基因工程教学大纲

第一篇：基因工程教学大纲

基因工程教学大纲

课程性质：专业课

课程教学目的：基因工程是分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上个世纪70年代诞生的一门新的生物技术科学。它的创立和发展，直接依赖于基因分子生物学的进步，两者之间有着密切而不可分割的内在关系。通过基因工程的教学，达到如下教学目的：

1.使学生了解和掌握基因工程的基本概念和原理； 2.使学生了解基因操作的主要技术原理和应用； 3.使学生了解基因工程的研究内容和操作规程； 4.使学生初步掌握基因工程基本的实验操作技术。课程教学原则与教学方法：

采用多媒体教学方法，并在教学过程中有机地结合以下几个基本教学原则。

1.突出直观教学的原则。通过多种直观教学形式如观察、实验、电影、投影、录相等，来丰富学生的直接经验和感性认识。

2.理论联系实际原则。在讲授理论之基础上，通过具体的实验操作使学生了解和掌握基因工程的基本操作技术和过程。

3.注重学生学习科学过程的原则。教学要将重点放在学生的学习过程上，而不是放在学习内容上，要让学生了解基因工程的科学过程。

4.既教书又育人的原则。教学过程中结合教学内容，对学生进行辨证唯物主义教育、爱国主义教育、职业道德教育等。

课程总学时：58学时；

课程教学内容要点及建议学时分配：

（一）教学内容要点

第一章 基因工程及其主要的研究内容

第一节 基因工程的诞生

1.理论基础 2.标志性研究

第二节 基因工程与相关学科之间的关系 第三节 基因工程的重要历史事件

第四节 基因工程的基本概念和主要的研究内容

1.遗传工程与基因工程 2.克隆与基因克隆 3.主要的研究内容和步骤 第五节 基因工程的安全性 1.基因工程的安全问题 2.物理防护标准 3.生物防护标准 第六节 基因工程的应用和展望

第二章 基因工程的主要技术原理

第一节 核酸的凝胶电泳

1.基本原理

2.琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰氨凝胶电泳 第二节 核酸的分子杂交

1.基本原理

2.southern印记杂交和northern印记杂交 3.菌落（或噬菌斑）杂交 第三节 细菌的转化

1.肺炎球菌的转化 2.大肠杆菌的感受态 3.大肠杆菌的转化 第四节 DNA核苷酸序列分析

1.双脱氧测序 2.化学法测序 3.序列测定的自动化 第五节 基因的定点诱变

1.盒式诱变 2.寡核苷酸引物诱变

第六节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法

1.凝胶阻滞试验 2.DNaseI足迹试验

第七节 聚合酶链式反应技术与基因扩增

1.PCR技术的基本原理和特点 2.Taq DNA聚合酶 3.寡核苷酸引物 4.PCR技术的应用

第三章 基因工程的酶学基础

第一节 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割

1.寄主控制的限制与修饰现象 2.限制性内切酶的类型和基本特性 3.II型限制性内切酶的基本特性 4.核酸限制性内切酶的命名法 5.影响限制酶活性的因素

第二节 DNA连接酶与DNA分子的体外连接

1.DNA连接酶

2.粘性末端和平末端的连接 第三节 DNA聚合酶

1.DNA聚合酶与缺口平移法制备核酸杂交探针 2.Klenow酶和DNA末端标记

3.T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段 4.逆转录酶与cDNA的合成 第四节 DNA及RNA的修饰酶

1.末端转移酶与同聚物加尾 2.T4多核苷酸激酶与5末端的标记 3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶

第四章 基因克隆的载体

第一节 质粒载体

1.质粒的一般生物学特性 2.质粒DNA的复制与拷贝数的控制 3.质粒DNA的分离与纯化 4.质粒载体的类型 5.重要的大肠杆菌质粒载体 6.质粒载体的稳定性问题 第二节 噬菌体载体

1.双链噬菌体载体—λ噬菌体载体 2.单链噬菌体载体—M13噬菌体载体 第三节 柯斯质粒载体和噬菌粒载体简介

1.柯斯质粒载体 2.噬菌粒载体

第五章 基因克隆与鉴定

第一节 DNA克隆片段的产生与分离

﹩1.基因组DNA的片段化 2.DNA片段的大小分布

第二节 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞

1.外源DNA片段同载体分子的连接重组 2.重组体分子导入受体细胞的途径 第三节 基因克隆的实验方案

1.互补作用基因克隆 2.cDNA克隆 3.基因组DNA克隆 第四节 克隆基因的分离

1.应用核酸探针分离克隆的目的基因

2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因 3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因 4.应用表达文库分离克隆的目的基因 第五节 重组体分子的选择和鉴定

1.遗传检测法 2.物理检测法

3.菌落或噬菌斑杂交筛选法

（二）建议学时分配

第一章 基因工程及其主要的研究内容 4学时 第二章 基因工程的主要技术原理 8学时 第三章 基因工程的酶学基础 8学时 第四章 基因克隆的载体 12学时 第五章 基因克隆与鉴定 12学时

课程的实践教学环节要求：实验课在理论课讲授完之后集中进行，每组原则上不超过20人。由于基因工程实验耗时长、所需仪器设备及试剂药品多而复杂等特点，实验课的开设情况根据实验条件允许进一步调整。在本院实验条件允许的情况下，将以基因工程大实验的方式连续进行，正取一周内集中完成。教材与主要教学参考书：

1.尹俊、邢万金、恩和巴雅尔、刘丽华编著。基因工程.呼和浩特。内蒙古大学出版社2006.9 2.吴乃虎 编著.基因工程原理（第二版）.北京，科学出版社.1998.3 3.陆德如，陈永青 主编.基因工程.北京，化学工业出版社.2002.7 4.萨木布鲁克等编著，金冬雁等译，分子克隆实验指南（第三板）.北京，科学出版社.2002 5.奥斯伯等 编著（美），颜子颖、王海林译.精编分子生物学实验指南.北京，科学出版社1998.6 6.第四军医大学分子生物学教研室等制作.分子生物学多媒体教程—PCR理论、实践与应用.北京，高等教育出版社.1998 7.英国皇家医学院制作，军事医学科学院译.遗传工程实验技术录象教材.1994 课程考试与评估：

1．平时成绩占40%，其中：作业和平时测验30% + 考勤10%，期末考试占60%，闭卷考试。

2．评估：系教学委员会和教研室不定期对教师的讲授情况以听课、与学生座谈等方式进行了解并作出评估，并与学生的评估结果结合，作出综合评估。

（执笔人：恩和巴雅尔）

第二篇：基因工程药物教学大纲（范文）

基因工程药物教学大纲

课程名称：基因工程药物

课程编号：0235203 学分：1.5 学时数：28

考核方式：N+2。笔记10%，考试成绩占40%，过程成绩N占50%。先修课程：生物化学、微生物学、基因工程等。课程说明：专业选修课。

一、课程的性质

基因工程技术, 不仅使整个生命科学的研究发生了前所未有的深刻变化, 而且也给工农业生产和国民经济发展带来了巨大的经济和社会效益, 给人类进步带来了新的契机。目前，基因工程学正以新的势头继续向前迅猛发展, 成为当今生物科学研究诸领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一, 特别是基因工程在医药生物技术领域中的研究和应用，其意义深远、潜力之巨大。

二、课程的目的与教学基本要求

课程目的：为了适应生物工程技术的迅速发展、拓宽专业面, 为了使学生对当今世界生物工程领域日新月异地发展的高新技术有更多的了解, 进一步扩大学生的知识面和视野，同时为他们今后从事这方面的工作和研究打下一定理论基础, 特开设该课程。

课程任务: 通过讲授基因工程制药的概貌及国内外研究进展、基因工程制药常用的工具酶和克隆载体、基因工程药物无性繁殖系的组建以及基因工程药物的生产和质量控制等, 使学生对基因工程的基本理论、基本步骤和操作技术以及基因工程药物的生产技术原理和方法有比较系统的了解, 初步掌握基因工程制药有关基本知识。

三、课程适用专业

本课程适用于生物技术专业等相关专业。

四、教学内容、要求与学时分配

第一章 基因工程制药概述(2学时)

第一节：基因工程的概貌 简述基因工程的诞生和兴起，基因工程的定义、特点与基本步骤，基因工程早期的开创性研究成就，基因工程的应用与发展趋势等。

第二节：基因工程与生物制药 简述基因工程药物的研究和发展概况，介绍应用基因工程和蛋白质工程技术研究开发的几种新型基工药物。

第二章 基因工程制药常用的工具酶(2学时)

第一节：限制性核酸内切酶 简述限制酶的发现、限制酶的种类、限制酶的命名和限制酶的特性与用途等。

第二节 DNA连接酶 重点介绍DNA连接酶连接作用的特点，基因工程中常用的连接酶(T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶)的酶活性和用途，DNA连接酶连接作用的分子机理。

第三节 DNA聚合酶 重点介绍大肠杆菌DNA聚合酶

1、Klenow大片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及、反转录酶等的酶活性和用途。

第四节 DNA修饰酶 重点介绍末端脱氧核苷酸转移酶、碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶等的酶活性和用途。

第五节 单链核酸内切酶 重点介绍S1核酸酶、Bal31核酸酶等的酶活性和用途。

第三章 基因工程制药常用的克隆载体(4学时)第一节 质粒载体 内容：质粒的定义、质粒DNA分子的特性、质粒载体的改造及构建。重点介绍基因工程制药中常用的几种质粒载体的结构和用途，主要包括pBR322及其衍生栽体、pUC系列载体。

第二节 λ噬菌体载休 内容：λ噬菌体的基本特性、λ噬菌体基因组的结构与功能、λ噬菌体DNA的改造及其载体的构建。重点介绍基因工程制药中常用的几种λ噬菌体载体，主要包括 Charon系列载体、EMBL系列载体、λgt系列载体。

第三节 M13噬菌体载体 内容包括：M13噬菌体的基本特性、M13丝状噬菌体载体的构建、常用的M13噬菌体载体，主要包括M13mp18和M13mp19载体。

第四节 粘粒（Cosmid）载体 内容：粘粒载体的构建、常用的粘粒载体。

第五节 哺乳动物细胞载体系统 主要介绍：SV40载体、BPV载体、EBV病毒载体。

第四章 目的基因的制取(2学时)

第一节 目的基因的化学合成 内容：目的基因的设计, 寡聚核苷酸片段的合成, 寡核苷酸片段的分离和纯化, 用寡核苷酸片段组装目的基因, 化学合成寡核苷酸的其它用途。

第二节 构建基因文库法分离目的基因 内容：构建基因文库法分离目的基因的基本步骤, 真核基因组DNA文库的构建过程

第三节 酶促合成法制取目的基因 内容：真核生扬细胞中的mRNA, 从构建 的cDNA文库中筛选目的cDNA, RT-PCR法合成目的cDNA。

第五章 目的基因与克隆载体的体外重组(2学时)

第一节 目的基因与质粒载体的连接 内容：粘性末端连接法, 定向克隆法,平末端连接法, 同聚物加尾法, 加人工接头连接法, 加DNA衔接物连接法, 其它转换末端形式连接法。

第二节 目的基因与噬菌体载体的连接 内容包括：噬菌体载体臂DNA的制备, 噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接。

第六章 重组克隆载体引入受体细胞(2学时)

第一节 概述 内容：基因工程的受体细胞, 重组体分子导入受体细胞的途径。

第二节 重组体DNA分子的转化或转染 内容包括：用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法, 用复合剂制备感受态细胞转化法, 高压电穿孔转化法。

第三节 重组噬菌体DNA的体外包装与转染 内容：噬菌体体外包装的基本原理, 噬菌体DNA的体外包装, 包装提取物的制备, 重组DNA的体外包装与感染方法。

第四节 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染

第七章 含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析(6学时)

第一节 重组体(菌)的筛选 内容：抗生素抗性基因插入失活法, b-半乳糖苷酶 基因插入失活法, 快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法, 放射性标记核酸探针杂交筛选法, 免疫化学筛选法。

第二节 重组体的鉴定 内容：酶切及凝胶电泳鉴定法, Southern印迹杂交法, 电镜R-环检测法, 基因产物鉴定法。

第三节 重组DNA的序列分析 内容：Sanger双脱氧链终止法DNA测序, Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序。

第八章 目的基因在宿主细胞中的表达(2学时)

第一节 外源目的基因在原核细胞中的表达 内容：原核基因表达载体的构建, 常见的原核细胞表达载体系统, 外源目的基因在原核细胞中的表达形式, 在原核细胞中高效表达目的基因, 基因定点诱变技术。

第二节 外源目的基因在真核细胞中的表达 内容：真核细胞表达载体的功能元件, 酵母菌表达系统, 哺乳动物细胞表达系统。

第九章 基因工程无性繁殖系的组建(2学时)

内容：人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建, 人a2b型干扰素工程菌的组建, 集落刺激因子工程菌的组建, 白细胞介素融合蛋白工程菌的组建, 乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建, 人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建, 红细胞生成素CHO细胞株的组建, 人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建。

第十章 基因工程药物的生产(2学时)

第一节 基因工程菌（细胞）的培养与发酵 内容包括：工程细菌的培养与发酵, 工程酵母的培养与发酵, 工程细胞的培养与发酵。

第二节 基因工程药物的分离纯化 内容包括：影响分离纯化工艺的主要因素, 各种产物表达形式采用的分离纯化方法,。

第三节 基因工程药物的分离纯化实例 内容包括：以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化, 以分泌型表达的人a1-干扰素的分离纯化, 以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化, 在酵母中表达的HBsAg的分离纯化。

第十一章 基因工程药物的检验(学生自学)

第一节 基因工程药物的质量控制 内容包括：主要的基因工程药物, 基因工程药物的特点, 基因工程药物的质量要求, 基因工程药物的质控要点, 基因工程药物的制造及检定规程。

第二节 基因工程药物常用的检验方法 内容：化学检定法, 肽图分析法，外源性DNA残留量的测定，宿主细胞蛋白杂质的检测，无菌试验，内毒素试验，异常毒性试验，热原质试验，生物学活性(效价)检定。

第三节 主要基因工程药物的检验 内容：重组人胰岛素的检验，重组人生长激素的检验，重组人干扰素的检验，重组人白细胞介素的检验，重组人红细胞生成素的检验，重组人集落刺激因子的检验，重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验, 重组人肿瘤坏死因子的检验，重组乙型肝炎疫苗的检验。

五、教材和主要参考资料

理论教学教材： 《基因工程》, 杨汝德主编，华南理工大学出版社，2006.8 主要参考教材： 《基因克隆技术在制药中的应用》, 杨汝德主编，化学工业出版社，2004.1

执笔人：阚劲松

教研室：

系主任审核签名：

第三篇：基因工程课程实习教学大纲

基因工程课程实习教学大纲

课程名称：基因工程

Gene Engineering 课程编号： 开课院系：生物科学与工程学院

实习周数： 1周 课程学时： 30学时 课程总学分： 2 适用专业： 生物科学

一、实习的性质、目的、任务

认知实习是学生进入专业课学习阶段的一个实践性教学环节。通过实地参观调查，增强学生对实际基因工程的感性认识，从而加深对课堂教学内容的理解，激发学生学习专业知识的热情，为今后创造性地从事专业工作打下良好的基础。

通过了解基因工程的操作过程、实验室设置、设备结构、工作原理等，为学生将来进入分子生物学实验室实习做好了理论知识与基因工程实践知识两方面准备。

二、实习的组织实施

基因工程课程实习主要在学生完成基因工程工程理论后，由生物科学与工程学院的领导和任课教师联系相关分子生物学实验室，组织学生去分子生物学实验室参观和参与基因工程的实验。

三、实习教学的基本要求

1.通过实习要求学生了解以下几点内容

基因工程操作的一般过程原理，包括各阶段操作原理和相应的分子生物学原理； 应能清楚基因工程操作的注意事项，并能指出所用仪器设备种类及其作用。

对一些基因工程相关的重要实验操作及其仪器设备，如PCR、分子杂交、电泳等能有清楚地了解。

2.学生应结合参观项目及课堂教学内容进行纪录、总结，并写出实习报告；报告内容除规定的流程调查等专题外，学生应结合参观项目，总结自己的参观体会。

四、实习内容

1.按知识实习讲义要求做好预习

预习基因工程操作的基本流程，掌握主要基因工程操作原理（酶切操作、连接操作、转化、检测），了解各步骤涉及的仪器设备及其使用。2.观看基因工程操作过程 将基因工程操作流程与实际设备、流程对号，初步建立分子生物学实验室的实验设备、废弃物处理等环节。

3.重要的分子操作实验，如电泳、PCR、分子杂交及一些试剂盒（如DNA提取试剂盒）4.讨论、答疑、完成实习报告。

五、实习方式和时间安排

实习方式：由教师组织学生到分子生物学实验室参观调查 时间安排：第6学期

六、实习考核和成绩评定

实习纪律：迟到、早退、出勤、安全等方面的执行情况。（30分）预习报告：（20分）实习报告：（50分）

综上面三个方面最终按优、良、中、及格和不及格评出实习成绩。

七、实习注意事项及其他

实习过程中教师必须和实习企业的相关负责人密切配合，遇到困难要协商解决，确保整个实习过程紧凑、有序、顺利和保证学生的人身安全。

制定人签名：陈明辉 制定时间： 2008年 12月 院系签章： 审核时间： 年 月

第四篇：基因工程

宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

基因工程

摘要：基因工程是20世纪70年代在分子遗传学、细胞生物学基础上发展起来的，是一种可以按照人们的意愿设计、改造和组建生物品种的新技术。包括它通过基因操作，将目的基因活DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状。

关键词：生物技术；基因工程

一、基因工程的诞生：

从20世纪40年代开始，受分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学取得巨大进步，为基因工程的诞生奠定了基础。现在人们公认的诞生日期是1973年，其中现代分子生物学领域上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性作用。

理论上的三大发现包括：第一，20世纪40年代，Avery 在美国的一次学术会上报道了肺炎球菌的转化，证明了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的双螺旋结构以及半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题；第三，20世纪50年代末的“中心法则”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操纵分子学说，并成功的由一批科学家破译了遗传密码从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

以上问题的解决使得人们自主改造生物遗传性状从理论上成为现实。

技术上的三大发明：第一，1967年发现的DNA连接酶，以及1979年发现的具有更高活性的T4 DNA连接酶。在1970年Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化的限制性核酸内切酶HindⅡ和1972年发现的EcoRⅠ核酸内切酶。后来发现的大量的限制性核酸内切酶。第二，一些病毒、质粒和噬菌体等载体技术的发现使把目的基因的导入更加容易。第三，DNA分子序列分析及琼脂糖凝胶电泳、Southern杂交技术的发展使得基因工程的诞生越来越近。1973年，斯坦福大学将抗四环素质粒和抗新霉素的质粒用限制性内切酶切割并连接成重组质粒导入到大肠杆菌中是基因工程诞生的标志。

二、基因工程有几个重要特征：（1）、打破了物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）、通过已知功能基因的遗传转化，进行物种的定向改良；（3）、创造出自然界中本来不存在的物种。

三、基因工程技术流程包括：（1）、目的基因克隆，即从特定生物基因组和cDNA中分离提纯和扩大繁殖目的基因；（2）、选择合适的载体，并对载体DNA进行克隆；（3）、将目的基因与载体宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

连接；（4）、将重组DNA导入到大肠杆菌或酵母菌体内培养；（5）、利用载体上的标记基因进行筛选，获得转目的基因的细胞或植株。

四、基因工程的应用：

（1）基因工程应用于农业生产方面：农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。

（2）基因工程应用于医药方面：目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和核苷酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。

（3）基因工程应用于环保方面：基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性问题：

自基因工程诞生以来，基因工程的安全性问题就受到人们极大的关注，关于重组DNA潜在的危险性问题的争论，在基因工程还处于酝酿阶段的时候就已经开始。争论的焦点是担心基因工程宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：的杂种生物会从实验室溢出，在自然界造成难以抑制的灾难，有害的杂种菌或病毒与化学物质不同，它们会在自然界不断繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美国国立卫生研究院（NIH）在加利福尼亚州的Asilomar 会议中心内，160名来自美国和16个国家的专家学者对重组DNA的危害辩论，虽然与会代表分歧挺大，但最后也达成了一些重要的共识，在1976年6月23日美国NIH制定并公布了《重组DNA研究准则》。为了避免可能造成的危害，除了规定禁止若干类型的重组DNA实验外，还制定了许多具体的规定条文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技术是继工业革命、信息革命之后 对人类社会产生深远影响的一场革命。它在基因制药、基因诊断、基因治疗、基因芯片和基因克隆等技术方面取得的革命性成果，将极大地改变人类生命和生活面貌。

参考文献：

1、基因工程/楼士林，杨盛昌，龙敏南等主编.—北京：科学出版社，2002

2、基因工程技术/钟卫鸿主编.—北京：化学工业出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主编.—北京：科学出版社，2008

4、基因工程原理与技术/刘志国主编.—2版.—北京：化学工业出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法与应用/徐煜泉等编著.—北京：北京大学出版社，2008.12

第五篇：基因工程

《基因工程论文》

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

学

院：生命科学学院 班

级：生物技术12-2 学

号：7011208209 姓

名：陈 昆 任课教师：张锐

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

摘要﹕从以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长的解烃菌———地芽孢杆菌MD-2细胞中获得了1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA。将基因sladA克隆到质粒pSTE33上,构建了重组质粒pSTalk。通过电转化将pSTalk转化入嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3内,构建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜热和解烃的功能,在70℃条件下,14d后对原油的降解率达75.08%。研究结果表明,可以通过体外重组的方式向嗜热菌中引入烃降解基因,从而构建嗜热解烃基因工程菌。关键词:微生物采油;烃类降解菌;嗜热解烃基因;质粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要机理之一。研究结果表明,在解烃菌作用下原油的族组分发生变化,轻质组分增加,粘度下降,改善了原油的流动性;同时,解烃菌还可以将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质。迄今为止,从自然界筛选的高效解烃菌绝大多数为嗜温微生物,最适合生长温度一般为20-45℃,很难适应油藏的高温环境。笔者从1株解烃菌细胞中分离出1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段将此基因转化到另外1株最适合生长温度为70℃的嗜热菌体内,构建了嗜热解烃基因工程菌SL-21。该基因工程菌既具有高效的解烃功能,又能适应油藏高温环境,在微生物采油中具有良好的应用前景。1.1 实验材料

实验材料包括限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR片断回收试剂盒;大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α;pGEM-T easy载体;质粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培养基按文献配制。无机盐培养基组成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸馏水100mL;pH值为7.2。嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3,分离自胜利油区孤岛油田中一区馆3区块采出液,最适合生长温度为70℃;地芽孢杆菌MD-2,以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长,分离自胜利油区原油污染土壤。1.2 实验方法

DNA的操作 基因组DNA小量提取,利用聚合酶链式反应(PCR)对DNA扩增、PCR产物的回收、酶切与连接,质粒DNA提取和基因序列测定等均按文献[13-14]方法进行。菌株培养 所涉及到的菌株培养均在温度为70℃,转速为180r/min的条件下进行振荡培养。基因工程菌的构建和筛选方法 ZJ-3感受态细胞的制备按文献[13-14]方法进行。用构建的重组质粒pSTalk在最佳条件下电转化ZJ-3感受态细 胞构建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB琼脂平板上挑选10个阳性克隆接种到5mL LB培养基中,培养过夜,获得种子液。将该种子液接种到200mL以液蜡为惟一碳源的无机盐培养基中,培养5d后用CCl4抽提剩余的液蜡,用红外测油仪测定烃的剩余量,根据菌株降解液蜡的速率筛选出目的基因工程菌。基因工程菌的诱导表达及SDS-PAGE检测挑取阳性克隆接种于含100μg/mL Amp的10mL的LB液体培养基中,180r/min下振荡培养至光密度值达到0.6(检测光波波长为600nm),加诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,振荡培养8h,收集表达菌体,加SDS上样缓冲液,于100℃水浴10min后上样,用12%的SDS-PAGE电泳检测。基因工程菌降油能力测试 将基因工程菌接入20mL LB培养基中,培养12h,以5 000r/min的速度离心5min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体1次,加20mL无菌生理盐水悬浮,作为菌株利用烷

烃生长的种子液。取菌悬液按1%接种量接入200mL无机盐培养基中,加入2%孤岛油田中一区馆3区块原油或2%的液体石蜡作为惟一碳源培养,取样稀释涂布计数。原油降解实验 在无机盐培养基中添加2%的原油,按1%接种量接入基因工程菌,培养14d。用正己烷萃取降解后的原油,用气相色谱仪测定原油饱和烃组分的降解情况。原油降解率为菌株降解前、后原油量的差值与菌株降解前原油量的比值。2 实验结果与分析

2.1 MD-2基因组DNA的检测

对MD-2基因组进行提取和纯化。提取后的染色体DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,相对分子质量不小于23kb,说明提取的DNA完好。在检测光波波长为260280nm条件下分别测出DNA的光密度,其比值为1.95,换算出DNA的质量浓度为1 400g/mL,表明DNA纯度较好,无蛋白、RNA、酚和多糖物质的干扰。2.2 烷烃单加氧酶基因的克隆与序列分析依据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)中的烷烃单加氧酶基因开放阅读框两端保守序列,设计了一对兼并引物以MD-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,将约1.3kb的PCR产物回收后连接到pGEM-T easy载体上,转入E.coliDH5α,挑取阳性克隆质粒进行测序。测序结果经Genbank检索,表明该DNA序列是个新的烷烃单加氧酶基因,命名为sladA。2.3 基因工程菌的构建及筛选

通过PCR扩增sladA后,将PCR产物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分离纯化出1 329bp的片断,与经EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33质粒连接,构建成含sladA的重组质pSTalk。经电泳鉴定表明(图1),重组质粒构建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的诱导表达

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE图谱可见(图2),在烷烃单加氧酶基因sladA对应蛋白大小的地方扫描到高信号强度,表明sladA基因在SL-21中得以表达。2.5 基因工程菌SL-21碳源生长

基因工程菌SL-21在以原油和液体石蜡为惟一碳源的无机盐培养基中培养,在70℃和180r/min条件下,经过3d的延滞期后进入对数期,菌体数增加。17d后,菌体数为接菌初期的5倍,表明SL-21能够利用原油或液体石蜡作为惟一碳源生长。2.6 对原油的降解作用

由原油饱和烃组分的降解情况可看出(图3),基因工程菌对原油有很明显的降解效果,几乎将饱和烃降解完全。经对气相色谱各峰面积对比,计算出各峰面积的含

量和饱和烃组分降解率(表2)。基因工程菌SL-21对原油的降解率为75.08%。

实验结果表明,烃类降解菌地芽孢杆菌MD-2细胞提取的烷烃单加氧酶基因sladA可以在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中表达。但不同的基因工程菌株中烷烃单加氧酶基因sladA表达的效率不同,需要通过菌株对原油的降解评价进一步筛选。获得的对原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高温条件下生长,并且对原油降解效果明显。因此以体外重组方式向嗜热菌中引入烃类降解基因构建嗜热解烃基因工程菌在技术上是可行的。3 结论

以地芽孢杆菌MD-2为目标菌株,克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因sladA,并在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中正确表达了基因sladA,构建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃条件下,能以原油或液体石蜡为惟一碳源生长。14d对原油的降解率为75.08%,对原油饱和烃组分均有明显的降解效果。该基因工程菌既可以用于微生物驱油技术,又可以用于高温油田污水的生物处理。利用基因工程的方法可以获得既能耐受极端环境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌种选育的重要方向。参考文献: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烃降解菌的筛选及性能研究[J].大庆石油地质与开发,2007,26(6):119-123.[2] 汪卫东,汪竹,耿雪丽,等.美国微生物采油技术现场应用效果分析[J].油气地质与采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁长忠,宋永亭,段传慧.微生物采油用营养物质在石英砂上的静态和动态吸附规律[J].油气地质与采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龙,董汉平,俞理,等.微生物提高采收率数值模拟研究现状[J].油气地质与采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花丽.本源微生物降解原油的饱和烃色谱分析[J].油气地

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