实时荧光定量PCR检测限的统计推断

第一篇：实时荧光定量PCR检测限的统计推断

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

来源：中国论文下载中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武

【摘要】 检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果≥4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997；而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。

【关键词】 实时荧光定量PCR；检测限；统计推断

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

检测限是检测方法的重要性能指标，只有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如：灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，以期得到一致的实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)检测限，现介绍如下。

文献中FQPCR检测限的描述

检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量”［2，3］、灵敏度［5～7］等术语，它等于已知的高拷贝HBV DNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀释倍数管浓度。表述有：阴性HBV DNA≤106拷贝/升［4］；荧光定量PCR法检测灵敏度102拷贝/ml［5］、104拷贝/ml［6］、8.6×102拷贝/ml［7］；HCⅡ法检测灵敏度1.4×105拷贝/ml［7］；103 Eq/ml理论值时到达检测极限［3］；PCRFP检测HBV DNA的最低检测出量1×101拷贝［2］；bDNA在105 Eq/ml时到达检测极限［3］。以上检测限术语各不相同，且同一方法检测HBV DNA在上述各实验室发出同样的“HBV DNA低于检测下限”的报告时其实际HBV DNA拷贝数相差可达100倍。

FQPCR检测过程简介

以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例：将40 μl血清样本加40 μl DNA提取液处理后，将其中2 μl（相当于1 μl血清）加入主反应液（含DNA引物、酶、DNA构件分子dNTP等）管中，在自动热循环上进行温度循环，自动热循环仪记录每一反应管在每一次温度循环的荧光强度，记30次温度循环后结束。在PCR循环过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值（Cyclethreshold),它与反应管中DNA起始拷贝数的对数值（lgN)呈非常显著的直线相关关系。自动热循环仪对标准样品自动生成一条Ct值对于起始拷贝数值（lgN)的工作曲线，并通过该工作曲线来确定待测未知样品反应管的起始拷贝数（N）。当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号时，仪器默认Ct值为30，不计算起始拷贝。确定FQPCR检测限的统计学原理

如果被检物的含量和检测方法的空白响应量的波动服从正态分布规律，则检测限可用多次检测空白的方法来确定。可信限为95%时检测限＝x空白+2.s空白；可信限为99.7%时检测限=x空白+3.s空白。这是目前多数检测限的确定方法。对核酸检测方法的检测限的理解可能与此有差别，但是原理应是一致的［1］，FQPCR检测限也应是推论总体与空白有统计学差异的最小抽样结果。

FQPCR检测限的统计推断

假设病原体在血液等体液中的分布是随机的，则单位体积中(如1.0 μl)病原颗粒数的分布服从Poisson分布。以Poisson分布的概率函数公式计算一次抽样检测出现的结果推论总体概率。从理论上来说，使用PCR测定技术测定病原体核酸序列的量可低至1个拷贝［2］。例如：血清标本中加入等量的DNA提取液，于离心管中煮沸，4 ℃放置，离心，吸取上清液2 μl作模板 进行扩增检测(2 μl上清液相当于抽样1 μl血清)［2］，其中至少有1个拷贝的HBV DNA才能有典型扩增反应，这时检测结果是1拷贝/μl。由Poisson分布的概率函数公式可计算出1次抽样检测结果出现0时，推断总体为1～9的概率见表1。

表1 总体为1～9时抽样为0的概率及总体（略）

在FQPCR检测HBV DNA中，当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号(即当Ct≥30)，反应管检测结果为0时，推论总体拷贝数为1～9的概率之和>0.581 92，总体为其他的概率之和<0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。总体为1时一次抽样结果分别为1～9时的概率见表1。当一次抽样结果≥4时，推论总体为1的概率≤0.015 33，所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果≥4拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/μl。当总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室间质量评价样本靶值选择1拷贝/μl、2拷贝/μl、3拷贝/μl时，无论实验室实际检测质量如何高，都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合［按靶值的对数值GM±0.5 log(10)［9］作为可接受的定量范围］。2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51拷贝数/μl的样本符合率仅35.2%；Mancini C 等［9］报道一些实验室对检测下限附近的样本(3.00 log IU/ml)准确定量有困难；Raggi CC等［10］也报道28.6%的实验室(12/42)对最低浓度的样本不能定量。这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所致，对此我们将另文详细讨论。造成上述文献中检测限差异较大的可能原因如下：用于10倍系列稀释的已知高拷贝HBV DNA血清本身拷贝数的差异；对检测限的理解差异，由一次抽样没能检测到典型扩增的稀释血清管推论总体浓度为0的可信度太低(<50%)；抽样单位的任意放大：在上述HBV DNA检测中，抽样单位是1 μl血清［如血清前处理过程中有抽提(浓缩)过程，取2 μl上清液相当于实际含12.5 μl血清，则抽样单位也只是12.5 μl］，而报告结果的单位是ml甚至L。当总体为1拷贝/μl时表示一次抽样结果为0的概率达0.368，结果在0拷贝/μl～4拷贝/μl的概率为0.996；而总体为1 000拷贝/ml时表示一次抽样结果为0的概率为0，结果在905拷贝/ml～1 095拷贝/ml的概率为0.997(Poisson分布总体>50时近似正态分布，范围是X±uα*√X，可信限为99.7%时uα=3);总体为100 000拷贝/L时表示一次抽样结果在997 000拷贝/L～1 003 000拷贝/L的概率为0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR检测为例，其他病源体核酸的FQPCR检测也与其相同，检测限是抽样反应管的检测限4拷贝/反应管；如反应管中加入模板量相当于12.5 μl血清则检测限相当于0.32拷贝/ μl。此推断仅是针对FQPCR技术本身的检测限度，未就临床上有意义的最小病源体核酸的拷贝数进行讨论。【参考文献】

［1］ 冯仁丰.分析灵敏度(检测限)［J］.上海医学检验杂志，2002，17(3)：133134.［2］ 郭晏海，张菊，赵锦荣，等.聚合酶链反应荧光偏振技术在乙型肝炎病毒DNA检测中的应用及价值［J］.中华检验医学杂志，2004，27(1)：2627.［3］ 张东华，金根娣，陆志檬.二种分子杂交技术定量检测临床标本中HBV DNA的比较［J］.上海医学检验杂志，2003，18(3)：163164.［4］ 何敏，杨朝霞，刘微，等.HBV DNA定量检测方法的评价［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2005，26(2)：123124.［5］ 刘停，韩亚萍，张永祥.荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA及其意义［N］.南京医科大学学报，2003，23(1)：7879.［6］ 黄希田，颜鸣鹤，凌乔，等.定量PCR微流芯片法定量检测血清HBV DNA含量.中国感染控制杂志，2003，2(2)：8991.［7］ 王豪，陶其敏，吴娟，等.两种乙型肝炎病毒DNA定量检测方法的比较与评价［J］.中华检验医学杂志，2002，25(5)：318320.［8］ 李金明，邓巍，王露楠，等.PCR测定乙型肝炎病毒DNA弱阳性质控血清的适用性研究［J］.临床检验杂志，2000，18(1)：67.［9］ Mancini C,Pisani G,Azzi A,et al.Interlabortory comparison of qualitative detection of hepatitis C(HCV)virus RNA in diagnostic virology:a multicente study(MS)in Italy［J］.J Clin Virol，2004，30(4):313319.［10］ Raggi CC,Verderio P,Pazzagli M,et al.An Italian program of external control for quantitative assays based on realtime PCR with TaqMan probes［J］.Clin Chem Lab Med，2005，43(5)：542548.

第二篇：荧光定量PCR的应用

荧光定量PCR 的原理及应用

荧光定量PCR 是一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,是对原有PCR 技术的革新,扩大了PCR 的应用范围。

实时荧光定量PCR（FQ-PCR）作为荧光定量PCR技术的一种，是基于荧光能量传递技术,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色基团转移到受体发色基团,受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比,检测PCR 过程的荧光信号便可得知靶序列的初始浓度。它融汇PCR 技术的核酸高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR 过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。目前已在众多领域有广泛的应用。

1、FQ-PCR 在预防兽医学中的应用

PCR 技术的应用有许多局限,不能准确定量,假阳性率太高,只要有微量病原体存在就可以得到阳性结果,这不能完全作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。FQ-PCR实现了PCR 从定性到定量的飞跃,有效解决PCR 污染和对模板定量不准确等问题。

1.1在动物病原菌检测和鉴定中的应用

炭疽杆菌作为人兽共患病的病原,尤其炭疽杆菌的芽胞可作为生物武器的病原。科学家在100 L 纯化空气中加入炭疽杆菌芽孢,进行FQ-PCR检测,1 h 内炭疽杆菌的单个芽孢就被检测到。

1.2在动物病毒检测和鉴定上的应用

FQ-PCR已应用于许多病原体的检测,如对艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA、尖锐湿疣皮损中HPVD-NA、与鼻咽癌关系密切的EB 病毒、结核分支杆菌、巨细胞病毒、A 型和B 型流感病毒等病原体的检测。

3.3在动物寄生虫检测和鉴定中的应用

常用TaqMan 探针。如在被感染猪和鼠组织、全血、羊水以及脑脊髓液中的弓形虫定量,其检测极限相当于套式PCR , 但准确率大大提高。

2、FQ-PCR在畜牧业中的应用

科学家采用TaqMan 探针检测鸡γ干扰素、采用RT-FQ-PCR 证明中国黄牛背最长肌中cap nl mRNA 表达量与宰后3 d 的牛肉嫩度高度相关等。

3、FQ-PCR在其他方面的应用

3.1在动物检疫领域的应用

FQ-PCR 可对动物源性饲料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量检测。

3.2细胞因子表达定量检测

常用FQ-PCR 测定细胞因子mRNA 表达情况,分析机体免疫状态。利用FQ-PCR 测定鸡、猪在注射疫苗、免疫增强剂以及在感染某种疾病情况下体内细胞因子的mRNA 表达水平。

3.3环境监测

应用FQ-PCR 对水资源及居家、办公环境中的大肠埃希菌、藻青菌和一些寄生虫进行监测。

3.4转基因生物中的应用

用一个已知拷贝数的内源基因作为参照,同时对样品作内源基因和外源基因的FQ-PCR。两者达到荧光阈值时的Ct 值可得到外源基因的拷贝数;FQ-PCR 还可用于转基因动物的纯合性鉴定及对转基因后外源基因表达情况进行监测。

第三篇：关于购买实时荧光定量PCR仪申请报告

关于购买实时荧光定量PCR仪申请报告

尊敬的校领导：

自我校2012年提出“五大工程”以来，人才队伍实力与水平得到显著提升，同时我们也清醒地认识到现在高校所面临的生存危机，应对危机唯有发展壮大我校的软实力：大力发展特色学科、特色专业；大力开发研究秦巴山区优势生物资源，立足于秦巴山区，服务于全国。然而，我校在科研仪器设备配置方面还有待提高，我学科现需购置实时荧光定量PCR仪，申购理由如下：

高通量的检测和定量核酸序列的实时定量PCR系统，在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。广泛应用于肿瘤的分子诊断，新药筛选，基因表达研究，转基因研究，单核苷酸多态性（SNP）及突变分析，病原体的分子检测，遗传分析等。

关于实时荧光定量PCR仪功能介绍：我校位于秦巴山区，秦巴山区素有“天然药库”之称，有着丰富的生物资源。随着世界科研水平的发展，目前我校的仪器设备已不能满足科研工作的要求。在对秦巴山区优势中药材功能基因的研究中：（1）对功能基因的发育阶段表达、组织表达情况分析；（2）检测功能基因RNAi干扰效率：功能基因的作用研究中，要对功能基因沉默表达（RNAi）分析，检测RNAi的干扰效率要用到实时荧光定量。（3）对功能基因相关基因表达模式分析。

作为一所

院校，拥有一台性能良好的实时荧光定量PCR仪，是学校发展和从业教师的需求。可行新分析：

（1）研究功能基因，实时荧光定量PCR仪是必不可少的仪器设备；（2）实时荧光定量PCR仪操作简单，经过简单培训即可学会；（3）试剂耗材费

（4）应用广泛

科研领域都在用 主要技术指标：

热循环系统

新型半导体

96/384孔

可升级选配低密度芯片 光学系统

氩离子激光器 全波长光栅 冷CCD 扫描模式

全程扫描

软件系统

Primer Express 3.0探针引物设计软件 SDS 软件 绝对定量 相对定量 等位基因分析 阴阳性结果自动判断

反应系统

最低可在35分钟内完成PCR实验

5ul反应体积（选配低密度芯片可至1ul）

配套试剂盒

30万基因表达试剂盒 200万SNP试剂盒 可代客定做引物模板 专业转基因 致病菌筛选试剂盒 主要性能：

全波长光栅分光，添加新染料无需更换滤光片，同时检测8种以上荧光染料，最大限度实现多重定量，SNP分析等应用。

完备，多样，专用的软件，无需人工计算，完成定量实验

多组份荧光校正软件，一体化硬件设计，辅助ROX荧光，保证定量结果的准确性和高分辨率（装机指标，5000和10000达到2倍的拷贝数）

齐备的试剂盒 帮助客户完成高要求的实验

9、可为客户提供安装操作鉴定（IQ/OQ）验证文件服务，以符合GLP/GMP对生产设备的要求。

技术参数：

（1）色荧光，可用于多重PCR检测（2）激发光源寿命

（3）检测器：

成像系统，无时间差，保证结果的准确（4）温度控制系统：半导体控温（5）温度准确性≤±0.05℃（6）温度控制范围：

（7）动力学线性范围：

个数量级，区分

拷贝两倍差异浓度的样本，其致信度高达多少99.7%（8）支持ROX或其它染料用做参比荧光，同时，软件支持无参比染料设置（9）试剂开放，耗材开放，（10）仪器性能有原厂装机试剂盒验证（11）灵敏度：

（12）激发/发射滤光片：是否支持客户自行添加染料。（13）可检测450～750nm连续波长

（14）数据分析：可同时分析

色荧光PCR数据；有无绝对定量、相对定量功能；可否选择多个看家基因进行数据处理；可否自动根据扩增效率对数据进一步处理，得到更加准确可靠的结果；软件支持分析无限制数量的数据文件，增大反应通量；具有等位基因、熔解曲线分析功能；软件支持进行加样重复及生物学重复结果的统计。

（15）配置专业引物探针设计软件，用于基因引物探针设计，并且保证退火温度一致性。

第四篇：荧光PCR检测原理

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。其特点有：

(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。

(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。实时荧光定量PCR技术的基本原理

在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。

方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR技术的应用 1.基因工程研究领域

① 基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。

② 转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。③ 单核苷酸多态性（SNP）及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基于两条探针和基因组的不稳定性。基因突变基于两条探针，一条探针横跨突变点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体得稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。2.医学研究领域

① 病原体检测：由于实时荧光定量PCR方法可靠性和重复性好，并且操作简便、快速、结果判断客观，目前，人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。

② 药物疗效考核：利用实时荧光定量PCR技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。结果证明，实时荧光定量PCR系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法，应用这种技术可以预测化疗将引起的反应。

③ 肿瘤基因检测：肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。

目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因、肿瘤MDRI基因、白血病WTI基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现。荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。3.其他领域

用实时荧光定量PCR方法对免疫组分进行分析是其应用的重要方面。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。检测方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。服务流程

1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；

3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；

5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。收费标准

优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）

（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数

（如图1所示）。

1.荧光阈值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1.TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2.SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。3.分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。1．传统定量PCR方法简介

1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。2．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．内标对定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

第五篇：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR荧光探针法)

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

样本要求

1.适用标本类型：血清或血浆 2.标本采集

1）血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30—60min，血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管

2）血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA-2K或枸橼酸钠的玻璃管，立即颠倒玻璃管混合5—10次，使抗凝剂和静脉血充分混匀，5—10分钟后即可分离血浆，转移至1.5 ml灭菌离心管

3.标本保存与运送：所采集的标本可立即用于测试，也可以保存在—20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。检验方法

1.DNA提取（样品制备区）

将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品进行同步处理。1）取200μl样品，加入450μlDNA提取液I和4μl的内标溶液，用振荡器剧烈混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理10±1分钟 2）12000rpm离心5分钟，备用 2.PCR试剂准备（试剂准备区）直接使用HBV-PCR反应管 3.加样（样品制备区）

往上述HBV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入待测样本、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清液各20μl。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。

4.PCR扩增（扩增和产物分析区）5.结果分析

反应结束后自动保存结果，根据分析后的图像调节baseline值得Start值、End值以及Threshold值，点击Analysis自动获取分析结果，在Repoet界面查看结果，记录未知样本数值（C）6.质量控制

(1)阴性质控品：FAM通道无对数增长期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线为明显对数增长期

(2)HBV阳性质控品：FAM通道有明显的对数增长期且Ct值小于30(3)HBV阳性定量参考品：FAM通道有明显的对数增长期，呈典型S形曲线。CT<29且R²>0.98 7.结果判断（1）如果在FAM通道无明显的对数增长期或Ct值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则判定样本的HBV DNA浓度小于检测灵敏度。（2）如果在FAM通道有对数增长期或Ct值小于30 则1）若样本的C<100，则样本的HBV DNA浓度<100IU/ml 2）若样本的100《C《5.00E+008，则样本的HBV DNA浓度= C IU/ml 3）若样本的C>5.00E+008，则样本的HBV DNA浓度>5×10 ⁿ IU/ml