TRIpure Reagent总RNA抽提试剂操作方法及步骤说明书

第一篇：TRIpure Reagent总RNA抽提试剂操作方法及步骤说明书

杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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TRIpure Reagent

TRIpure Reagent总RNA提取试剂

目录号：RN01  试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成

TRIpure（4℃避光）

(RN0101)50 ml

(RN0102)

ml  储存事项：

TRIpure 在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2~8°C的环境下。

 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。

 1.注意事项：

样品用TRIpure匀浆后，如果不即刻加入氯仿之前，置于-70°C下可放置一个月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern Blot等。

2.若下游实验对DNA非常敏感，建议用 RNase free DNase I（货号：RN45）对RNA进行处理。

3.自备试剂：氯仿、异丙醇（新开封或提取RNA专用）、75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)、RNase free water或者DEPC处理过的水。

4.本公司生产TRIpure Reagent质量优异，可以完美替代Invitrogen的Trizol Reagent。提取质量和下游实验完全一样。已经销售8年数万瓶。从无质量问题。客户如果购买本公司TRIpure Reagent证明不能替换Invitrogen的Trizol，无条件退货，并3倍销售价格赔偿。

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 RNA抽提操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：用TRIpure 抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无特殊说明，所有的操作应该在在15~30°C的室温条件下。1.匀浆

a.植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIpure中迅速研磨，每50-100mg组织加入1ml TRIpure，混匀。注意：样品体积一般不要超过TRIpure体积的10%。

b.动物组织：取新鲜或-70℃冻存动物组织尽量剪碎，每30-100mg组织加入1ml TRIpure，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入TRIpure 1ml混匀。注意：样品体积一般不要超过TRIpure体积的10%。

c.单层培养细胞：尽量去除干净残留培养液后直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml 的TRIpure覆盖并反复吹打裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIpure 量（每10cm2加1ml）。当TRIpure 量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。

注意：贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全破裂开，并已释放出全部RNA，继续做即可。d.细胞悬液： 离心收集细胞。在TRIpure 试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加1ml的TRIpure。在加入TRIpure 前应避免洗涤细胞，因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

e.血液：推荐使用本公司的TRIpure Reagent LS(货号：RN02)，这是全血或者液体样品专用的TRIpure Reagent，LS就是Liquid Sample 液体样品的首字母简写。相当于Invitrogen公司的 TRIzol LS。

2.3.将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。可选步骤： 在4°C的条件下以12,000 rpm的离心力离心10分钟，取上清。如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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离心后的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织的样品时，上层是大量油脂应除去。取澄清的匀浆液进行下一步。4.每1ml TRIpure加0.2ml氯仿。盖紧管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下放置2~3分钟。5.在4°C 12,000 rpm的离心力高速冷冻离心10-15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色有机苯酚氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIpure 容量的50-60%。（有机层和中间层是蛋白和DNA，如果需要提取，请联系我们索取提取方法）。6.将水样层转移到一干净的离心管中，加入等体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10分钟。

RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

7.8.9.在室温或者4°C 12,000 rpm 离心10分钟，弃上清。

加入75%乙醇洗涤沉淀。每使用1•ml•TRIpure用1•ml•75%乙醇对沉淀进行洗涤。在室温或者4°C 12,000 rpm离心3分钟，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。• 10.室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100μl RNase free water，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。

第二篇：TRIpure LS 总RNA抽提试剂操作方法及步骤说明书

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TRIpure Reagent LS 液体样本总RNA提取试剂

目录号：RN02  试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成

TRIpure LS（4℃避光）(RN0201)50 ml

(RN0202)

ml

 储存事项：

TRIpure LS在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2~8°C的环境下。

 重要提示：

本品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。

 1.注意事项：

样品用TRIpure LS匀浆后，如果不即刻加入氯仿之前，置于-70°C下可放置一个月以上。保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8°C可以保存一周，-20°C条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern Blot等。

2.若下游实验对DNA非常敏感，建议用 RNase free DNase I（货号：RN45）对RNA进行处理。

3.自备试剂：氯仿、异丙醇（新开封或提取RNA专用）、75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)、RNase free water或者DEPC处理过的水。

4.本公司生产TRIpure Reagent LS质量优异，可以完美替代Invitrogen的Trizol Reagent LS。提取质量和下游实验完全一样。

 RNA抽提操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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提示：用TRIpure LS抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无特殊说明，所有的操作应该在15~30°C的室温条件下。1.匀浆

a.生物液体：每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml TRIpure LS，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75ml TRIpure LS。TRIpure LS 和液体样品的终体积比总是3：1。b.动物组织：用glass或强力匀浆器搅匀组织样品，每50~100mg组织或者0.25ml组织悬液加0.75ml的TRIpure LS。一般50~100mg组织体积都要小于0.25ml，如果组织样品的体积小于0.25ml，加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3：1。

c.单层生长细胞：直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的TRIpure LS裂解细胞，用加样枪吹打帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIpure LS量（每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因为培养板中附着残留的培养液已经充分稀释了TRIpure LS。注意：贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全破裂开，并已释放出RNA，继续做即可。d.细胞悬液：通过离心来沉淀细胞。在TRIpure LS试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加0.75ml的TRIpure LS。和步骤b一样用灭菌水调节样品体积到0.25毫升。在加入TRIpure LS前应避免洗涤细胞，因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

e.植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIpure LS中迅速研磨，每50-100mg组织加入0.75ml TRIpure LS，和步骤b一样用灭菌水调节样品体积到0.25毫升，混匀。

2.3.将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。可选步骤： 在4°C的条件下以12,000 rpm的离心力离心10分钟，取上清。杭州昊鑫生物科技股份有限公司

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如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。离心后的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织的样品时，上层是大量油脂应除去。取澄清的匀浆液进行下一步。4.每0.75ml TRIpure LS加0.2ml氯仿。盖紧管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下放置2~3分钟。5.在4°C 12,000 rpm的离心力高速冷冻离心10-15分钟。离心后混合物分成三层：下层有机苯酚氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIpure LS容量的70%。（有机层和中间层是蛋白和DNA，如果需要提取，请联系我们索取提取方法）。6.将水样层转移到一干净的离心管中，加入等体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10分钟。

RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

7.8.在室温或者4°C 12,000 rpm 离心10分钟，弃上清。

加入75%乙醇洗涤沉淀。每使用0.75ml TRIpure LS用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。9.在室温或者4°C 12,000 rpm离心3分钟，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。• 10.室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100μl RNase free水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。

第三篇：血液总RNA抽提

血液总RNA抽提

1.取250ul血清加入750ul Trizol LS（用于液体中RNA的抽提）中，剧烈震荡，静置。2.加入200ul 三氯甲烷，剧烈震荡，静置10min。3.4度，12000g 离心15min。4.吸上清至新的EP管，加入500ul(与所吸出的上清比列为1:1)异丙醇，并加入1ul的糖原，轻轻上下颠倒混匀，-20度冰箱沉淀过夜。5.4度，12000g 离心15min。留沉淀（RNA），将上清倒掉，加入1ml 75%的乙醇（DEPC水配），上下颠倒，洗涤RNA沉淀。6.4度7500g离心10min。去上清，将沉淀晾干（不能太干）加入10ul左右的Rnase free 的水溶解即可。

第四篇：invitrogen trizol rna抽提说明书

RNA抽提全过程(TRIZOL)

一，准备工作 1，实验器具与材料：

（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul

（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml

（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）

2，实验器具的处理与准备

（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）

将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。或直接购买经DEPC处理的枪头和EP管,每盒大约30元,基本上试剂公司都可以购买。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次（或180度干烤）。（3）金属制品：（镊子等）

先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：

（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶

（5）Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提时注意事项：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤 1． 匀浆化作用

取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2． 分离阶段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3． RNA的沉淀

将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。4． RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5． RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。

TRIzol法抽提总RNA

组织100mg ↓

加1mlTRIzol ↓

研磨，匀浆（研磨时倒入液氮，研磨完后从研钵转入EP管中，）（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）↓

颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）↓

颠倒混匀15S，室温5分钟 ↓

4℃，离心12000rmp，15分钟 ↓

转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中（注意勿吸入中间那层）↓

加等体积异丙醇（约400-500μl）↓

4℃，离心12000rmp，10分钟 ↓

弃上清 ↓

加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml ↓

4℃离心7500rmp，5分钟 ↓

弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）↓

溶于DEPC水中至50μl（此处可按照实际情况修改，有人用50，也有人用100）（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）↓

立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录

RNA纯度检测及定量

从36μl中取6μl，用无RNA酶的水稀释100倍至600μl，用DU70型分光光度仪分别测定样品在260nm、280nm波长的光密度值，计算出RNA的浓度（μg/ml）。

纯RNA样品的A260/A280比值为1.7-2.1，若低于此值，表明存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。RNA样品的A260/A230比值应大于2.0，若低于该标准，提示有变性缓冲液残留需重新用乙醇沉淀RNA，然后用750ml/L的乙醇洗涤，以除去残留的变性缓冲液。

RNA电泳

用无Rnase水配TAE电泳液，称1.0g新开封的琼脂糖，加TAE电泳液至100ml，煮沸，加溴乙锭20μl，降至室温后灌胶置DEPC水处理过的电泳槽中，凝固20min，加TAE 缓冲液浸没胶块。取15μl RNA加6×RNA专用上样缓冲液3μl，混匀，用移液枪将样品加入上样孔内，待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，紫外灯下观察、拍照。

上传RNA电泳条带如下

最下面条带代表5s 色浅代表RNA基本无降解

如出现拖把状条带 则为降解较严重情况

但有时这种情况也可以照样RT－PCR

我们同学就有在低温冰箱放了几个月的组织照样可以出结果的

第五篇：RNA抽提知识

RNA抽提

1：RNA抽提原理

简单地讲，RNA抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的RNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使RNA与裂解体系中的其它成分，如DNA、蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。Trizol试剂的出现基本能解决绝大部分样品RNA抽提，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流。

2：了解你的实验样品

如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：该样品的RNA含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提RNA的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择抽提方法。但同时提醒的是：没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真的了。

3：实验样品量的取用

样品与Trizol的比例。这个问题非常重要，应该获得足够的重视。Trizol的Protocol，提供了一个简单的比例，1ml 裂解液可以用于 50-100mg 组织或5-10X106个细胞；我的建议是，样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的RNA，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果(纯度及得率)没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。不同得样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。考虑后续实验，一般情况下，高丰度的样品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中丰度样品50mg/ml Trizol,低丰度样品我们可以根据客户提供的实验样品量酌情取用。重申一下，不是越多越好，在考虑样品在1ml Trizol里能充分裂解的同时，还得考虑大量的样品可能也会带来大量的杂质！利用Trizol试剂抽提血清样品时，Trizol /血清比值不要小于7/3。石蜡样品由于RNA降解严重，含量大打折扣，所以取样时应该按低丰度样品原则取用。

3：裂解方法

裂解的目的就是破坏细胞的结构，释放出里面的RNA，使其溶解于裂解液中。绝大部分样品的裂解，比如冻存的细胞，心、肝、脾、肺、肾等，利用Trizol试剂，普通的匀浆方法就可以达到满意的效果！但是如果碰到比较特殊的样品，我们可能要附加一些其他的辅助手段。1）骨骼。骨骼组织质地坚硬，普通的匀浆器根本无法使其破碎，以致RNA不能完全释放溶解在TRIZOL试剂中，碰到这种类型的样品，我们必须先利用液氮把样品破碎成粉末状，Trizol悬浮混匀再利用Minibeadbeater匀浆5分钟。取上清, 2000g 4℃离心5min再取上清 去沉淀。2）细菌 Trizol虽然对细胞的裂解效果出众，但是对细菌坚韧的细胞壁还是无可奈何，这时我们可以利用超声来辅助破壁。将细菌重悬于300ul的Trizol中，置于Bioruptor冰水浴中，M 档 30s “on”、30“off”超声处理1—2 min.取出用Trizol将体积补至1ml。3)酵母 酵母细胞跟细菌一样，还是因为细胞壁的原因，不能充分裂解。Zymolyase在37℃ 40分钟可以很好的消化掉酵母细胞壁，这里需要提醒的是消化缓冲液不能有外源性RNA酶污染，最好附加使用RNA酶抑制剂，做好了这点就不用担心这步有RNA降解的问题。4）石蜡包埋样品 石蜡包埋的组织样品在加Trizol裂解前必须先脱蜡，脱蜡的效果直接影响后续实验，所以我们为使脱蜡充分，选用高温脱蜡与二甲苯脱蜡相结合的两步脱蜡法。脱蜡后加入Trizol匀浆。5）脂肪 脂肪组织可以直接用Trizol 匀浆，这里需要提醒的是脂肪组织匀浆后，需室温静置5min，再室温7500g 离心5分钟，去除上面的脂肪层再继续后续实验！

4：分相

Trizol里含有的物质之一“酚”去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，裂解匀浆后的样品，按1ml Trizol 加200ul 的氯仿，震荡离心，绝大部分样品在这一步是不需要用特殊方法对待的，但对于蛋白含量比较高的组织样品必须要二次抽提，甚至多次抽提方可彻底去除。这里要着重提到的是血清样品！离心分相后，取上清这一步是分相实验的操作难点，一定要谨慎，万不可混入有机相污染，原则是宁缺勿滥！

5:异丙醇的沉淀

异丙醇的沉淀，目的是使RNA从裂解体系中沉淀下来，从而实现RNA与其它杂质 – 主要是盐 – 的分离。实际操作中，有的杂质也会与RNA一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。异丙醇的沉淀并不是非常特异性的，有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。在不影响后续实验的情况下，我们是可以忽略这些盐污染。有些实验样品，由于前期用药物或某种方法处理过，导致会残留有一些特殊的杂质，之所以残留，往往是因为这些杂质与RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们往往是非常强的酶抑制剂，对后续实验影响非常大。这里介绍有几种方法除去这些杂质：1）TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。2）介质纯化：遇到一些与RNA共同沉淀下来且影响后续实验的一些杂质，可以利用BioMag公司提供的连有 Oligo dT的磁珠纯化出总RNA中的mRNA，这个方法优点是基本能解决绝大多数有杂质污染的总RNA（目前没有遇到这种方法处理不了的），缺点是成本比较高。对与RNA含量少的样品，直接异丙醇沉淀得率会很低，而且基本看不见沉淀物，这也会给后续的操作带来很大的麻烦，进一步损失RNA。遇到这种情况我们可以使用一种媒介(Golycogen)跟RNA共同沉淀下来，这种媒介物质既能很好的跟RNA共同沉淀下来，又不会影响后续实验。不要迷信试剂说明书里的标准方法；有时，使用标准方法碰到问题在标准方法中是找不到答案的，要具体问题具体分析。

6：洗涤

洗涤注意四点：首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当RNA沉淀比较大时 ；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。在异丙醇沉淀后，绝大多数时是能看见管底的白色沉淀，但还是有时候是看不见的，即使是加过Golycogen的。遇到这种情况不要慌，没看见不等于没有，遇到这种情况可以先用移液器小心的吸去上清，注意枪头不要碰到管壁。加入75%乙醇，上下颠倒几次，短暂离心后用移液器吸去上清，同时仔细观察管壁是否有挂液。如果有，那没问题，可以确定沉淀都附在管壁上了。

7：RNA的溶解和保存

纯化后的RNA溶解以水为主，用无Rnase酶的水溶解的RNA基本上还算稳定，其稳定与温度成反比，与浓度成正比。所以抽提好的RNA应尽快保存在-70℃，避免反复冻融，同时注意不要把浓度稀释的太低，大概保持在1000ng/ul。如果温度合适，保存中RNA发生降解或者消失，其原因应该是酶残留导致的酶解。

8：RNA质量的检测问题

将抽提好的RNA直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，不可全信。目前实验室用于正式实验前检测RNA质量的方法，一是电泳，二是NANO-Drop。电泳检测的主要是RNA的完整性和大小，该方法还是比较可信的；同时电泳还可以用于估计核酸的浓度，其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。NANO-Drop检测的是纯度和核酸含量。然而，由于NANO-Drop不能确保非常准确，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行NANO-Drop检测和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用大惊小怪。（A260/A280 比值低 – 蛋白质残留但更可能是苯酚残留。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差可初步判断是苯酚残留。）