第一篇：细胞实验细胞骨架组分的荧光染色观察
细胞生物学实验
细胞骨架组分的荧光染色观察
一、实验目的
1、掌握细胞骨架的显示方法
2、掌握荧光显微镜的使用方法
3、了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构
4、了解荧光探针Hoechst 33342（Ho.33324）与细胞成分的结合特性和光谱特性
二、实验原理
1、微丝股价是一种高度动态的三维网状结构，与细胞的多种生理活动如细胞运动、胞质分离、细胞器的定位、细胞内物质的运输、吞噬作用、细胞极性生长等密切相关。
2、鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
3、由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用.因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。
三、实验材料
1、材料：CHO（中国仓鼠卵巢细胞）
2、试剂：
（1）PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM
EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇
（2）0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。
（3）4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。
四、实验步骤
1、取出上次实验爬片于小盖玻片上的CHO细胞；
2、取出培养有CHO细胞的盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)； 3、37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)4、37℃预温 PEM洗3次
5、加入0.5%Triton X-100处理约10min(1mL)；
6、取一洁净的载玻片，按照其的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上滴加20μL 60nM Alex-phalloidin 10L湿盒中室温染色30min；
7、在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片； 8、37℃预温 PEM洗数3次；
9、滴加10L Ho.33342复染色；
10、荧光镜下观察。【注意事项】
1、注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；
2、各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；
3、荧光观察注意避光操作
4、节约试剂。
五、实验结果
图一：CHO细胞微丝荧光染色图
图二：CHO细胞细胞核荧光染色图
图三：CHO细胞微丝与细胞核荧光染色叠加图
六、实验结果分析
染色后微丝呈绿色，细胞核为蓝色，染色较为清晰。但细胞数量较多，导致有些染色结果重叠。
七、思考题
1、PEM缓冲液的作用是什么？
细胞内的微丝在含有ATP和Ca2+及低浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，趋于解聚成G-actin；而在Mg2+和高浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，G-actin则装配为F-actin。PEM缓冲液提供高Mg环境，让单体肌动蛋白（G-actin）聚合成丝状肌动蛋白（F-actin）。同时，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin装配成F-actin，微丝骨架保持聚合状态且较为舒张。用PEM缓冲液处理细胞，能够模拟体内环境并提高细胞骨架的稳定性。2、0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？
0.5%Triton X-100处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，增加细胞膜的通透性，使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合。
3、鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？
（1）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点：鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合，通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。（2）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点：对细胞有毒性，价格昂贵。
参考文献：细胞生物学实验(桑建利, 谭信)
第二篇：细胞骨架组分的荧光染色观察
细胞生物学实验报告
细胞骨架组分的荧光染色观察
姓名：
学号：
班级：
专业：
同组成员：
一、实验原理
鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用。因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。
二、实验目的
1．掌握细胞骨架的显示方法 2.掌握荧光显微镜的使用方法
3.了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构
三、实验器材 1.材料：
CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 2.试剂：
PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液。4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液。3.仪 器
超净工作台、CO2培养箱、荧光显微镜 4.其它用品：
盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。
四、方法与步骤
由于上节课鸡胚成纤维细胞被污染，本次实验所用细胞为CHO细胞（1）准备好实验器材。（本次实验无需在超净台中进行）
（2）将上节课进行细胞爬片的培养皿从培养箱中取出，取出盖片，于小平皿中。（3）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100处理约10min(1mL)（5）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)（7）37℃预温 PEM洗3次
（8）55nM Alex-phalloidin 10µL湿盒中室温染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。（10）37℃预温 PEM洗数3次，滴加10µL Ho.33342复染色。（11）荧光显微镜下观察并拍照。
五、注意事项
1.盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻。2.注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 3.各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 4.荧光观察注意避光操作，防止荧光淬灭。5.节约试剂。
六、实验结果
本次实验我们对CHO细胞爬片结果进行了荧光染色，在荧光显镜下用不同波长的激发光对细胞骨架微丝结构及细胞核进行了观察、拍摄照片并将结果叠加。得到以下的实验现象：
图1.CHO细胞微丝荧光染色图
图2.CHO细胞核荧光染色图
图3.CHO细胞微丝及细胞核荧光染色合成图
从拍摄的照片可以较为清晰的看到CHO细胞骨架的微丝被染成了绿色，细胞核被染成蓝色；微丝的形状为长条的纺锤状细丝，遍布整个细胞，在细胞中起到了类似骨架般的支撑作用；细胞核为椭圆形，之后再将两图合成，可观察到细胞核被遍布的微丝结构包围。实验较为成功。在实验时要注意荧光染料均存在淬灭问题，所以要尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。
【参考文献】
[1] 桑建利, 谭信.细胞生物学实验指导.北京:科学出版社, 2010.[2] 北京师范大学生命科学学院.细胞生物学实验.北京:北京师范大学生命科学学院,2015.9.
第三篇：2014 细胞生物学实验课内容(细胞形态观察、细胞器活体染色、细胞骨架观察)
实验三 细胞形态的观察
【实验目的】
1.认识光学显微镜下细胞的形态结构； 2.掌握临时制片和显微绘图的方法。
【材料、器材和试剂】
材料：人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱鳞茎；
器材：显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸； 试剂：1%碘液。
【方法和步骤】
1.口腔黏膜上皮细胞的制片与观察
口腔黏膜细胞涂片标本的制备：吸取一滴碘液滴在一张洁净的载玻片中央，用一根事先灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，然后，将其放入载玻片上的染液中并来回搅动使细胞散开，染色1 min左右后小心加盖玻片（尽量避免产生气泡），用滤纸吸去盖玻片周围的液体。
观察：将自制的口腔黏膜上皮细胞标本装片置于显微镜下观察，先用低倍镜观察较分散的、轮廓清晰的黏膜上皮细胞。由于该细胞体积较小、着色较淡，观察时应稍降低视野亮度以便于较快找到目标（在低倍镜下，用碘液染色的细胞呈黄色，成群或分散分布，形态大小多呈扁平椭圆形）。选择轮廓清晰的细胞移至视野中央，转换至高倍镜下观察。在高倍镜下，可见口腔黏膜上皮细胞外围有一层薄薄的细胞膜，扁圆形的细胞核呈深黄色，细胞质呈浅黄色或浅蓝色，核中央致密的结构为核仁。
2.洋葱鳞茎内表皮细胞的制片与观察
表皮细胞装片标本的制备：取一干净载玻片，在其中央滴一滴碘液，将洋葱鳞茎用小刀分为几块，取一块肉质鳞叶，用剪刀在内表皮划“田”字形小方格，每一小方格边长3-4mm，然后用镊子轻轻撕下一小方格的膜质表皮，置于载玻片的碘液滴中铺平，取一干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁的碘液，再缓缓地盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。
观察：将制备好的装片标本放到显微镜下，先用低倍镜观察，可见许多长柱状、排列整齐、彼此相连的细胞，选择其中一个典型的细胞移至视野中央，再转换至高倍镜下仔细观察细胞壁、细胞核、细胞质和液泡等结构。
【实验结果】
绘图并进行适当标注：人口腔黏膜上皮细胞和洋葱鳞茎内表皮细胞。【讨论】
简述观察细胞形态时，制作临时装片和显微镜镜检时的注意事项。
实验四 线粒体和液泡系的活体染色
【实验目的】
1.掌握一些细胞器的超活性染色技术和原理。
2.观察动物、植物细胞内线粒体和液泡系的形态、数量和分布。
【材料、器材和试剂】
材料：人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱；
器材：显微镜、牙签、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片；
试剂：Ringer溶液；1/5000詹纳斯绿B溶液；1/3000中性红溶液。
【方法和步骤】
1.线粒体的超活染色与观察
（1）人体口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色和观察
① 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液； ② 用一根预先灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加一滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于显微镜下观察；
③ 在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，转换高倍镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或棍棒状的线粒体。（2）洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色和观察
① 用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴在干净的载玻片上，然后用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于染液中，染色10-15min；
② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮展平，盖上盖玻片，显微镜下观察。在高倍镜下，可见表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至旁边，线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。
2.液泡系的超活染色和观察
① 洋葱鳞茎内表皮一小块，置于1/3000中性红溶液中，染色5-10min；
② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮展平，盖上盖玻片，显微镜下观察，可见被染成砖红色的中央大液泡。
【实验结果】
1.根据实验观察，绘制洋葱鳞茎内表皮细胞和人体口腔黏膜上皮细胞线粒体分布图。2.根据实验观察，绘制洋葱鳞茎表皮细胞指示液泡系的形态和分布。
【讨论】
1.简述线粒体詹纳斯绿B活体染色和液泡系中性红活体染色的原理； 2.分析线粒体和液泡系活体染色时需要注意的事项。3.细胞内线粒体的形态和分布有何特点？
实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察
【实验目的】
了解细胞骨架的结构特征及其样品制备技术。
【材料、器材和试剂】
材料：洋葱鳞茎；
器材：普通光学显微镜、5Oml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸；
试剂：M 缓冲液；6mmol/L（pH 6.8）磷酸缓冲液；1% Triton X-100；0.2%考马斯亮蓝R250；3%戊二醛。
【方法和步骤】
1.撕取洋葱鳞茎内表皮（约lcm大小若干片）置于装有pH 6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；
2.吸去磷酸缓冲液，用l% Triton X-100处理20-30min； 3.吸去Triton X-100，用M缓冲液洗3次，每次10min； 4.3%戊二醛固定O.5-lh；
5.pH 6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10min； 6.0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30min；
7.用蒸馏水洗1或2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。
2【实验结果】
绘制洋葱鳞茎表皮细胞微丝束的分布图。
【讨论】
1.阐述采用考马斯亮蓝R250染色法显示微丝的原理； 2.分析和论述在光学显微镜下观察到的细胞骨架的形态特征。
第四篇：实验二、植物细胞骨架的观察
实验
二、植物细胞骨架的观察
一、实验目的
观察植物细胞内网状的骨架结构。
二、实验原理
在真核细胞的细胞质中，存在着由蛋白质纤维构成的网状骨架系统。Triton X-100是非离子去垢剂，用适当浓度的Triton X-100处理细胞，可将细胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保护和维系作用，细胞内其他可溶性成分也随之流失，这样一来水不溶性的细胞骨架系统蛋白质却被保留下来，而这被保留下来的蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，便可在光学显微镜下观察它们——细胞骨架的网状结构。为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。M-缓冲液洗涤细胞,可以提高细胞骨架的稳定性。M－缓冲液和磷酸缓冲液作用都是维持细胞的渗透压
三、实验用品
显微镜、50ml烧杯、盖玻片、载玻片、滤纸、M-缓冲液、磷酸缓冲液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛、洋葱鳞茎。
四、实验方法与步骤
1、撕取洋葱鳞茎内表皮若干片，大小约1平方厘米，置于装有PH6.8的磷酸缓冲液（PBS）的50ml烧杯中，使其下沉。
2、用滤纸吸去磷酸缓冲液（PBS），用1% Triton X-100处理20-30分钟。
3、吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，每次10分钟。
4、用3%戊二醛固定10-15分钟。
5、用磷酸缓冲液（PBS）洗3次，用滤纸吸干。
6、用0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。
7、用蒸馏水洗1-2次，将洋葱细胞置于载玻片上，加上盖片。
8、在光学显微镜下镜检。
五、作业
写出你的实验结果并绘成图。
附：药品配置
1、M—缓冲液（10×原液）
咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巯基乙醇 0.78（0.7ml）蒸馏水 加至1000ml 用时稀释，取50ml（10×原液）加450ml蒸馏水。
2、磷酸缓冲液（PBS）
配方①：
NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（无水）0.10g 0.5%酚红 4ml 双蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3调PH值至6.8。也可先配成10被浓缩液，使用时再稀释。配方②：
6m mol/L PH6.5磷酸盐缓冲液
A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸馏水100ml即为工作液。加入0.5%酚红4ml。3、1% Triton X-100 用M-缓冲液配制。
取1mlTriton X-100液加M-缓冲液至100ml。4、0.2%考马斯亮蓝R250配制
考马斯亮蓝R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸馏水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制
用磷酸缓冲液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸盐缓冲液至100ml。
第五篇：洋葱鳞片叶表皮细胞的细胞骨架观察实验报告
洋葱鳞片叶表皮细胞的细胞骨架观察实验报告
吴若自然科学大类 16307110316 单周四 119 2016/11/17
一、实验目的: 1.掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法。2.认识细胞骨架的形态，联系细胞骨架的功能。
二、实验原理：
细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中间纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。
三、操作步骤：
1.取洋葱内皮表层膜1cm2(可多取两片)左右置于含2mlPBS液的小皿中湿润5min后，吸去PBS 2.向小皿中加入1.5mlTritonX-100(1%)，浸没20min后，吸走TritonX-100
3.向小皿中加入2mlMbuffer浸没置于摇床上5min，重复两次后，吸走Mbuffer 4.向小皿中加入105ml戊二醛（3%），浸没30min后，吸走戊二醛 5.向小皿中加入2mlPBS，浸没置于摇床上5min，重复两次
6.取出表皮平铺于载玻片上，滴加100微升，静置100min后吸取染料 7.向表面滴加蒸馏水洗涤后用纸巾洗去液体，重复两次
8.盖上盖玻片，擦去残余液体，用光学显微镜观察并拍照记录
四、实验结果：
如图所示，洋葱内表皮细胞轮廓清晰可见，细胞壁及其分界明显可见。可观察到线性纤维交织而成的网状结构，同一细胞内各处骨架密集度不均匀，细胞核区域纤维较密集，蓝色较重。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。
五、思考题：
1.简述细胞质骨架的基本类型及结构特征
答：微管：中空的圆筒状结构，直径为18nm～25nm，构成微管的主要成分是微管蛋白。这种蛋白有两个亚基，即α，β亚基它们成螺旋形排列。进化高度保守。微丝：由肌动蛋白组成的直径约为7nm的骨架纤维，单体形式的球形肌动蛋白聚合形成纤维形肌动蛋白，在微丝结合蛋白的辅助作用下形成微丝高级结构，行使功能。
中间纤维：中空的骨状结构，直径介于微管微丝之间，具有明显的组织细胞特异性，基本结构为一个中央α螺旋杆状区辅以两侧大小和化学组成不同的端区。2.本实验观察到的蓝色纤维主要是哪种细胞骨架？
答：应为微丝和中间纤维。3.考马斯亮蓝染色方法的优缺点。
答：优点：反应相对迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定，试剂配置简单，操作简便。
缺点：用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，仍有一些物质干扰此法的测定。
六、实验讨论：
1.观察和分析细胞骨架的意义？
答：细胞骨架是细胞结构的重要组成部分，也是细胞行为与功能的重要调节系统，观察和分析细胞骨架的性质与变化将帮助我们更好地认识和研究细胞性质、功能与机制。
2.考马斯亮蓝是一个理想的细胞骨架染料吗？本实验的优点和缺点是什么？
答：不是，特异性荧光染料可能更好。本实验优点是反应相对迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定，试剂配置简单，操作简便。缺点是无法直观分辨微管，微丝和中间纤维等。
点击咨询 