DNA病原—圆环病毒2型PCR检测方法专题

第一篇：DNA病原—圆环病毒2型PCR检测方法专题

猪圆环病毒2型PCR检测方法操作程序

廖荣斌，何启盖

（华中农业大学动物医学院）

一、原理

猪圆环病毒2型感染引发的仔猪断奶衰竭综合症、肾炎与皮炎、增生性肠炎以及母猪繁殖障碍。通过病原检测和病毒分离是确证本病的重要手段。猪圆环病毒分为2种，即圆环病毒1型和圆环病毒2型。前者不致病，后者可致病。猪圆环病毒2型（PCV2）的基因组大小为1768 bp或1767bp。其中，PCV2 ORF2基

因与免疫保护和毒力等重要特性有关，同时，此基因与PCV1的同源性较低，通

过合理设计引物，扩增ORF2，从而可检测并区分PCV2与PCV1。

PCR技术具有快速、敏感的优点，已经用于许多动物疾病病原的检测。本试验是利用我们设计的引物，通过反应条件的优化，以感染猪组织或血液为模板，扩增PCV2的ORF2基因，从而作出感染的结论。

二、材料准备

1、手术器械：采样用。根据样品数量来确定。

2、微量移液器（规格：2.5l，10l，100l，200l，1000l）

3、反应引物

上游引物：CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT；

下游引物：CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC4、磁珠：用于吸附和分离DNA4、PCR仪：东胜创新

5、电泳仪：北京六一电子设备

6、紫外检测仪：Bi0-RAD凝胶成像系统

7．相关溶液及配方：

1╳TAE buffer（电泳缓冲液）配方：（1）称量Tris：242g，Na2EDTA.2H2O：

37.2g，置于1L的烧杯中；（2）向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解；

（3）加入57.1ml的醋酸，充分搅拌；（4）加去离子水将溶液定容至1L后，室 1

温保存；（5）使用时将室温保存的该溶液稀释50倍即可使用。

扩增产物的样品缓冲液：全式金生物6╳Loading buffer。

三．样品采集

感染猪或流产的胎儿的肺脏、淋巴结、脾脏和肾脏；发热期猪的抗凝血或血

清；每个样品用单独的剪刀或刀片，避免交叉污染。

样品置冷藏条件下送检。也可放冷冻保存。

四、模板的制备（DNA提取）

*（注：所用DNA提取试剂盒为日本TOYOBO产品）

1、取组织100mg（或血液100ml）以下放入1.5ml离心管中，然后加入850l的溶解吸附液，再使用匀浆器充分匀浆。

2、离心分离（10000rpm，5分钟)后，将上清液吸入新的1.5ml的离心管内。

3、加入40l磁珠，然后使用涡旋振荡器剧烈混合10分钟（注意：加入磁珠前，要把磁珠混匀）。

4、将离心管置于磁性台架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

5、离心管中添加900l 洗净液，然后涡旋振荡剧烈混合5秒。

6、将离心管置于磁性台架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

7、重复步骤5和6.8、离心管中添加900l 70﹪的乙醇溶液，然后涡旋振荡剧烈混合5秒。

9、将离心管置于磁性台架上，放置30秒使磁珠聚集，然后去除上清液。

10、重复步骤8和9.11、添加100l灭菌水后，剧烈震荡10分钟，使DNA溶出。

12、将试管置于磁性台架上，通过放置30秒使磁珠聚集，然后将含有DNA的上

清液回收至新的1.5ml离心管内，上清液即为DNA模板！

13、阴阳性对照的设立：利用灭菌三蒸水和PCV2阳性病毒液（或者所保存的临

床PCV2阳性病料）与临床送检病料同步提取DNA，分别作为PCV2临床检测的阴性

对照和阳性对照。

五、配置PCV2-PCR的标准反应体系（单重扩增）：

10×扩增缓冲液2.5ul

dNTP混合物2ul引物（10mM）各1ul

模板DNA4ul

Taq DNA聚合酶0.15ul

加灭菌三蒸水14.35ul

即总反应体系25ul.六、扩增

将配好样品的PCR管放入PCR仪中选择适合反应条件的程序进行扩增。退

火温度54°C。

反应条件：按如下程序进行扩增: 94℃变性5 min后,进入循环94℃

30sec,54℃ 40sec, 72℃ 45sec,35个循环后,72℃延伸10 min。

七、配置琼脂糖凝胶块

1、材料：广口瓶、琼脂糖、电泳液

2、制作步骤：

（1）、称取琼脂糖1克放入广口瓶内。

（2）、取电泳液100ml加入广口瓶，即为1﹪的琼脂糖混合液。

（3）、然后放入微波炉中加热2分钟，取出后冷却约56℃。

（4）、倒入容器中，混合液约占容器容积的1/2—2/3。

八、电泳

1、扩增结束后，每只PCR管中都加入约2.5ul的6╳Loading buffer（电泳样品

缓冲液）

2、将制备好的凝胶块放入DNA电泳仪内的电泳液中，胶块有孔的一侧靠近负极。

3、从滴加有电泳样品缓冲液的样品中分别取7ul注入胶块相对应的孔内。

4、注入5ul的分子量（DL Mark 2000）对照。

5、电泳到凝胶块的1/2—2/3处。

九、图片观察

1、电泳结束的凝胶块放入溴乙锭（荧光物质）中浸泡10min。

2、放入成像系统中照胶。

3、结果判定（目的片段大小是494bp）如图1.******8M bp

图1.临床病猪圆环病毒PCR检测的凝胶成像图片

1：阴性对照；2：阳性对照；3—18：湖北某规模化猪场送检病料；其中3—6，8，11—12，15—16为PCV2感染阳性。其余被检病料为PCV2感染阴性，M(分子标记): DL Mark 2000。

4．结果分析

（1）感染的判定：PCR结果为阳性，表明为PCV2感染；阴性表明无PCV2感染。

（2）疾病的判定：由于本病毒感染较广，PCR阳性结果需要与猪群的流行病学以及临床表现（断奶消瘦、咳嗽、体温升高、腹股沟淋巴结肿大）等结合考虑。

第二篇：猪细小病毒论文：猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

猪细小病毒论文：猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

【中文摘要】猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是当前影响养猪业发展的3种重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2单独感染或混合感染均能引起猪发病,造成母猪的繁殖障碍或(和)感染猪的免疫抑制,为其他病原的继发感染提供了便利,甚至会造成猪群中疫病的流行,使养殖效益蒙受损失。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特异等优点,自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势,在动物疫病诊断和病原检测上也得到广泛地应用,对疫病防控起到了重要的作用。由于当前养猪业中猪群中多种病原混合感染病例的增多,单一病原PCR检测方法也表现出自身的不足,需要对一种病料进行多次PCR检测,使得检测时间延长,耗费人力,成本也高。多重PCR不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点,而且还具有一个PCR反应就同时检测多种病原,具有简便、快捷、灵敏等优点,能满足生产上同时对多种疾病进行快速诊断的要求。本研究基于前期对陕西省部分养殖企业猪群中病毒性病原的调查检测,发现常有PPV、PRV和PCV-2的单纯或混合感染,为此我们拟建立PPV、PRV和PCV-2检测的多重PCR方法,以期为生产中这3种病原的快速检测提供可用方法。本研究获得了以下结果:(1)根据GenBank中已经发表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0软件,针对病毒的保守性基因序列,分别设计了检测引物,通过对引物浓度、退火温度、PCR组分等条件的优化建立起鉴别PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性试验表明,PRV、PCV-2在多重PCR反应中的敏感性到达pg级,而PRV在多重PCR反应中的敏感性少了一个数量级,其最低检测量也达到了10pg级。以PCV-

1、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠埃希菌、PPV、PRV、PCV-2为模板分别进行多重PCR检测,结果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及单个病毒的PCR均扩增出各自的特异性条带。(2)用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行病毒检测,从临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果来看,PCV-2在正常猪群中有一定比例的存在,同时在个别猪场也存在PRV和PCV-2双重感染的现象;从临床患病猪病料中进行检测发现,PRV和PCV-2混合感染较严重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染发生;多重PCR检测结果与单项PCR检测结果的符合率达99%以上,说明建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测,为这3种疫病的诊断提供依据。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【关键词】猪细小病毒 伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 多重PCR 【英文关键词】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目录】猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用综述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文献

第一章 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒

12-26

1.1 猪细小病毒

1.1.2 猪细小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型检测方法研究进展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 猪细小病毒病流行情况14-1

51.2 伪狂犬病病毒19-22的检测方法研究15-19概述191.2.2 伪狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 伪狂犬病病毒检测方法

1.3.1 概述

1.2.3 伪狂犬病流行情况2020-2222-231.3 猪圆环病毒22-261.3.2 猪圆环病毒的特性231.3.3 猪圆环病毒检测方法23-26检测上的应用26-31PCR 技术26

第二章 聚合酶链反应(PCR)技术在动物病原

2.1 PCR 技术概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技术的发展26-27

PCR 技术27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常规PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二温式PCR27-28转录PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反转录一复合套式聚合酶链反应

2.2.7 竞争PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 标记PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31试验研究31-45重PCR(Multiplex PCR)猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2 型 PCR 检测方法的建立31-38313232-333.1 材料与方法31-3

33.1.1 主要试剂

3.1.3 引物设计3.1.5 PCR 反应33

3.1.7 PCR 产物3.1.2 毒株、菌株和细胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反应条件的优化的测序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反应的敏感性和特异性分析

3.2.1 最佳PCR 退火温度的确定3.2 结果33-363.2.2 PCR 反应最佳引物体浓度的确定3.2.3 PCR 产物的鉴定3

43.2.4 PCR 反应的敏感性3.2.5 PCR 反应的特异性试验和重复性试验3.3 讨论36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料与方法检测方法的建立与临床样品检测分析38-39384.1.1 主要试剂38

4.1.2 毒株、菌株、细胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 结果4.1.3 临床样品及病料的采集反应条件的优化384.1.5 样品检测38-39

39-424.2.1 两重PCR 反应条件的优化39-40

4.2.3 样品检测41-42

参考文献46-56

4.2.2 4.3 讨致谢多重PCR 的建立40-41论42-4556-57结论

45-46作者简介57

第三篇：猪场圆环病毒与其它病原混合感染情况

圆环病毒病相对于“历史悠久”的猪瘟是一个新病，1997年Clark等才首次分离到猪圆环病毒2型（PCV2），我国更是到2000年才有猪群中存在PCV2感染的血清学证据的报道，但该病给养猪业带来的损失则越来越大。

圆环病毒病会引起断奶后仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）及猪皮炎肾病综合征，同时还能引起母猪繁殖障碍、新生仔猪先天性震颤、增生性坏死性肺炎和肠炎等疾病，同时也是猪呼吸道病综合征的原发病原之一。

近年越来越被猪病专家重视的免疫抑制病中，圆环病毒病和猪瘟、蓝耳病相提并论。杨汉春老师2009年在学术年会上指出目前国内PVC2呈高感染率，在病死猪组织样本中检出率几乎达100%。

在实际生产中，PCV2单独感染的情况较为少见，通常为混合感染。Eng等对美国101个猪场中PMWS相关因素进行研究发现，PMWS阳性样本中最普遍的混合感染为蓝耳病病毒（72%）、猪肺炎支原体（69%）、猪链球菌（69%）和猪流感病毒（55%）。

我国学者陈义祥等调查显示，圆环病毒2型与蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒混合感染的病料占57.73%，其中与蓝耳病病毒混合感染比例最高，约51.85%。近年我国有关PCV2混合感染的调查多限于病毒病，本文主要针对病毒病的混合感染情况做了统计，结果发现PCV2与蓝耳病毒的二重感染最为严重，约50.27%，该结果与国内外报道趋势相一致。截至目前，流行病学和试验数据表明，单独的PCV2感染并不能足以引起疾病的临床表现，但并发或继发细菌或病毒感染却可使死亡率大大增加。

混合感染的普遍性可能与PCV2感染导致免疫抑制有关，感染猪血液中单核细胞增加，T细胞（主要是CD4+）和B细胞数量减少，并出现低密度的未成熟粒细胞，导致免疫抑制。由于圆环病毒发病猪细胞免疫功能显著降低，缺乏有效的免疫应答能力，必然出现严重的继发感染，如副猪嗜血杆菌、链球菌、巴氏杆菌等的侵袭。

需要说明的是，目前可导致猪群发生免疫抑制的病原主要包括猪瘟病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒及猪肺炎支原体等。最近研究表明，PCV2常见于肺炎支原体感染的支气管周围淋巴组织区域，且肺炎支原体可促进圆环病毒的感染。

另有研究发现，在呼吸道综合征的临床病例中常见肺炎支原体与PCV2混合感染，而不一定有蓝耳病毒或流感病毒的存在。虽未对我国PCV2和肺炎支原体混合感染调查，但该现象可能是临床上最为常见的，需要加以重视，同时针对支原体肺炎做好预防免疫。另外，在选择支原体肺炎疫苗过程中也要注意油佐剂激发PCV2复制的现象。更多请访问http:///

第四篇：猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展

猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011年猪圆环疫苗上市至今，已有17家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。

1.PCV-2国内外最新流行动态

由PCV-2引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起PMWS后[1]，学者通过调查本国包括SPF猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪群中PCV-2血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中PCV-2抗体阳性率分别为86％和92％。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在PMWS。在我国猪群中PCV-2感染情况也不容乐观。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22个猪群采集了559份血清，用ELISA方法检测PCV-2抗体，其阳性率高达5l％，表明我国猪群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒2型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒2型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等[4]在2010年对安徽省PCV-2流行病学调查，结果表明安徽省14个市(县)的PCV-2抗体阳性率平均为74.36％，表明安徽省猪群中普遍存在着PCV-2的感染。从上述报道表明PCV-2在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中PCV-2抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与PCV-2混合感染率达到了20％[5]。陕西省PCV-2与PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陈义祥等对广西地区197份组织病料检测发现，PCV-2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占总病料数量的57.73％。2003年王文军等[7]对黑龙江地区PCV-2阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。

哈尔滨兽医研究所刘长明[8]在2007年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群480份血清和发病猪群424份血清，抗体阳性率分别为79.2%和91.7%，表明PCV-2在猪群中感染率非常高。山东农科院畜牧兽医研究所吴家强博士检测结果也证实PCV-2防控比较糟糕，PCV-2，2010年检出率为34.66%（124/357），2011年检出率为25.59%(174/588)；2012年检出率为2

1.38%(147/683)，圆环病毒病依然严重，但有下降趋势，这个和使用圆环疫苗免疫有关系。

第五篇：猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白表达综述

PCV2是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，为单股环状负链无囊膜的DNA病毒, 为已知的最小动物病毒之一，约17~ 20nm, 二十面体对称。根据病毒的抗原性和基因组成不同，可分为2种基因型或称血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1无致病性。PCV2具有致病性，基因组全长1767bp或1768bp，包括11个读码框，其中ORF2编码病毒的主要结构蛋白)核衣壳蛋白(Cap)，其N端包含一个由41个氨基酸残基组成的的核定位信号(Nuclear location signal，NLS)，与PCV2在细胞核内定位有关。Mahe和Liu等分别在sf 9真核细胞及大肠杆菌中进行了PCV2Cap蛋白的表达, 但Cap蛋白的表达量较低。为了提高Cap蛋白的表达量, 本实验成功构建去除NLS的重组质粒, 并对其进行表达、纯化、鉴定。

1材料和方法

1.1pcv-581重组质粒的构建

1.1.1PCR扩增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的设计与合成: 根据本实验室保存毒株的测序结果, 用Oligo6.0设计删除核定位信号特异引物(由大连宝生物工程公司合成), 并引入限制性内切酶BamHI、HindIII(加下划线表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;产物长度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接种PCV2病毒的PK-15细胞悬液500uL, 常规方法提取, 最后加20uL灭菌去离子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR扩增: PCR的反应体系总体积25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去离

子水补到25LL。反应参数为: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30个循环;72e , 7min。

取5LLPCR产物进行电泳分析(见图1)。

1.1.1.4PCR扩增产物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

扩增产物、酶切、回收。具体操作方法如下: PCR

产物补到100LL, 加入等体积异丙醇, 置-20e 静

止过夜, 13 000r/ min离心15min弃上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min离心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL灭菌去离子水溶解。将醇沉产物

进行BamHI酶切, 体系为20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉产物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。将酶切产物继续醇沉淀

(方法步骤同上)后进行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

单酶切, 酶切体系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重组质粒的构建和鉴定: 将载

体pQE-32(QIAGEN)质粒用BamHI 和HindIII双

酶切, 做100LL 酶切体系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32质粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用胶回收试剂盒回收

(TIANGEN, 操作按照说明书进行), 目的片段和载

体常规方法连接、转化M15、筛选阳性重组质粒

pQE-pcv581。酶切鉴定(见图2)。

1.3重组蛋白的诱导表达及纯化

从含有氨苄抗性的琼脂平板上挑取单个阳性

菌落接种到5mL氨苄抗性(100Lg/ mL)的LB液体 培养基中, 37e 过夜振荡培养、活化, 取过夜活化 的培养物按照的比例接种到5mL含氨苄抗性的液 体LB培养基, 37e 振荡培养, 培养至OD600nm达 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至终浓度为0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L继续培养, 分别在诱导前、诱 导1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取样, 取1mL菌液离心