植物生物技术

第一篇：植物生物技术

我对转基因技术的认识与体会

园艺111班

蔡朝途

1131100916

转基因技术（Genetically Modified，简称GM），是指运用科学手段，将基因片段转入特定生物中，并最终获取具有特定遗传性状个体的技术。

转基因技术的理论基础来源于分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有特定的遗传性状个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。

20世纪80年代末转基因植物在美国问世至今，该项技术正以日新月异的速度迅猛发展，逐渐走入了人们的生活。人们认为转基因技术可以在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、植物朝着对人类有利方向发展的技术。特别是遗传学创立后近百年的转基因育种则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传基因的改良。但是在过去的几千年内我们的祖先对农作物遗传基因的改良就一直不断的突破着和改良着，那时转基因的方式主要是对农作物在自然条件下突变产生的优良基因和重组体的农作物的选择和利用，通过人为的和自然的方式来积累优良遗传基因。因此我们可以说现在的转基因技术与过去的传统技术相比，他们的本质都是通过获得优良基因人为的或者自然的进行基因的遗传改良。但是他们又有本质上的区别：传统技术只能在生物种内个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制；传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对某个基因进行操作和选择，对后代的表现预见性较差。而转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。所以我们可以说现在转基因技术是对传统转基因技术的发展和补充，我们将两者紧密结合，可以大大地提高动植物品种改良的效率。转基因技术的发展，为人们带来了新的福音，但新的问题也随之涌现，对于

转基因技术走进生活这一事件，质疑声不绝于耳。我们应该对其一分为二地看，既有利也有弊，人们应该客观地看待其利弊，将其作为一把双刃剑来使用。

凡事都有两面性，对于转基因技术我们不能全部的否定也不能全部的肯定。从利的方面来说转基因技术对人类有百利而无一害。自1983年世界第一例转基因植物——烟草问世以来仅20多年的时间里，转基因植物的研究和应用就已经得到了迅猛的发展，已有近1000例转基因植物被批准进入田间试验，涉及的植物物种有50余个，已有48个转基因植物品种被批准进行商业化生产。转基因技术有如下优势：第一，增加产量。在传统作物中植入快速生长基因后，农作物的特性得到了改善，不仅可缩短生长期而且还增加作物产量，使土地得到了最大限度的充分利用，也使人类从此告别缺粮的历史。第二，改良品质。植入不同的基因片段，可使食品的外观、味道、口感甚至营养成分完全改变，将使人类的食物进入一个随心所欲的新时期。例如转基因大米是通过人为改变大米的基因使其拥有更好的性状的一种稻子结出来的大米。它可能是更具有抗涝、抗旱、抗虫害、增加了大米里的蛋白质含量。第三，增强抗逆性。通过基因改变，使传统作物具备了抵御病虫害的能力，因此可大大减少农药和杀虫剂的使用，防止环境污染；通过改良基因，人类能让作物具有耐寒、耐热、耐干旱或耐涝的不同特性，从而适应不同的生长环境，农作物将彻底告别靠天种植的历史。例如20世纪80年代初期由我国学者周光宇提出的，我国目前推广面积最大的用花粉管通道法培育出来的转基因抗虫棉，是对转基因技术对人类有利的最好的证明。该转基因抗虫棉最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单不需要，装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

转基因技术给人类带来福音的同时也带来了危害。如：1999年，美国康奈尔大学的研究者约翰•洛希在英国《自然》杂志上发表报告，用涂有转Bt基因玉米花粉的叶片喂养斑蝶，导致44%的幼虫死亡。2004年，瑞士联邦技术研究院踢球植物学研究所海尔比克教授发现，先正达研发的转基因Bt-176玉米中，用来毒杀欧洲玉米螟的Bt毒素，无法分解，最终毒死了奶牛。2005年5月22日，英国《独立报》又披露了知名生物技术公司“孟山都”的一份报告，以转基因食品喂养的老鼠出现器官变异和血液成份改变的现象。2005年的11月16日，澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）发表的一篇研究报告显示，一项持续

4个星期的实验表明，被喂食了转基因豌豆的小白鼠的肺部产生了炎症，小白鼠发生过敏反应，并对其他过敏源更加敏感，并据此叫停了历时10年、耗资300万美元的转基因项目。2006年，俄罗斯科学院高级神经活动和神经生理研究所科学家伊琳娜•艾尔马科娃博士研究发现，食用转基因大豆食物的老鼠，其幼鼠一半以上在出生后头三个星期死亡，是食用非转基因大豆老鼠死亡率的6倍。2007年，在奥地利政府的资助下，泽特克教授及其研究小组对孟都山公司研发的“转基因抗除草剂玉米NK603和转基因抗虫玉米MON810的杂交品种”进行了实验。在经过长达20周的观察之后，发现转基因产品影响了小鼠的生殖能力,《俄罗斯科学家证实转基因食物是有害的》。2007年10月和11月，美国《纽约时报》等媒体报道，经过长期周密跟踪观察，发现有两种转基因玉米种植导致伤害蝴蝶生存，对生态环境安全的威胁程度已经超出可接受水平。为此，欧盟已经做出了初步决定、禁止该转基因玉米的种子销售使用。2008年，美国科学家也证实了长时间喂食转基因玉米，小白鼠的免疫系统会受到损害，该研究成果发表在同年《农业与食品化学》杂志上。2009年12月，法国科学家发表了新的研究结果并证实，孟山都公司出产的转基因玉米对大鼠的肝脏和肾脏具有毒性，这些副作用是性别依赖的、也时常是剂量依赖的；其他副作用也见于大鼠的心脏、肾上腺、脾和造血系统。2010年4月16日，俄罗斯科学家公布了新的独立研究成果，进一步证明仓鼠食用转基因大豆三代就会绝种！同时转基因技术的发展打破了自然发展的规律，或多或少破坏了生物界领域的和谐。转基因技术对生态系统和人类健康存在危害：第一，基因飘逸即基因流或基因水平转移到其他近缘物种。如加拿大发现转基因油菜与野生近缘种间发生过交叉杂交,从而形成所谓超级杂草，导致野生等位基因的丢失，从而造成遗传多样性的丧失，影响生态平衡。第二，转基因植物产生的杀虫毒素可由根部渗入土壤，某种单一的转基因植物的大量种植可能会对土壤生物及微生物和环境产生不良影响，因而减少本地区物种的多样性。第三，转基因产品的毒性，能引起人的过敏反应。1995 年发现美国国际先锋公司转巴西坚如果基因的大豆能引起人过敏，在转花生基因的作物中也有过过敏现象。第四，转入植物的标记基因(特别是抗生素基因),有可能通过某种途径扩散到其他微生物中并使其产生新的抗药性，导致超级病原菌的产生。

总之，转基因技术的发展是不可逆转的。然而,它的发展总会伴随着各种利

弊问题。我们必须以一种谨慎的态度来看待转基因技术，转基因技术的应用对人类发展而言前景是广阔 的，影响也是深远的。我们应采取积极的态度对待转基因技术的开发和利用，坦然面对在对转基因技术运用过程中带来的是与非，在对转基因技术充分重视的同时加快安全性技术的研究，让转基因技术在促进人类生存和发展中发挥重大作用，带来科技领域和生物界领域的重大飞跃，让转基因技术真正造福于人类。

参考文献

(1)文平，王仁祥.转基因研究进展[J].生物学教学，2005.12

(2)Russia says genetically modified foods are harmful

(3)刘松鑫.基因重组技术与伦理研究[J].攀枝花学院学报.2010.6,27

(4)陈学敏.转基因技术与生物多样性的冲突[J].华中师范大学学报.2010.11

(5)刘松鑫.基因重组技术与伦理研究[J]攀枝花学院学报。

第二篇：园艺植物生物技术

园艺专业推广硕士《园艺植物生物技术》试题

一．名词解释

1．基因组：某一生物包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。2．RT-PCR：一是反转录PCR的缩写，即通过聚合酶链式反应，将RNA链逆转录成互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。二是实时PCR的缩写，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。3．Northern blot：是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过Northern blot可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。

4．AFLP：扩增片段长度多态性。是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。

5．蓝白斑筛选：蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，可用于菌落鉴定和筛选。

二．选择题

1.B 2.ABD 3.B 4.BD 5.A 6.BC 7.D 8.ABCD 9.ABC 10.BCD

三．简答题

1.简述植物农杆菌介导的植物遗传转化过程。

答：农杆菌介导的植物遗传转化是以农杆菌为媒介，将目的基因通过载体上的特定区域导入细胞，并整合到染色体中。主要过程为：①分离目的基因片段；②将目的片段链接到克隆载体上，形成重组DNA分子；③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞进行增殖；④从细胞中筛选重组子；⑤提取已经扩增的基因，进一步分析研究；⑥将目的基因克隆到表达载体，一般采用双元载体；⑦利用表达载体转化农杆菌；⑧利用农杆菌转化植株，常用的方法有原生质体法、真空渗入法和蘸花法3种。

2.列举基因工程中常用的工具酶。答：基因工程中常用的工具酶有：

①限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。

②DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。③DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。

④逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。

⑤末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。⑥碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。⑦依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。3.简述SSR标记原理和主要过程。

答：SSR即微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA。微卫星的突变率在不同物种、同一物种的不同位点和同一位点的不同等位基因间存在很大差异，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因而可以根据这两端的序列设计一对特意引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。

主要过程：①反应体系，包括模板DNA、SSR引物、10×PCR缓冲液、dNTP、Tap 酶和ddH2O；②反应过程包括预变性、变性、退火、延伸，在PCR仪上进行；③将PCR产物在测序电泳仪上用5%聚丙烯酰胺凝胶分离，DNA染色采用银染法。④数据分析，可用Quantity One软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。4.简述改良CTAB法提取园艺植物DNA的原理及主要过程。

答：CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。主要过程：

① 称取植物组织约100-200mg，加适量液氮，研磨至组织破碎成粉末状，迅速转入2mL离心管。

② 在离心管中加入1mL 65℃预热的1.5×CTAB提取液(100mmol/L的Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L的EDTA，pH8.0，1.4mol/L的NaCl，4%的β-巯基乙醇)，放至65℃水浴30min，其间轻摇3次以混匀反应液。

③ 水浴后取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24﹕1)混合液，轻轻上下颠倒混匀，室温下静置15min后，于10000 r/min离心3min，取上清液。

④ 将上清液移至新的离心管，加入0.7倍体积的冷冻异丙醇，颠倒混匀后放置15min，10000 r/min离心5min，弃上清液。

⑤ 用75%的乙醇清洗 3次，沉淀为白色透明状，用滤纸条吸干残留乙醇，在超净工作台上无菌风干后，将DNA溶于 50μL 超纯水中。5.简述PCR反应中引物设计原理。答：PCR反应中引物设计原理为：

①选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。

②长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-25bp。

③Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。④G+C含量：有效引物中的G+C含量一般为40%-60%。

⑤碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。

⑥引物末端：只有引物的3’端与模板结合，PCR才能进行，所以3’端最好是G或C。

⑦引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免3’端的互补。

⑧引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到PCR的扩增效率。6.简述同源序列法克隆目的基因的主要过程。

答：利用同源序列法快速克隆基因的基本思路是依据基因序列的高度保守区域，设计特异性的简并引物，通过PCR扩增基因组DNA或cDNA，获得所要分离的基因序列，多用于抗病基因的分离、克隆。主要过程为：①提取基因组DNA；②根据已知基因保守区域的核酸序列特征，运用软件设计引物并合成；③以基因组DNA为模板进行PCR扩增；④回收PCR扩增的目的片段；⑤将目的片段链接载体并转化大肠杆菌；⑥测序并进行序列分析。四． 综合题

根据你所学，谈谈你对转基因植物的看法。

答：自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用。目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。植物转基因技术主要应用于农业、生物和医学等领域，进行植物品种的改良、新品种的培育以及作为生物反应器生产生物药物和疫苗等。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术药品已应用到医药、保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃、进展最快的产业之一。因此，人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。

植物转基因技术的应用十分广泛：（1）植物品质改良、新品种的培育，以满足人类不断增长的物质生活需要：植物转基因技术可高效、快速提高粮食作物、蔬菜、林木树种和花卉草种的产量、品质和抗耐性，为培育高产、高抗、多抗、优质的新品种提供了科学的手段。（2）医药研究，为人类健康服务：转基因技术可以把植物作为“生物反应器”，进行药物蛋白、工业用酶、糖类、脂类等一些有益次生代谢产物的生产，具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特点。（3）能源开发，促进世界经济的可持续发展：随着世界经济的发展，加速了对石油等有限的不可再生矿质能源的消耗，世界各国均面临着能源枯竭的严重问题。（4）减少环境污染，保护人类赖以生存的自然环境：转基因技术可以生产许多抗性强、适应性广的植物，最大限度地利用土地资源，增加全球植被的覆盖率，减少水土流失和土地沙漠化，减少因CO2增加引起的温室效应。抗病、抗虫转基因作物的广泛种植，可以减少农药的使用量。转基因植物可对土壤中的有毒污染物进行高效吸收或生物降解，通过植物修复系统使受污染的环境得到修复。

总之，转基因植物的广泛种植可以显著降低农业生产成本，提高农业生产效率；可以有效缓解人类的粮食问题、能源问题；可以大大提高人类的生活质量和健康水平；可以有效增加可利用的土地资源，扩大绿地植被面积，减少土地的沙漠化和盐碱化，减少环境污染，保护生态环境。目前，转基因技术及其转基因植物已广泛应用于农业、医药、食品工业、畜牧业等各个领域，其经济效益、生态效益和社会效益都是巨大的。植物转基因技术是一种技术创新，是现代科技革命的一个重要方面，在农业、生物、医学、食品、环保和能源领域具有广阔的发展前景。

第三篇：《园艺植物生物技术》实验教案

实验一 现代生物技术实验室与实验仪器

一、实验目的

实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。

二、实验场所选择及实验内容

园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。

三、实验方法与步骤

1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。

2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。

四、实验注意事项

实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。

五、思考题

1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。

2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？实验二 质粒DNA的提取、纯化及检测

一、实验目的

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

三、主要仪器及试材

含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。

液氮、及DNA提取有关试剂。

四、实验方法与步骤

（一）试剂配制:

1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。

7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。

（二）实验步骤

1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。

2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。

3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。

4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。

5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。

8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。

9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。

10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。

五、实验注意事项

1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。

2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。

3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。

六、思考题

简述质粒DAN提取的步骤。

实验三 PCR技术

一、实验目的

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。

二、实验原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。

三、主要仪器及试材

含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。

四、实验方法与步骤

1、调整模板浓度至5ng/ul。

2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反应循环条件设置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳

5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。

五、实验注意事项

1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；

2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；

3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；

4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。

六、思考题

简述PCR技术的原理和步骤。

第四篇：园艺植物生物技术 试卷（模版）

一、将下面词组相对应的中文译成拉丁文或拉丁文译成中文。

1.Propagation

2.liquid medium

3.antibody

4.vitrification

5.SSH

6.克隆

7.接种

8.非对称融合 9.RT-PCR

10.转录后水平的基因沉默

二、判断下列各题正确与否，正确的填“Y”错误的填“N”。

1.培养基灭菌后其Ph值会略微降低。

2.胚状体是植物组织培养中的专门术语，是指由体细胞形成的、类似于生殖细胞形成的配子胚发育过程的胚胎发生途径。

3.组织培养的培养基多采用湿热灭菌。

4.DNA电泳操作时要戴手套，是因为其中的EB是一种强致癌物和诱变剂。

5.DNA复制时，新合成链的延伸方向是从5’到3’方向。

6.可用作病毒鉴定的草本指示植物种类很多，常用的有藜科、茄科、豆科、十字花科、葫芦科等植物。

7.花药培养属于小孢子培养，而花粉培养则属于器官培养的范畴。

8.胚抢救主要是对由于营养和或生理原因，造成难以播种成苗或要发育中期阶段就败育或退化的胚进行中期离体培养。

9.理论上，从同一植物的根、茎、叶等不同器官中分离的DNA样品它们之间不存在多态性；但分离Mrna再合成Cdna后可能存在丰富的多态性。

10.引起病毒类病害的病原包括病毒、类病毒、植原体、螺原体和韧皮部及木质部限制性细菌等。

11.常用的报告基因吸cat、GUS、Ant、Luc、AFLP等。

12.植物生物技术的外植体材料以离体操作为主。

13.载体的条件是：能在宿主细胞中能自我自制并能稳定保存，要有多个酶切位点，每种酶切位点最好只有一个，酶切后不损坏其自制能力及选择标记基因并能嵌于外源DNA具有可作为选择。

14.在DNA电泳中，分子量大的片段比分子量小的片段距负极更近。

15.DNA双链中AT间形成的氢键比CG间少。

三、填空题：将下列各题空缺部分的答案填在后面的方框内，两者用“，”隔开。

1.常见的启动子有＿、＿、＿等。

2.进行胚抢时，就最终对胚抢救成活及成苗率影响大小而言，所利用的组织优劣顺序是：＿、＿、＿、＿。

3.日前世界上有200多种植物成功地再生出单倍体植株，其中我国首先报道的有40多种。获得单倍体的方法有三种＿、＿、＿。

4.可用于病毒及类病毒检测的方法很多，主要有＿、＿、＿。

5.要判断哪一个克隆中具有我们所需要的基因就需要对所得到的重组克隆进行筛选，筛选的方法主要有：＿、＿、＿等。

6.分子标记研究中应用最广泛的DNA鉴定技术有＿、＿、＿等四种。

7.常用于植物组织培养的植物激素种类有＿、＿、＿等

8.目前尚无防治病毒病的有效药剂，在园艺植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

9.转基因在沉默的原因是多方面的，根据外源基因失活或沉默的分子机制，可将其分为三类：＿、＿、＿等。

10.园艺植物组织培养一般要经历五个阶级，即＿、＿、＿、＿、＿等。

11.在遗传转化的表达载体中通常构建有一些筛选基因或报告基因，如果实验很成功，且检测方法正确，则下列基因的作用效果应呈现的颜色分别是：LacZ基因重组子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

12.狭义的植物生物技术是指：在离体的条件下，对植物（细胞）进行遗传改良或使其增殖的各种技术的总称，包括＿＿和＿＿两个大的层面。

13.迄今为止，已在猕猴桃、马铃薯、苜蓿、莴苣、甘蓝、蕃茄、柑橘等植物的原生质体再生植株中观察到变异，再生植株产生的变异主要有＿、＿、＿、＿。

14.生命活动的各个进程都伴随着不同基因的选择开启和关闭，基于这一基本的分子生物原理，现在已开发出许多克隆基因的方法，主要有＿、＿、＿、＿等。

15.常用的遗传标记有______标记;______标记;_______标记和_______标记等四种不同水平的标记。

四、选择题：从备选答案中选出正确的结果，正确答案是唯一的。

1.如果DNA一条链是5’-ATCG TACG GGTT-3’，则能与其互补配对的另一条链可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

2.植物病毒检测可以用的方法有:（）

A：血清学检测 B：PCR检测 C：同工酶检测 D：指示植物鉴定

3.可用于外植体消毒的方法有：()

A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒

4.原生质体融合的方式有：（）

A：对称融合 B：非对称融合 C：配子—体细胞融合 D：供受体融合5.常用的选择标记基因有：（）

A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：荧光素酶基因

6.基本的PCR所需的试剂主要有：（）

A：两侧的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ 7.赤霉素的生理作用主要包括：（）

Ａ：诱导茎细胞的伸长 Ｂ：对形成层的细胞分化有影响 Ｃ：可以解除种子、块茎、鳞茎等休眠 Ｄ：抑制衰老

8.基于现代生命科学的研究进展，下列可能是遗传物质的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

9.园艺植物外植体脱除病毒的方法有：()A：热处理脱除病毒 B：茎尖培养脱除病毒 C：微芽嫁接脱除病毒 D：高压灭菌脱除病毒

10.影响原生质体分离的因素主要有：（）

Ａ：植物的类型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植体类型 Ｄ：生理状态

11.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白质结构模型 B：RNA结构模型 C：DNA是遗传物质 D：DNA双螺旋结构

12.体细胞杂种的鉴定方法主要有：（）

A：形态学 B：细胞学 C：电子显微镜观察法 D：遗传标记

13.可以用于基因分离的方法有：（）

A：同源序列法 B：图位克隆法 C：功能克隆法 D：差减杂交法

14.下列属于现代生物技术研究的内容有:()

A：有性杂交 B：体细胞杂交 C：组织培养 D：基因克隆

15.目前分子标记在种质资源研究中的用途有：（）

A：绘制品种的指纹图谱

B：种质资源的遗传多样性及分类研究 C：物种的起源与演化 D：种质资源的评价、鉴定与创新

16.单克隆抗体制备主要步骤有：（）

A：免疫注射 B：细胞融合 C：筛选 D：克隆化

17.如果RAPD分析时所选用的随机引物的序列为5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虚线部分为500—1000 pb长的DNA区域，请分析其中能进行2的指数倍扩增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’

18.右下图中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位点，长方形是探针结合部位，试问1、2、3三种DNA样品用该酶/探针组合进行RFLP分析能得到的杂交信号条带数分别是：

A： 1、2、1 B：1、2、2 C：1、1、1 D：1、1、2 19.影响原生质体培养及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生质体来源 Ｂ：基因型 Ｃ：培养基 Ｄ：渗透压调节剂

20.原生质体的应用主要有哪些：（）

Ａ：种质资源保存 Ｂ：原生质体融合 Ｃ：筛选突变体 Ｄ：遗传转化

五、简答题：将下列各题的答案填在下面的方框内。

1.简述PCR反应原理。

2.如果你是某单位的技术人员，现欲建一园艺植物组织培养实验室，请简述实验室的布局及主要的仪器设备

3.阐述一下培养基的灭菌方法，灭菌时间。

4.体细胞杂种筛选与鉴定方法。

5.简述常见启动子有哪些？

6.简述转基因植物的鉴定方法。

六、综述题：将下列各题的答案写在下面的方框内。

1.1、通过对生物技术的学习，谈谈生物技术在园艺科学中的应用与展望。

2.3、如果现已证明园艺植物的某一重要农艺性状是单基因控制的质量性状，且发现了一个与控制该性状的基因紧密连锁的分子标记。现有一传统品种，此品种的其它性状均十分优良，唯独该性状表现不佳，试论述如何应用现代生物技术的方法对该性状进行改良？

3.2、谈谈体细胞杂种在育种中的应用。

一、将下面词组相对应的中文译成拉丁文或拉丁文译成中文。

1.RT-PCR

2.转基因植物

3.共培养

4.subtractive hybridization

5.基因组文库

6.生物技术

7.抗原

8.SSH

9.培养基

10.RAPD

二、判断下列各题正确与否，正确的填“Y”错误的填“N”。

1.限制性片断长度多态性技术（RFLP）是用已知的限制性内切酶消化目标RNA，电泳印迹，再用RNA探针杂交并放射自显影，从而得到与探针同源的RNA序列酶切后在长度上的差异。

2.植物生物技术的外植体材料以离体操作为主。

3.理论上，从同一植物的根、茎、叶等不同器官中分离的DNA样品它们之间不存在多态性；但分离Mrna再合成Cdna后可能存在丰富的多态性。

4.植物原生质体分离时，常采用酶解的方法脱除细胞壁。

5.PCR扩增的引物为单链DNA片段。

6.常用的报告基因吸cat、GUS、Ant、Luc、AFLP等。

7.愈伤组织原上指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团有序生长的薄壁细胞。

8.DNA复制时，新合成链的延伸方向是从5’到3’方向。

9.Western杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，用是于外源基因整合的鉴定及分析。

10.原生质体指采用机械或酶解法去掉了细胞壁的裸露的且具有活力的细胞。

11.载体的条件是：能在宿主细胞中能自我自制并能稳定保存，要有多个酶切位点，每种酶切位点最好只有一个，酶切后不损坏其自制能力及选择标记基因并能嵌于外源DNA具有可作为选择。

12.植物转基因的方法主要有：大肠杆菌介导的转化，PEG介导基因转化、电击法介导的转化、基因枪法介导基因转化及花粉管通道法介导基因转化等。

13.易高温分解培养基，往往不能进行高压灭菌，通常采用过滤灭菌，即先将除去了这些不耐热物质的培养基的其他成份经高压灭菌后放置于无菌场所，若制备半固态培养基，须待培养基冷却至60℃左右，再加入经过滤灭菌的各种不耐热成分溶液，再混匀放置，分装备用。

14.培养基灭菌后其Ph值会略微降低。

15.胚抢救主要是对由于营养和或生理原因，造成难以播种成苗或要发育中期阶段就败育或退化的胚进行中期离体培养。

三、填空题：将下列各题空缺部分的答案填在后面的方框内，两者用“，”隔开。

1.园艺植物组织培养一般要经历五个阶级，即＿、＿、＿、＿、＿等。

2.原生质体的培养方法较多，大多数与细胞培养相似。主要的培养方法有三种，即＿、＿、＿。

3.分子标记研究中应用最广泛的DNA鉴定技术有＿、＿、＿等四种。

4.可用于病毒及类病毒检测的方法很多，主要有＿、＿、＿。

5.原生质体培养的前提之一是获得大量有活力的原生质体，影响原生质体的主要因素有＿、＿、＿、＿。

6.农杆菌介导的遗传转化、基因枪介导遗传转化、原生质体介导的遗传转化、花粉管通道法、无选择标记基因的转化系统。

7.目前尚无防治病毒病的有效药剂，在园艺植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

8.常用于植物组织培养的植物激素种类有＿、＿、＿等

9.植物转基因研究的报告基因，在导入植物的24~48h内就可以检测结果，从而可以对转基因程序的有关因素进行快速评价和优化，检测该基因的方法有＿、＿、＿。

10.德国植物生理学家HABERLANDT对植物组织培养的杰出贡献在于提出了___理论；组织培养中外植体再生的两种主要途径是_______和_______。

11.＿是从Thermus aquaticus 菌提取的热稳定性酶，分子量大约94kDa.12.在遗传转化的表达载体中通常构建有一些筛选基因或报告基因，如果实验很成功，且检测方法正确，则下列基因的作用效果应呈现的颜色分别是：LacZ基因重组子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

13.基因克隆是一系列技术的总称，又称为＿、＿、＿、＿等。

14.日前世界上有200多种植物成功地再生出单倍体植株，其中我国首先报道的有40多种。获得单倍体的方法有三种＿、＿、＿。

15.园艺植物常用的脱病毒的途径有＿、＿、＿、＿等方法。

四、选择题：从备选答案中选出正确的结果，正确答案是唯一的。

1.可用于外植体消毒的方法有：()A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒

2.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白质结构模型 B：RNA结构模型 C：DNA是遗传物质 D：DNA双螺旋结构

3.如果RAPD分析时所选用的随机引物的序列为5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虚线部分为500—1000 pb长的DNA区域，请分析其中能进行2的指数倍扩增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’ 4.基于现代生命科学的研究进展，下列可能是遗传物质的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

5.影响原生质体培养及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生质体来源 Ｂ：基因型 Ｃ：培养基 Ｄ：渗透压调节剂

6.植物转化实验中常用的报告基因主要有：（）

A：cat B:GUS C;Ant D:GFP

7.单克隆抗体制备主要步骤有：（）

A：免疫注射 B：细胞融合 C：筛选 D：克隆化

8.组织培养室的设计及其基本设备有：（）

Ａ：准备室 Ｂ：制备室 Ｃ：无菌操作室 Ｄ：培养室

9.下列属于现代生物技术研究的内容有:()

A：有性杂交 B：体细胞杂交 C：组织培养 D：基因克隆

10.原生质体的应用主要有哪些：（）

Ａ：种质资源保存 Ｂ：原生质体融合 Ｃ：筛选突变体 Ｄ：遗传转化

11.原生质体融合的方式有：（）

A：对称融合 B：非对称融合 C：配子—体细胞融合 D：供受体融合12.基本的PCR所需的试剂主要有：（）

A：两侧的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ 13.植物病毒检测可以用的方法有:（）

A：血清学检测 B：PCR检测 C：同工酶检测 D：指示植物鉴定

14.园艺植物常见的病毒病有：（）

A：黄龙病 B：裂皮病 C：线虫病 D：速衰病

15.如果DNA一条链是5’-ATCG TACG GGTT-3’，则能与其互补配对的另一条链可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

16.外源基因表达蛋白的检测方法有：（）

A：ELISA B：Southern杂交 C：Western杂交 D：Northern杂交

17.园艺植物常用转化方法有哪些：（）

A：农杆菌介导转化 B：基因枪法 C：PEG转化法 D：电泳法

18.胚抢救在园艺植物上的应用是多方面的，主要表现在：（）

Ａ：抢救发育不良或早期退化胚 Ｂ：克服远缘杂交不亲和 Ｃ：用于柑橘合子胚抢救 Ｄ：三倍体育种

19.生物技术对园艺科学发展的贡献有：（）

A：脱毒与快速繁殖 B：花药培养以及小孢子培养 C：胚抢救技术 C：细胞融合技术

20.影响原生质体分离的因素主要有：（）

Ａ：植物的类型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植体类型 Ｄ：生理状态

五、简答题：将下列各题的答案填在下面的方框内。

1.原生质体再生植株的遗传变异及其利用。

2.简述转基因植物的鉴定方法。

3.简述目前园艺植物生物技术的主要研究内容。

4.高温易分解培养基如何灭菌？

5.简述PCR反应原理。

6.阐述一下培养基的灭菌方法，灭菌时间。

六、综述题：将下列各题的答案写在下面的方框内。

1.1、通过对生物技术的学习，谈谈生物技术在园艺科学中的应用与展望。

2.3、如果现已证明园艺植物的某一重要农艺性状是单基因控制的质量性状，且发现了一个与控制该性状的基因紧密连锁的分子标记。现有一传统品种，此品种的其它性状均十分优良，唯独该性状表现不佳，试论述如何应用现代生物技术的方法对该性状进行改良？

3.2、谈谈体细胞杂种在育种中的应用。

一、将下面词组相对应的中文译成拉丁文或拉丁文译成中文。

1.基因组文库

2.RFLP

3.培养基

4.transcriptional gene silencing

5.Anther culture

6.subtractive hybridization

7.简单序列重复

8.antibody

9.接种

10.CAPS

二、判断下列各题正确与否，正确的填“Y”错误的填“N”。

1.植物原生质体分离时，常采用酶解的方法脱除细胞壁。

2.可用作病毒鉴定的草本指示植物种类很多，常用的有藜科、茄科、豆科、十字花科、葫芦科等植物。

3.载体的条件是：能在宿主细胞中能自我自制并能稳定保存，要有多个酶切位点，每种酶切位点最好只有一个，酶切后不损坏其自制能力及选择标记基因并能嵌于外源DNA具有可作为选择。

4.DNA复制时，新合成链的延伸方向是从5’到3’方向。

5.易高温分解培养基，往往不能进行高压灭菌，通常采用过滤灭菌，即先将除去了这些不耐热物质的培养基的其他成份经高压灭菌后放置于无菌场所，若制备半固态培养基，须待培养基冷却至60℃左右，再加入经过滤灭菌的各种不耐热成分溶液，再混匀放置，分装备用。

6.在DNA电泳中，分子量大的片段比分子量小的片段距负极更近。

7.原生质体指采用机械或酶解法去掉了细胞壁的裸露的且具有活力的细胞。

8.PCR扩增的引物为单链DNA片段。

9.花药培养属于小孢子培养，而花粉培养则属于器官培养的范畴。

10.胚状体是植物组织培养中的专门术语，是指由体细胞形成的、类似于生殖细胞形成的配子胚发育过程的胚胎发生途径。

11.植物转基因的方法主要有：大肠杆菌介导的转化，PEG介导基因转化、电击法介导的转化、基因枪法介导基因转化及花粉管通道法介导基因转化等。

12.DNA双链中AT间形成的氢键比CG间少。

13.核酸分析包括直接对病毒基因组核酸电泳分析和根据已知的基因组核酸序列设计引物对病毒及类病毒基因组的特异性片断进行PCR扩增，通过观察特异性条带而对这些病原进行鉴定。

14.柑橘珠心胚培可以有效脱除病毒，珠心胚是由珠心胚细胞形成的有性胚。

15.组织培养的培养基多采用湿热灭菌。

三、填空题：将下列各题空缺部分的答案填在后面的方框内，两者用“，”隔开。

1.农杆菌介导的遗传转化、基因枪介导遗传转化、原生质体介导的遗传转化、花粉管通道法、无选择标记基因的转化系统。

2.常用于植物组织培养的植物激素种类有＿、＿、＿等

3.原生质体培养的前提之一是获得大量有活力的原生质体，影响原生质体的主要因素有＿、＿、＿、＿。

4.园艺植物常用的脱病毒的途径有＿、＿、＿、＿等方法。

5.目前尚无防治病毒病的有效药剂，在园艺植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

6.在遗传转化的表达载体中通常构建有一些筛选基因或报告基因，如果实验很成功，且检测方法正确，则下列基因的作用效果应呈现的颜色分别是：LacZ基因重组子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

7.日前世界上有200多种植物成功地再生出单倍体植株，其中我国首先报道的有40多种。获得单倍体的方法有三种＿、＿、＿。

8.要判断哪一个克隆中具有我们所需要的基因就需要对所得到的重组克隆进行筛选，筛选的方法主要有：＿、＿、＿等。

9.迄今为止，已在猕猴桃、马铃薯、苜蓿、莴苣、甘蓝、蕃茄、柑橘等植物的原生质体再生植株中观察到变异，再生植株产生的变异主要有＿、＿、＿、＿。

10.狭义的植物生物技术是指：在离体的条件下，对植物（细胞）进行遗传改良或使其增殖的各种技术的总称，包括＿＿和＿＿两个大的层面。

11.＿是从Thermus aquaticus 菌提取的热稳定性酶，分子量大约94kDa.12.常见的启动子有＿、＿、＿等。

13.常用的遗传标记有______标记;______标记;_______标记和_______标记等四种不同水平的标记。

14.分子标记研究中应用最广泛的DNA鉴定技术有＿、＿、＿等四种。

15.进行胚抢时，就最终对胚抢救成活及成苗率影响大小而言，所利用的组织优劣顺序是：＿、＿、＿、＿。

四、选择题：从备选答案中选出正确的结果，正确答案是唯一的。

1.目前分子标记在种质资源研究中的用途有：（）

A：绘制品种的指纹图谱

B：种质资源的遗传多样性及分类研究 C：物种的起源与演化 D：种质资源的评价、鉴定与创新

2.基于现代生命科学的研究进展，下列可能是遗传物质的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

3.园艺植物外植体脱除病毒的方法有：()

A：热处理脱除病毒 B：茎尖培养脱除病毒 C：微芽嫁接脱除病毒 D：高压灭菌脱除病毒

4.如果DNA一条链是5’-ATCG TACG GGTT-3’，则能与其互补配对的另一条链可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

5.影响原生质体分离的因素主要有：（）

Ａ：植物的类型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植体类型 Ｄ：生理状态

6.基因分离克隆的基本步骤有：（）

A：实验材料的选择 B：目标DNA片段的制备与克隆 C：目的基因的纯化

D：载体的构建

7.园艺植物常见的病毒病有：（）

A：黄龙病 B：裂皮病 C：线虫病 D：速衰病

8.组织培养技术在园艺植物上的应用主要有：（）

Ａ：快速繁殖 Ｂ：提高育种效率，改良品种 Ｃ：脱毒 Ｄ：种质保存

9.下列属于现代生物技术研究的内容有:()

A：有性杂交 B：体细胞杂交 C：组织培养 D：基因克隆

10.胚抢救在园艺植物上的应用是多方面的，主要表现在：（）

Ａ：抢救发育不良或早期退化胚 Ｂ：克服远缘杂交不亲和 Ｃ：用于柑橘合子胚抢救 Ｄ：三倍体育种

11.影响原生质体培养及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生质体来源 Ｂ：基因型 Ｃ：培养基 Ｄ：渗透压调节剂

12.右下图中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位点，长方形是探针结合部位，试问1、2、3三种DNA样品用该酶/探针组合进行RFLP分析能得到的杂交信号条带数分别是：

A： 1、2、1 B：1、2、2 C：1、1、1 D：1、1、2 13.单克隆抗体制备主要步骤有：（）A：免疫注射 B：细胞融合 C：筛选 D：克隆化

14.如果RAPD分析时所选用的随机引物的序列为5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虚线部分为500—1000 pb长的DNA区域，请分析其中能进行2的指数倍扩增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’

15.原生质体融合在植物遗传改良上的应用主要表现在：（）

A：克服生殖障碍，创造新种质 B：转移有利性状，改善作物品质 C：作为育种中间材料，进一步用作物改良 D：转移部分染色体，获得非对称杂种

16.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白质结构模型 B：RNA结构模型 C：DNA是遗传物质 D：DNA双螺旋结构

17.植物转化实验中常用的报告基因主要有：（）

A：cat B:GUS C;Ant D:GFP 18.常用的选择标记基因有：（）

A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：荧光素酶基因

19.赤霉素的生理作用主要包括：（）

Ａ：诱导茎细胞的伸长 Ｂ：对形成层的细胞分化有影响 Ｃ：可以解除种子、块茎、鳞茎等休眠 Ｄ：抑制衰老

20.可以用于基因分离的方法有：（）

A：同源序列法 B：图位克隆法 C：功能克隆法 D：差减杂交法

五、简答题：将下列各题的答案填在下面的方框内。

1.高温易分解培养基如何灭菌？

2.试比较固体培养基和液体培养基的优、缺点。

3.阐述一下培养基的灭菌方法，灭菌时间。

4.体细胞杂种筛选与鉴定方法。

5.简述常见启动子有哪些？

6.如果你是某单位的技术人员，现欲建一园艺植物组织培养实验室，请简述实验室的布局及主要的仪器设备

六、综述题：将下列各题的答案写在下面的方框内。

1.2、谈谈体细胞杂种在育种中的应用。

2.3、如果现已证明园艺植物的某一重要农艺性状是单基因控制的质量性状，且发现了一个与控制该性状的基因紧密连锁的分子标记。现有一传统品种，此品种的其它性状均十分优良，唯独该性状表现不佳，试论述如何应用现代生物技术的方法对该性状进行改良？

3.1、通过对生物技术的学习，谈谈生物技术在园艺科学中的应用与展望。

第五篇：《园艺植物生物技术》实验教案

《园艺植物生物技术》实验教案

实验一 现代生物技术实验室与实验仪器

一、实验目的

实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。

二、实验场所选择及实验内容

园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。

三、实验方法与步骤

1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。

2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。

四、实验注意事项

实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。

五、思考题

1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。

2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？

实验二 植物组织培养

一、实验目的

植物组织培养是现代生物技术研究的重要技术手段，在原生质体融合、病毒脱除、离体快繁及遗传转化等领域发挥着不可替代的作用。胡萝卜以其培养体系成熟、再生容易而被视为组织培养的理想外植体材料，本实验通过胡萝卜的组织培养使同学们掌握基本培养基的配制、灭菌及培养的基本技能。

二、实验原理

基于1902年德国科学家哈勃兰特（Haberlandt）提出植物细胞的全能性理论，即指已分化的细胞仍然具有分化发育成新个体的潜能。在适宜的培养条件下，植物的细胞、组织或器官都具备再生成完整植物的能力。

三、主要仪器及试材

仪器：pH计、微波炉、高压灭菌锅、超净工作台、培养室、三角瓶、封口膜、无菌滤纸、手术刀片、镊子、酒精灯、记号笔等

试材：新鲜胡萝卜，培养基配制所需相关试剂

四、实验方法与步骤

（一）培养基母液的配制（小规模实验应按比例减少，避免造成很大的浪费）：

1、大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。

KNO

395 g NH4NO3

82.5 g KH2PO

48.5 g MgSO4•7H2O

18.5 g CaCl2•2H2O

22.0 g 注意事项：

（1）配置母液前要仔细清洗存储容器

（2）应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；（3）溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；

（4）夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；

（5）沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的浑浊型沉淀，所以配置时一定不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。

2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：

KI

0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O

0.86 g NaMoO4*2H2O

0.025 g CuSO4*5H2O

0.0025 g CoCl2*6H2O

0.0025 g

MnSO4*4H2O

2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1.前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2.蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。

3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：

甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L

4、铁盐的配制（100倍液）：

称取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分别溶解后混合定容到1L，放入棕色细口瓶中，室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

5、维生素B的配制（100倍液）：

VB组分 VB1(盐酸硫氨素)VB6(盐酸吡哆素)VB5(烟

酸)

改良MT 1g 1g 0.5g

MS 10 mg 50 mg 50 mg 分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1L。

注: 需要溶解完一个再加另一个；VB5不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。

6、Vc的配制（100倍液）：

称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1L即可。

7、其它溶液配制：

BA，NAA，IBA，GA3等激素类试剂可先用少量1N NaOH彻底溶解，再加水定容。配好后室温放置一段时间，再放入冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解，但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在制作培养基时使用。这样不容易产生沉淀。

（二）培养基配制

母液配好后，按以下体种（或质量）量取，最后用蒸馏水定溶到1L,调节pH至5.8，用塑料烧杯放入微波炉中充分溶解后分装灭菌。

大量元素(10倍液)

ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)

ml 铁盐（100倍）

ml 维生素B（100倍）ml Vc（100倍）

ml 蔗糖

g 琼脂

7.5 g

（三）接种与培养

在超净台上接种后，用记号笔做好标签，放置到光照培养室中进行培养。

五、实验注意事项

1、实验中涉及到酒精及砷汞等危险品，注意人身安全的环境安全，废液不要随意乱倒。

2、外植体消毒及接种操作要规范，注意超净台的卫生，养成良好的实验习惯。

六、实验结果处理

一星期后，统计污染率，并对未污染材料的生长状况进行观察，并分析产生污染的可能原因。

七、思考题

影响植物组织培养的因素有哪些？

主要参考文献

1.张娅，曾君祉，周志勇，陈毓荃，黄华樑。胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立。植物学通报,2005，22:37-42。

2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验三 植物DNA的提取、纯化及检测

一、实验目的

DNA 提取是开展分子生物学的重要前提之一，高质量的DNA直接关系到分子标记、基因克隆、图谱构建及功能基因组研究等工作的成败。通过本实验应了解常用DNA提取方法的原理和技术，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA检测技术，为将来从事园艺植物生物技术研究奠定基础。

二、实验原理

植物的遗传物质是DNA，植物细胞内含有丰富的遗传物质。在机械研磨、高温和去污剂的共同作用下，植物细胞破裂，DNA从细胞核释放到提取缓冲液中。经蛋白质强变性剂处理结合离心，除去蛋白质和色素等杂质，再用乙醇沉淀便可获得高纯度的DNA。

DNA电泳是依据DNA带负电荷，而不同浓度的琼脂糖凝胶孔径大小不同，在外加电场的作用下DNA由负极向正极移动，分子量小的移动快而分子量大的移动慢，最终达到不同分子量大小的DNA分离的目的。

三、主要仪器及试材

水浴锅、离心机、移液枪、研钵、离心管、核酸电泳系统等；新鲜健康植物叶片，液氮、及DNA提取有关试剂。

四、实验方法与步骤 1.药品的配制: CTAB提取液：

(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解备用。使用前要在65℃温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇，混均匀。苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）：

重蒸酚65℃水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4℃冰箱中储存备用。2.DNA的粗提

在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用尖头玻棒将材料研细后加入600 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65℃水浴锅中温浴60分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，其间置于37℃水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000 rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰冻无水乙醇1 ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000 rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000 rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。3.DNA的纯化：

向风干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分钟至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小时，然后加入700 µl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，10000-12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入700 µl氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），10000 –12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 µl 5M NaCl，再加入1 ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20℃冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小时后换一次，后浸泡过夜，8000 rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100 µl TE充分溶解备用。

4、DNA检测

（1）取DNA原液15 µl稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7

（3）向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5 U/µg DNA，37℃消化过夜，用0.5×TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。

五、实验注意事项

1、实验中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危险或有毒物质，操作时要戴手套，并在专门区域操作。

2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。

六、思考题

简述DAN提取的步骤及主要试剂的作用。

主要参考文献

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验四 质粒DNA的提取、纯化及检测

一、实验目的

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

三、主要仪器及试材

含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。

液氮、及DNA提取有关试剂。

四、实验方法与步骤

（一）试剂配制:

1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。

7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。

12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。

（二）实验步骤

1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。

2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。

3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。

4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。

5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。

8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。

9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。

10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。

五、实验注意事项

1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。

2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。

3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。

六、思考题

简述质粒DAN提取的步骤。

主要参考文献

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。

实验五 PCR技术

一、实验目的

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。

二、实验原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。

三、主要仪器及试材

含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。

四、实验方法与步骤

1、调整模板浓度至5ng/ul。

2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反应循环条件设置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳

5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。

五、实验注意事项

1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；

2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；

3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；

4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。

六、思考题

简述PCR技术的原理和步骤。

主要参考文献

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料

实验六 PCR产物的TA克隆

一、实验目的

采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果树上常用的分子克隆方法。相对于粘性末端来说，克隆具有平末端的双链PCR产物效率较低。目前，有两种方法可以采用，一种是在特异引物设计时引入酶切位点，另一种是TA克隆。通过本实验应掌握PCR产物TA克隆的原理，学习PCR产物纯化及回收，以及PCR产物与TA克隆载体的连接。

二、实验原理

TA克隆是利用耐热聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端转移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校准活性，即在PCR产物的两个3’末端加上未配对的单一A凸出尾，质粒载体提供线性3’末端单一的T凸出尾，使该载体能够直接与PCR产物高效连接。TA克隆技术比其它PCR克隆方法有更高的重组效率。

三、主要仪器及试材

PCR扩增产物、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Promega公司）、pMD18-T载体（TaKaRa公司）以及感受态大肠杆菌、高速冷冻离心机、移液枪、琼脂糖凝胶电泳等相关仪器及试剂。

四、实验方法与步骤

1、PCR扩增片段纯化回收

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒收集PCR扩增产物，具体操作步骤参考试剂盒说明书进行。

2、连接反应 反应体系组成

pMD18-T

0.5-1.0 ul PCR fragment

1.0-4.5 ul ddH2O

0-3.0 ul Ligation Solution I

5.0 ul 混合后，置于室温下放置数小时或过夜连接。

3、重组子转化（热激法）

1）在含适当浓度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；

2）冰上冷冻新灭菌的1.5 ml 离心管； 3）取出感受态大肠杆菌，冰上放置冻融；

4）取新灭菌的1.5 ml 离心管，加入50 ul感受态细胞和10 ul连接反应液，用移液枪轻轻吸打均匀，在冰上放置30 min；

5）热激：将离心管在42 ℃下水浴90秒钟。请勿摇动离心管； 6）冰镇：快速将离心管转移至冰浴，1-2分钟；

7）复苏：每管加400 ul液体LB培养基，在37 ℃摇床温和摇动45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均匀涂布于“1）”已制备好的LB平板上；

9）培养：在37 ℃下倒置培养12-16 h，即可观察到蓝白相间的菌落。白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色是载体自连的转化子。转化子可以在4 ℃下保持1个月；

10）单菌落培养：用灭菌的牙签，挑选白色的单菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液体LB培养基的50 ml离心管中，在37 ℃摇床上培养过夜（12-16 h）。

4、质粒DNA的分离 参考有关文献。

5、检测

采用相同的引物对进行PCR再扩增，或质粒上根据插入片段两端的酶切位点而进行限制性酶切，通过电泳可以检测出片段是否克隆成功。

五、实验注意事项

1、连接温度不宜太高，连接温度过高（>28℃）可使背景增加，使重组克隆菌减少。降低连接温度可以提高白斑率；

2、热激过程注意勿摇动离心管。

六、思考题

简述PCR产物TA克隆的原理和步骤。

主要参考文献

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料。