第一篇：《土壤及灌溉水二氯喹啉酸除草剂残留量测定高效液相色谱法》标准项目实验报告
《土壤及灌溉水
二氯喹啉酸除草剂残留量的测定
高效液相色谱法》
标准项目实验报告
《土壤及灌溉水 二氯喹啉酸除草剂残留量的测定 高效液相色谱法》标准项目组
2012 年 5 月
目 录 录
1.前言 .............................................................................................错误!未定义书签。
2.标准的适用范围 .........................................................................错误!未定义书签。
3.原理 .............................................................................................错误!未定义书签。
3.1
测定方法原理.........................................................................错误!未定义书签。
3.2
二极管阵列检测器原理.........................................................错误!未定义书签。
4、试验材料 ..................................................................................错误!未定义书签。
4.1
仪器.........................................................................................错误!未定义书签。
4.2
试剂.........................................................................................错误!未定义书签。
5.试验方法 ...................................................................................错误!未定义书签。
5.1
取样.........................................................................................错误!未定义书签。
5.2
标准溶液的配制及标准曲线的建立.....................................错误!未定义书签。
5.2.1 二氯喹啉酸标准溶液的配制...............................................错误!未定义书签。
5.2.2 标准曲线的建立..................................................................错误!未定义书签。
5.3
提取液的配制.........................................................................错误!未定义书签。
5.4 样品前处理方法......................................................................错误!未定义书签。
5.5
液相色谱条件.........................................................................错误!未定义书签。
5.6
添加回收率试验.....................................................................错误!未定义书签。
5.7
结果计算与表述.....................................................................错误!未定义书签。
6.结果与讨论 .................................................................................错误!未定义书签。
6.1
色谱条件.................................................................................错误!未定义书签。
6.2
样品提取.................................................................................错误!未定义书签。
6.3 样品经层析柱净化与未经层析柱净化方法比较..................错误!未定义书签。
6.4 待测液及标准储备液存放时间..............................................错误!未定义书签。
6.5 空白试验..................................................................................错误!未定义书签。
6.6
标准曲线线性、最小检出量和最低检测浓度.....................错误!未定义书签。
6.7 重复性试验..............................................................................错误!未定义书签。
6.8
回收率试验.............................................................................错误!未定义书签。
7.比对试验 .....................................................................................错误!未定义书签。
8.结论 .............................................................................................错误!未定义书签。
参考文献........................................................................................错误!未定义书签。
《 土壤及灌溉水 二氯喹啉酸 除草剂 残留量的测定 高效液相色谱法》 试验研究报告 1.前言 二氯喹啉酸简介 中文通用名：二氯喹啉酸
英文通用名：quinclorac 化学名称：3，7-二氯-8-喹啉羧酸
其他名称：快杀稗，杀稗净，克稗星化学结构式：
化学分子式：C 10 H 5 Cl 2 NO 2 分子量：242.1 二氯喹啉酸是1983年由德国巴斯夫公司首先开发的一种激素型的喹啉酸类水田除草剂，具有用量少、残效期长、对稗草有特效、施用期宽等优点。二氯喹啉酸纯品为无色结晶体，熔点274 ℃，相对密度1.75，蒸气压＜1×10-5 Pa（20 ℃）。溶解度（20 ℃）：水0.065 mg/kg（pH7），丙酮2 g/kg，乙醇2 g/kg，几乎不溶于其它有机溶剂。原药为淡黄色固体，纯度96%，熔点269℃。对光、热稳定，在pH3-9条件下稳定。毒性：大鼠急性经口LD 50 ＞2680 mg/kg，小鼠急性经口LD 50 ＞5000 mg/kg，大鼠急性经皮LD 50 ＞2000 mg/kg。对兔眼睛、皮肤无刺激性作用，对豚鼠皮肤有致敏作用。大鼠急性吸入LC 50（4h）＞5.2 g/L。无致癌性。野鸭和鹌鹑急性经口LD 50 ＞2000 mg/kg。野鸭饲喂LD 50（8d）＞5000 mg/kg。虹鳟、鲤鱼等LC 50（96h）＞100 mg/l。通常用量下，对蜜蜂无毒。
二氯喹啉酸是近年来开发和应用的新型喹啉酸类激素型除草剂,主要通过杂草根部吸收，也能被发芽的种子吸收，少量通过叶部吸收，在杂草体内传导，使杂草死亡。杂草中毒症状与生长素物质的作用症状相似，即具有激素型除草剂的特点。适用作物为水稻（包括水稻秧田、直播田、移栽田和抛秧田），对2叶期以后的水稻安全。主要用于稻田防除稗草，也可防治雨久花、田菁、水芹、鸭舌草等农田杂草。
在使用过程中发现，许多农作物对二氯喹啉酸敏感，包括番茄、烟草、马铃薯、茄子、辣椒、胡萝卜、芹菜、菠菜、甜菜、棉花、黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜、NCLCLCOOH
青豆、紫花苜蓿、向日葵、甘薯等。当土壤和灌溉水中残留一定量的二氯喹啉酸时，就会造成药害，导致这些作物畸形生长。
1998 年至 2002 年期间，广东省烟区出现因水稻田施用二氯喹啉酸，而引发后茬烟草大面积的生长畸形，给当地烟农带来了巨大的经济损失。2011 年湖南部分烟区也出现完全相同于广东烟区烟草生长畸形发生，受害几百亩，经项目组检测也是由土壤残留二氯喹啉酸引起。
据报道，我国烟草种植面积为 1600 万亩左右。我国烟区主要分布于南方，约占植烟总面积的 94%。烟区种植模式主要有：旱地以烟草与玉米（或其它作物）轮作，水田以烟草与水稻轮作；而南方烟区以烟草与水稻轮作为主，约占南方烟区的 50%左右。
为了避免南方 50%左右烟区因环境中残留二氯喹啉酸而导致烟草和其它作物生长畸形再度发生，需建立一种快速检测土壤及灌溉水中二氯喹啉酸残留量的标准方法。
为了配合建立此标准方法，项目组从全国不同烟区采集的土壤和灌溉水样品中，分析了不同土壤类型、不同 pH 和灌溉水对二氯喹啉酸降解动态的影响，为我国烟草安全性生产和环境治理提供科学依据和技术保障。
关键 词：二氯喹啉酸、土壤、灌溉水、残留、高效液相色谱分析、标准方法
2.标准的适用范围
本标准规定了土壤及灌溉水中二氯喹啉酸除草剂残留量的测定方法——高效液相色谱法。
本标准适用于土壤及灌溉水中二氯喹啉酸残留量的测定。
3.原理 3.1 测定方法原理 以甲醇和1%乙酸水溶液为流动相，采用填有粒径5 µm的高效固定相的柱色谱分离技术。精确吸取10 μL样品注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于240 nm波长处检测二氯喹啉酸的吸收值。采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量。
3.2 二极管阵列检测器 原理 二极管阵列检测器（Diode-array detector, DAD）：以光电二极管阵列作为检测元件的UV-VIS检测器。可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。
大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外或可见光吸收基团，因而有较强的紫外或可见光吸收能力，因此二极管阵列检测器（DAD）既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。
4、、试 验 材料 4.1 仪器
（1）高效液相色谱仪 HPLC（Agilent1200），配备：脱气泵、四元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（美国 Agilent 公司）
（2）振荡器：DHZ-D 型（3）电子天平BS 210S(德国 Sartorious)（4）台秤：T-1000 型电子天平
（5）PHS-3C 精密 pH 计(上海雷磁仪器厂制造)
（6）超声波清洗器：KQ-250DE 型（7）旋转真空蒸发器：ZFQ-3 型（8）真空抽滤泵：SHZ-DⅢ型（9）分液漏斗等各种实验室通用玻璃器皿
4.2 试剂（1）99.5%二氯喹啉酸标准品（国家农药质检中心生产，广东省农科院农化研究中心提供）
（2）甲醇（一级色谱纯和分析纯）
（3）乙酸（分析纯）
(4)
四硼酸钠（分析纯）
（5）水（实验用水均为二次蒸馏水）
（6）土壤及灌溉水样品（广东省烟草公司提供）
（7）0.45 µm 微孔滤膜
（8）98%浓硫酸（分析纯）
（9）无水硫酸钠（分析纯）
（10）二氯甲烷（分析纯）
（11）氯化钠（分析纯）
5.试验方法 5.1 取样
土壤样品的采集按照 NY/T 395 标准推荐的方法进行；灌溉水样品的采集按照 NY/T 396 标准推荐的方法进行。
（1）土壤样品 选定取样点，按对角线取 5 点，四分法取样 200 g，每份样品用两层塑料袋包装，写明标签。在空白试验区内同期采集空白样品，置于-20℃冰箱贮存待测。
（2）灌溉水样品 选定取样点用干净的纯净水瓶采集灌溉水约 1 L，先用灌溉水清洗瓶子三次，然后再装灌溉水样品，加3滴浓硝酸进行酸化后拧紧瓶盖，贮存于冰箱（-20℃）中，待测。
5.2 标准溶液的配制 及标准曲线的建立 5.2.1 二氯喹啉酸标准溶液的配制 准确称取 0.0100 g 二氯喹啉酸标准品，用甲醇(色谱纯)溶解后定容至 100 mL 配制成 100 mg/L 二氯喹啉酸标准溶液，振荡摇匀后超声处理 5 min。所配标准溶液置于避光环境中 4℃保存，有效期为 3 个月，并且应监控标准储备液中二氯喹啉酸浓度。
5.2.2 标准曲线的建立 采用系列稀释法，分别配制浓度为 0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500、1.000 mg/L 的二氯喹啉酸标准溶液于高效液相色谱上检测；以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，求出二氯喹啉酸浓度与相应峰面积的线性回归方程。
5.3 提取液的配制 称取 9.53 g 四硼酸钠，于 500 mL 的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分摇匀得浓度为 0.05 mol/L 的硼砂缓冲溶液。
5.4 样品前处理方法
5.4.1 灌溉水样品 取 50 mL 水样经铺有适量的 Celite545 助滤剂的布氏漏斗抽滤，将滤液转入250 mL 分液漏斗中，加入 10 mL5%NaCl 溶液，用 0.5 mol/L 硫酸溶液 5mL 调节pH 值至 1-2，分别用 50mL、40 mL、30mL 二氯甲烷，萃取三次，合并有机相于烧瓶中。加入 5g 无水硫酸钠静置 10min，脱水后过滤于梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上 45 ℃浓缩近干，用氮气吹干，再用 5ml 甲醇定容,过 0.45 μm 微孔滤膜，所得溶液待高效液相色谱测定。
5.4.2 土壤样品
土壤样品晾干，磨碎，过 40 目筛后称取 50.00 g，放入 250 mL 具塞三角瓶内，加入30 mL前处理提取液和60 mL甲醇，在150 r/min转速下振荡提取60 min。提取液经铺有适量的 Celite545 助滤剂的布氏漏斗抽滤，用 10 mL 甲醇冲洗滤渣，将滤液全部转入 250 mL 分液漏斗中，加入 10 mL 5%NaCl 溶液，用 0.5mol/L 硫酸溶液 5mL 调节 pH 值至 1-2, 分别用 50 mL、40 mL、30 mL 二氯甲烷萃取三次，合并有机相于烧瓶中。加入 5g 无水硫酸钠静置 10min，脱水后过滤于梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上 45 ℃浓缩近干，用氮气吹干，再用 5ml 甲醇定容，过 0.45 μm微孔滤膜，所得溶液待高效液相色谱测定。
5.5 液相 色谱 条件（1）高效液相色谱仪HPLC（Agilent1200）配二极管阵列检测器（2）色谱柱：C18，5μm，4.6×250mm（3）柱温：30℃（4）流动相类型：甲醇∶1%乙酸水溶液（体积比为60/40）
（5）流动相流速：1 mL/min（6）检测波长为：240 nm（7）进样量：10 µL 5.6 添加回收率 试验 验（1）不同土壤类型 添加回收试验
土壤类型选择前茬作物为水稻，后茬种植烟草的不同地区的四种类型的土壤，作为本试验添加回收试验用土，比较不同土壤中添加回收率。其土壤类型及
采集地分别为：红壤土-油红大土（云南大理），黄壤-麻黄泥土（广东梅县），渗育水稻土-牛肝土田（广东南雄），潴育水稻土-青市麻砂泥田土（湖南宁乡县）。
（2）土壤添加回收率试验
取空白土壤 50.00 g，分别添加二氯喹啉酸标准溶液 0.10 mg/kg（高）、0.05 mg/kg（中）、0.01 mg/kg（低）三个浓度水平，每个水平重复 5 次，按照上述前处理方法（5.4.2）和色谱条件（5.5）测定土壤添加回收率。
（3）水样添加回收率实验 取灌溉水样50 mL，分别添加二氯喹啉酸标准溶液0.10 mg/L（高）、0.05 mg/L（中）、0.01 mg/L（低）三个浓度水平，每个水平重复5次，按照上述前处理方法（5.4.1）和色谱条件（5.5）测定水样添加回收率。
5.7 结果计算与表述 按照 5.5 的色谱条件对二氯喹啉酸标准溶液（5.2.2）进行色谱分析，做出二氯喹啉酸进样浓度与相应峰面积的线性回归方程。每 12 次样品测定后应注入 1个中等浓度的二氯喹啉酸标准溶液，如果测得的值与原值相差超过 3%，则应重新制作新的标准曲线进行定量分析。
样品中二氯喹啉酸的残留量，按下式计算：
C VRW
式中：
R — 样品中二氯喹啉酸残留量，单位为毫克每千克或毫克每升(mg/kg或 mg/L)C— 样品提取溶液中二氯喹啉酸的浓度，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg 或 mg/L）
V— 样品提取溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）
W— 取样量，单位为克或毫升（g 或 mL）
6.结果与讨论 6.1 色谱条件 61.1 色谱柱的选择
本标准对国内现用液相色谱柱的两家最大供应商（安捷伦和迪马）的同种类型的色谱柱，进行了优化选择。添加 0.5 mg/kg 二氯喹啉酸标准溶液后按照上述前处理方法处理后的样品，在以下色谱柱下进行检测，每个样品进样 5 次（即重复 5 次）；比较保留时间和峰面积重复稳定性及差异，选择重复稳定性较好并且峰面积差异较小且分离效果较好的色谱柱作为本试验研究主要色谱柱和色谱条件。
可选择的色谱柱有：Diamonsil C 18
200mm×φ4.6mm×5.0μm 和 Agilent TC-C18 5μm 4.6×250 mm。
表 1.不同厂家 C18 液相色谱柱出峰时间和平均峰面积比较 厂家 保留时间（min）
均 值 RSD% 峰面积(UV.S)
均值 RSD% 迪马 12.215 12.124 12.171 12.067 11.993 12.114 0.720 44.0 43.6 44.2 42.6 41.3 43.14 2.780 安捷伦 7.643 7.649 7.643 7.645 7.649 7.646 0.040 65 65 64.4 65.3 65.3 65.00 0.565
从表1中出峰时间和峰面积可以看出液相色谱柱Agilent TC-C18 5μm 4.6×250 mm 出峰时间比 Diamonsil C18 200mm×φ4.6mm×5.0μm 要快近5min,且 5 次平行测定标准偏差较小重复性较好且干扰较少，考虑到节约材料和时间等因素，因此本标准选择用 Agilent TC-C18 5μm 4.6×250 mm 色谱柱作为分析用色谱柱。两种色谱柱典型色谱图见图 1.其中 A 为使用 Agilent TC-C18 色谱柱时 1mg/kg 二氯喹啉酸色谱图，B 为使用 Diamonsil C18 色谱柱时 1mg/kg 二氯喹啉酸色谱图。
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(QUINCLORAC 2010-07-21 10-47-08 84-0501.D)7.558
min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18mAU
051015202530 VWD1 A, 波长=230 nm(E:DATA籽粒 BEBE_LC 2011-08-19 14-26-08SEED HST 12.D)图 1.不同色谱柱下二氯喹啉酸标准溶液典型色谱图 A B
6.1.2 色谱柱保留时间的重复性 用 Agilent TC-C18 色谱柱检测二氯喹啉酸的保留时间重复性较好，有利于获得良好的试验重复性。日内 5 次测定二氯喹啉酸的保留时间的相对标准偏差为0.1%与 0.2%（表 2）。
表 2.二氯喹啉酸在 Agilent TC-C18 色谱柱上的保留时间的日内精密度
样品类型 保留时间(min)第 1 次 第 2 次 第 3 次 第 4 次 第 5 次 RSD（%）
土壤样品 7.877 7.876 7.884 7.894 7.894 0.1 灌溉水样品 7.821 7.811 7.808 7.825 7.778 0.2
6.1.3 流速的选择
流速对色谱柱的分离有一定的影响。高流速可以缩短分析时间，但另一方面也会使柱压大大升高，而且可能降低目标色谱峰与杂质峰的分离效果。Agilent TC-C18 色谱柱的最高耐压为 400 bar，因此实验选用同一标准溶液对比了 0.5、0.8、1.0 mL/min 三种流速。流速为 0.5 mL/min 时，二氯喹啉酸出峰时间在 16 min，出峰时间过长。流速为 0.8 mL/min 和 1.0 mL/min 时，二氯喹啉酸的色谱峰形和分离效果差别不大，流速为 1.0 mL/min 的分离时间较短，在 8.5 min 内二氯喹啉酸出峰完毕。所以，方法选用流速为 1.0 mL/min。
6.1.4 色谱运行时间的设定 二氯喹啉酸的色谱峰在 8.5 min 内出峰完毕，在分析标准样品时，可把色谱运行时间设定为 10 min。为了避免 10 min 后会有杂峰出现，干扰下一个样品的检测，选取了 9 种不同的土壤样品进行高效液相色谱检测，色谱运行时间为 120 min，色谱图见图 2~10。如图可见，在 120 min 的色谱运行时间内，目标峰出现后，只有极少的杂峰出现，而且杂峰的峰高很低，不会对下一样品的检测造成干扰。所以，将色谱运行时间设定为 10 min。标准溶液和土壤，灌溉水样品的示例色谱图见图 11、图 12 和图 13。.min 0 20 40 60 80 100mAU*** DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0524 5240005.D)
Area: 53.5193 7.668 图 2
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（兖州土样）
min 0 20 40 60 80 100mAU-50510152025 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0524 5240006.D)
Area: 44.5389 7.695 图 3
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（重庆秀山县）
min 0 20 40 60 80 100mAU-505101520 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0524-2 5240001.D)
Area: 49.6927 7.698 图 4
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（山东泰安）
min 0 20 40 60 80 100mAU-10-5051015202530 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0524-2 5240002.D)7.702 图 5
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（深圳龙岗平湖县）
min 0 20 40 60 80 100mAU0510***0 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0525 5240005.D)
Area: 37.4818 7.572
图 6
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（山东淄博）
min 0 20 40 60 80 100mAU-50510152025 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0525-2 5240001.D)
Area: 49.2698 7.661 图 7
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（河南开封）
min 0 20 40 60 80 100mAU***0175200 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0525-2 5240002.D)7.702 图 8
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（福建漳州）
min 0 20 40 60 80 100mAU*** DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0525-2 5240003.D)
Area: 51.8256 7.701 图 9
土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（湖南邵阳）
min 10 20 30 40 50 60mAU-5051015 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(HY0525-2 5240004.D)7.707 图 10 土壤样品(添加量为 0.65mg/kg)色谱图（河南平顶山）
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-20-1001020 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(D:HYFCOMPARISON RESIDUE20100909RESIDUE20100909 2010-09-09 12-27-53 02-0201.D)7.918 图 11
二氯喹啉酸标准溶液（5mg/L）色谱图
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(D:CHEM321DATAQUINCALORACQ20110725 2010-07-25 10-39-19 82-1201.D)7.642 图 12
土壤样品色谱图(添加水平为 0.05mg/kg)
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(D:CHEM321DATAQUINCALORACQ20110725 2010-07-25 10-39-19 87-1701.D)7.651 图 13
灌溉水样品色谱图（添加水平为 0.05mg/L）
6.1.5 流动相比例的选择
通过查阅相关文献，二氯喹啉酸高效液相检测的流动相常用的有：甲醇和水，甲醇、水和乙酸两种组合情况。实验使用同一标准溶液对比了甲醇∶水=80∶20，甲醇∶水=65∶35，甲醇∶1%乙酸水=60∶40，甲醇∶1%乙酸水=70∶30 四种流动相比例。流动相比例为甲醇∶水=80∶20 时，二氯喹啉酸出峰时间在 11 min，出峰时间过长。流动相比例为甲醇∶水=65∶35时，二氯喹啉酸出峰时间在8 min，但其峰高仅为流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=60∶40 的 47%。流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=70∶30 时，出峰时间为 6 min，不利于某些样品的杂峰与目标色
谱峰的分离。流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=60∶40 时，二氯喹啉酸出峰时间为 7~8min，且目标色谱峰与附近杂质峰的分离干净。所以选择流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=60∶40。
6.2 样品提取 6.2.1 萃取溶液浓度的选择 称取 50.00 g 土壤样品，添加二氯喹啉酸标准溶液 0.72 mg/kg，按 5.4.2 样品前处理方法和 5.5 色谱条件进行样品分析，把硼砂萃取液的浓度分别设置为0.025、0.050、0.100 mol/L，每个处理设置两次重复，结果见表 3。由表 3 可见，二氯喹啉酸在萃取液浓度为 0.050 mol/L 和 0.100 mol/L 时，基本提取完全。在萃取液浓度为 0.025 mol/L 时，提取率比浓度为 0.050 mol/L 时低了 6.9%，提取不完全。所以选择萃取液的浓度为 0.050 mol/L。
表 3.土壤样品中二氯喹啉酸在硼砂提取液不同浓度下的回收率* 提取液硼砂浓度（mol/L）
土样重量（g）
土样添加二氯喹啉酸浓度(mg/L)实际测得二氯喹啉酸浓度(mg/L)回收率（%）
0.025 0.050 0.100 50.00 50.00 50.00 0.72 0.72 0.72 0.69 0.74 0.73
95.8 102.8 101.4 *表中数据为两次重复测定平均值
6.2.2 硼砂提取液体积的选择
称取 50.00 g 土壤样品四份，按前处理方法 5.4.2 和 5.5 色谱条件进行样品分析，把硼砂提取液的体积分别设置为 30、40、50、100 mL 和 60 mL 甲醇。其添加回收率结果见表 4。从表中可以看出硼砂提取液体积为 30、40、50、100 mL时添加回收率差别不是很大，但是考虑到节约试验成本，降低费用，因此选择提取液体积为 30 mL 硼砂缓冲液和 60 mL 甲醇。
表 4.土壤样品中二氯喹啉酸在不同体积硼砂提取液下的添加回收率试验结果* 硼砂提取液体积（mL）40 50 100 添加回收率(%)
99.87 99.05 101.5 98.98 *表中数据为两次重复测定平均值
6.2.3 提取时间的选择 称取土壤样品 50.00 g，添加二氯喹啉酸标准溶液 0.65 mg/kg，对同一添加二氯喹啉酸土样进行震荡提取 1 h、2 h 和 5 h，每个处理重复两次，其回收率结果见表 5；结果表明 1 h 和 2 h 无明显差别，而提取 5 h 时回收率显著下降，考虑全国各地土壤酸碱度、粘度及对二氯喹啉酸的吸附率不同和经济等因素，本标准采用震荡提取 1 h。
表 5.不同提取时间下的添加回收率* 提取时间(h)土样重量（g）
测试浓度(mg/L)添加回收率(%)1 50.00 0.658 101.3 2 50.00 0.659 101.5 5 50.00 0.445 67.56 *表中数据为两次重复测定平均值
6.3 样品 经 层析 柱净化与 未经层析柱 净化 方法 比较
称取 50.00 g 土壤样品 4 份，放入 250 mL 具塞三角瓶内，加入 30 mL0.05 mol/L 的硼砂缓冲溶液和 60 mL 甲醇，振荡提取 60 min。用铺有适量的 Celite545助滤剂的布氏漏斗抽滤，用 10 mL 甲醇冲洗滤渣，将滤液全部转入 250 mL 分液漏斗中，加入 10 mL 5%NaCl 水溶液，用 0.5 mol/L 硫酸 5mL 调节 pH 至 1-2,用50、40、30 mL 二氯甲烷萃取三次，合并二氯甲烷相；二氯甲烷相经无水硫酸钠脱水后，在旋转蒸发仪上于 45℃浓缩近干，氮气吹干，其中 2 份用 5 mL 甲醇定容,过 0.45 μm 微孔滤膜，所得溶液待高效液相色谱测定。另外 2 份进行柱净化，用 2mL 丙酮定容，移入层析柱内净化。在层析柱内依次加入 1 cm 无水硫酸钠，2 g 硅胶，1 cm 无水硫酸钠，用 10 mL 丙酮预淋洗，弃去，将上述提取已浓缩丙酮定容液移入层析柱内，用 40 mL 丙酮淋洗，收集淋洗液于 45℃下浓缩近干，氮吹至干，5 mL 甲醇定容过 0.45 μm 微孔滤膜，待高效液相色谱测定。其色谱图见图 14。
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(QUINCLORAC 2010-07-21 10-47-08 72-0201.D)7.290
mi n 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Si g=240, 8 Ref =320, 100(D: CHEM32 1 DATA QUI NCALORAC Q20110725 2010-07-25 10-39-19 074-0401.D)7.593 a：.未经层析柱净化土壤色谱图
b：.经层析柱净化土壤色谱图
图 14.未经层析柱净化和经层析柱净化样品色谱图 从色谱图中可以看出未经层析柱净化样品目标峰和杂质峰能够完全分离开，且不受杂质峰干扰，经层析柱净化和未经层析柱净化差别不是很明显；从省时省力，节约成本等方面考虑，本标准选择土壤样品不经层析柱净化。
6.4 待测液 及标准储备液 存放时间 为了便于批量分析及数据准确性，验证标准储备液及检测样品经提取后的待分析有效存放时间。配制 1mg/kg 二氯喹啉酸标准储备液，分成 12 分，每 3 份为一组（即设置三次重复），将标准储备液放置在 4℃条件下分别于 0、30、60和 90 d 取标准储备液, 进行高效液相色谱检测，比较其峰面积变化情况。
表 6.标准储备液在不同存放时间内二氯喹啉酸峰面积变化的测定结果* 存放时间（d）
重复 1 重复 2
重复 3平均值 RSD(%)
0 65.3 64.9 65.3 65.2 0.27 30 65.3 64.4 65.6 65.1 0.72 60 65.4 65.3 64.4 65.0 0.65 90 65.3 64.4 64.4 64.1 0.62 *表中数据为二氯喹啉酸 1mg/kg 标准储备液的色谱峰面积单位 UV.S
从表 6 中可以看出 1mg/kg 标准储备液 在 4℃条件下存放 90d 后检测结果与立即检测结果差别不大；在 4℃条件下 1mg/kg 标准储备液 存放有效期可定为 90d,更高浓度的标准储备液至少可存放 3 个月。
称取 1 份土壤样品，添加 0.05mg/kg 水平的二氯喹啉酸标准溶液，按 5.4.2进行样品前处理，样品处理好后，分成 12 份，分别装于 12 个样品瓶中。每 3个样品瓶分为一组（即设置三次重复）：第一组，在样品处理好后立即进行高效液相色谱检测；第二组、第三组、第四组，将待测液放置在 4℃条件下分别于 24、48、72 h, 继而进行高效液相色谱检测。
表 7.样品制备完成后在不同存放时间下的测定结果* 存放时间（h）
重复 1 重复 2
重复 3平均值 RSD(%)
0
22.8 22.5 22.4 22.57 0.9225 24
22.4 22.2 22.6
22.40 0.8929 48
22.2 22.5 22.5 22.40 0.7732 72
22.3 22.2 22.3 22.27 0.2593 *表中数据为土壤样品色谱峰面积单位 UV.S
从表7中可以看出样品制备完成后在4℃条件下存放72 h后检测结果与立即检测结果差别不大；说明可以在 4℃条件下存放 72 h 后进行高效液相色谱检测。
6.5 空白 对照 试验 不加入标准品，按 5.4.2 前处理方法和 5.5 色谱条件对空白土壤样品进行测定。由图 15 和图 16 可见，空白图谱基线稳定，在二氯喹啉酸出峰处无其他干扰峰。因此，在 5.7 的二氯喹啉酸含量的计算公式中，无需进行空白扣除。
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8mAU-25-20-15-10-505 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(D:HYFCOMPARISON RESIDUE***1 2010-09-21 10-06-00 10-1001.D)图 15 水样空白试验色谱图 min 0 1 2 3 4 5 6 7 8mAU050100***0350 DAD1 A, Sig=240,4 Ref=360,100(D:HYFCOMPARISON RESIDUE***1 2010-09-21 10-06-00 07-0701.D)图 16 土样空白试验色谱图 6.6 标准曲线线性、最小检 出 量 和最低检测浓度 采用外标法定量，以进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到线性回归方程和相关系数。在所设定的仪器条件下，二氯喹啉酸最小进样量峰高为噪声 3 倍时，最小检出量为 2.5×10-11
g。土壤样品取 50.00 g，最后定容至 5 mL，进样量 10 l，计算土壤样品最低检测浓度为：0.0025 mg/kg。灌溉水样品取 50 mL，最后定容至 2 mL，进样量 10 l，计算灌溉水样品最低检测浓度为：0.0010 mg/L；结果见表 8。
结果表明，方法的线性良好，相关系数均大于 0.9997。方法的最小检出量为 2.5×10-11 g，土壤和灌溉水样检测限分别为：0.0025 mg/kg 和 0.0010 mg/kg，其灵敏度良好。
表 8.标准曲线的线性方程、相关系数、最低检测浓度和最小检出量 样品 线性方程 相关系数 最小检出量(g)最低检测浓度(mg/kg)
二氯喹啉酸 Y=66.726x-0.1448 0.9997 2.5×10-11
土壤
0.0025 灌溉水 0.0010
y = 66.726x-0.1448R 2
= 0.***60700 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2进样浓度（mg/kg）峰面积（UV.S）图 17 二氯喹啉酸标准曲线图
6.7 重复性试验
按5.4样品前处理方法和5.5色谱条件对土壤和灌溉水添加样品进行5次平行测定，得到方法精密度，以 RSD 表示，结果见表 9 与表 10。二氯喹啉酸灌溉水样品的精密度小于 2.3%，二氯喹啉酸土壤样品的精密度小于 2.2%，方法的重复性良好。
表 9.方法重复性实验灌溉水样品结果 水样体积（mL）
添加二氯喹啉酸量（mg/L）
检测二氯喹啉酸含量（mg/L）
2.0 0.72 0.73
2.0 0.72 0.74 2.0 0.72 0.74 2.0 0.72 0.71 2.0 0.72 0.70平均值 0.72 0.72 RSD(%)
2.3
表 10.方法重复性实验土壤样品检测结果 土样重量(g)添加二氯喹啉酸量（mg/L）
检测二氯喹啉酸含量（mg/kg）
50.00 0.65 0.67 50.00 0.65 0.68 50.00 0.65 0.67 50.00 0.65 0.69 50.00 0.65 0.65平均值 0.65 0.67 RSD（%）
2.2
6.8 回收率试验 6.8.1 不同土壤类型添加回收实验 在四种不同类型土壤中添加中浓度水平（即 0.05 mg/kg）二氯喹啉酸标准溶液，按上述前处理方法(5.4.2)和色谱条件(5.5)进行检测，每个处理设置重复两次；结果见表 11。
表 11.不同类型土壤中添加 0.05 mg/kg 二氯喹啉酸回收率结果* 土壤类型 油大红土（云南大理）
青市麻砂泥田土（湖南宁乡县）
麻黄泥土（广东梅县）
牛肝土田（广东南雄）
RED(%)回收率(%)
99.1
98.8 96.1
95.2
96.1 95.5 95.8
94.3
平均回收率(%)97.6 97.2 96.0 94.8 1.31
*注：表中数据位两次重复平均值
从表 11 中可以看出二氯喹啉酸在四种土壤类型中的添加回收率在94.8%-97.6%之间,相对标准偏差为 1.31%;表明在四种土壤类型中添加回收率差别不大，均符合农药残留标准。故可以选择一种土壤类型进行土壤高、中、低浓度的添加回收率试验。
6.8.2 不同添加水平回收率试验 取土壤样品和灌溉水样品，以其五次平行测定的平均值作为计算其二氯喹啉酸原始含量的依据，添加高、中、低三个浓度水平的标准溶液进行回收试验。由表 12 可见，二氯喹啉酸的回收率在 94.78%~99.43%之间，相对标准偏差在0.705%-2.177%之间;符合农药残留添加回收率标准。二氯喹啉酸标准溶液、土壤空白、水样空白以及土壤添加和水样添加色谱图见图 18-22。
表 12.二氯喹啉酸在土壤中和灌溉水中的添加回收率 样品 添加水平回收率(%)平均回 收率(%)相对标准偏差RSD(%)(mg/kg 或 mg/L)土壤 0.01 98.70、96.84、95.12、99.02、94.27 96.79 2.177 0.05 101.19、99.11、98.81、99.11、96.14 98.87 1.820 0.1 99.32、96.49、100.34、99.64、97.80 98.72 1.573 水样 0.01 97.18、93.72、92.66、98.31、92.05 94.78
2.951 0.05 94.77、96.23、92.58、95.01、95.26 97.10 2.735 0.1 98.82、100.59、98.99、99.22、99.53 99.43 0.7050
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(QUINCLORAC 2010-07-21 10-47-08 82-0301.D)7.557 图 18.1.0 mg/kg 二氯喹啉酸标准溶液色谱图
mi n 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Si g=240,8 Ref =320,100(QUINCALORACQUINCALORAC2011722 2010-07-22 13-26-26 80-1301.D)图 19.水样空白色谱图
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-15-10-50510 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(QUINCLORAC 2010-07-21 10-47-08 77-0701.D)图 20.土壤空白色谱图
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(QUINCLORAC 2010-07-21 10-47-08 73-0301.D)7.303
图 21.土壤添加中浓度（0.05 mg/kg）色谱图
min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9mAU-202468 DAD1 A, Sig=240,8 Ref=320,100(QUINCLORAC 2010-07-21 10-47-08 92-1101.D)7.530 图 22.水样添加中浓度（0.05 mg/L）色谱图
7、、比对 试验
按照本项目建立的方法，项目组于 2010 年 8 月至 10 月分别在 5 个具有测试资质的烟草测试分析中心进行平行比对试验。委托测试单位有：深圳中烟工业有限责任公司（实验室Ⅰ）、广东中烟工业有限责任公司（实验室Ⅱ）、川渝中烟工业有限责任公司（实验室Ⅲ）上海中烟工业有限责任公司（实验室Ⅳ）和湖南中烟工业有限责任公司（实验室Ⅴ）。2010 年 10 月完成了比对试验。
选取的试验样品是各比对试验室当地烟-稻轮作田内的土壤和灌溉水样品，土壤和灌溉水样品的添加量均为 0.65 mg/kg(或 mg/L)，并设有空白对照。按照本标准设定的前处理方法和仪器条件对土壤和灌溉水进行添加回收率试验其结果见表 14，比对试验在各实验室使用的高效液相色谱（HPLC）和紫外检测器（UVD）型号见表 13。
表 13.实验室Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ使用的高效液相色谱和检测器型号 实验室 HPLC 型号 UVD 型号 仪器生产商 Ⅰ 1200 G1315C Agilent Ⅱ 1200 G1314A Agilent Ⅲ PE Flexar 15 PE Flexar 15 PerkinElmer Ⅳ 1100 G1314A Agilent Ⅴ 1100 G1314A Agilent
表 14.土壤及灌溉水中二氯喹啉酸残留检测 实验室Ⅰ～Ⅴ比对试验结果*
二氯喹啉酸含量（mg/kg 或 mg/L）
回收率(%)实验室 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ平均值 RSD(%)土样 0.597±0.02 0.620±0.03 0.599±0.03 0.636±0.01 0.620±0.05 91.8±0.02 95.4± 0.03 92.2± 0.03 97.9± 0.01 95.4± 0.05 94.5 2.1 水样 0.747±0.03 0.703±0.01 0.641±0.04 0.647±0.02 0.658±0.04 104.6±0.03 108.2±0.01 98.6± 0.04 99.5±0.02 101.3±0.04 102.4 3.1 *表中数据为 3 次重复的平均值 X ±S.E，土样中二氯喹啉酸的添加量为 0.65mg/kg，水样中二氯喹啉酸的添加量为 0.65mg/L。
采用本标准建立的方法进行土壤及灌溉水二氯喹啉酸除草剂残留量的测定，在上述五家实验室进行了对比试验，土壤添加平均回收率为 94.5%，相对标准偏差为 2.1%；灌溉水平均添加回收率为 104.4%，相对标准偏差为 5.3%。结果 表明本实验方法符合农药残留检测分析的要求，适用于土壤及灌溉水中二氯喹啉酸的残留检测。
8、、结论 项目组对《土壤及灌溉水二氯喹啉酸除草剂残留量的测定高效液相色谱法》进行了验证，并对高效液相色谱法测定烟区灌溉水、土壤样品中二氯喹啉酸含量的线性、检测限、回收率进行了考察，精确度，重复性等均达到了标准方法的各项指标。该标准方法能够准确地测试农田和烟区灌溉水、土壤中二氯喹啉酸残留量。
建立的高效液相色谱测定土壤及灌溉水中二氯喹啉酸除草剂残留量的标准方法具有快速、准确，易操作的特点，特别适用于烟区灌溉水、土壤样品中二氯喹啉酸残留量的检测与分析。
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