猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白表达综述

第一篇：猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白表达综述

PCV2是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，为单股环状负链无囊膜的DNA病毒, 为已知的最小动物病毒之一，约17~ 20nm, 二十面体对称。根据病毒的抗原性和基因组成不同，可分为2种基因型或称血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1无致病性。PCV2具有致病性，基因组全长1767bp或1768bp，包括11个读码框，其中ORF2编码病毒的主要结构蛋白)核衣壳蛋白(Cap)，其N端包含一个由41个氨基酸残基组成的的核定位信号(Nuclear location signal，NLS)，与PCV2在细胞核内定位有关。Mahe和Liu等分别在sf 9真核细胞及大肠杆菌中进行了PCV2Cap蛋白的表达, 但Cap蛋白的表达量较低。为了提高Cap蛋白的表达量, 本实验成功构建去除NLS的重组质粒, 并对其进行表达、纯化、鉴定。

1材料和方法

1.1pcv-581重组质粒的构建

1.1.1PCR扩增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的设计与合成: 根据本实验室保存毒株的测序结果, 用Oligo6.0设计删除核定位信号特异引物(由大连宝生物工程公司合成), 并引入限制性内切酶BamHI、HindIII(加下划线表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;产物长度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接种PCV2病毒的PK-15细胞悬液500uL, 常规方法提取, 最后加20uL灭菌去离子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR扩增: PCR的反应体系总体积25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去离

子水补到25LL。反应参数为: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30个循环;72e , 7min。

取5LLPCR产物进行电泳分析(见图1)。

1.1.1.4PCR扩增产物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

扩增产物、酶切、回收。具体操作方法如下: PCR

产物补到100LL, 加入等体积异丙醇, 置-20e 静

止过夜, 13 000r/ min离心15min弃上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min离心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL灭菌去离子水溶解。将醇沉产物

进行BamHI酶切, 体系为20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉产物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。将酶切产物继续醇沉淀

(方法步骤同上)后进行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

单酶切, 酶切体系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重组质粒的构建和鉴定: 将载

体pQE-32(QIAGEN)质粒用BamHI 和HindIII双

酶切, 做100LL 酶切体系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32质粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用胶回收试剂盒回收

(TIANGEN, 操作按照说明书进行), 目的片段和载

体常规方法连接、转化M15、筛选阳性重组质粒

pQE-pcv581。酶切鉴定(见图2)。

1.3重组蛋白的诱导表达及纯化

从含有氨苄抗性的琼脂平板上挑取单个阳性

菌落接种到5mL氨苄抗性(100Lg/ mL)的LB液体 培养基中, 37e 过夜振荡培养、活化, 取过夜活化 的培养物按照的比例接种到5mL含氨苄抗性的液 体LB培养基, 37e 振荡培养, 培养至OD600nm达 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至终浓度为0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L继续培养, 分别在诱导前、诱 导1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取样, 取1mL菌液离心

第二篇：猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011年猪圆环疫苗上市至今，已有17家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。

1.PCV-2国内外最新流行动态

由PCV-2引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起PMWS后[1]，学者通过调查本国包括SPF猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪群中PCV-2血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中PCV-2抗体阳性率分别为86％和92％。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在PMWS。在我国猪群中PCV-2感染情况也不容乐观。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22个猪群采集了559份血清，用ELISA方法检测PCV-2抗体，其阳性率高达5l％，表明我国猪群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒2型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒2型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等[4]在2010年对安徽省PCV-2流行病学调查，结果表明安徽省14个市(县)的PCV-2抗体阳性率平均为74.36％，表明安徽省猪群中普遍存在着PCV-2的感染。从上述报道表明PCV-2在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中PCV-2抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与PCV-2混合感染率达到了20％[5]。陕西省PCV-2与PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陈义祥等对广西地区197份组织病料检测发现，PCV-2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占总病料数量的57.73％。2003年王文军等[7]对黑龙江地区PCV-2阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。

哈尔滨兽医研究所刘长明[8]在2007年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群480份血清和发病猪群424份血清，抗体阳性率分别为79.2%和91.7%，表明PCV-2在猪群中感染率非常高。山东农科院畜牧兽医研究所吴家强博士检测结果也证实PCV-2防控比较糟糕，PCV-2，2010年检出率为34.66%（124/357），2011年检出率为25.59%(174/588)；2012年检出率为2

1.38%(147/683)，圆环病毒病依然严重，但有下降趋势，这个和使用圆环疫苗免疫有关系。

第三篇：猪圆环病毒病 概述

猪圆环病毒病 概述： 本病由猪圆环病毒(PCV)引起。病原-----PCV

1、分类：1995 年列为圆环病毒科（Circoviridae)。在本科里还有其 他的病毒，如鸡传染性贫 血病毒（CAV）、鹦鹉喙羽病病毒（BFDV）。PCV、BFDV 列为圆环病毒属，CAV 列为环形 病毒属。2.核酸类型：DNA。其单链环状 DNA 染 色质有 1759 个碱基组成。且已克 隆测定了序列。11 个开放阅读框架，有 编码 11 种蛋白质。引起 PMWS 的 PCV 和引起 PK-15 污染的 PCV，同属于圆环病毒属，且高度的同源，但抗原性及 DNA 序列方面有一定的差异。为了区别，日前将 PCV－PK15 称为 PCV-1，而将 PMWS 称为 PCV-2。

3、形态大小： 为无囊膜二十面体，大小约 4～26.5nm。

4、PCV 可在猪源细胞上复制，但 CPE 不明 显。

5、存在：淋巴结，骨髓，血液。流行病学

1、PCV 易引起猪发病，一 般不与 CAV 和 BFDV 发生交叉感染，但用 ELISA 证实人血清有 30%、小鼠血清 12%~69%、牛血清 35%抗体阳性。

2、血清学调查表明：猪的阳性为 20%~80%，且分布极其广，几乎世界各处都有。

3、周龄的猪多发，PRRS 阳性猪群中更易继发本病。6~8 在

4、发病率高，病死率有高有低，但即使不死，亦诱发其它疾病的发生。症状 ①仔猪 断奶后多系统衰弱综合症； ②猪皮炎肾病综合症； ③相关性繁殖障碍综合症； ④相关性肺炎； ⑤相关性肠炎； ⑥相关性神经系统病。体重减轻，渐进性消瘦，虚弱。呼吸困难，过速，偶有咳嗽。皮肤苍白，结膜黄染。下痢、腹泻。中枢神经紊乱。病 变： 全身淋巴结肿大，尤以腹股沟淋巴结为最，肿大达 3~4 倍，切面充血、出血。肺 弥漫性病变，比重增加，坚实成橡皮样，表面呈花斑状。肝花斑状，萎缩。脾肿 大，切面呈肉状。肾被膜有白色病灶，肿大。回肠有花斑状。诊断：

一、临诊 腹股沟淋巴结肿大，脾、肾肿大，肝萎缩，渐进性消瘦，有诊断价值。

二、实验

1、原代肾细胞或 PK-15 可用作培养 PCV-2，但在细胞培养物上还不能判是否有 病毒存在。需要特异抗体用免疫荧光或直接免疫过氧化物酶染色确认。

2、用 PCR 扩 增病毒。

3、待检材料做组织切片，观察有否包涵体。

4、ELISA 测定抗体。防 治

1、预防：圆环病毒-繁殖障碍与呼吸综合症二联苗。首免：10-15 日龄。二免： 30-35 日龄。

2、发病后的处理： 1）在饲料中添加呋喃妥咽或病毒灵或病毒唑，多维。2）注射圆环·蓝毒康或圆环抗毒杀。3）注射猪用干扰素

第四篇：猪圆环病毒疫苗应用现状

猪圆环病毒疫苗应用现状

摘要

目前在国外只有梅里亚动物保健公司生产全病毒灭活疫苗，使用于母猪免疫。

已经注册的国产圆环病毒疫苗均为全病毒灭活疫苗。分别由哈尔滨兽医研究所用LG、南京农业大学用SH株研制而成。①哈尔滨维科生物技术开发公司；②上海海利生物药品有限公司；③洛阳普莱柯生物工程有限公司；④江苏南农高科技股份有限公司4家公司生产。国产疫苗亟待提高纯化工艺。水性佐剂要比矿物油佐剂疫苗对机体的刺激性小，副反应小。疫苗免疫保护期为3—4月，贮存有效期为12—18月。

FLEX系列茵格发猪圆环病毒疫苗，是具有纯化蛋白抗原的水性佐剂的亚单位灭活疫苗。形成形态、大小与活病毒相同的、具有高度免疫原性的纯化抗原。该产品是目前所有猪圆环病毒疫苗中唯一的单针疫苗，具有抗原缓解效果，应用时不必加强免疫。

在应用圆环病毒疫苗后满意度调查中，进口圆环病毒疫苗满意度最高。如何选择疫苗、制定适合猪场实际的免疫程序、确定免疫时机适时免疫显得尤为重要。

疫苗免疫哪些猪群？何时免疫？应对猪场流行病学、临床症状、剖检变化、生产成绩、病原和抗体的实验室监测进行评估后作出决定。猪场是否应用疫苗，应充分考虑本场发病情况、饲养管理状况、生物安全、主要相关疫病免疫与控制状况、药物预防效果等因素基础上综合判断。母猪是否需要免疫？倘若母猪群因PCV2感染而流产、产死胎、弱仔的比例超出正常，或仔猪因PCV2感染在断奶后1—2周发病，选择母猪免疫就是正确的。进口的疫苗可普免2—3次/年，在国产疫苗应用安全的情况下可免疫3—4次/年。研究表明免疫母猪所产仔猪和非免疫母猪所产仔猪接种疫苗后，其免疫效应均未受到母猪免疫的负面影响，尽管这一结果令人鼓舞，但还需进行更多研究。

仔猪免疫的时间可据下游猪发病日龄确定。疫苗起效时间为2周，感染潜伏期约2周。当母源抗体在3—8周下降到较低水平而环境中野毒感染压力较大时，对于保育猪特别是10周龄后肥育猪是否获得足够保护？一般12周龄开始感染。应在猪群出现临床症状至少4周前施行免疫注射。商品猪群只注射1次即可；1针免疫4个月后再进行第2次免疫。在第1次免疫2周后加强免疫一次；在加强免疫的3—4个月后再免疫。

新生仔猪3—4周龄首免，第一次免疫后间隔3周加强免疫一次。

在制定免疫程序时，还应注意与其它免疫的相互干扰作用。至少7d的间隔；若PRRS弱毒疫苗免疫在前，最好有10d以上的间隔再免PCV2疫苗。

圆环病毒疫苗免疫效果通过常规的抗体检测目前难以给出正确评价，可通过临床症状、生产成绩予以评估，免疫后对猪的健康状况和增重改善明显。圆环病毒疫苗应用于PCV2急性感染，仔猪群呼吸困难、消瘦、皮炎，母猪群流产、产弱仔等，可减少母猪流产，产死胎、弱仔的数量，可明显降低保育及生长育肥猪发病率、死淘率；明显提高日增重、猪群整齐度，降低料肉比，减少皮炎发病率，缩短出生至出栏时间；还有助于猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗、伪狂犬病疫苗免疫效果的正常发挥，降低机体对饲料霉菌毒素的敏感度。

第五篇：猪圆环病毒病相关知识问答

1.什么是猪圆环病毒病？

猪圆环病毒病是指以2-型圆环病毒为主要病原、单独或继发/混合感染其它致病微生物的一系列疾病的总称。

2．猪圆环病毒病具体有哪些发病类型？

主要有猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性震颤、肠炎等。

3．请介绍一下猪圆环病毒病的流行情况。

本病最早发生于加拿大（1991），此后很快在世界各地（大洋洲除外）流行，亚洲及我国各地有关的报道也越来越多。朗洪武（2000，2001），曹胜波（2001）先后通过血清学方法和PCR技术在河北、北京、天津、山东、吉林、江苏、上海、河南、湖北和广东、广西检测到了PCV-2。中国农业大学杨汉春教授等对北京、天津、广东、山西等12个规模大猪场病原检测和流行病学调查，发现11个猪场存在PMWS的感染，一个猪场存在PDNS的问题，可见PCV-2在我国的普遍性。

4．猪圆环病毒病的病原体是什么？

是2-型圆环病毒，圆环病毒有两个血清型，1-型没有致病性。

5．发病越来越多的原因是什么？

（1）集约化养猪的出现，导致管理及操作体系的巨大变动；2）宿主遗传性状的改变与世界范围内的流动；3）蓝耳病病毒和细小病毒等病原体的混合感染。

6．猪断奶后多系统衰竭综合征的临床症状、解剖病理变化有哪些？

猪断奶后多系统衰竭综合征确诊往往需要有一群猪的一组特征性的临床症状和显微病变，其临床症状有：僵猪比例明显增多、生长不良或停滞、消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、腹泻、苍白、部分猪出现黄疸。但在同一头猪中，不表现出以上全部症状。同时亦有部分猪出现咳嗽、肺炎、发热、胃溃疡、中枢神经症状及突然死亡。其中有些症状与继发感染有关。其特征性显微病理变化表现为淋巴器官的肉芽肿炎症和不同程度的淋巴细胞缺失。病理解剖可见肺斑点状出血，全身淋巴结肿胀，尤其是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结和支气管淋巴结明显肿大，切面浸润，呈土黄色，有的淋巴结皮质出血，使整个淋巴结呈紫红色外观。心脏变形、质地柔软、心冠脂肪萎缩，肾肿胀，皮质变薄，有时有出血点或灰白色病灶。不同猪场所表现的临床症状和病理变化的严重程度不同，这与混合/继发感染的类型以及猪场的饲养管理有关。

7、什么阶段的猪最易感断奶后多系统衰竭综合征？

不同猪场由于饲养管理、母源抗体水平及继发/混合感染的差别，发病年龄和严重程度不同。主要易感阶段有断奶前后（即3-6周）、12-16周龄。如遇转群运输等应激也可出现发病高峰。

8、猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）/猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是同一个病吗?不是，猪断奶后多系统衰竭综合征的病原是２－型圆环病毒，有或没有其它致病菌都可发生ＰＭＷＳ。当ＰＭＷＳ病猪继发一些呼吸道病的病原时，可以出现呼吸困难等症状。猪呼吸道疾病综合征是指多病原引起的呼吸道疾病征候群，其病原不一定包含圆环病毒。

9、抗生素对圆环病毒病有治疗效果吗？

无论是多系统衰竭综合征、呼吸道疾病综合征还是其它的复合感染，其病原均有病毒、细菌等多种致病微生物引起。抗生素对大多数细菌、支原体、原虫有疗效，只要能查清继发感染的病原种类、选用敏感药物，能有效降低发病严重程度，减少死亡率。但由于病毒往往是原发性致病因素，抗生素对病毒无效。所以抗生素的疗效并不理想，一旦停药，往往复发。

10、Ｐ－特产品特点是什么？疗效如何？

Ｐ－特是中药复方制剂，为中药提取后精制而成，易吸收、疗效稳定、用量省、适口性特好，治愈后不会复发。中药的抗病毒作用是早有定论的，正因为Ｐ－特针对原发性病毒直

接起作用，其疗效是目前同类产品屈指可数的．而且Ｐ－特内含免疫增强因子，能迅速恢复病猪被抑制的免疫机能，有效防止复发，使用得当，疗效非常明显。

11、Ｐ－特应如何使用？

因为一旦发病，损失是不可避免的，所以最好是预防用药，可以按每１０００kg饲料添加１kgＰ－特，连用１周的方法使用。早期断奶仔猪由于采食量很低，可以适当增加用量。猪呼吸道疾病的传染性很强，所以在治疗时应对尚未发病的猪进行预防，以防病情蔓延。病猪应及时隔离，治疗可采用饮水给药，为了保证病猪都能有足够的药量可采取喂服。鉴于猪呼吸道疾病的复杂性，一旦形成内脏病变，则需要漫长的恢复期，所以防治重点是预防和早期用药。

12、Ｐ－特能否与抗生素合用？

Ｐ－特是中药制剂，与化药有协同作用，可以降低抗生素的用量，提高抗生素的疗效。如果和抗生素混合在一起使用，则应根据药物的性质决定，Ｐ特是酸性药，应避免与碱性药物和喹诺酮类混合使用。

13、Ｐ－特使用过程中还应注意哪些问题？

由于猪病的复杂性，在使用前应注意对继发／混合感染的诊断，专家建议，下列病猪可按如下治疗方案：混合感染、弓形体、附红细胞体时，则应同时使用对弓形体、附红细胞体有效的药物，如长效土霉素、914A、磺胺六甲氧嘧啶；如果气喘病很严重，则应同时用强力霉素控制支原体；胸膜肺炎放线杆菌、副嗜血杆菌、巴氏杆菌等可选用氟苯尼考。一般来说，呼吸困难、咳嗽越明显、鼻涕呈黄色、体温越高、病程越短、死亡率越高表明继发／混合感染越严重，为提高疗效，宜配合抗生素同时使用。而以消瘦、生长不良等为主要症状的，无需使用抗生素。临床应用表明，对呼吸道疾病综合征，与氟苯尼考、替米考星、阿奇霉素等配合使用，疗效十分显著。

14、为什么有的猪场使用Ｐ－特效果不是很好？

原因有：１）有猪瘟等高致死性的疫病存在；２）存在弓形体、附红细胞体等混合/继发感染；３）发病晚期，机体已形成无法逆转的病变，如坏死、粘连等。

15、Ｐ－特是否应与退热药同时使用？

不需要，Ｐ－特本身含清热解毒成份，退热药不能抗菌、抗病毒，盲目退热只会使机体抗病力下降，病情复杂化。使用Ｐ－特一个疗程后，病猪体温自然下降，表明病猪已经康复。

16、圆环病毒病有疫苗吗？

到目前为止，尚无商品疫苗供应，现有圆环病毒－蓝耳病病毒二联苗中试产品，效果和安全性有待评价。有些猪场应用自家苗，其效果的往往因抗原浓度不足而欠佳。

17、为什么有的病猪治疗后体温和精神都正常，而食欲不佳，应如何处理？

这部分猪主要是重病猪，病程较长，造成机体肠道菌群失调，脾胃虚弱及病原体内毒素引起的。饲养管理方面可以补充电解质或电解多维，以及给予优质易消化饲料和青饲料调理。

18．除治疗外，还应注意些什么？

在积极治疗的同时，应注意：１）全进全出的饲养方式；２）限制寄养和合群；３）尽可能减少应激因素；４）合理按排免疫程序；５）降低饲养密度和增加空气流通；６）及时隔离和淘汰。配图文字：

1、皮炎肾病综合症：病猪后躯密布圆形成不规则丘疹，可见中间呈黑色外周紫红色的病灶。

2、皮炎肾病综合症肾脏肿大，呈土黄色，表面散布大小不一的灰白色坏死点。

3、圆环病毒感染，图为同窝健康猪及病猪体重差异悬殊。

4、典型的多系统衰竭综合症：病猪消瘦、拱背、苍白、生长不良。

5、PCV-2感染心脏变形，心肌松软，冠状沟脂肪萎缩黄染。

6、腹股沟线淋巴结显著肿大、苍白、切面多汁。

7、继发副嗜血杆菌引起的胸膜炎、心包炎、肝周炎。

8、混合感染的肺出现肉样变。

9、圆环病毒引起的相关性肠炎。

10、购入猪出现圆环病毒混合多种病原感染出现的综合症：消瘦、肺炎、肠炎、生长不良。

11、圆环病毒与细菌混合感染：淋巴结肿大，皮质出血。

12、混合感染猪瘟：肾脏肿大、瘀血，散在针尖状出血，表面于沟回状。更多请访问http:///