsAg浓度很高的样品的A值升高（在一定程度上解决了后带现象）;当HBsAg浓度与A值呈线性关系时才会因溶血的稀释作用使A值下降;当HBsAg浓度近临界值时，可能造成假阴性。
Hb具有类过氧化物酶活性，其作用与辣根过氧化物酶类似，如果反应孔非特异吸附Hb而残留，则可催化底物显色，使本底A值升高甚至造成假阳性。如果洗涤质量好，则可能大大减少或排除非特异性吸附的干扰。单桂秋等［5］ 的实验未体现血中Hb非特异性吸附的影响。龙宪和等 ［8］ 采用二步法操作可以排除溶血释出的Hb对HBsAg检测的影响也说明洗板质量在ELISA检测中的重要性。
总之，溶血对ELISA检测HBsAg有一定的影响，影响的性质及其大小因所使用的试剂、测定方法、标本HBsAg的有无及浓度高低、洗板的质量好坏而异。参考文献 靳敏.溶血对临床生化检验影响的探讨.广西医学，2002，24（9）:1363-1364.2 张小洁，刘建芝.真空采血标本溶血原因分析及预防措施.护士进修杂志，2001，16（3）:180.3 李穗芬.标本溶血对乙肝表面抗原检测的影响.广州医药，2001，32（5）:65.4 许斌，朱虎定.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨.临床检验杂志，2000，18（4）:232.5 单桂秋，苏建婷.溶血及脂浊样品对ELISA检测乙肝表面抗原的影响.临床检验杂志，1999，17（2）:102-103.6 钱厚明，赵江燕，张燕.应重视ELISA检测HBsAg灰区范围内样品的复检.上海医学检验杂志，2002，17（3）:156.7 刘玉振，张淑琴，马宏伟.溶血对抗-HCV、HBsAg等测定结果的影响.中国输血杂志，1999，12（1）:32-33.8 龙宪和，童华诚.溶血对乙型肝炎五项血清标志物检测结果的影响.中华医学检验杂志，1996，19（1）:47-48.作者单位:430061武警湖北总队医院检验科
第五篇：实验报告
实验报告
固体碱催化剂KF/CaO-MgO-Fe3O4的制备与表征
摘要：采用在制备复合物CaO—MgO的过程中加入一定量磁性基质Fe3O4来制备磁性复合物CaO—MgO—Fe3O4，再以等体积浸渍法负载KF，制备了负载型磁性固体碱催化剂KF／CaO—MgO—Fe3O4，并将其用于催化菜籽油与甲醇酯交换反应制备生物柴油。重点考察催化剂制备条件对酯交换反应的影响。实验结果表明,在m(CaO)：m(MgO)=9:
1、KF负载量为载体质量的20％和500℃焙烧2h制备的催化剂具有较好的催化活性，酯化率达98.4％。磁性催化剂具有多孔结构，孔径在100nm左右，催化剂粒径(30—50)nm，是负载型磁性纳米固体碱催化剂。
关键词：磁性纳米固体碱；生物柴油；复合氧化物催化剂；磁性纳米复合氧化物催化剂
1.时代背景
生物柴油是一种典型的“绿色能源”，它是以植物油、动物油、餐饮废油等为原料制成的液体燃料，是一种清洁的可再生能源，是优质的石油替代品。大力发展生物柴油，对经济可持续发展，推进能源利用，控制城市空气污染，减轻环境压力具有十分重要的战略意义。
能源是经济社会发展的重要动力，面对全球经济的迅速发展，人类对能源的需求日益增长，中国能源消耗每年以超过10%的速度增长。长期以来，石化燃料一直是人类消费的主要能源。石化能源不可再生，按照目前已探明的世界石油储量和开采速度，全球石油的平稳供应只能维持40.6年。世界石油资源的日益枯竭和世界经济高速发展对石油资源的需求急速膨胀，使得原油的价格日益飚升，厄瓜多尔石油部长预计09年全球原油均价为55一60美元/桶(中金在线，2009)，2009年原油均价或至75美元/桶(中证网，2008)。中国社会科学院2008年4月7日发布的《中国能源发展报告(2008)》蓝皮书中预计，2007一2020年间，中国石油消费仍将保持较高的增长速度，其中2010年和2020年中国石油消费量将达4.07亿吨和5.63亿吨，分别比2006年提高17.42%和62.47%。报告预计，2007年至2010年石油需求年均增长率为4.5%，2010至2020年石油需求年均增长率为3.3%。其中柴油比重将继续提高，由2006年的34%提高到2007年的36%;汽油所占比重将减少;煤油比重保持在3%至4%之间(中证网，2008)。近年来，中国石油消费逐年递增，GDP和石油消费关联度提高、交通运输业迅速发展、企业拥有量快速增加等因素共同推动着中国的石油消费。根据中国石油和化学工业协会的统计，2008年我国原油表观消费量为3.65亿吨，其中进口原油1.79亿吨，对外依存度达到49%。随着农用柴油机械的发展，我国柴油市场的供需矛盾将不断突出，预计到2010年，我国柴油的需求量将超过1.5亿吨。同时，世界柴油需求量占燃料油总量的比例将会继续上升，全球柴油供应量不足的矛盾将不断激化，因此世界各国都把目光放到了石油替代能源—生物柴油的开发与应用上面。生物柴油是一种清洁的绿色能源。生物柴油和常规柴油的性能比较见表1(孙纯和刘金迪，2006)。与普通柴油相比，生物柴油具有诸多优良的环保性能。使用生物柴油燃料，可降低90%的空气毒性，降低94%的患癌率。由于生物柴油的含氧量高达10%，因此燃烧较为充分，排烟少，废气中只有少量一氧化碳和氮氧化合物，没有苯并芘及二恶英等。排放的CO与矿物柴油相比减少约48%，有催化剂时减少约95%，排放的CO2比矿物柴油减少约50%，SO2和硫化物的排放可减少30%，有催化剂时可减少70%以上;燃烧后残炭低，废气中微小颗粒物含量低(0.02%);具有良好的低温发动启动性能，无添加剂冷滤点达一20℃;具有较好的润滑性能，降低了喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率，使用寿命更长;具有较好的安全性能，生物柴油闪点大于100℃，高于矿物柴油，在运输、储存、使用方面十分安全;具有良好的燃烧性能，其十六烷值超过50，燃烧性能优于矿物柴油，燃烧后残留物呈微酸性，可延长催化剂和发动机的使用寿命;生物柴油的生物降解率高(3星期后降解率:生物柴油98%，矿物柴油70%);具有可再生性能，与矿物柴油不同，其原料来源为各种植物油或动物油，原料供应源源不断;无须改动柴油机，即可直接添加使用生物柴油，并且无需另外添设加油设备、储存设备及人员的特殊技能培训;生物柴油以一定比例与石化柴油调和使用，可降低油耗、提高动力，且能减少尾气污染，改善环境质量(邢英和郡怡佳，2006;张良波，2008)。
2001年美国环保署颁布的生物柴油测试报告表明，与石油柴油相比，使用B20(20%生物柴油与80%柴油的混合物)的柴油混合燃料，可以使尾气中的生物柴油催化剂—磁性纳米固体碱的制备及应用烟尘含量降低10.1%，低碳烃降低21.1%，一氧化碳降低11.0%;若使用未掺杂的生物柴油，则可以使致癌物质多环芳烃减少80一90%，一氧化碳减少48%，二氧化硫减少30%一50%，烟度降低75%。生物柴油尾气排放符合欧Ⅲ标准。
国外生物柴油发展现状：能源危机和环境污染等问题的持续存在，越来越呼唤清洁能源的诞生。经科学家数十年的艰辛努力，新型替代能源—生物柴油得到了迅速发展，并己开始规模化使用。近年来，美国和欧盟纷纷制定优惠政策，鼓励本国企业大力发展生物柴油产业，支持农民种植油料作物，并提供高额的财政补贴，对生物柴油给予税收优惠，以提高生物柴油的市场竞争力，其发展势头十分强劲。
美国历来都相当重视能源战略，积极发展可替代能源是美国能源战略中的重要组成部分，作为一种新型替代能源，生物柴油在美国已经发展了相当长的时间。自20世纪90年代初，美国就开始将生物柴油投入商业应用，目前生物柴油己成为该国增长最快的新能源产品。1992年美国制定的能源政策措施中计划，到2010年，非石油的替代燃料要占到进口石油燃料总量的10%。2002年，美国材料试验学会(ASTM)通过了生物柴油标准。
2006年，美国生物柴油产量达2.5亿加仑，并计划于2012年使美国的生物柴油消费量增加到4.62亿升。截至2006年9月，美国共有81家生物柴油厂，另外还有82个项目正在投建或扩建当中。为了进一步鼓励使用生物柴油，美国农业部决定今后两年每年拿出1.5亿美元用以补贴生物柴油等生物燃料的使用。2006年，欧盟生物柴油产能超过600万吨，产量达到420万吨。2007一2010年间，欧盟生物柴油产量将维持33.9%的年增长幅度，并计划在2010年将生物
柴油占欧盟交通能源使用量的比例提高到5.8%，2020年提高到10%。为了增加生物柴油在燃料消费市场的需求量，欧盟于2008年1月提出了相应的议案，要求到2010年欧盟国家生物柴油消费量达到燃料消费市场的10%;另一项强制性目标要求欧盟国家到2012年生物柴油消耗量必须达到燃料总消耗量的6.5%，从而确保实施欧盟生物柴油的长期发展计划，实现环境的可持续性发展。欧盟制定了多项优惠政策鼓励开发和使用生物柴油，如免征生物柴油增值税，并规定机动车使用生物燃料占动力燃料总额的最低比例。德国、法国、意大利、奥地利、比利时、丹麦、匈牙利、爱尔兰、西班牙等国也纷纷开始研究和发展生物柴油，并制定了各自的发展战略，在生物柴油研究开发和产业化方面取得了相当的进展。
德国是目前全球最大的生物柴油生产国，主要采用纯态生物柴油(B100)作为车用燃料，实施免征燃油税政策(邢英和都怡佳，2006)。德国政府大力提倡使用生物柴油，对德国的生物柴油生产企业全额免除税收，使得生物柴油的价格低于普通柴油。2004年德国已有 1800个加油站供应生物柴油，并已颁布了德国生物柴油标准(DIN V51606)。法国对生物柴油的税率也为零，市场上
使用BS生物柴油，在排放控制严格的地区，使用B30生物柴油作为公共交通燃料。在欧洲，意大利是生物柴油使用最广泛的国家，基本上使用纯态生物柴油作为车用燃料，主要用于柴油车辆和农业机械方面。意大利对生物柴油的税率也为零，在国内已普及使用，使用标准是BS。在奥地利，生物柴油的税率为石化柴油的4.6%，目前有3个生物柴油生产厂，总生产能力超过14万吨/年。
葡萄牙的生物柴油生产主要使用菜籽油、大豆油和棕搁油，目前约有6家工厂，生产能力超过30万吨/年。近年来，西班牙也开始大力发展生物柴油产业，目前在建和己建设完成的生物柴油企业约10家，产能约40一60万吨/年，所有这些生物柴油项目建成后，西班牙有望挤入欧洲生物柴油生产四强。芬兰富腾能源公司在芬兰南部城市波尔沃兴建了1家生物柴油厂，于2007年夏季完工并投产，产量约为17万吨/年。拉脱维亚Bio一Venia公司也计划在波罗的海沿岸的文茨皮尔斯建造该国首座大型生物柴油总厂，产量约10万吨/年(段炼，2009)。近年来，阿根廷生物柴油出口量巨大。根据阿根廷农业部的统计资料显示，2007年阿根廷生物柴油出口量达31.9万吨的，其中76%出口给美国，23.7%出口给欧洲;2008年，阿根廷生物柴油产量突破150万吨，生物柴油协会预计，到2010年生物柴油产量将达到220万吨。目前阿根廷约有生物柴油生产厂8家，产能约60万吨/年。阿根廷政府鼓励企业投建生物柴油厂，为生物柴油企业提供优惠的税收措施，希望到2010年可以开始使用5%生物柴油。
在世界市场上，马来西亚逐步上升为生物柴油的主要出口国(段炼，2009)。马来西亚的生物柴油工业兴起于2006年，2006年7月，GoldenHope成立了第一个产能3万吨/年的工厂，2007年上半年，与马来西亚棕榈油委员会(MPOB)又合作兴建了第二个6万吨/年的的分厂。据市场统计，2007一2008年，已经投入运营的生物柴油工厂约12一巧家。到2007年底，这些工厂生产量达到约60一70万吨，到2008年中期约有200一2400万吨。在马来西亚生产的燃料作为Enffue(环境友好型燃料)的品牌被出口到世界各国，如美国、欧盟以及亚太国家。日本从1995年开始研究生物柴油，1999年建立了以煎炸油为原料日产259吨的生物柴油工业化生产实验装置，2003年生物柴油年产量达40万吨，并实施了生物能源“阳光计划”(全球品牌网，2009)。此外，印度有“绿色能源工程计划”(全球品牌网，2009)。加拿大惊呼本国生物能源行业落后于美欧和日本，大力调整政策迎头赶上;目前，瑞士正准备种植10万公顷生物柴油植物，借此解决每年50%左右的石油需求量;南美的巴西、阿根廷、哥伦比亚和亚洲的韩国以及俄罗斯等国也正积极发展生物柴油。
国内生物柴油发展现状：与国外相比，我国生物柴油的研发起步较晚，但发展迅速。目前我国生物柴油各方面的研究都取得了阶段性成果，一部分科研成果已达到国际先进水平，研究内容包括油脂植物的分布、筛选、培育、遗传改良及其加工工艺和设备。海南正和生物能源公司、湖南天源清洁燃料有限公司、四川古杉油脂化工公司和福建卓越新能源发展公司都己开发出拥有自主知识产权的生物柴油生产技术，并相继建成规模超过万吨的生物柴油生产厂，这标志着生物柴油产业在中国大地的蓬勃发展(武彤等，2008)。
我国对可再生能源生产企业也逐渐采取各种采取优惠措施，如减半征收增值税。随着《可再生能源法》的颁布，国家对可再生能源生产的政策也逐步确立，并出台了其他一系列配套细则，如2006年1月国家发改委颁布的《可再生能源产业发展指导目录》、《可再生能源发电有关管理规定》等法律;2006年6月财政部出台的《可再生能源发展专项资金管理暂行办法》;国务院常务会议审议并原则通过的《可再生能源中长期发展规划》等。从“十一五”起，国家和地方就开始在资金和财税两个方面大力支持可再生能源生产企业的发展。我国“十一五”纲要提出要发展各种石油替代品，将发展生物基液体燃料确定为国家产业的发展方向。2007年9月4日，国家发展和改革委员会向全社会公布了我国《可再生能源中长期发展规划》，提出到2010年生物柴油年利用量达到20万吨，2020年生物柴油年利用量达到200万吨。
2001一2004年是我国生物柴油企业发展的起始阶段。2003年，四川古杉油脂化学公司在河北邯郸建成了3万吨/年的生物柴油工厂，这是当时我国建成的最大的生物柴油工厂。截至2003年，我国共有5家生物柴油生产工厂，年生产能力约9万吨，年产量达到4一5万吨，主要以餐饮和食品企业回收的废油为生产原料。2004年我国新建生物柴油项目明显增多，当年开工建设的生物柴油项目主要有:河南星火生物工程公司的5万吨/年项目、福建源华能源科技公司的3万吨/年项目、四川古杉集团本部的3万吨/年项目、山东绿诺新能源公司的2万吨/年项目。此外，还有许多小型生物柴油项目开工建设。
从2005年开始，我国生物柴油产业进入高速发展阶段。到2005年底，我国已有8家生物柴油生产厂，年生产能力超过20万吨，较上年增长一倍多。其中，四川古杉油脂化工公司旗下的三个生物柴油工厂合计年生产能力达到7万吨，成为我国最大的生物柴油生产企业;河南星火生物工程公司的生物柴油年产能达到5万吨，位居全国第二位。2005一2006年我国生物柴油产业发展速度超出市场预期，新开工建设的生物柴油项目共有20多个，其中出现了一批年产5万吨以上的大型生物柴油项目。2006年部分大型生物柴油项目陆续竣工投产，使得我国生物柴油产能迅速增加。国家粮油信息中心统计数据显示，到2006年底，我国已有25家生物柴油生产企业，年生产能力达到120万吨，是2005 年的6倍。2006年我国建成投产的主要生物柴油项目有:安徽国风集团和江苏清江生物能源科技公司年产20万吨的生物柴油项目，这两个企业是目前我国单厂生产规模最大的生物柴油企业;四川古杉集团和山东华鹜集团年产10万吨生物柴油项目;浙江东江能源科技有限公司年产5万吨的生物柴油项目;江苏丹阳河海植物油厂年产4万吨的生物柴油项目;中国生物柴油国际控股有限公司、河南天冠燃料乙醇公司及石家庄金谷生物制品厂年产3万吨的生物柴油项目。
到2006年底，我国生物柴油产能达到300万吨/年，生物柴油产能继续增加，生产企业近50家。其中，江苏碧路生物能源饲料蛋白公司投资建设的年产25万吨生物柴油项目于2007年底建成投产，成为我国最大的生物柴油工厂。2007年我国建成投产的年产5万吨以上的其他大型生物柴油项目主要有:江苏宜兴四海公司巧万吨/年项目;辽宁瑞联科技发展公司、河北富宽油脂集团公司、河南星火生物工程公司、河南天冠燃料乙醇公司上海公司、江苏无锡华宏生物燃料公司、广西柳州明慧生物燃料公司、内蒙古天宏生物能源科技公司及四川古杉集团北京分公司10万吨/年项目;吉林植物油公司和金鹰集团福建莆田公司6万吨/年项目;河北东安实业公司、闻仁德上海环保能源公司及中国生物柴油国际控股有限公司5万吨/年项目。此外，还有许多年产5万吨以下的生物柴油项目建成投产。2007年全国生物柴油产能已达300万吨，但实际产量只有30万吨，增产空间较大。随着我国生物柴油产能快速扩张，生物柴油产量也随之增加。但由于2007年10月份以来国内外食用植物油价格大幅上涨，伴随着废弃油脂的价格也一路攀升，原料竞争加大，生物柴油生产成本提高，导致目前国内已建成的大型生物柴油企业开工率都保持较低水平，国内企业对生物柴油产业的投资热情降低，在一定程度上制约了国内生物柴油产业的发展。2008年新开工建设的生物柴油项目已明显减少，而停建和缓建的生物柴油项目却在不断增加，许多原计划今年扩大产能的企业也大都暂停了改扩建工作。尽管如此，近年我国生物柴油生产能力仍将会继续保持增加的趋势，只是增速开始放缓。2008年国家发改委批准了中石油南充炼油化工总厂6万吨/年、中石化贵州分公司5万吨/年和中海油海南6万吨/年3个小油桐生物柴油产业化示范项目，中国生物柴油的产业化得到逐步推进。四力l古杉、海南正和、福建卓越、重庆华正、北京清研等数十家企业参与生物柴油产业的开发与生产，并取得了一定的成果。到2008年底我生物柴油催化剂—磁性纳米固体碱的制备及应用国生物柴油生产能力至少增加100万吨，达到400多万吨。
近年来，我国相继建成了许多年产量过万吨的生物柴油厂。计划到2010年，我国年生产生物柴油100万吨;到2020年，年产生物柴油将达到900万吨。预计到2010年，我国生物柴油需求量将达2000万吨。面对着巨大的需求缺口，投资我国生物柴油的时机己经出现。
2.磁性纳米固体碱
2.1 磁性纳米固体碱的制备设想：通过一定的方法，将固体碱材料多功能化，即将系列碱土金属氧化物的负载型固体碱催化剂与磁性基质组合制备成系列磁性固体碱催化剂(KF/XO一Fe3O4，X=Mg，Ca，Sr)，赋予固体碱催化剂以磁性，制备出磁性纳米固体碱双功能催化剂，比较该系列催化剂的催化性能，筛选出催化效果较好的催化剂，并研究其在生物柴油制备中的应用。由于氧化钡(BaO)会溶解在甲醇中，并且有毒，因此一般很少研究氧化钡催化制备生物柴油。主要研究内容如下:(l)磁性固体碱催化剂的制备采用等体积浸渍法，研究了催化剂(KF/XO一Fe3O4,X=Mg，Ca，Sr)制备条件的优化(KF/XO的质量比、焙烧温度和焙烧时间)，并采用透射电镜(TEM)、低温从吸附一脱附、X一射线粉末衍射(XRD)、拉曼(Raman)、Hanunett指示剂和振动样品磁强计(VSM)等手段对催化剂进行表征。(2)筛选出催化效率较好的催化剂，进一步研究其在生物柴油制备中的应用，包括优化酯交换反应条件(催化剂用量、醇/油摩尔比、反应温度和反应时间)，催化剂耐酸耐水性能和催化剂回收、重复使用和再生。初步探讨催化反应机理。(3)初步设计生产工艺流程和磁性分离管。2.2 磁性纳米固体催化剂的制备：以共沉淀法、等体积浸渍法和焙烧法制备催化剂。以n(Na2CO3)：，n(NaOH)=3：1的溶液为底液和沉淀剂，称取一定比例的无水CaCl2和MgCl2·6H20，混合加人蒸馏水，搅拌至完全溶解，置于恒压滴液漏斗。400 r/min进行搅拌，控制滴液速率为l滴/s。滴加完毕后，60℃陈化6h，停止搅拌，静置1h，抽滤，洗涤至无杂质离子，马弗炉900℃焙烧4 h，得到钙镁复合氧化物载体。取一定量的载体粉末，以一定比例的KF溶液等体积浸渍，一定温度下焙烧一定时间，即得负载型KF／CaO—MgO固体碱催化剂。
2.3 磁性纳米固体碱的研究结论：采用共沉淀法，以钙和镁氧化物为复合载体，制备负载型纳米固体碱催化剂KF/CaO—MgO，在m(CaO)：m(MgO)=9：
1、KF负载量为载体质量的25％、焙烧温度600℃和焙烧时间3 h的条件下，制备的催化剂催化活性最高，酯化率达到95％以上。因此，磁性固体催化剂制备生物柴油是成功可行的。磁性固体催化剂是一种高效的环境友好催化材料，是在固体催化剂上负载磁性基质，使其不仅具有磁性功能而且具有碱性的催化功能的双重功能。这种催化剂具有较高的催化活性；易与反应体系分离回收，具有可再生能力；对环境友好，对反应设备没有腐蚀。
3.复合氧化物固体碱催化剂的研究
水滑石经煅烧后形成的复合氧化物中二价金属离子和三价金属离子分散均匀，可形成与无水碳酸钠碱强度相当的固体碱；通过调节水滑石中所含双金属离子的种类以及配比可对其碱强度和孔径分布实现有效调节。据报道，以水滑石煅烧制得的复合氧化物作为非均相催化剂可用于催化制备生物柴油，如David G Cantrell等用醇油物质量比为30：1，反应时间为3 h，在60℃下油脂转化率最高为74．8％；Wenlei Xie等。在催化剂用量为油重的7.5％，醇油物质量比为15：l，反应9 h后，油脂转化率为67％；陈和等在230℃，醇油物质量比12：1，催化剂用量为棉籽油油重的2％条件下，反应3 h后甲酯收率达到90％以上；Chawalit N等以Ca—Zn复合氧化物为催化剂，在60℃，101.325 kPa，醇油物质量比30：1，催化剂用量为油重的10％，反应1h后甲酯收率达94％；颜姝丽等将Zn／A1类水滑石的煅烧产物用于菜籽油一甲醇酯交换反应，发现具有较好的催化活性；齐涛等通过调节Zn／Al类水滑石中Zn／Al物质的量比，在200℃，2.5 MPa，醇油物质的量比为42：1，催化剂用量为油重的1.4％条件下用于催化菜籽油甲醇酯交换反应，菜籽油转化率达到80％。以水滑石煅烧制备的复合氧化物作为碱催化剂应用于生物柴油酯交换反应具有较高活性，但较大醇油比和较长反应时间限制了其在工业的应用。在前期研究基础上，通过共沉淀法，合成Zn／Al=4的复合氧化物，考察并优化了该固体催化剂在亚临界条件下催化菜籽油一甲醇酯交换反应的工艺条件以及高FFA和水含量对其催化反应的影响。Zn／A1复合氧化物催化生物柴油酯交换反应（齐涛 鲁厚芳 蒋炜 梁斌；四川大学化工学院）所得结论：1.用共沉淀法合成了Zn／A1为4的LDH，XRD分析表明样品具有较好的单一类水滑石结构。样品于400℃煅烧处理8 h后，对亚临界条件下菜籽油一甲醇的酯交换反应具有较好的催化活性。2.以Zn／A1复合氧化物为催化剂，在反应温度200℃，醇油物质量的比为24：1，搅拌转速为400 r／min，压力为2.5 MPa，催化剂用量为菜籽油油重的1.4％条件下，反应90min，菜籽油转化率可达84.25％。在催化酯交换反应中，该催化剂对FFA和水分具有一定的耐受能力。在FFA含量为油重的6％，水质量分数为10％时，油脂转化率仍在80％以上。
除此之外，下面有两例有关“复合氧化物催化剂”的研究进展。
Ca／Al复合固体碱催化剂用于生物柴油的制备(孙广东 李瑞娇 吴谋成；华中农业大学生物质能研发中心，食品科学技术学院)所得结论: 1.采用菜籽油为原料．自制固体碱催化剂制备生物柴油的试验条件为醇油摩尔比为12：1。催化剂用量为原料油质量的10％。反应时间9h，反应温度65℃，在此条件下收率90％以上。2.由于采用固体催化剂，非均相反应所需时间比传统采用液体酸或碱的时间长．但后处理大大简化．副产物甘油极易分离．避免了环境污染和有用化学品的流失。3.自制固体碱催化剂经过简单的处理后可重复使用。其生物柴油的主要指标达到了相关标准。
固体碱SrO—La203催化大豆油合成生物柴油(淳宏 谢文磊；河南工业大学化学化工学院)的研究：用共沉淀法制备了SrO—La2O3，复合氧化物固体碱催化剂，用于催化大豆油与甲醇的酯交换反应，并考察了催化剂制备方法及制备条件对大豆油转化率的影响。结果表明，采用共沉淀法、以氨水为沉淀剂，催化剂中Sr与La摩尔比1.5：1，催化剂焙烧温度973 K条件下显示出固体碱催化剂的最佳催化活性和稳定性。考察了酯交换反应条件对大豆油转化率的影响，结果表明，在甲醇沸点温度下，醇油摩尔比15：
1、催化剂用量占反应物总量3％、反应时问4 h的最佳条件下，大豆油转化率最高达92.63％。考察了SrO—La203，固体碱催化剂重复使用性能，结果表明，当催化剂重复使用3次后，再用773 K温度活化2h，催化剂活性仍保持90％以上，经5次重复利用后大豆油转化率仍能保持在90％左右。SrO—La203固体碱催化剂用于催化大豆油酯交换反应合成生物柴油，考察了反应条件、催化剂制备方法对大豆油转化率的影响，最后还考察了催化剂的稳定性能、在极性溶剂中活性组分的流失以及失活原因等方面问题。而且还考察了金属锶与镧摩尔比对固体碱催化剂的催化活性有较大影响。锶与镧摩尔比由0增大到2.0时，SrO—La203，固体碱催化大豆油酯交换反应的催化活性呈先增大后减小的趋势。在Sr／La摩尔比为1.5：1时，SrO—La203，催化剂对大豆油的转化率达到最大，为87.42％。原因是在SrO—La203系列固体碱中，金属锶与镧摩尔比较低时，经高温焙烧后形成的活性中心能够裸露在催化剂表面，并且随摩尔比增加有越多的碱性中心形成，催化活性不断增加；但过多增加锶含量，高温煅烧后不但不能完全分解形成的碱性中心，而且聚集在担体的表面和孔道内，堵塞孔道，使催化剂比表面积下降，固体碱催化活性降低。实验结果表明，SrO—La203，固体碱催化剂在催化大豆油与甲醇酯交换反应过程中Sr／La摩尔比选择1.5：1较合适。
综合上述前人的研究，利用复合氧化物固体碱催化剂来制备生物柴油的技术已经相当成熟，但仍存在一些问题。例如，如何保持它的高活性一直不变；如何寻找到最佳的二价金属和三价金属离子来制备复合氧化物固体碱；如何提高复合氧化物固体碱的催化活性及稳定性等等。尽管如此，但我相信随着化工技术的发展，采用此技术来制备生物柴油将不断被完善，形成化工生产规模。
4.固体碱KF/CaO-MgO-Fe3O4的设想
本课题拟通过一定的方法，将固体碱材料多功能化，即将磁性纳米固体碱与复合氧化物固体碱组合制备成KF/CaO-MgO-Fe3O4，赋予固体碱催化剂以磁性﹑稳定性﹑强碱性，制备出磁性纳米复合氧化物固体碱多功能催化剂，比较不同制备条件下催化剂的催化性能，筛选出催化效果较好的催化剂，并研究其在生物柴油制备中的应用。主要研究内容如下:(l)该固体碱催化剂的制备采用沉淀法和等体积浸渍法（本实验由于时间有限而且药品供给齐全，所以直接称取一定量CaO﹑MgO﹑Fe3O4粉末和KF·2H2O晶体进行搅拌混匀，然后高温煅烧），研究了该催化剂制备条件的优化(KF/（CaO-MgO）的质量比、焙烧温度、焙烧时间和后期对氧化钙和氧化镁的质量比)，并采用X一射线粉末衍射(XRD)和Hanunett指示剂等手段对催化剂进行表征。(2)筛选出催化效率较好的催化剂，进一步研究其在生物柴油制备中的应用，包括优化酯交换反应条件(催化剂用量、醇/油摩尔比、反应温度、反应时间和原料油的酸值及水含量)，催化剂耐酸耐水性能和催化剂回收、重复使用和再生。(3)初步探讨催化反应机理。
5.固体碱KF/CaO-MgO-Fe3O4的制备与酯交换反应
称取现成的CaO 9g﹑MgO 1g﹑Fe3O4 0.4g粉末以及一定量KF·2H2O晶体，并加入少许蒸馏水，在烧杯中用玻璃棒进行搅拌混匀，然后转移到坩埚里，再在马弗炉中一定温度下焙烧一段时间，待冷却后用坩埚钳取出，并装袋贴标签，放入干燥器中备用。
由于我们组的实验重点在于固体碱催化剂的制备与研究，因此酯交换反应时，参考文献中理论数据取菜籽油25g﹑无水甲醇 10.5g﹑催化剂 1g和磁石两粒 置于圆底二颈烧瓶，然后放在集热式恒温加热磁力搅拌器中反应三小时（67℃），待反应完全后进行减压过滤，去除混合物中的催化剂；再进行减压蒸馏，去除多余的甲醇，最后将混合液倒入分液漏斗中置于铁架台上进行静置，待分层明显后，从下放出甘油，从上收集粗生物柴油，称量甘油的质量和量取粗生物柴油的体积，并将粗生物柴油密封保存在贴好标签的药瓶里，以待后期气相色谱分析。
6.影响固体碱KF/CaO-MgO-Fe3O4的催化活性的因素分析
6.1 KF的用量
查阅相关文献资料，在催化剂制备过程中，25%KF用量（占载体CaO-MgO质量的百分数）作为理论最佳参考用量，另外我们组为研究不同KF用量对该固体碱催化活性的影响再取两组不同值（20%和30%）作为比较对象来研究。6.2 反应温度和焙烧时间 对于大多数催化反应来说，催化反应温度是一个必须考虑的因素，然而在催化剂制备过程中反应温度仍是一个重要的影响因素。纳米固体碱催化剂KF／CaO—MgO制备生物柴油的研究（李斌，段学友，王运，文利柏，韩鹤友）结果表明，在m(CaO)：m(MgO)=9:
1、KF负载量为载体质量的25％和600℃焙烧3 h制备的催化剂具有较好的催化活性，酯化率达95％以上。因此，我们组把600℃和3h作为最佳反应温度和焙烧时间，然后仍各取两组不同值500℃和700℃，2h和4h作为参照来进行实验探。
气象色谱分析前生物柴油的产率估计
气象色谱分析后生物柴油的实际产率
6.4 CaO﹑MgO质量比
基于实验时间有限，我们组积极听取老师意见，先将CaO﹑MgO质量比定为9:1，然后再综合上面所考虑的因素设计正交试验表进行实验，再根据所得甘油的质量来对产率进行初步估计，竟而选择出比较合适的反应温度﹑KF用量和焙烧时间，再在这三者一定的条件下探讨研究钙镁比对固体碱催化活性的影响，这样既节约时间，又合理可行。根据以上数据，我们选择第七组﹑第九组和理论最佳组所对应的上面三个条件来研究三组不同钙镁比8：2，7：3，9：1对催化活性和产率的影响，从而选出制备固体碱催化剂的最佳反应条件来催化制备生物柴油。7.探讨制备生物柴油的最佳反应参数
查阅相关文献，取理论最佳酯交换反应条件：醇油摩尔比为12:1（菜籽油 25g﹑无水甲醇 10.5g），催化剂用量 1g，反应温度67℃，反应时间3h。确定上述因素后，我们组重点考察了制备三组不同CaO﹑MgO质量比（8:2,7:3,9:1）的固体碱催化剂对酯交换的影响，相关数据如下：
注：理论最佳组中钙镁比为9:1的一组由于产率高于百分之百，故而舍去，经分析有以下可能原因：1.在做气象色谱分析时，水杨酸甲酯或生物柴油的加入量不符合标准；2.这组固体碱是我们组制备的第一组催化剂，由于试验经验不足等问题，在实验操作过程中可能存在一些错误；3.气象色谱分析时操作过程可能出现错误等。
8.结论与后期实验
综合上述实验操作与数据，可以得到以下结论：
(1)经浸渍法制备的磁性纳米固体碱KF/CaO-MgO-Fe3O4催化剂用于菜籽油酯交换反应中，具有较高的催化活性，菜籽油转化率最高达98.4％，最低达62.8％，从此可看出催化剂的制备方式不同对生物柴油产率的影响。
（2）在甲醇沸点温度下，醇油摩尔比12：1（菜籽油25g﹑无水甲醇10.5g），催化剂用量1g，反应时间3h时，固体碱KF/CaO-MgO-Fe3O4在m(CaO)：m(MgO)=9:
1、KF负载量为载体质量的20％、焙烧温度500℃和焙烧时间2h的最佳制备条件下菜籽油转化率可达98.4％。但考虑钙镁比对产率的影响，我们可以初步总结出8:2是一个比较稳定合适的比例，但仍需后期实验考察与分析。
（3）从以上数据可知，根据甘油的质量来进行产率的初步估计时存在巨大偏差，因此我们组根据估计的产率选择适当的固体碱制备条件来探讨钙镁比对产率的影响时没有预测的合理，这也是后期实验必须解决的问题。对于钙镁比的影响，除以上研究过的三组，再可选取实验序号为1﹑3﹑4和9所对应的固体碱制备条件来考察研究。（4）针对理论最佳组，在后期实验中也应重新试验，再综合上述所有数据进行对比判断，从而得出在酯化反应条件一定的情况下，针对固体碱的制备条件不同来选择最佳制备方案的结论。
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