江苏省54家PCR技术验收合格单位名单（共五则）

第一篇：江苏省54家PCR技术验收合格单位名单

江苏省54家PCR技术验收合格单位名单

发布时间：2006-12-1

根据卫生部下发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发〔2002〕10号）和《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字〔2002〕8号）规定，省临检中心对全省开展PCR技术的实验室进行了验收，截止2005年底，共有54个实验室通过验收。现将通过验收的医疗机构的实验室名单公布如下：

江苏省54家PCR技术验收合格单位名单 江苏省人民医院临床检验中心 分子生物学实验室

江苏省中医院检验科 PCR实验室 南京军区南京总医院全军医学检验中心 分子生物学实验室

南京医科大学附属南京第一医院放免中心 临床基因扩增实验室

南京市鼓楼医院医学检验中心 基因诊断实验室

东南大学附属中大医院免疫科 临床基因扩增实验室

南通大学附属医院酶学研究室 基因扩增检验实验室 连云港第一人民医院肿瘤生物治疗中心 临床基因扩增实验室

南京市儿童医院儿科研究所 基因扩增室 南京市妇幼保健院遗传诊断研究室 临床基因扩增实验室

盐城市第一人民医院检验科 临床基因扩增实验室

盐城市第三人民医院检验科 临床基因扩增实验室

苏州大学附属第二医院放免中心 临床基因扩增实验室

昆山市第一人民医院检验科 临床基因扩增实验室

常州市第一人民医院综合实验室 基因扩增实验室

常州市第二人民医院检验科 临床基因扩增实验室

常州市第三人民医院检验科 基因扩增实验室

常州市武进人民医院检验科 分子生物学实验室

溧阳市人民医院检验科 临床基因扩增实验室

无锡市第一人民医院中心实验室 临床基因扩增室

无锡市第二人民医院检验科 中心实验室 无锡市第三人民医院中心实验室 临床基因扩增室

无锡市第四人民医院肿瘤中心实验室 临床基因扩增室

宜兴市人民医院检验科 临床基因扩增实验室

扬州市医学检验中心 基因扩增实验室 南京市第二医院肝病研究室 基因扩增实验室

江苏大学附属医院检验科 临床基因扩增实验室

镇江市第一人民医院中心实验室 基因扩增实验室

镇江市第三人民医院检验科 临床基因扩增实验室

苏州市立医院总部检验科 分子生物学实验室

淮安市楚州医院检验科 分子生物学实验室 32 常熟市第二人民医院检验科 分子生物学实验室 33 张家港市第一人民医院检验科 基因扩增实验室 34 无锡市妇幼保健院中心实验室 基因扩增实验室 35 江阴市人民医院检验科 PCR实验室

中国医学科学院皮肤病医院（所）性病参比实验室 PCR实验室 37 南京医科大学第三附属医院检验科 临床基因扩增实验室 38 淮安市第四人民医院肝病研究所 临床基因扩增实验室 39 苏州大学附属第一医院检验科 分子生物学实验室

苏州市第五人民医院中心实验室 临床基因扩增检验实验室 41 常熟市第一人民医院检验医学中心 分子生物学实验室 42 常州市红十字中心血站 HLA配型实验室

无锡市传染病医院检验科 临床基因扩增检验实验室 44 南京扬子医院传染科 PCR实验室 45 宝应县人民医院检验科 PCR实验室

淮安市第一人民医院中心实验室 分子生物学室 47 常州市妇幼保健院临床实验室 PCR实验室 48 镇江市第四人民医院检验科 PCR实验室 49 江苏省血液中心 分子生物学诊断实验室

徐州中心医院检验科 临床基因扩增检验实验室 51 徐州第三人民医院检验科 临床基因扩增检验实验室

大屯煤电（集团）公司中心医院核医学科 临床基因扩增实验室 53 苏州木渎人民医院、吴中中医院检验科 临床基因扩增实验室 54 无锡市中医院中心实验室 临床基因扩增检验实验室

第二篇：pcr检测技术

《食品安全学》综述

PCR快速检测技术综述

1．前言

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。

2.研究的目的与意义

聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。

人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。

1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。3.国内外研究现状

3.1.基础研究方面的应用

目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：

[1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变；

3.2.PCR在临床上的应用[2]

[1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。

[2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。[3]在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3．3.在法医学中的应用[3]

例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将4.相关检测技术 4.1.技术原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验中发现，DNA在高温下也能发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。4.2.工作原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 4.3.工作步骤

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度 5.研究方案

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。5.1研究方法

① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。

② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。

③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，5.2.技术路线

PCR技术

聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。5.3.所用仪器与材料

引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40-60%,浓度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。

4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究内容

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。6．1.检测对象

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。[4]乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能 6．2检测内容

PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。

PCR技术类型[5]

免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术

复合PCR技术

彩色PCR技术

抗原捕获PCR技术 增敏PCR技术

酶标PCR技术

二温式PCR技术

锚定PCR技术

定量PCR技术

毛细管PCR技术

多重PCR技术

巢式或套式PCR技术 7.预期目标PCR 技术在大肠杆菌O157: H7检测中

（1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物： 正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld。

徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR: kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7。

4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中

传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。

参考文献

[1] 葛忠源;荧光定量PCR检测DPV弱毒免疫鸭消化道和呼吸道大肠杆菌、葡萄球菌、乳酸杆菌及其数量变化规律的研究[D];四川农业大学;2006年

[2] 徐焕宾,贲昆龙,曾涛,李劲光;检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用[J];中国病毒学;2001年02期

[3] 顾鸣，韩伟.复合PCR鉴定沙门菌的方法.中国卫生检验杂志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陆.肠出血性大肠埃希菌(EHEC)流行趋势.中国食品卫生杂志[J]，1999，3:31-35 [5] 石岚;实时定量PCR检测IgH基因重排的研究[D];昆明医学院;2004年 [6] 王颖.食品安全学技能训练.2010.10

第三篇：PCR技术原理及心得.

PCR技术原理与心得体会

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h 后带型不规则甚致消失。

一.假阴性,不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。

物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

二.假阳性,出现非特异性扩增带 1.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR 扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片

段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

2.出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸。

3.出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:①减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量,减少循环次数。

三.PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛 的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因

(一标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。

(二PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题,因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml,远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物 污染,就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大。污染的监测

一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

四.对照试验

1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下,但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。

2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。

3.重复性试验

4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 五.防止污染的方法

(一合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。

(二吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板

核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或产生气溶胶污染。(三预混和分装 PCR 试剂:所有的 PCR 试剂都应小量分装，如有可能，PCR 反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR 试剂，PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。(四防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使 用。(五设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最 低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一 管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。(六减少 PCR 循环次数，只要 PCR 产物达到检测水平就适可而止。(七选择质量好的 Eppendorf 管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。呵呵 其实 DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的质量也很关键 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 与 RNA 的 PCR 结果有很大的差异的。呵呵。

第四篇：pcr室验收整改措施（共）

pcr室验收整改措施（共7篇）

第1篇：供应室整改措施供应室整改措施

篇1：消毒供应室室质量检查存在的问题及整改措施

消毒供应室质量检查存在问题及整改措施

检查人:

日期：

篇2：县中医院消毒供应室验收整改报告

瓮安县中医院

关于消毒供应室验收整改报告

县卫生食品药品监督管理局：

按照《贵州省医疗机构消毒供应室验收评定标准》的要求，州、县主管部门及评审专家组于20XX年3月22日对我院迁建的消毒供应室进行了认真、严格的现场验收、评审，结果我院以950分通过了消毒供应室的评审验收，但在建设中已存在不足。专家组在评审会议上提出了以下六个方面的问题：

1、供应室未相对独立，自然通风条件欠佳。

2、无辅助区域，回收间无负压。

3、器械消毒时还存在完全闭合消毒的现象。

4、单包装的尖锐器械未上保护套。

5、回收区域无专用感染物品的冲洗池。

6、无菌物品无追溯记录登记本。

我院针对专家提出的建议，高度重视，专题会议研究和部署，迅速组织相关人员在规定时间内完成，及时制定了相应的整改措施，逐条落实，现将整改情况汇报如下：

1、针对第1、2个问题，我院目前属部分搬迁，现新建的供应室是在原县医院用地上建设的，因受地理条件的限制，自然通风条件欠佳，无辅助区域，待医院整体搬迁后再行改扩建。

2、我院根据《医院消毒供应中心清洗技术规范》及相关制

度，打包灭菌时器械已采用不完全锁扣消毒，并定期加强督查。

3、根据《医院消毒供应中心清洗技术规范》单包装的尖锐器械已上保护套，并定期加强督查。

4、回收区已于20XX年3月25日安装专用感染物品的冲洗池。

5、按照相关制度及要求已建立无菌物品追溯登记本。

总之，我院按照评审专家组整改意见，在规定的时间内，逐条落实，已于20XX年3月25日整改完毕。

瓮安县中医院

20XX年3月26日

篇3：供应室等级验收中存在问题与整改措施

供应室等级验收中存在问题与整改措施

一、布局、流程有欠合理

二、未做到全院集中回收、供给

三、未做到密闭下送、回收

四、人员配置欠合理，压力容器上岗证不能做到人人持有。

整改措施：

一、内部还可稍做改建，但改建后依然不符合规范中供应室布局的要求。

二、供应室去污区使用面积太小，已没有地方可放置浸泡呼吸管道

容器，只有等清洗管道的清洗架到了进行机洗，同时解决供应

室人员配置问题，才能共同解决第三、第四问题。

三、人员配置问题解决了，就可以做到密闭下收下送。

四、供应室合理人员配置应是：专业人员6＋工勤2。

按照人力资源

管理理念，专业人员应做专业的事（准备用物、清洗打包）工

勤人员应担任消毒（培训、拿证），密闭下送，回收手术室器械。

又能保证消毒人员都持有压力容器上岗证，又符合规范中供应

室管理要求，既做到专业人员合理应用，有节约因人员

应用不

合理，造成人人上岗必培训拿证所付出资本投入。

供应室

20XX年8月1日

第2篇：供应室等级验收中存在问题与整改措施供应室等级验收中存在问题与整改措施

一、布局、流程有欠合理

二、未做到全院集中回收、供给

三、未做到密闭下送、回收

四、人员配置欠合理，压力容器上岗证不能做到人人持有。

整改措施：

一、内部还可稍做改建，但改建后依然不符合规范中供应室布局的要求。

二、供应室去污区使用面积太小，已没有地方可放置浸泡呼吸管道

容器，只有等清洗管道的清洗架到了进行机洗，同时解决供应室人员配置问题，才能共同解决第三、第四问题。

三、人员配置问题解决了，就可以做到密闭下收下送。

四、供应室合理人员配置应是：专业人员6＋工勤2。按照人力资源管理理念，专业人员应做专业的事（准备用物、清洗打包）工勤人员应担任消毒（培训、拿证），密闭下送，回收手术室器械。又能保证消毒人员都持有压力容器上岗证，又符合规范中供应室管理要求，既做到专业人员合理应用，有节约因人员应用不合理，造成人人上岗必培训拿证所付出资本投入。

供应室

年8月1日

第3篇：档案室整改措施[推荐]xx镇档案工作按照上级相关部门的要求，结合学_实践科学发展观活动适应新形式的总体部署要求，通过广泛征求各部门、单位的意见建议。经整理得出以下几个不足之处：

1、档案库房管理现代化手段落后，还沿用以前的老方法，科学创新不够，需加快档案现化化管理。

2、服务形式单一，无法满足查阅者诸多方面的需要，服务质量仍有待进一步提高。

3、查阅室设施简单，需进一步优化查档利用环境。

结合自身实际,针对以上3条意见建议，经过镇党委、政府领导讨论研究，提出了促进科学发展的主要思路和措施，现制定如下整改措施：

(一)加强档案库房现代化管理。

1、继续做好经常性的日常维护管理工作。

2、重新制订修改相关制度，进一步明确管理人员的岗位职责。

(二)做好窗口服务工作，做到热情周到、文明高效，方便老百姓查档。

1、根据档案查阅利用的相关法律法规规定，从方便群众查阅利用出发，制订便民措施。

2、做到文明用语，热情周到。

3、结合政务公开，公开办事程序，方便群众查阅利用。

4、提供热情周到优质服务，真正做到查档、阅档人员高兴而来，满意而归。

第4篇：叉车充电室整改措施叉车充电室整改措施

一、建立叉车充电室卫生岗位责任制。

二、在叉车充电室门框里侧和外侧粘贴警示帖。

三、在叉车充电室内墙内侧粘贴叉车防撞警示贴。

四、对叉车充电室内充电设备进行清理并码放整齐。

五、对叉车充电室内消防设备及叉车零部件进行整理并规

化码放位置。

物流配送-09-02

第5篇：中支验收整改措施筹建工作整改情况的汇报

12月2日山东保监局对合众人寿淄博中心支公司的筹备工作进行了现场验收，保监局领导对筹备工作提出了一些须改善的问题和对公司今后发展有益的建议。针对保监局领导提出的问题和建议，分公司和淄博中支筹备组十分重视，进一步自查了筹备工作中存在的问题，并用一个月的时间对存在的问题进行了整改，使各项筹备工作更加完善，中支公司的今后发展打下了良好的基础。现把整改的主要工作汇报如下：

一、对中支班子成员及相关管理人员进行了调整。

进一步明确薛立志同志为筹备负责人兼团代部经理，分管团银业务；团银部设立团险业务管理岗和银保业务管理岗分别由张斌、马建华两位同志担任；王勇同志担任助理分管个险业务。年昕同志调分公司营销部担任总督导长，负责各中支的业务推动和筹建指导，其余人员岗位不变，目前中支各管理岗位定位清晰，队伍稳定。鉴于淄博筹建初期年昕同志直接参与筹建，对当地情况和队伍状况都较了解，为保证队伍开业初期顺利发展，近期将协助淄博中支工作一段时间。

二、充分做好一线队伍的建设，使中支公司三条业务线的队伍建设更加壮大。

对业务队伍进行了系统的培训和学_，使一线人员的业务技能得到了提高。另外还加强了代理人资格的培训和考试，持证人力由一个月前的40多人达到目前的约200人，为开业后的人力规模和100%持证率的达标打下了良好的基础。

三、强化了保险法律法规的学_。

为了在今后的经营中更加规范，在分公司的组织下对管理人员进行了法律法规的系统学_，制定了学_内容和学_时间，并进行考试，平均成绩82分，保证了学_的效果，在学_中也得到了保监局领导的指导和学_内容的提供。今后分公司将把法律法规的学_纳入制式学_的内容，让所有管理人员掌握制度，在今后的工作中更好的贯彻。

四、加强了对口业务的指导。

为保证各业务系列明确06年的发展方向和总分公司的经营思路保持一致，分公司各系列负责人前往淄博沟通座谈，大家进一步统一了思想、明确了业务拓展的方向和市场的主攻目标，结合总公司提出的“主体跟随、重点突破、局部超越”的战略部署制定了各系列的06年的目标和计划。

五、进一步加强了基础管理和团队文化的建设。

新公司各项工作都要从无到有逐步完善，只有团队文化的真正形成才能更好的提升团队的凝聚力和战斗力，为此我们充分利用开业前有足够培训时间的机会加强了公司介绍、公司文化的学_，中支公司在管理制度的制定、日常的行为的规范、职场的布置等多方面做好文化的建设，中支管理文化初步形成。

六、元月4日分公司王总亲自带领分公司一行人员对淄博中支进行了再次内部检查，各项工作均已落实到位，达到了预期的目的。

我们将在此次筹备的基础上总结经验，不断完善各项管理工作，不仅把淄博中支建设好，还要把过程中的经验和教训总结好，为其他中支的建立和成长做好借鉴，使合众人寿在山东的发展真正做到健康、稳健、快速发展。

合众人寿山东分公司

年1月10日

第6篇：换药室整改措施.3.24换药室整改措施

年3月24日，我院怀疑换药室被污染，立即通知换药室人员对换药室进行封闭整顿。具体措施如下：

1.换药室所有怀疑被病人污染的不在有使用价值的物品集中进行焚烧处理。

2.换药室所有器械、物品凡能用1%过氧乙酸浸泡的一律浸泡30分钟，再清洗、打包、高压灭菌。

3.所有无菌物品一律送供应室重新高压锅灭菌。

4.换药室内各种用物用1%的过氧乙酸擦拭

5.换药室三间物用40%的甲醛加热熏蒸，密24小时后通风。

具体：换药室每间房子面积约70m3,每m3用40%的甲醛12ml,每间房屋用85ml，房屋内温度开空调保持在18℃以上，湿度保持在60%以上，加热熏蒸密24小时后通风。

注：换药室在未彻底整顿之前任何人不得换药。

第7篇：急诊科门诊输液室整改措施关于地区对阿克苏市医院急诊科免疫规范化管理专项整治活动督察反馈意见整改措施

一、存在问题

1、门诊输液室含氯消毒剂浓度监测日期记录到.2.3

二、改进措施：

1、护士长对科室工作质控力度不够，未能及时发现科室存在的问题，对各项护理工作及制度落实情况未检查监督。

2、个别护士对消毒隔离管理未按要求执行，科室院感监控员未尽到应有的责任。

三、改进措施：

1、护士长对本次检查出的问题及时反馈，并跟踪检查做到及时整改。

2、科室加强护士工作责任心，严格执行各项护理操作规程及消毒规范要求，保证患者安全。

急诊科

.3.2

实验室整改措施

检验室整改措施

重点实验室整改措施（共7篇）

化验室整改措施（共19篇）

收费整改措施

第五篇：江苏省2011二级注册建造师继续教育单位名单

江苏省二级建造师继续教育培训单位公示

根据住房和城乡建设部《注册建造师继续教育管理暂行办法》(建市【2010】192号)及《江苏省二级注册建造师继续教育管理办法》(苏建规字【2010】8号)的规定，经各省辖市建设主管部门推荐，由省厅对各市推荐的培训单位进行了认真考核。经研究，拟确定南京市城建中等专业学校等25家培训机构为我省二级注册建造师继续教育培训单位，现予以公示。

公示时间为2011年5月10日-16日。期间，如对公示单位有异议，请与省厅建管处联系。电话：025-51868657，联系人：房福亮。

二级注册建造师继续教育单位名单

南京市城建中等专业学校 江苏省南京工程高等职业学校 江苏省建设集团公司培训中心 江苏建科建筑技术培训中心 南京工业大学土木工程学院 无锡市建设培训中心 无锡市江大培训服务中心 江苏建筑职业技术学院（徐州）徐州工程学院

江苏省常州建设高等职业技术学校 常州市建筑职工大学 苏州市建设职业培训中心 苏州市智信建设职业培训学校 苏州科技学院成人教育学院 南通建筑职业技术学校

南通市通州建筑职工中等专业学校 连云港市建设培训中心 淮安市建筑职工教育培训中心

盐城市委党校（与盐城市建设教育协会联合办学）扬州市建筑职工中等专业学校 扬州市建设培训中心 江苏科技大学（镇江）泰州市建筑科技教育培训中心 泰州市建设教育培训中心 宿迁市广播电视大学