第一篇：基因工程综述
植物基因工程技术及其应用进展
摘 要:近几年来植物基因工程的研究进展十分迅速。在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改变植物的某些成份方面都巳得到不少转基因植株,有的巳经建成了品系。为提高作物的产量、抗逆能力、改进它们的品质,进行快速、优质、稳产的良种选育提供了一条全新的诱人的途径，将给人类社会带来一场深刻的变革，我们有必要了解植物基因工程的概念、原理、技术程序，以及在农业、工业等方面的应用和进展情况。
关键词:植物基因工程 原理 技术程序 应用进展
正文
（一）植物基因工程是近几年发展起来的分子生物技术。基因工程是按照人们的意愿,把一种生物的有用基因提取或合成出来,在生物体外对DNA分子进行剪切、拼接、修饰和重新组合,然后转移到受体细胞内进行组织培养和无性繁殖,在受体细胞内复制并得到表达,产生受体细胞新的遗传性状,产出人类所需的基因产物。利用植物基因工程技术,改良作物蛋白质成分,提高作物中必需的氨基酸含量,培育抗病毒、抗虫害、抗除草剂、抗盐、抗旱等抗逆境植株,有的已建立了品系,为快速培育优质、高产的良种开辟一条全新途径,并展示了植物基因工程在未来农业生产中的诱人前景。
1、目的基因的获取
开展植物基因工程的工作,首先必须取得目的基因。获取目的基因的途径有直接分离和人工合成法。
1.1目的基因的分离
直接分离是用在核苷酸序列中具有特定切点的DNA限制性内切酶将供体细胞中含目的基因的DNA片段切取分离出来。
1.2人工合成基因
目前人工合成基因的方法主要有:一是以目的基因转录成的mRNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的催化下合成双链DNA,而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应mRNA序列,然后按照碱基互补配对的原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法以四种脱氧核苷酸(dNTA)为原料合成目的基因。三是通过DNA序列自动测序仪对提出的目的基因进行核苷酸序列分析,采用聚合酶链式反(PCR)技术,快速、简便地扩增目的基因的DNA片段。其基本方法是:先提取植物的染色体DNA或RNA,对于RNA,需经过逆转录酶合成第一链cDNA,然后以染色体DNA或第一链cDNA为模板,以人工合成的一对寡聚核苷酸为引物,在dNTP存在下,通过DNA模板的变性、模板与引物的退火及引物的延伸3个阶段的多次循环,来扩增目的基因。
2、目的基因的修饰
目的基因分离出来后往往需要经过一些修饰,让它们能够和更好的在转基因植物中进行表达。生物体细胞中存在着对基因表达的调控机制,使基因能够有序地表达。在基因DNA分子上有结构基因,在结构基因的上游有协调配合,共同对结
构基因的表达起调控作用的操纵基因、启动子和调节基因。
3、目的基因转移到植物受体细胞的方法
3.1植物基因工程运载体及与目的基因的结合
植物基因工程实验常用土壤农杆菌Ti质粒作载体,需删除原Ti质粒上的致病基因并用抗生素抗性基因代之。已发展出了共整合型载体和双元载体两套载体系统。也可用DNA病毒等材料构建载体。Ti质粒是根癌农杆菌细胞核区外存在的一种双链DNA分子,其长度约200-250kb。Ti质粒有4个同源区,其中T-DNA区和Vir区与基因的转移和表达有关。T-DNA能转移到植物受体细胞并整合到染色体基因组,称转移DNA.将目的基因与运载体结合,实际上是不同来源的DNA重组过程。首先用一特定的限制性内切酶切断运载体产生粘性末端,然后用同一种限制性内切酶切断目的基因,使其产生相同的粘性末端,由同一种限制性内切酶切断得到的两个DNA片段的粘性末端可通过碱基互补配对而结合,并在DNA连接酶的催化作用下,DNA链的5c磷酸基与一相邻的DNA链的3c羟基形成磷酸二酯键连接起来,形成重组DNA分子。
3.2 DNA直接转移法
直接转移法是利用物理化学方法将外源基因直接转入受体植物细胞的技术。聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等尤其是聚乙二醇是常采用的协助基因转移的聚合物,这些聚合物和二价阳离子如Ca、Mg、Mn及DNA可在原生质体表面形成沉淀颗粒,通过原生质体的内吞作用而被吸收。电击法是将植物细胞酶解去壁获得原生质体,并与外源基因混合置于电激仪的样品室中,在适当外电压作用下,进行短时间(Ls-ms)直流电脉冲,细胞膜被击穿而使外源基因导入原生质体内。基因枪法是将外源基因吸附在钨、金等金属微粒(1Lm)表面,然后以400mPs的速度直接射入受体植物细胞,微弹携带外源基因穿透细胞壁和细胞膜进入受体植物细胞而实现基因转移。此外,还有激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法和花粉管通道法等。
4、植物转化细胞的筛选和转基因植物细胞的组织培养
目前,转化细胞与未转化细胞的区分及未转化细胞的淘汰常采用抗生素抗性基因和抗除草剂基因,即筛选标记基因和筛选试剂。就是将有抗性的筛选标记基因同时转移进植物细胞中去,然后在筛选试剂的作用下,未转化的细胞受到抑制,转化的细胞被赋予抗性而能继续存活、分裂和分化成株。
植物细胞的全能性指植物细胞具有全套遗传信息,在特定的适当环境下仍能够进行表达,培养成为一个完整的植物体。DNA直接转移法是将DNA通过一定手段直接导入到植物的原生质里或细胞中去,然后将它们放在适当的培养基表面进行培养,使其形成愈伤组织,最后诱导出苗并培养成植株。
5、目的基因的表达和鉴定
大多数转基因植物的外源基因的表达都相当低,现在认为这是由于外源基因插入的位点效应引起的;另外,外源基因的表达会受到植物体自身的同源基因或先前转入的外源基因中的同源序列的影响而常表现为外源基因失活。
目的基因在其转化后获得的转基因植物中能否有效表达,转基因植物能否表现出特定的遗传性状,并稳定地遗传给后代,可借助植株的表型、PCR方法鉴定和筛选转化植株,或取植物细胞或愈伤组织的提取物检测外源基因表达的生成物来鉴定。
（二）让我们来了解一下基因工程在农业、工业及环境保护、医药、食品等方面的应用。随着生命科学和基因工程技术的进一步发展和完善，越来越多以基因工程改良的植物、动物和微生物品种已经或将要应用于社会生产。农业生产的方式必将发生重大的改变，农产品的产量和质量将大幅度提高；许多高耗能、高污染的化工产业将可能被低耗能、低污染的基因工程产业所取代等等。
1、基因工程在农业方面的应用。
基因工程技术对农业发展具有举足轻重的作用。我国的杂交水稻技术使水稻的产量有了大幅度的提高，为解决我国和世界粮食问题做出了巨大的贡献。我国杂交水稻研究中心的科学家与美国科学家的联合研究发现了一个高光合效率的基因，专家们的分析认为，如果将此高光合效率基因转移到杂交水稻中，则杂交水稻的产量有可能在原有的基础上再提高20%。虫害是降低农作物产量的主要原因之一，全世界每年都因虫害要损失数千亿美元。化学杀虫剂的长期和大量使用已经产生出许多严重的问题，而用基因工程方法培育出的能抗虫害，不需要施用农药，对人、畜食用安全的作物，则不仅能提高种植的经济效益，而且能有效地保护我们的生存环境。
2、基因工程在工业及环境保护方面的应用。应用基因工程技术，使植物成为能替代微生物发酵设备的生物反应器，更经济地生产出人类所需要的各种原料已经成为非常具有吸引力的领域。现在已经培育了多种可作为生物反应器的转基因植物，能产生出可分解的塑料原料、石油、工业用脂肪、糖类和酶类等。环境保护是人类目前面临的与人类前途生死攸关的重大问题。基因重组技术为解决这些问题提供了可能性，通过基因重组，人们可以根据需要将某种微生物的基因转移到另一种微生物中，创造一些对有害物质分解能力更强、更能适应环境要求的新菌种。利用微生物分解各种废弃物的同时能产生出重要的工业原料是转基因微生物应用的一个重点。
3、植物基因工程在食品方面的应用
按转基因的功能大致可以分为以下几种类型：⑴增长型。家作物增产与其生长、分化、肥料、抗逆、抗虫害等因素密切相关，故可转移成修饰相关的基因达到增产效果。⑵控熟型，通过转移或修饰与控制成熟期有关的基因可以使转基因生物成熟期处迟或提前，以适应市场需求；⑶高营养型，从改造种子贮藏蛋白质基因入手，使其表达的蛋白质具有合理的氨基酸组成；⑷保健型，通过转移病原体抗原基因或毒素基因至粮食作物或果树中，人们吃了这些粮食和水果，相当在在补充营养的同时服用了疫苗，起到预防疾病的作用；⑸新品种型，通过不同品种间的基因重组形成新品种，由其获得的转基因食品可能在品质、味和色香方面具有新的特点；⑹加工型，由转基因产物作原料加工制成，花样最为繁多。
4、基因工程在医药方面的应用。
在医药方面，基因工程主要用来生产各种重要的人用蛋白药物，迄今为止，人们已经分离和克隆了300多种不同的人用蛋白药物的基因，其中有数十种基因已经在不同的宿主中进行了表达和对其表达产物进行了功能分析和检测，有20多种经批准已经投放市场，如通过转基因微生物生产的干扰素、胰岛素、人和动物用生长激素等。
（三）我们了解一下基因工程的进展状况。基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，而且也已经取得了许多重要的应用成果，但我们也应该看到，基因工程技术不是一项已经成熟的技术，仍然还很粗糙和原始，在许多方面尚需完善和改进。
1、基因工程在技术上存在一定的不确定性和盲目性。
这种不确定性表现在两个方面，一是技术方面的不稳定性，二是由于对不同生物的生理特性的了解不很深入，如我们将鱼类抗冻蛋白基因转移到不抗寒的罗非鱼等热带鱼中，虽然抗冻蛋白基因得到表达，但并没有使受体鱼产生预期的抗寒效果。目前我们所进行的基因工程基本上只能对简单的、单基因控制的性状进行设计和改造，操作对象只限于一些比较简单的单因子基因。但生物绝大部分的重要性状是由多个基因共同控制的，对这些多基因控制的性状，现有的基因工程技术几乎仍然是束手无策。我们对活的生物体中基因表达调控的机制知之甚少，有关的知识仅限于对启动子和增强子有所了解，对生物体整体的调节复杂性的认识还刚刚开始。
2、在安全性方面存在着不确定性。
对社会大众来说，最主要和最关心的是基因工程的安全性问题，基因工程的安全性问题包括两个方面：一是基因工程产品的消费安全问题，二是转基因生物的生态安全问题。目前用转基因技术生产出来的食品因其成分的某些改变是否会对人类的健康产生不良的影响，这需要实验和时间来验证。有着某种生存优势的转基因生物如果进入到自然生态系统，就有可能排挤自然种群，降低生态系统里物种的多样性，打破生态平衡。
所以我们在大力发展转基因技术的同时，必须高度重视对转基因动物、植物及微生物品种的生物控制和控制技术的研究。在转基因品种的安全性没有进行全面的评估和没有可靠的生物控制措施之前，应严格禁止其进行生产和进入开放的自然生态系统，只有其生态安全性达到了传统育种方法培育的新品种时，或无生殖能力的转基因动物和植物才能允许进入自然界进行生产，也只有这样才是有益于人类和社会进步的。
第二篇：基因工程
宁波大学科学技术学院考核答题纸
（2011--2012学年第 学期）
课号：:EK5G04A00
课程名称：现代生物技术概论
阅卷教师：
班级：10级生物工程
学号：104177306
姓名：郭兆峰
成绩：
基因工程
摘要：基因工程是20世纪70年代在分子遗传学、细胞生物学基础上发展起来的，是一种可以按照人们的意愿设计、改造和组建生物品种的新技术。包括它通过基因操作，将目的基因活DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状。
关键词：生物技术；基因工程
一、基因工程的诞生：
从20世纪40年代开始，受分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学取得巨大进步，为基因工程的诞生奠定了基础。现在人们公认的诞生日期是1973年，其中现代分子生物学领域上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性作用。
理论上的三大发现包括：第一，20世纪40年代，Avery 在美国的一次学术会上报道了肺炎球菌的转化，证明了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的双螺旋结构以及半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题；第三，20世纪50年代末的“中心法则”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操纵分子学说，并成功的由一批科学家破译了遗传密码从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。
以上问题的解决使得人们自主改造生物遗传性状从理论上成为现实。
技术上的三大发明：第一，1967年发现的DNA连接酶，以及1979年发现的具有更高活性的T4 DNA连接酶。在1970年Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化的限制性核酸内切酶HindⅡ和1972年发现的EcoRⅠ核酸内切酶。后来发现的大量的限制性核酸内切酶。第二，一些病毒、质粒和噬菌体等载体技术的发现使把目的基因的导入更加容易。第三，DNA分子序列分析及琼脂糖凝胶电泳、Southern杂交技术的发展使得基因工程的诞生越来越近。1973年，斯坦福大学将抗四环素质粒和抗新霉素的质粒用限制性内切酶切割并连接成重组质粒导入到大肠杆菌中是基因工程诞生的标志。
二、基因工程有几个重要特征：（1）、打破了物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）、通过已知功能基因的遗传转化，进行物种的定向改良；（3）、创造出自然界中本来不存在的物种。
三、基因工程技术流程包括：（1）、目的基因克隆，即从特定生物基因组和cDNA中分离提纯和扩大繁殖目的基因；（2）、选择合适的载体，并对载体DNA进行克隆；（3）、将目的基因与载体宁波大学科学技术学院考核答题纸
（2011--2012学年第 学期）
课号：:EK5G04A00
课程名称：现代生物技术概论
阅卷教师：
班级：10级生物工程
学号：104177306
姓名：郭兆峰
成绩：
连接；（4）、将重组DNA导入到大肠杆菌或酵母菌体内培养；（5）、利用载体上的标记基因进行筛选，获得转目的基因的细胞或植株。
四、基因工程的应用：
（1）基因工程应用于农业生产方面：农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。
（2）基因工程应用于医药方面：目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和核苷酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。
（3）基因工程应用于环保方面：基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。
五、基因工程的安全性问题：
自基因工程诞生以来，基因工程的安全性问题就受到人们极大的关注，关于重组DNA潜在的危险性问题的争论，在基因工程还处于酝酿阶段的时候就已经开始。争论的焦点是担心基因工程宁波大学科学技术学院考核答题纸
（2011--2012学年第 学期）
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姓名：郭兆峰
成绩：的杂种生物会从实验室溢出，在自然界造成难以抑制的灾难，有害的杂种菌或病毒与化学物质不同，它们会在自然界不断繁殖，造成的危害更大。
在1975年2月，美国国立卫生研究院（NIH）在加利福尼亚州的Asilomar 会议中心内，160名来自美国和16个国家的专家学者对重组DNA的危害辩论，虽然与会代表分歧挺大，但最后也达成了一些重要的共识，在1976年6月23日美国NIH制定并公布了《重组DNA研究准则》。为了避免可能造成的危害，除了规定禁止若干类型的重组DNA实验外，还制定了许多具体的规定条文。
六、基因工程的前景展望：基因工程技术是继工业革命、信息革命之后 对人类社会产生深远影响的一场革命。它在基因制药、基因诊断、基因治疗、基因芯片和基因克隆等技术方面取得的革命性成果，将极大地改变人类生命和生活面貌。
参考文献：
1、基因工程/楼士林，杨盛昌，龙敏南等主编.—北京：科学出版社，2002
2、基因工程技术/钟卫鸿主编.—北京：化学工业出版社，2007.6
3、基因工程/何水林主编.—北京：科学出版社，2008
4、基因工程原理与技术/刘志国主编.—2版.—北京：化学工业出版社，2010,12
5、基因工程：原理、方法与应用/徐煜泉等编著.—北京：北京大学出版社，2008.12
第三篇：基因工程
《基因工程论文》
嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建
学
院：生命科学学院 班
级：生物技术12-2 学
号：7011208209 姓
名：陈 昆 任课教师：张锐
嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建
摘要﹕从以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长的解烃菌———地芽孢杆菌MD-2细胞中获得了1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA。将基因sladA克隆到质粒pSTE33上,构建了重组质粒pSTalk。通过电转化将pSTalk转化入嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3内,构建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜热和解烃的功能,在70℃条件下,14d后对原油的降解率达75.08%。研究结果表明,可以通过体外重组的方式向嗜热菌中引入烃降解基因,从而构建嗜热解烃基因工程菌。关键词:微生物采油;烃类降解菌;嗜热解烃基因;质粒;基因工程菌
微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要机理之一。研究结果表明,在解烃菌作用下原油的族组分发生变化,轻质组分增加,粘度下降,改善了原油的流动性;同时,解烃菌还可以将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质。迄今为止,从自然界筛选的高效解烃菌绝大多数为嗜温微生物,最适合生长温度一般为20-45℃,很难适应油藏的高温环境。笔者从1株解烃菌细胞中分离出1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段将此基因转化到另外1株最适合生长温度为70℃的嗜热菌体内,构建了嗜热解烃基因工程菌SL-21。该基因工程菌既具有高效的解烃功能,又能适应油藏高温环境,在微生物采油中具有良好的应用前景。1.1 实验材料
实验材料包括限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR片断回收试剂盒;大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α;pGEM-T easy载体;质粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培养基按文献配制。无机盐培养基组成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸馏水100mL;pH值为7.2。嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3,分离自胜利油区孤岛油田中一区馆3区块采出液,最适合生长温度为70℃;地芽孢杆菌MD-2,以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长,分离自胜利油区原油污染土壤。1.2 实验方法
DNA的操作 基因组DNA小量提取,利用聚合酶链式反应(PCR)对DNA扩增、PCR产物的回收、酶切与连接,质粒DNA提取和基因序列测定等均按文献[13-14]方法进行。菌株培养 所涉及到的菌株培养均在温度为70℃,转速为180r/min的条件下进行振荡培养。基因工程菌的构建和筛选方法 ZJ-3感受态细胞的制备按文献[13-14]方法进行。用构建的重组质粒pSTalk在最佳条件下电转化ZJ-3感受态细 胞构建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB琼脂平板上挑选10个阳性克隆接种到5mL LB培养基中,培养过夜,获得种子液。将该种子液接种到200mL以液蜡为惟一碳源的无机盐培养基中,培养5d后用CCl4抽提剩余的液蜡,用红外测油仪测定烃的剩余量,根据菌株降解液蜡的速率筛选出目的基因工程菌。基因工程菌的诱导表达及SDS-PAGE检测挑取阳性克隆接种于含100μg/mL Amp的10mL的LB液体培养基中,180r/min下振荡培养至光密度值达到0.6(检测光波波长为600nm),加诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,振荡培养8h,收集表达菌体,加SDS上样缓冲液,于100℃水浴10min后上样,用12%的SDS-PAGE电泳检测。基因工程菌降油能力测试 将基因工程菌接入20mL LB培养基中,培养12h,以5 000r/min的速度离心5min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体1次,加20mL无菌生理盐水悬浮,作为菌株利用烷
烃生长的种子液。取菌悬液按1%接种量接入200mL无机盐培养基中,加入2%孤岛油田中一区馆3区块原油或2%的液体石蜡作为惟一碳源培养,取样稀释涂布计数。原油降解实验 在无机盐培养基中添加2%的原油,按1%接种量接入基因工程菌,培养14d。用正己烷萃取降解后的原油,用气相色谱仪测定原油饱和烃组分的降解情况。原油降解率为菌株降解前、后原油量的差值与菌株降解前原油量的比值。2 实验结果与分析
2.1 MD-2基因组DNA的检测
对MD-2基因组进行提取和纯化。提取后的染色体DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,相对分子质量不小于23kb,说明提取的DNA完好。在检测光波波长为260280nm条件下分别测出DNA的光密度,其比值为1.95,换算出DNA的质量浓度为1 400g/mL,表明DNA纯度较好,无蛋白、RNA、酚和多糖物质的干扰。2.2 烷烃单加氧酶基因的克隆与序列分析依据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)中的烷烃单加氧酶基因开放阅读框两端保守序列,设计了一对兼并引物以MD-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,将约1.3kb的PCR产物回收后连接到pGEM-T easy载体上,转入E.coliDH5α,挑取阳性克隆质粒进行测序。测序结果经Genbank检索,表明该DNA序列是个新的烷烃单加氧酶基因,命名为sladA。2.3 基因工程菌的构建及筛选
通过PCR扩增sladA后,将PCR产物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分离纯化出1 329bp的片断,与经EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33质粒连接,构建成含sladA的重组质pSTalk。经电泳鉴定表明(图1),重组质粒构建成功。
2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的诱导表达
由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE图谱可见(图2),在烷烃单加氧酶基因sladA对应蛋白大小的地方扫描到高信号强度,表明sladA基因在SL-21中得以表达。2.5 基因工程菌SL-21碳源生长
基因工程菌SL-21在以原油和液体石蜡为惟一碳源的无机盐培养基中培养,在70℃和180r/min条件下,经过3d的延滞期后进入对数期,菌体数增加。17d后,菌体数为接菌初期的5倍,表明SL-21能够利用原油或液体石蜡作为惟一碳源生长。2.6 对原油的降解作用
由原油饱和烃组分的降解情况可看出(图3),基因工程菌对原油有很明显的降解效果,几乎将饱和烃降解完全。经对气相色谱各峰面积对比,计算出各峰面积的含
量和饱和烃组分降解率(表2)。基因工程菌SL-21对原油的降解率为75.08%。
实验结果表明,烃类降解菌地芽孢杆菌MD-2细胞提取的烷烃单加氧酶基因sladA可以在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中表达。但不同的基因工程菌株中烷烃单加氧酶基因sladA表达的效率不同,需要通过菌株对原油的降解评价进一步筛选。获得的对原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高温条件下生长,并且对原油降解效果明显。因此以体外重组方式向嗜热菌中引入烃类降解基因构建嗜热解烃基因工程菌在技术上是可行的。3 结论
以地芽孢杆菌MD-2为目标菌株,克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因sladA,并在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中正确表达了基因sladA,构建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃条件下,能以原油或液体石蜡为惟一碳源生长。14d对原油的降解率为75.08%,对原油饱和烃组分均有明显的降解效果。该基因工程菌既可以用于微生物驱油技术,又可以用于高温油田污水的生物处理。利用基因工程的方法可以获得既能耐受极端环境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌种选育的重要方向。参考文献: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烃降解菌的筛选及性能研究[J].大庆石油地质与开发,2007,26(6):119-123.[2] 汪卫东,汪竹,耿雪丽,等.美国微生物采油技术现场应用效果分析[J].油气地质与采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁长忠,宋永亭,段传慧.微生物采油用营养物质在石英砂上的静态和动态吸附规律[J].油气地质与采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龙,董汉平,俞理,等.微生物提高采收率数值模拟研究现状[J].油气地质与采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花丽.本源微生物降解原油的饱和烃色谱分析[J].油气地
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第四篇：基因工程
基因工程技术的程序与应用
【摘要】基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，它将给人类社会带来一场深刻的变革，我们有必要了解基因工程的概念、原理、技术程序，以及基因工程在农业、工业、医药等方面的应用和进展情况。
【关键词】基因工程技术程序应用进展
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，在分子水平上对基因进行复杂的操作，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
一 基因工程的技术程序
基因工程的基本原理是在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成镶嵌DNA分子，然后将之导入宿主细胞，使其扩增表达，从而使宿主细胞获得新的遗传特性，形成新的基因产物。它有3个基本的步骤：①从合适材料分离或制备目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段与载体连接作成重组DNA分子。③重组DNA分子引入宿主细胞，在其中扩增和表达。不同种类生物的生物学特性不同，其基因工程在操作上和具体技术上必然有所差异，但技术核心都是DNA的重组，即利用一系列的DNA限制性内切酶、连接酶等分子手术工具，在某种生物DNA链上切下某个目标基因或特殊的DNA片段，然后根据设计要求，将其接合到受体生物DNA链上。
一个完整的用于生产生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：①外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。②适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。③外源基因的导入。④外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。⑤外源基因表达产物的生理功能的检定。⑥转基因新品系的选育和建立以及转基因新品系的效益分析。⑦生态与进化安全保障机制的建立。⑧消费安全评价。
（一）外源目标基因的分离、克隆及功能结构分析
获合乎人类某种需要的取目的基因是实施基因工程的第一步，也是开展一项基因工程的前提和全部工作的核心。目前人们已经能够通过多种途径和方法来获取目标基因，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），1
从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。
（二）构建能在受体生物细胞中表达的重组目标基因
要使一个外源目标基因能整合到受体细胞的基因组中并能在整合后在受体基因组的调控下有效地转录和翻译，就必须事先对目标基因的功能结构用DNA重组技术进行适当的修饰，也就是将目标基因与一种特别的DNA分子重组，这种特别的DNA分子称为基因载体，目前所用的载体主要有以下几类：质粒、λ噬菌体、柯斯质粒、病毒载体、YAC载体等，各类载体具有独特的生物学特性，可用于不同的目标基因。
（三）外源重组目标基因的导入
将重组的外源目标基因转入到宿主细胞中的过程称为基因导入或基因转移。接受外源基因的细胞称为受体细胞。由于受体生物学特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因导入的方法也不同，有的是用载体导入，有的是直接用物理的方法导入。目前使用的有转化、转染、电穿孔导入法、基因枪射入法、显微注射法、脂质体介导法等，向细菌等微生物中导入外源目标基因常用质粒转化和噬菌体转染方法；向植物细胞中导入外源基因常用基因枪注入法和Ti质粒导入法；能由原生质体再生出植株的植物细胞还可以用电穿孔导入法及脂质体融合法；动物的受精卵一般通过人工显微镜注射法导入外源基因；动物的体细胞可用电穿孔法和病毒转染法导入外源基因，但对用于生产目的的基因工程常常避免用病毒转染法。
（四）转基因细胞或个体的鉴别和筛选
在对宿主的细胞进行了外源目标基因导入处理以后，有些细胞可能并没有外源基因的进入，另有一些细胞可能在外源基因进入后因各种原因而不能使外源基因表达，因此必须对被进行了基因转移处理的细胞或个体进行鉴别，以筛选出导入外源目标基因的转基因细胞或个体。鉴别和筛选转基因生物一般在两个层面上进行：一是检测目标基因是否表达，二是检测目标基因是否整合到了宿主的染色体上和能否稳定传代。表达检测的方法主要有转录产物的印迹杂交法、免疫印迹检测法、免疫组织化学检测法等。整合检测可通过DNA分子杂交来确定。
（五）转基因品系的效益分析。
一个生产性能优越的转基因品系，首要的条件是目标基因的表达产物必须有正常的生理功能，另一个必要标志是其目标基因必须有适度的高效表达特性和可持续生产能力。
（六）生态与进化安全保障
由于转基因生物与其他生物一样具有可遗传、易扩散及自主的特性，而且人类对生命、生态系统、生物的演化实际上还知之甚少，对不同物种间基因的人工组合，外源基因对受体生物进化的可能影响，转基因生物对生态系统的长期影响
等都无法进行评估，因此如果人们不事先采取控制措施，转基因生物一旦进入到自然环境中就可能打破生态平衡，破坏生态环境和自然种质资源。对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去；生物的方法一般就是造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离，如利用三倍体不育的特性将用于生产的转基因动物或植物变成三倍体等。
（七）消费安全评价
消费安全评价一般要考虑以下一些主要的方面：①导入外源目标基因本身编码的产物是否安全。②外源目标基因是否稳定。③使用的载体是否安全。④使用的报道基因（就是能产生很容易观察的性状的基因）是否会产生有害物质。⑤外源基因导入后是否会诱导受体生物产生新的有害遗传性状或不利于健康的成分。为了保护人类的健康，许多国家都已通过立法或其他形式对转基因产品进行消费安全评价和严格的管理，对进口转基因食品严格限制。
二 基因工程的应用
基因工程在医药业中的应用。许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。如基因工程胰岛素、干扰素、人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。
基因诊断与基因治疗。遗传病是长期困扰人类的一类不治之症，迄今已发现的有3000多种。其根源于遗传基因存在缺陷，主要特征是可随生育而传代。基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。基本方法是：基因置换、基因修复、基因增补和基因失活等。如运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。
基因工程在农牧业、食品工业上的应用。运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。如转基因鱼（生长快、耐不良环境、肉质好），转基因牛（乳汁中含有人生长激素），转黄瓜抗青枯病基因的甜椒，转鱼抗寒基因的番茄，转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯，不会引起过敏的转基因大豆，抗虫棉等。
基因工程在环境保护工业方面的应用。基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。如有一种超级细菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。这种超级菌是美国科学家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一个菌株内而产生的。
总之，基因工程的发展将会给人类社会带来巨大的变化。
三 基因工程的进展状况
基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，而且也已经取得了许多重要的应用成果，但我们也应该看到，基因工程技术不是一项已经成熟的技术，仍然还很粗糙和原始，在许多方面尚需完善和改进。
1．基因工程在技术上存在一定的不确定性和盲目性。目前的基因工程在技术上有很多的不确定性。这种不确定性表现在两个方面，一是技术方面的不稳定性，二是由于对不同生物的生理特性的了解不很深入，如我们将鱼类抗冻蛋白基因转移到不抗寒的罗非鱼等热带鱼中，虽然抗冻蛋白基因得到表达，但并没有使受体鱼产生预期的抗寒效果。目前我们所进行的基因工程基本上只能对简单的、单基因控制的性状进行设计和改造，操作对象只限于一些比较简单的单因子基因。但生物绝大部分的重要性状是由多个基因共同控制的，对这些多基因控制的性状，现有的基因工程技术几乎仍然是束手无策。我们对活的生物体中基因表达调控的机制知之甚少，有关的知识仅限于对启动子和增强子有所了解，对生物体整体的调节复杂性的认识还刚刚开始。
2．在安全性方面存在着不确定性。对社会大众来说，最主要和最关心的是基因工程的安全性问题，基因工程的安全性问题包括两个方面：一是基因工程产品的消费安全问题，二是转基因生物的生态安全问题。目前用转基因技术生产出来的食品因其成分的某些改变是否会对人类的健康产生不良的影响，这需要实验和时间来验证。有着某种生存优势的转基因生物如果进入到自然生态系统，就有可能排挤自然种群，降低生态系统里物种的多样性，打破生态平衡。
所以我们在大力发展转基因技术的同时，必须高度重视对转基因动物、植物及微生物品种的生物控制和控制技术的研究。在转基因品种的安全性没有进行全面的评估和没有可靠的生物控制措施之前，应严格禁止其进行生产和进入开放的自然生态系统，只有其生态安全性达到了传统育种方法培育的新品种时，或无生殖能力的转基因动物和植物才能允许进入自然界进行生产，也只有这样才是有益于人类和社会进步的。
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第五篇：材料基因工程
材料基因工程
——为什么是一项“颠覆性前沿技术”
1.前言
材料基因组技术是近几年兴起来的材料研究新理念和新方法，是当今世界材料科学与工程领域的最前沿。材料基因工程借鉴人类基因组计划，探究材料结构与材料性质变化的关系。并通过调整材料的原子或配方、改变材料的堆积方式或搭配，结合不同的工艺制备，得到具有特定性能的新材料。但是材料基因组与人类基因组的又有很大的区别，材料的微观结构多样化，不但成分组成可以不同，微观形貌等结构也可能千差万别，其组成-结构-性能之间的关系更加复杂。
2.材料基因组技术
2.1材料基因组技术
材料基因组计划是通过“多学科融合”实现“高通量材料设计与试验”；其核心目标在于通过“高通量计算、实验和大数据分析”技术加速材料“发现-研发-生产-应用”全过程，缩短材料研发周期，降低材料研发成本，引发新材料领域的科技创新和商业模式变革。
材料基因组技术包括高通量材料计算方法、高通量材料实验方法和材料数据库三大组成要素。
2.1.1高通量材料计算方法
高通量计算是指利用超级计算平台与多尺度集成化、高通量并发式材料计算方法和软件结合，实现大体系材料模拟、快速计算、材料性质的精确预测和新材料的设计，提高新材料筛选效率和设计水平，为新材料的研发提供理论依据。其中并发式材料计算方法包括第一原理计算方法、计算热力学方法、动力学过程算法等，跨越原子模型、简约模型和工程模型等多个层次，并整合了从原子尺度至宏观尺度等多尺度的关联算法。
高通量材料集成计算技术利用第一性原理、分子动力学与位错动力学、合金相图计算、相场计算等方法，快速并行模拟实验室中成分与性能优化的传统试错式材料研发过程，并基于材料科学知识，迅速挑选有利于目标性能的合金成分与微观结构特征，从而加速新材料的研发进程并显著降低材料研发成本。
2.1.2高通量材料实验方法
传统材料研发模式依赖于成分与工艺的不断“试错”实验优化，结合对结构-性能关系的不断理解以获得满足性能指标的材料。但是，新型关键材料具有成分多元化、复杂化、微结构多级化等特点，传统的“试错”模式在实际材料开发中不仅耗费巨大，而且几乎难以取得成功。
高通量实验平台是发展材料基因组技术具备的条件之一。高通量实验平台可以为据库提供数据支撑；而就高通量集成计算而言，高通量实验技术为各种计算模拟工作提供计算目标。材料基因组概念中的高通量实验技术具有快速制备快速表征各类金属与非金属样品的能力，典型的高通量实验方法有扩散多元结与材料基因芯片
2.1.3材料数据库
数据可以看作是感兴趣参量的具体数值，这些参量在空间与时间上的一系列数值就构成数据集，不同的数据集结合到一起并按照一定的协议实现相互调用，体量巨大、结构性的数据集就构成大数据。利用物理层面的分布式服务器对随时间不断膨胀的数据集进行存放，利用通讯协议实现服务器中数据集的远程调用与管理，利用专门的算法对不同数据集自身和数据集之间进行分析并提取有价值的信息，并用专门的软件实现数据分析的可视化，就构成了基于大数据方法的材料数据库技术。
材料信息学通过数据管理、数据分析与数据协作，实现从已有数据中提取高价值信息和知识的目的。由于计算材料数据库是综合物理，化学及生物的交叉学科的数据库。因此，材料数据库的建立，有利于减少材料的重复实验和测试，对缩短新材料的研发周期，节约新材料的研发成本具有非常积极的作用
2.2结论
材料计算模拟是实现“材料按需设计”的基础，可以帮助缩小高通量材料实验范围，提供实验理论依据；高通量材料实验起着承上启下的角色，既可以为材料模拟计算提供海量的基础数据和实验验证，也可以充实材料数据库，并为材料信息学提供分析素材，同时还可以针对具体应用需求，直接快速筛选目标材料；材料数据库可以为材料计算模拟提供计算基础数据，为高通量材料实验提供实验设计的依据，同时计算和实验所得的材料数据亦可以丰富材料数据库的建设。
3．结论
材料基因组技术融合了材料科学、固体力学、信息科学、软件工程、先进实验方法等学科，采用数值模拟、数据库及数据挖掘、人工智能等技术研究材料的工艺过程、微/细观结构、性能和服役行为等，阐明成分、微结构和工艺对性能的控制机制，引导并支撑实体材料的研发和应用。
在材料基因工程提出之前，新材料从研发到市场应用实践跨度非常大，某种材料从最初的研究开发，经过性能优化、系统设计与集成、验证、制造再到投入市场通常需要10-20年时间。部分原因是一直以来过度依赖对材料研发的科学自觉与实验判断，目前大部分材料的设计与测试时通过耗时的重复实验完成的、而实际上，有些实验通过理论计算工具就能完成模拟。材料基因工程采用强大的计算分析和理论模拟工具，减少新材料研发和生产过程中对物理实验的依赖。改进的数据共享系统和一体化的工程团队将允许设计、系统工程与生产活动的重叠与互动。这种新的综合设计将结合更多的计算与信息技术，加上实验与表征方面的进步，将显著加快材料投入市场的种类及速度，材料的开发周期可从目前的 10~20 年缩短为 5~10 年。因此说材料基因组技术是一项“颠覆性前沿技术”
参考文献
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