第一篇：悲伤的分子生物学读后感
悲伤的分子生物学读后感
一年前的今天，我开始了二十四的日子，没想过文理问题。
一年后的今天，几个小时前，决定学文的我看到接下来转的这篇网文，拼命回忆我所学的生物知识基础，费力把它看完以后。我的悲伤仿佛也随着身体里的DNA，mRNA，多肽链起无处不在地蔓延开来，眼瞅着那段日子还在我面前晃来晃去，却发现这段间隔几乎已占我已走过生命长度的很多
我们的生活就是一个DNA剧本，不停的翻译同一段故事，把角色名换了又换。它一丝不苟，我们无法自拔。有时我们觉得别人的故事让我们感动，共鸣，我们义愤填膺或者我们嫩牛满面，不管我们汉族，藏族，蒙古族，还是黑种人，黄种人，白种人，我们觉得故事似曾相识，因为我们DNA大同小异，剧本也就八九不离。
朋友走，情侣走，流光去，岁月抛。我们可忆、可喜、可气，可高歌、可扼腕、可捧腹，唯独无法让时间停住，容我摸摸触触。时针绕着轴转，我们跟着时间转。转到我们自己也厌了，却发现除了跟着转我们别无他法。明明知道剧本就在身体里，可是盯着自己的手，我们只能看到折叠组装包装再包装的蛋白质外壳，连多肽链也看不到，更遑论DNA？
“如果相遇的尽头注定是错过，是不是，还是做一个内含子好一些呢？”噢，我们还有内含子，这些未显现的东西是不是就是给我们追求给我们希望的动力呢？殊不知，内含子从来不参与生命剧本的演出。当一些人以此为精神支柱苦苦追求一生未果时，不知又作何感想呢？
身体里的DNA编剧兼男二号上演着一出出华丽的悲剧，身体外的DNA冷眼旁观地指挥着生活中的高潮低谷。逃也逃不离，避也避不起。谁试图结束，那只有一条路——一把火烧古，那些悲悲喜喜通通作古，剩下一堆无机物。
第二篇：悲伤逆流读后感
悲伤逆流读后感
悲伤逆流读后感1
人世间最大的悲哀是什么?幸福近在咫尺，可你却怎么也抓不住它。不是不想，而是有太多的无奈。你想与命运抗争、你想拯救天使、拯救幸福，对不起!你…不行从来不懂什么是爱情，也许…没人懂，齐铭跟易遥不是爱人，但仿佛又是…...也许，那是一种常人无法理解的感情。初看这篇小说，觉得最悲哀的人是易遥。但越读越发现其实不然，最痛苦、最无奈的人其实是那个一直默默守候在受伤的天使身边的守护者-齐铭。他深爱着易遥，可是却只能一直眼睁睁地看着她被一次次的伤害，那种无奈的痛苦有谁会了解?也许易遥几乎失去了一切，可齐铭的爱却是她一生最宝贵的财富。爱的表达方式有很多种，有的人选择的是“沉默”。爱情不是甜言蜜语、不是身体上的占有，而是在你几乎一无所有时他(她)的不离不弃!有一种爱从来不用说出来，他只是默默地关心着你、祝福着你!不要责怪齐铭，因为这个世界人很难做。不要只为一人鸣冤，其实所有的人都很悲哀!人生就是这样，明明应该是你的东西可就是没办法得到。
悲伤逆流成河。仍然是个美丽的故事，虽然美得令人心痛…因为过于幸福美满的东西总让人感觉不真实，也许悲喜交加才是真的生活罢。没有体会过那种生离死别的感觉、没有经历过那种凄美的爱情故事，但现在越来越觉得其实平凡的生活最幸福，细细品位那些平凡日子中的人和事，发现自己其实真的很幸福!喜也好、悲也罢，都是人生旅途的动人风景，所以，一切坦然。
悲伤逆流读后感2
应该不是第一次看这本书了，第一次是在看我电影后他们都说小说的结局更惨，所以就看了。第二次是在某个无聊的晚上看的，那这次应该第三遍看了吧！每一次看都有不同的收获，看电影时哭的稀里哗啦，就记得一些情节；第一次看小说是为了追求不同的结果，也哭的稀里哗啦，也还是对情节进一步加深；第二次看小说是为了打发时间，仅只是吐槽了一些坏人，然后想着如果改变一些做法那么结局会不会改变；现在，来说说这一次看小说的想法吧！这一次，不想情节，也不去假设，想了一下道理：
1、如果一个男人不爱你，不要试图想为他生一个孩子，然后让他不得不和你在一起，孩子，生出来是需要负责的，在为一个男人生孩子的时候请你想清楚如果有一天这个男人不要你了，把你抛弃了，你是否自己可以很好的带孩子，给孩子一个温暖的环境。
2、可以爱一个人，但是不能为他付出一切。一个男人以爱你为借口而和你一起上床，那么这样的渣男直接离开就好，不要因为爱他而相信她会对你负责的话。
3、如果你想了解一个人，请不要从别人口中认识他，而是走进他的生活，然后慢慢去了解他，那个才是真正的他。
4、以暴制暴解决不了问题，甚至还好把问题扩大。当出现问题时要积极想解决问题的方法，而不要逃避问题，把自己知道的说出来。
5、语言的伤害是很大的，好多年过去了可能还会在耳边不停的想着，心里想着什么就说什么，不要总是口是心非，这样会害人害己。
悲伤逆流读后感3
光线在瞳孔中，只射进一缕时，顿寂寞，顿温暖。
明媚中我看见忧伤，就如同我被刀匕划出一道冗长的血口，却在最痛处有人为我包扎。开与落，来与归，喜与悲，笑与泪。我在人群的形形色色中找到插裤袋的人，他们在绽开，奔来，喜悦，欢笑；依然有低头看路的人，他们则落去，回归，悲愤，泪垂。我不喜欢简单的节奏，更不喜欢复杂的情节，依是孤独在青春的暮霭中。
花季，雨季，如果沾上了污秽，亦是芳华，年华。女孩子灰暗，真正的灰暗是否让她在苍茫中独立面对。有些早。而男孩子过晚地心痛，又是否是一种晚熟？
他们都不应该这样接受。然而，他们矗立的人生不在想象的部落，他们依是凡人，普普通通的绿草，晨曦抑或是风雨，他们无从选择。他们只能提前知悉，在乐过后，一定会有悲伤在悲伤后悲伤。
她很幸运，在苍茫中有那丝缕阳光影射在她的生命中。她没有任何的理由不生活。同样的，他很欣慰，晚熟下是他关怀还落拓的光芒……
对于她们的未来，我未知。对于每一个人，我依旧是个过客。
那个白天，我抬头暸看黯淡的夜空。我感到一颗石头在心脏上几次被弹起，这应该叫做隐痛。该与不该就像我眼中的风景，混淆在落花秋去中，消逝在伊人何方君何方中。
悲伤逆流读后感4
上个月，我看了这么一本书，或许是它的标题吸引着我，或是它的作者名声波及到我。是我就这么的读上了它，它就是《悲伤逆流成河》。书中讲述着一个包含着黑暗、繁复、沉重、压抑、细密、锐利这些名词的少年青春故事。和着书店中卖着的青春小说或许有些相同，都统概着如火的青春。
王子型的的男主角，灰姑娘般的女主角，青春小说中的典型故事主角。后来的结局都是美满的幸福的在一起。但在《悲伤》中这却是另一种结局，父亲的离开妈妈的毒骂同学的每天的冷眼热嘲，使着女主易瑶戴上了“灰姑娘”的角色。然而女主的性格便变得坚强与世孤立而又敏感使着有着“王子”角色的齐铭要想着相信着自己可以将易瑶救出黑暗之中。但渐渐地事与愿违。毕竟这本书叫《悲伤》。对于王子型的名铭的一次次靠近，只让易瑶感到一丝温暖而又掉进更深的冷境中。或许真是生活中的各种荆刺塑造着一个坚强的女主角易瑶。虽在后尾而因他人不信任而瓦崩的坚强，选择一跳而结束自己的生命。
就这么几个如同我们和我们一样花样年华的他们却在这本《悲伤》中遭遇着不幸，接触着这世界的黑暗。都是我们不愿看的。和他们相比，我们是有那么的幸运，生活在这光明里。好好去珍惜生活中的一小细节快乐，温暖的感动，就这么一小细节，在这本书中易瑶身上应该是放大的。让我们在将遇见如同书中的黑暗时，可以回想，我们曾经拥有过啊，拥有过那快乐，幸福年华。
悲伤逆流读后感5
翻开书页，我感觉血液在血管里缓缓地流动，就像那条在黑暗中暗暗流淌着悲伤的河流。流经青春的每一个角落，在回到命运原本的轨道，让人以为，生命是凝着明媚和忧伤的琥珀，透明的松脂包裹着永远也无法触摸的狰狞的伤口。
我把沉郁的铅灰色文字拼成一张巨大的照片，投放在那条昏暗的弄堂，然后流着泪看它尖叫着破碎。而那张照片上，有笑着的易遥和齐铭好看的脸那些撒满回忆的碎片，再也难成曾经的和谐。失去的青葱岁月，成为记忆里的斑斑点点。
不是友情的关心会不会是爱情的讯号？可是，我看见齐铭牵着顾森湘的手走出校门，走过易遥和她的单车。我想那一刻易遥的心是痛的，就像自己唯一的洋娃娃被人夺走一样。齐铭之于易遥就像一直陪伴她的洋娃娃。突然间失去了，让易遥不知所措，所以她固执地想要挽回。
然而，当一切归于枉然，易遥用力地微笑着看离开了自己的齐铭变得阳光，充满幸福的味道。只是，空气中依然弥漫着苦涩。
合上书的瞬间，我突然间忘了爱情与友情在悲伤的青春里有着这样的钩钩缠缠。却也突然间明白，爱与不爱，不只是接受与拒绝，也是信与不信的纽带。就像易遥的离开，不只是想要告别那条弄堂里的热牛奶，也是想对着这悲伤的青春说：永别！
悲伤逆流读后感6
如果我说《悲伤逆流成河》，我想我会收到这几类应答：“哦，就是那部台词矫揉造作得要命的烂片啊。”亦或者“那部拍得像MV的影片真的没啥好看的”……不过我今天提起这部电影，并不是要和你去争辩它是好是坏，我只想谈谈那些霸凌者的帮凶——“软弱者俱乐部”。
电影中的女主易遥在被以唐小米为首的霸凌者的欺侮下，最后走向崩溃轻生，这中间被无辜卷入的学霸顾森湘也因为这场霸凌失去了生命。整部影片下来，我发现我厌恶的不是唐小米，而是那些不作声，全程保持沉默的看客，我称他们为“软弱者俱乐部”。
明面上自己没动手，没有去跟着唐小米欺侮易遥，可实际上正是这群人的冷漠把易遥推向了人生的终点。
记得影片中有这样一幕：易遥因为唐小米的人身攻击而异常伤心，班上有一个女同学看到了，就像拿着纸巾，上前安慰她，但最后却被其他同学拦了下来。
所以我说，真正击垮易遥的不是一件事，是长期以来被这群“软弱者俱乐部”营造出的冷漠环境。
正是因为这群人的不发声，才助长了施暴者的士气，她越会觉得自己的所作所为使受众人支持的，是占主流的，所以霸凌别人的时候，自然是肆无忌惮。
其实作为一部霸凌题材的影片，个人觉得它并没有部分网友说得那么糟糕，不要因为某些刻板印象就去全盘否定它。《悲伤逆流成河》还是值得大家一看的，说里边儿霸凌题材太浮夸，不切实际的，我只能说一句：别拿自己没经历过的事情，当做是这个世界上不存在的。
悲伤逆流读后感7
书中写了很多的感人的故事，书中的易遥是那么的悲惨，以自杀结束了自己的生命，也以死换来了他人的信任，换来了自己的无辜。
更多的时候，我也时常问自己，自己是不是对他人不信任。也许每个人都会有一点，但说真的，我们要努力去相信眼前的一切，虽然你有时会觉得这世界很多时候都在欺骗着你。不要等到后悔的时候才去相信，也许那时候已经来不及了。
可悲的爱情，齐铭和易遥没有走在一起，那也是曾经了。因为他们两个根本是不同世界的人，就像同性的磁铁一样。相反的最终只能各走各的，但记忆里总少不了那一段，永远的搁置在心里。顾深湘同样的走了。一个是可能，一个是不可能，两个都走了。一个只留下从前的记忆；一个留下了一句话——这个世界太肮脏。剩下只是活着人的无尽的悲伤。
可恨的爱情，唐小米心底的那颗沉默的黑暗的一面慢慢地流遍全身，为了得到想要的，暗地里可以去伤害另一个人，却不一点不觉得过不去，甚至还向别人展现出纯美的一面，就像一只披着羊皮的狼，是那么的虚伪!
每一个人都有自己黑暗的一面，这一面它不可能从你身上剔除，只在于你自己，如何对待。对这个世界充满美好，真的不要抱怨，因为那真的是徒劳的，它不可能因你而改变，只有你因它而改变。
珍惜别人的爱情，同样的，努力追寻自己的爱情，不要为了爱情，将黑暗吞噬了心，即使没有获得，但至少曾经追寻过，那已足够。
悲伤逆流读后感8
生命被书写成潦草和工整两个版本，再被时间冲刷得褪去颜色。难以辨认。 日记
两家只隔着一面墙，却生活在两个世界里，每天都能看到的熟悉的面孔，却又抑制不住的伤悲。
她，易遥。她的一生都在痛楚中度过，命运就像一条黑色的长鞭，一下下的在她的痛楚中打下去，她的痛楚似乎已不可抹灭，成了悲伤。18岁的她，在自杀中结束了生命，这个已承载了她无数无奈、痛楚的世界，因为尊严、信念，忽然让她觉得这个世界的“肮脏”和无法信任。
他，齐铭。一位品学兼优的好学生，一个老师偏爱，父母疼爱的温室花朵。却是时时刻刻看到易遥那无法抹去的悲伤。自己的女友顾森湘为自己而死，一无所有的易遥被自己所不信任，当成了凶手，最后自杀死去。一时间，顾森湘、易遥的悲伤化作河流逆流进了他的心底。
这并不是讴歌什么爱情故事，是现实生活中无法避免的一种宿命。
书中的主人公，或许认为死是从悲伤中解脱出来的好办法。
总有一缕悲伤属于你，你拥有家财万贯也好，你是平民也好，都有一种悲伤在自己的心底。
有一种不可抹灭的痛楚叫悲伤。虽然如此，我们或许不该像书中的主人公那样向命运低头、向残酷的现实低头、向悲伤低头！
有一种不可磨灭的痛楚叫悲伤，但有一种可以弥补悲伤的方法叫坚强！
悲伤逆流读后感9
生命被书写成潦草和工整两个版本，再被时间冲刷得褪去颜色。难以辨认。
易遥和齐铭两家只隔着一面墙，却生活在两个不同的世界里，每天都能看到的熟悉的面孔，却又抑制不住的伤悲。
她，易遥。她的一生都在痛楚中度过，命运就像一条黑色的长鞭，一下下的在她的痛楚中打下去，她的痛楚似乎已不可抹灭，成了悲伤。18岁的她，在自杀中结束了生命，这个已承载了她无数无奈、痛楚的世界，因为尊严、信念，忽然让她觉得这个世界的“肮脏”和无法信任。
他，齐铭。是一位品学兼优的好学生，一个老师偏爱，父母疼爱的温室花朵。却是时时刻刻看到易遥那无法抹去的悲伤。自己的女友顾森湘为自己而死，一无所有的易遥被自己所不信任，当成了凶手，最后自杀死去。一时间，顾森湘、易遥的悲伤化作河流逆流进了他的心底。
这并不是讴歌什么爱情故事，是现实生活中无法避免的一种宿命。
书中的主角，或许认为死是从悲伤中解脱出来的好办法。
总有一缕悲伤属于你，你拥有家财万贯也好，你是平民百姓也罢，都有一种悲伤在自己的`心底。
有一种不可抹灭的痛楚叫悲伤。虽然如此，我们或许不该像书中的主人公那样向命运低头、向残酷的现实低头、向悲伤低头！
有一种不可磨灭的痛楚叫悲伤，但有一种可以弥补悲伤的方法叫坚强！
悲伤逆流读后感10
悲伤逆流成河，等的悲伤。可怜、无助、无奈、恐惊……
毋庸置疑，这是一个悲剧。发生在美好青春中的一个苍白得没半点彩色的悲剧。
悲剧的上演，并没有停止。不同的环境，不同的人物，同演一个剧情——悲剧。
悲剧是世人所不愿看到的，但它又是确确实实地潜藏在我们生活中，很多事情不是与常人的意识而转移。真实得比喜剧更能让人产生悲悯之心。然而，悲剧并不是一定要用其悲伤欲绝的故事来打动你的心，获得你们的泪水，这不是根本的目的。
如果，为这个悲剧流几滴泪的话，那只会增加这个悲剧的悲伤，它的发生是必然的吗？它怎么会发生呢？怎么会酿生一个永恒的悲剧呢？该去深思的是处在这场暴风雨边缘或是即将被卷进去的人，还有那些掌控这个方向盘的人，延伸一下思想，悲剧不是注定了听。
《悲》中人与人之间的距离有多远？双有多近？
几个年轻的，意气风发的中学生共处一台，演绛着青春，并不完美的青春，他们没有自由的选择，更没有选择自由的余地，说他们有思想，不如说思想是别人强加给他们的。
当悲伤逆流成河时，眼泪是滚滚而来的河水，它将无情摧毁一切人与人之间微妙的关系，淹没悲伤，流至大海。
当眼泪变成奔流到海，一去不返的河水时，那悲伤就是那条眼泪流过的沟壑；比海深一寸的沟壑。
悲伤逆流读后感11
齐铭陪着易遥一起慢慢长大，看着她一路跌撞、一路受伤看易遥的目光被悲伤拉长。看的我的眼睛湿漉漉的，心随着故事的走向一会明媚一会忧伤。
这本书看的实在是太虐心了，为什么那些恶意、黑暗怎么也不肯放过路遥呢？齐铭就这样无能为力、充满忧伤的看着易遥被伤害、被中伤，在易遥喊：“救我”的时候义无反顾的去帮忙。
易遥实在是太悲惨了，真心错付之后去流产，刚流完产没几天就被唐小米领来的一个小太妹用脚狠狠的踹肚子，齐铭赶到女厕所的时候，满厕所都是吓人的血。
因为齐铭，易遥的生命被拉长了一点。易遥和顾森西。齐铭和顾森湘。一切看上去显得那么美好时，忽的一下又被疾驰的风暴吸走了所有的阳光。顾森湘的死让顾森西用最恶毒的语言咒骂被人陷害的易遥。
易遥刚被温暖点缀了一下的心顷刻又变的冰凉。最后想跟齐铭谈一谈，齐铭不信任、冰冷的语言最终让易遥走上了绝路。
齐铭也选择了自杀。误会需要生命来陪葬，这就是青春啊！一定要粉身碎骨，才显得荡气回肠，才会让活着的顾森西无比难忘。
这本书读起来太难过了，感觉很压抑，眼泪哗哗的往下淌。
悲伤逆流读后感12
今天看完了小四的最新长篇悲伤逆流成河，确实是很悲伤啊，看得哭了，在易遥死的时候
非常非常的心疼易遥，那个女孩子，从不被爱，或者说，从来没有人让她感受到爱。她心里一定是十分悲伤的吧。即使是齐铭，也总不能了解她内心的悲伤，他没有想过他跟易遥说“其实你也是很恶毒的”的时候，易遥心里是怎样的悲伤委屈。他没有想过，当他和顾森湘走在一起的时候同样跟在后面的易遥是怎样的刀削般的疼。他不知道易遥死前给他打电话时是怎样的绝望。对啊，所有的人都遗弃她了，连同齐铭。易遥躲在黑暗里哭泣，而齐铭却转身走向阳光下灿烂微笑的顾森湘。易遥，她就像无根的浮萍，被风一吹，就散了。长在最黑暗的不被人注意的角落里，没有人记得。
同样想问，为什么顾森湘在齐铭手机里的名字叫“湘湘”，而易遥就只是“易遥”而已呢，为什么是“易遥”，而不是“遥遥”？为什么在地震馆里被齐铭小心的保护在怀里的是顾森湘而不是易遥呢？为什么所有人都希望易遥代替顾森湘去死呢？为什么易遥的命就比顾森湘的贱？仅仅是因为易遥打过一次胎，所以易遥就应该忍受所有人的唾弃？为什么？
可是易遥，却傻瓜一样选择了自杀，在齐铭面前。她死的时候，嘴巴张开。易遥，你要跟齐铭说什么？
易遥，请你在另一个世界里，自由的，微笑吧。
悲伤逆流读后感13
今天，我读完了《悲伤逆流成河》这本书，在读的过程中，我为易遥流过同情的眼泪，也为她流过不值的眼泪。
在这个故事的最后，易遥她选择了死亡。我觉得：易遥的选择是可以理解的，因为当一个人的生活真的只剩下悲伤，希望早已不见，活着只是做无谓的挣扎时，选择死亡也许是一种解脱。而对于故事里的易遥来说，正是如此。易遥的父亲在他年幼时就狠心离弃她和她的母亲；曾经那个视她若珍宝的母亲也变得愤世嫉俗了，成了街坊口中的卑微之人，对她更是不时地白眼和打骂。她被同学排挤，书包被扔进脏水池里，为了捡书包差点淹死；她听父亲说：你以后别再来找我了。她听母亲说：你死了最好，死了都和我没关系。她听唯一关心自己的朋友说：你去死，你去死，你去死那么多那么多残酷的言语和行为，那么多的苦难，世界对那时的易遥来说，就是一个阴暗的地狱，没有人能够在那里生存，所以，她最终走向死亡是注定的。
看着易遥那种种的苦难，无奈和残酷的生活，我除了悲天悯人之外，更多的是知足。和易遥的生活比起来，我们的生活就是天堂，天天快乐的生活着。不像易遥一样，自己的出生都是多余的。
悲伤逆流读后感14
今天，我从头到尾彻底的看了一遍郭敬明的《悲伤逆流成河》。但是从开始到结尾我没有流过一滴眼泪，不是说写的不好，也不是说不感人，更多的是无奈。甚至可以说是社会某一处的现实的写照。故事内虽没有武林的豪言壮语，可他（她）的每一句话都如揪心一样疼痛让人心酸。情节内虽没有战场上的硝烟滚滚，却在娇艳可嫩的花瓣背后存有可恶、恶毒的心计和手段。如锋利的针刺般扎入我的每一个毛细血管，让你备受坚煎熬。
最纯洁又带有叛逆心里的青春，在每个冰雾笼罩的冬天，他（她）们都可以看清一切！对于外面一个个似笑非笑的脸，装腔作势的表情，还有那极其做作的行为，让人看了都想找个洞穴钻进去。
可是，在这个你我无法改变的城市里，结局也会让人心寒，悲伤！也许，这对他（她）们来说也算是一种解脱吧！
说实话，我没想到看完这本书的时候，我的心却是那样的平静。好像已经可以理解人生的无奈和可悲！只是希望当时过境迁，车轮还在转动时，纯洁美丽地青春依然被东日的朝阳所记载！
当悲伤逆流成河，当物事人非……你还曾记得这个故事。那里曾让你牵肠挂肚的人物，还会勾起你的回忆吗？回忆总是美好的，所以它只会让这段美好的回忆给你带来快乐和幸福！
悲伤逆流读后感15
提到校园，大家脑海里浮现的大概都是阳光灿烂的校园生活。没错，校园是神圣不可侵犯的。然而这样美好的圣地，也有不为人知的一面——那就是可怕的校园暴力。
读了《悲伤逆流成河》这本小说，我既同情主角易遥的遭遇，又深深的感受到了校园暴力的可怖。冬天被泼冷水、嘴里被塞粉笔灰、被周围的同学冤枉成杀人凶手……无情、可怖的校园暴力直接造成了一个花季女孩的香消玉殒。
在我们的生活中，很少有这样的例子。但是我们却要提防校园暴力，因为校园暴力的可怕不是我们能够比拟的，这一切都是人心在作怪。有的人看到别人遭受校园暴力，仿佛是在看戏剧一般；有的人则是冷眼旁观，一副事不关己高高挂起的模样；更有甚者，把它当作乐趣一般，加入其中。受害者是可怜的，校园暴力则是可憎的。我们应该防微杜渐，阻止每一起校园暴力引发的事件。
用更多的目光去关注校园暴力，加强管理，从根本上把校园暴力从我们的生活中剔除，才能还我们一个美丽洁净的校园。希望不会有更多的“易遥”出现在我们身边。
第三篇：分子生物学
分子生物技术在微生物鉴定中的应用
摘要：微生物多样性是生物多样性的重要组成部分。由于微生物和 动、植物 相比, 存在着多种显著差异。而传统的基于微生物培养与纯种分离的技术具有很大的局限性，分子生物学及其有关技术的长足进展及其在为生物中的使用, 使微生物的研究进入了分子的阶段。
关键词：16SrDNA PCR 温度梯度电泳 变性梯度凝胶电泳 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物: 细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒, 是生物多样性的重要组成部分。此外, 微生物多样性与其他生物类群相比有许多独特之处, 包括: 1)生存环境多样;2)生长、繁殖速度多样;3)营养、代谢类型多样;4)生活方式多样。因而, 微生物多样性的研究无论对于生态系统功能的完整理解, 还是对于微生物资源的利用和开发都具有特殊重要的意义[1]。微生物作为生态系统中极重要的一员, 对动植物的生长，生态系统中的能流和物质循环及环境污染物的降解和解毒等方面起着重要作用并且与人的生活健康息息相关。随着微生物的不断发现及研究，传统微生物技术越来越不能满足其发展的需要，最主要的不足是丢失了微生物的多样性, 许多报道都指出, 在自然环境中有相当多的菌种(约90%-99%)用传统方法无法培养出来[2].这对于微生物基因组学研究来说是很不利的.，导致研究的片面性并且效率低下。而分子生物学技术则避开了传统微生物培养分离的环节, 而是采取直接从样品中抽取所含微生物总DNA, 然后通过16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE
和RFLP 等多种分子生物学研究手段, 对直接提取的总DNA进行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的种类和含量, 以研究样品中微生物的实际组成, 同时可以利用直接提取得到的总DNA 建立基因文库, 并从中筛选有用的基因。由于是直接从样品中提取总DNA, 中间没有任何筛选性的过程, 因此, 所得DNA 能够准确地反映样品中微生物的实际情况, 避免了传统培养方法不能真实反映微生态实际情况的缺点, 也不会丢失样品中存在的任何微生物,同时, 这种方法能够很容易、大批量地取得同一环境下乃至不同环境下的不同微生物的同源基因, 为微生物比较基因组学研究开辟了道路.此外, 用直接提取的总DNA 构建的基因文库, 包含了大量以前因为无法培养而不能获得的微生物基因, 从这些文库中发现全新的具有巨大应用价值的抗生素类、酶类及其他生物活性物质的基因应该是非常有潜力的。1．16SrRNA比较测序
16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因，长度约1500bp，存在于所有的原核生物的基因组中，由多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异[3]。2.PCR近年来,对环境样品总DNA 进行PCR 扩增, 推动了利用分子标记技术研究微生物的多样性。PCR技术是美国letus公司人类遗传研究室的科学家与1983年发明的一种在体外快速扩增特异基因或DNA 序列的方法, 其目的是将极微量DNA大量扩增。该技术模仿生物体内DNA 的复制过程,首先使DNA 变性, 两条链解开;然后使引物模板退火, 二者碱基配对;耐高温的Taq DNA 聚合酶以4种dNTP为底物, 在引物的引导下合成与模板链互补的DNA 新链[4]。PCR 技术可在体外快速扩增DNA, 具有快速、简便、灵敏度高的特点。当然常规 PCR技术也存在很多的问题，如出现假阳性、形成引物二聚体、传统的PCR技术一次扩增只能检测一种微生物、RNA病毒的PCR检测操作繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果等.为了弥补上面这些不足，一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践，如热启动PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA 多态性扩增（RAPD）、限制性长度多态性分析（RFLP）、实时荧光PCR（real-time PCR）等[5]。3.电泳分离及其显示方法
除过我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE 分离)银染方法外, 还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记, 如变性梯度凝胶电泳(DGGE), 可分离长度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。对于特异性引物PCR 扩增的环境微生物的16SrRNA 基因, 一般的电泳很难将序列不同的片段分开。DGGE胶在聚丙烯酰氨胶中添加了线性梯度的变性剂, 可以形成从低到高的线性梯度, 在一定温度下, 同一浓度的变性剂中, 不同序列的产物，其部分解链程度不同。DNA 解链程度不同决定其电泳的迁移率, 结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下, 该技术能分辨一个碱基对。DGGE 技术在微生物群落结构 的研究、微生物种群的动态分析、富集培养以及分离物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到广泛应用[6]。
温度梯度电泳(TGGE)是利用不同构象的分子具有不同的变 性温度来进行分离, 最先应用于DNA /RNA 的分子构象分析和序列变异分析, 是一种新出现的检测点突变的电泳技术, 其最大特点上具有高分辨能力。单链构象多态性(SSCP)也是根据不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大, 结果不同序列的DNA 片段在凝胶上得以高分辨率的分离。基因芯片可分为cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因组芯片。在一定条件下, 载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记, 在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号[7]。
分子生物学技术在环境微生物研究中的应用中rRNA 技术提供了一种摆脱传统的纯种培养方法而鉴定环境微生的途径,并已被广泛应用于微生物的各个领域。虽然当前,标准rRNA 技术的灵敏度还难以检测到低丰度的(低于1/ 1 000)在群落中仅占很小比例的微生物种类, 从而使之在微生物生态以及环境学上的应用受到很大的限制。然而, rRNA 技术与其它的分子技术以及特别是与传统的纯种培养方法相结合, 具备分析微生物多样性的巨大潜力。随着这些新的分子方法的不断改进以及rRNA 数据库中序列信息的不断增加, 我们能探知更多的未知的微生物世界。
参考文献：
[1]杨永华，姚健.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用[J].生物多样性，2000 8(3):337-342.[2]李 红,周友兵,陈炳耀,胡锦矗.分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用[J].河北大学学报(自然版),2003 12(23).[3]朱诗应，戚中田.１６ＳｒＤＮＡ扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用[J].微生物与感染,2013 8(2):104-109.[4，7] 高小朋, 张欠欠, 任桂梅.分子生物学技术在环境微生物研究中的应用[J].延安大学学报(自然科学版),2008 9(27)：27-45.[5] 路则宝，白现广。分子生物学技术在微生物检验中的应用研究进展[J].红河学院学报，2013 4（1）38-46.[6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技术在微生物鉴定中的应用[J].湖北生态工程职业技术学院学报，2006 1（4）：35-45.
第四篇：分子生物学课件整理
注：根据课件内容简单整理，为了方便大家理解，内容较多;如果仅仅为了考试，可以根据自己的需要进行内容的删减。Lecture 1.Introduction
1.What is Molecular Biology? Molecular biology seeks to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relationships contribute to the operation and control of biochemical processes.Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA
（一）基因的概念的产生和发展
2、Morgan 基因的物质载体是染色体
3、G.Beadle & R.Tatum
基因是决定蛋白质一级结构的遗传物质单位
5、O.Avery
基因的化学本质是DNA
6、Jacob & Monod
基因是在特定的遗传调控系统的调节下和控制下表达其功能的遗传物质单位
7、现代的基因概念
基因是核酸分子中储存遗传信息的遗传单位，是指储存有功能的蛋白replication, recombination and translocation.分子生物学的研究内容
Major content of molecular biology ◆ Structure and Function of nucleic acid ★conformation and function of DNA ★conformation and function of RNA ◎mRNA ◎tRNA◎rRNA ◎ ribozyme ◎antisence RNA ◎ microRNA ◎ RNA interfrence 人们开发出：RNAi、RNAa、ncRNA、SiRNA、microRNA、Antisene RNA、SatellileRNA、TelomereRNA、lincRNA、InCRNA、PiRNA、qiRNA、endoSiRNA等等，其他还有RNA结合蛋白(RNPs)、RNA酶等成百上千种RNA相关的新成员，组成了一个庞大的RNA新世界
这些RNA不仅在基因-蛋白质的合成中发挥重要作用，它更调节和管理着—基因的转录、表达、表型等几乎所有的功能。
在细胞增殖、分化、生长、凋亡、生殖、发育、遗传、损伤、修复、炎症、感染、防治等一切生命活动中发挥着重要作用；
RNA还是生命起源的“先驱’’，近年来研究证明，RNA比DNA更古老，它是地球上最早出现的生命形式；它可以携带遗传信息，能自我复制，自我进化，自我编译，又具有催化分子功能------,以后才有了DNA和蛋白质，才有了今天的生物世界。
RNA更是人类生命健康的维护者，它不仅调节和管理着人类的一切生命活动，而且它还是防治许多重大的疾病和开发新药物的靶分子和预警分子，并可直接和间接的发挥防治疾病的作用。
◆Functional Genomics ◎As the Human Genome Project has mostly determined the genetic sequence, the next step is functional genomics, which will reveal each gene's functions and controls ◎ Human Genome Diversity Project ◎ Environmental Genome Project ◎Pharmacogenomics ◎Comparative Genomics
Artificial life 人工生命是通过人工模拟生命系统,来研究生命的领域。人工生命的概念，包括两个方面内容
1.属于计算机科学领域的虚拟生命系统，涉及计算机软件工程与人工智能技术，以及
2.基因工程技术人工改造生物的工程生物系统，涉及合成生物学技术。
分子生物学与医学
◆人体发育调控和人体功能调控的分子生物学基础 ◎发育、分化与衰老的分子生物学基础 ◎细胞增殖调控的分子生物学基础
◎神经、内分泌和免疫调控的分子生物学基础
◆ 基因与疾病 ◎疾病的分子机理
致病基因的克隆
复杂疾病的分子基础 ◎基因诊断 ◎基因治疗
Lecture 2 structure and function of gene 第一节 基因的概念及其发展 一 基因（gene）
质多肽链或RNA序列信息所必需的全部核苷酸序列
二、基因组（genomic）The genome is the entirety of an organism's hereditary information.It is encoded either in DNA or, for many types of virus, in RNA.The genome includes both the genes and the non-coding sequences of the DNA
细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。
人类基因组包含24条染色体以及线粒体上的全部的遗传物质。
第二节 真核生物基因组
一、基因分类
1、结构基因（strutual gene）可被转录形成mRNA并进而翻译位多肽链，构成各种结构蛋白的基因
2、调节基因（regulatory gene）可调节、控制结构基因表达的基因。其突变可能会影响一个或多个结构基因的功能，导致一个（或多个）蛋白质的改变。
3、rRNA基因和tRNA基因
二、基因的结构
enhancer pr omoter e xon 5UTR, 3UTR intron
（一）编码区、外显子（exon）
2、内含子（intron）★GT—AG规则：
内含子多是以GT开始，并以AG结尾
★一个基因的内含子可以是另一个基因的外显子。★外显子的数量是描述基因结构特征的重要指标。三、调控元件（acting elements）
（二）前导区：
位于编码区的上游，相当于mRNA5端的非编码区
（三）调节区：
包括启动子、增强子等基因编码区的两侧，也称侧翼序列
◎顺式调控元件（cis-acting elements）：与结构基因表达调控相关。能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。◎反式调控元件（trans-acting elements）:一些可以通过结合顺式元件而调节基因转录活性的蛋白因子。
（一）启动子（promoter）
启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。2 启动子的类型
(1)一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子 这类启动子应当总是能被转录。
但实际上也不都如此，外来蛋白质可对其有影响，即该蛋白质可直接阻断启动子，也可间接作用于邻近的DNA结构，使聚合酶不能和启动子结合(2)另一类启动子在和聚合酶结合时需要有蛋白质辅助因子的存在。这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的DNA顺序。3 启动子的共同顺序
⑴ 真核生物基因启动子 位于RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。
-10序列又称为Pribnow盒(原核生物)。是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序
⑵真核生物基因启动子
▲TATA box（Goldberg-Hogness box）：
位于-35bp处，序列为TATA（A/T）A（T/A）是RNA聚合酶Ⅱ的结合部位
▲CAAT盒：在转录起始位点上游70-80bp处
保守的共同顺序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以识别这一顺序。⑶启动子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序 [1]RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主 链中的磷酸基相接触;[2]离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱;[3]最重要的是，破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，沉默子的作用机理
沉默子介导产生的沉默是一种状态的变化,在此过程中,产生类似于异染色质的结构阻止转录因子与DNA的相互作用,使转录被抑制,沉默子作为异染色质形成中的失活中心参与沉默状态的建立和扩散
沉默子含阻遏蛋白结合序列，阻遏蛋白与其结合后阻遏基因的转录。直接阻遏(direct repression)沉默子结合蛋白与转录复合物中的成员结合后将其固定，使基础转录复合物无法形成而丧失活性
竞争(competition)在一些基因中沉默子与增强子等正调控元件相邻或相重叠，阻遏蛋白结合后阻止激活蛋白与邻近正调控元件的结合从而阻遏转录
淬灭
沉默子与增强子相邻，阻遏蛋白与沉默子结合后,虽不影响激活蛋白与DNA的结合能力,却通过蛋白之间的相互作用阻止激活蛋白与转录复合物的正确接触来抑制其活性 可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像，它能“感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状。”
（三）增强子（enhancer)★位于结构基因附近，能够增强该基因转录活性的一段DNA顺序称为增强子(enhancer)。
★增强子是另一类顺式作用的DNA片段，可使基因转录的速率大大提高。
增强子的类型
①组织和细胞专一性增强子
许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能。②诱导性增强子
这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。
例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。
增强子的特点
①增强子可提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常距离l～4kb，个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。
②增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒置就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。③增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现其活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。
④增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。
例如，人类胰岛素基因5’端上游约250个核苷酸处有一组织特异性增强子。在胰岛素p细胞中有一种特异性蛋白因子，可以作用于这个区域，以增强胰岛素基因的转录。在其他组织细胞中没有这种蛋白因子，所以也就没有此作用。
⑤大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列，即(G)TGGA／TA／TA／T(G)，是产生增强效应时所必需的。
⑥许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。
增强子的作用机理
①增强子中有Z-DNA结构，这种结构的双链间距离大于B-DNA，与蛋白质的亲和力更高一些，有利于转录。
②增强子中有DNA水解酶容易切断的部位，可与一些转录因子蛋白形成复合物，促进转录。
③增强子可与核基质结合形成结构体，促进转录。
3．沉默子（Silencer）
Silencers are control regions of DNA that, like enhancers, may be located thousands of base pairs away from the gene they control.However, when transcription factors bind to them, expression of the gene they control is repressed.沉默子的特点
(1)可以在远距离作用于启动子
(2)对基因的阻遏作用没有方向的限制，即无论其位于启动子的上游或下游均可阻遏启动子的表达
某些沉默子中含有骨架结合位点保守序列
沉默子与蛋白结合,通过蛋白之间的相互作用形成DNA环后与启动子作用，破坏起始复合物而抑制转录;
或者产生的DNA环发生了组蛋白的修饰和拓扑结构的变化,这种变化使关键的转录因子不能正确结合从而阻止转录
也可能沉默子和核基质相互作用将转录单元固定于缺乏转录因子的亚显微结构
4.绝缘子(insulator)
绝缘子(insulator)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子(为异染色质)之间的一种调控序列。
绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。绝缘子的功能
①有序地装置庞大的染色体DNA以及确保其中上万种基因每一种都能在时空上正确无误地表达。
绝缘子在这里起着关键的阻断作用,保护启动子的功能不受其它异常增强子或其它激发信号的有害影响
②防止基因免受邻近沉默信号的作用。这类沉默信号系来自细胞核的内环境中遍布的大量致密染色质的“扩张”或“溢出”。
绝缘子的这种功能可以维持染色质区域的分界以及保护基因座位的独立性。
绝缘子的作用原理
①结构域边界模型(Domain boundary model,)
绝缘子能使它所限定的染色质区域发生折叠成环,促使该区域内各种调节元件彼此相互作用,同时也阻止了不同区域调节元件之间互相影响。染色质形成环状结构域能对抗附近致密染色质结构的扩展。这样一来,绝缘子能防止位置效应也能得到合理的解释。②“跟踪”模型(“Tracking” model):
结合在增强子元件上的转录因子沿DNA链向它的目标启动子追逐。此时绝缘子的特异结合蛋白在中途阻挡转录因子,使其不能抵达启动子区域。③转录诱捕模型(Transcription decoy model)
在绝缘子与其特异结合蛋白结合所形成的复合物可成为捕捉增强子的笼子,将增强子复合物吸引到其中而使之失去功能。
四、基因家族（gene family）
（一）基因家族的概念
1、基因家族：核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。由同一祖先基因进化而来。
2、假基因（pseudogene）
在多基因家族中，某些成员并不能表达出有功能的产物，这些基因称为假基因。
假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因。
与相应的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列。
人们推测，假基因的来源之一，可能是基因经过转录后生成的RNA前体通过剪接失去内含子形成mRNA，如果mRNA经反转录产cDNA，再整合到染色体DNA中去，便有可能成为假基因，因此该假基因是没有内含子的，在这个过程中，可能同时会发生缺失，倒位或点突变等变化，从而使假基因不能表达。
（二）、基因家族大致可分为两类
1、一类是基因家族成簇地分布在某一条染色体上，它们可同时发挥作
用，合成某些蛋白质，如组蛋白基因家族就成簇地集中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内；
2、另一类是一个基因家族的不同成员成簇地分布 在不同的染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族
五、重复序列：高度重复序列 中度重复顺序 单拷贝顺序
（一）高度重复序列
高度重复序列在基因组中重复频率高，可达百万(106)以上，因此复性速度很快。
在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60％，在人基因组中约占20％。
高度重复顺序又按其结构特点分为三种。
1、倒位（反向）重复序列（inverted repeats）
反向重复序列由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成。约占人基因组的5％。
2、卫星DNA
卫星DNA(satelliteDNA)是另一类高度重复序列，这类重复顺序的重复单位一般由2-10bp组成，成串排列。由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA或随体DNA。在人细胞组中卫星DNA约占5-6％。§大卫星DNA（macrosatellite DNA）§小卫星DNA（minisatellite DNA）
§微卫星DNA（microsatellite DNA）
3、较复杂的重复单位组成的重复顺序
这种重复顺序为灵长类所独有。用限制性内切酶HindⅢ消化非洲绿猴DNA，可以得到重复单位为172bp的高度重复顺序，这种顺序大部份由交替变化的嘌呤和嘧啶组成。有人把这类称为α卫星DNA。而人的α卫星DNA更为复杂，含有多顺序家族。
4、高度重复顺序的功能
⑴参与复制水平的调节反向序列常存在于DNA复制起点区的附近。另外，许多反向重复序列是一些蛋白质（包括酶）和DNA的结合位点。
⑵参与基因表达调控DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA分子中，而有些反向重复顺序可以形成发夹结构，这对稳定RNA分子，免遭分解有重要作用
⑶参与转位作用几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到1400bp。由于这种顺序可以形成回文结构，因此在转位作用中即能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别。
⑷与进化有关 不同种属的高度重复顺序的核苷酸序列不同，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如人的α卫星DNA长度仅差1个碱基（前者为171bp，后者为172bp），而且碱基序列有65％是相同的，这表明它们来自共同的祖先。在进化中某些特殊区段保守的，而其他区域的碱基序列则累积着变化。
⑸同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹。
（二）中度重复顺序
中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（<105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。少数在基因组中成串排列在一个区域，大多数与单拷贝基因间隔排列。依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为两种类型。（1）短分散片段
（short interspersed repeated segments, SINES）这类重复顺序的平均长度约为300bp（〈500bp），它们与平均长度约为1000bp的单拷贝顺序间隔排列。拷贝数可达10万左右。如Alu家族，Hinf
家族等属于这种类型的中度重复序列（2）长分散片段
（Long interspersed repeated segments, LINES）
这类重复顺序的长度大于1000bp，平均长度为3500-5000bp，它们与平均长度为13000bp（个别长几万bp）的单拷贝顺序间隔排列。
也有的实验显示人基因组中所有LINES之间的平均距离为2.2kb,拷贝数一般在1万左右，如KpnⅠ家族等。
中度重复顺序在基因组中所占比例在不同种属之间差异很大，一般约占10-40％，在人约为12％。这些顺序大多不编码蛋白质。这些非编码的中度重复顺序的功能可能类似于高度重复顺序。
在结构基因之间，基因簇中，以及内含子内都可以见到这些短的和长的中度重复顺序。如HLA基因，rRNA基因，tRNA基因,组蛋白基因,免疫球蛋白基因等。
中度重复顺序一般具有种属特异性；在适当的情况下，可以应用它们作为探针区分不同种哺乳动物细胞的DNA。下面介绍几种典型的中度重复顺序。
Alu家族是哺乳动物包括人基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族，在单倍体人基因组中重复达30万-50万次，约占人基因组的3-6％。Alu家族每个成员的长度约300bp，由于每个单位长度中有一个限制性内切酶Alu的切点（AG↓CT）从而将其切成长130和170bp的两段，因而定名为Alu序列（或Alu家族）。
Alu序列分散在整个人体或其他哺乳动物基因组中，在间隔DNA，内含子中都发现有Alu序列，平均每5kbDNA就有一个Alu顺序。
KpnⅠ家族是中度重复顺序中仅次于Alu家族的第二大家族。用限制性内切酶KpnⅠ消化人类及其它灵长类动物的DNA，在电泳谱上可以看到4个不同长度的片段，分别为1.2,1.5,1.8和1.9kb，这就是所谓的KpnⅠ家族。
KpnⅠ家族成员顺序比Alu家族更长（如人KpnⅠ顺序长6.4kb），而且更加不均一，呈散在分布，属于中度重复顺序的长分散片段型。
尽管不同长度类型的KpnⅠ家族（称为亚类，subfamily）之间同源性比较小，不能互相杂交，但它们的3'端有广泛的同源性。KpnⅠ家族的拷贝数约为3000￣4800个，占人体基因组的1％,与散在分布的Alu家族相似，KpnⅠ家族中至少有一部份也是通过KpnⅠ顺序的RNA转录产物的cDNA拷贝的重新插入到人基因组DNA中而产生的。
Hinf家族：
这一家族以319bp长度的串联重复存在于人体基因组中。用限制性内切酶HinfⅠ消化人体DNA，可以分离到这一片段。Hinf家族在单位基因组内约有50 100个拷贝，分散在不同的区域。319bp单位可以再分成两个亚单位，分别为172bp和147bp,它们之间有70%的同源性。
rRNA基因：在原核生物如大肠杆菌基因组中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重复次数更多。在真核生物基因组中18S和28S,rRNA基因是在同一转录单位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一转录单位中；
而在高等生物中，5SrRNA是单独转录的，而且其在基因组中的重复次数高于18S和28S基因。和一般的中度重复顺序不一样，各重复单位中的rRNA基因都是相同的。
rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因组中，这样的区域称为rDNA，如染色体的核仁组织区（nucleolus organizer region）即为rDNA区。
（三）单拷贝顺序
单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次或数次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序在基因组中占50-80％，如人基因组中，大约有60-65％的顺序属于这一类。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。
六、真核生物基因组的特点
1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组。
2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。
3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。4.基因组中不编码的区域多于编码区域。
5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。
6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小
重叠基因有以下几种情况
（1）一个基因完全在另一个基因里面。如基因Ａ和Ｂ是两个不同基因，而Ｂ包含在基因Ａ内。同样，基因Ｅ在基因Ｄ内。（2）部分重叠。（3）两个基因只有一个碱基重叠。
八、原核生物基因组的结构和功能
（1）基因组通常仅由一条环状双链DNA 分子组成。
（2）具有操纵子结构，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。
（3）在大多数情况下，结构基因在细菌基因组中都是单拷贝，但是编码rRNA的基因rDNA往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。
（4）和病毒的基因组相似，不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。
（5）具有编码同工酶的同基因（isogene）例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸（chorismicacid）变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。
（6）和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象。
（7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区TerC,转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序。
（8）在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。
例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。
终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。
Lecture 3 DNA replication 第一节 DNA的复制
一、DNA复制的基本特点
（一）复制的起始点和方向
★复制起始点：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(origin of replication)常用ori或o表示
★复制子： replicon DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元
★复制叉：在复制开始时，复制起始点出呈现一叉形结构，称为复制叉（replication fork）
1、复制起始点：
DNA复制起始点有结构上的特殊性。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。§大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置
2、DNA复制的方向
(1)定点开始双向复制：这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡。
(2)定点开始单向复制：质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制
(3)两点开始单向复制：腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。
二、复制的基本方式
(一)DNA的半保留复制(semiconservative replication)
（二）半不连续复制 前导链(leading strand)：在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的 随从链(lagging strand)：另一条母链DNA是5′→3′方向，它作为模板时，复制合成许多条5′→3′方向的短链，叫做随从链，随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。
随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做岗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物岗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链。
由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制
三、复制过程
（一）DNA复制的起始阶段
1、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质
⑴解链酶(helicase)：解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。
大肠杆菌中DnaB蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5′→3′方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。
⑵.单链结合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP)
它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。
⑶ 引发体的形成
DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由Dna B.Dna C和单链结合蛋白组成。★引物酶(primase)它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置
★引发体(primosome)高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′OH末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。
（二）DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子
1、DNA的聚合反应和DNA聚合酶
★DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerse Ⅰ）：
DNA polⅠ是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn++，是聚合活性必须的。
(1)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合活性 这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸顺序，将互补的dNTP逐个加到引物RNA3′-OH末端，并促进3′-OH与dNTP的5′-OH形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用。
(2)DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′外切核酸酶活性
这种酶活性的主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。
(3)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切核酸酶活性
这种酶活性是从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必须的。
DNA polⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。
DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ）
分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而没有5′→3′外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ）
这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体 DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，解链酶等构成一个复制体。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNA polⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制
2、与超螺旋松驰有关的酶
拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。
在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。
在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。
DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。
DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。
拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用
将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解，利于DNA复制叉继续向前打开。
对环状单链DNA还有打结或解结作用，对环状双链DNA的环连或解连以及使环状单链DNA形成环状双链DNA都有作用
拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)的主要作用
是在大肠杆菌中发现的，曾被称为旋转酶(gyrase)，它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的部分经切口穿过而旋转，然后封闭切口。还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态，此反应不需要ATP参与。DNA复制完成后，TopoⅡ在ATP参与下，DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋。
催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连，以及打结或解结。
DNA连接酶(DNA ligase)作用：消耗ATP，将随从链中相邻的两个DNA片段连接起来
催化同一模板DNA链上的两个相邻DNA片段的3＇端与5＇端间形成磷酸二酯键，把相邻的两段DNA连成完整的链
（三）DNA复制的终止阶段
DNA在复制过程中，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。
DNA复制的过程 延长:
DNA-pol Ⅲ(DDDP-Ⅲ)的5 → 3的聚合活性使核苷酸之间生成3，5磷酸二酯键
模板 以DNA单链为模板
底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）
引物 以小片段RNA为引物，在 RNA引物的 3-OH末端上开始逐个添加dNTP
按碱基配对原则（A = T G ≡ C）按5 → 3 方向
第二节 真核生物DNA复制的特点 1.复制起始点及方向
与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点，例如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点，因此，虽然真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒钟)慢得多，但复制完全部基因组DNA也只要几分钟的时间。2.在真核生物DNA复制叉处，需要两种不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)
polα和引物酶紧密结合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延长DNA链，这种活性还要复制因子C参与。
同时结合在引物模板上的PCNA，此时释放了polα，然后由polδ结合到生长链3′末端，并与PCNA结合，继续合成前导链。
而随从链的合成靠polα紧密与引物酶结合并在复制因子C帮助下，合成岗崎片段
3、末端复制与端粒酶 端区(telomeres)由于真核生物染色体是线性DNA，它的两端叫做端区(telomeres)，端区是由重复的寡核苷酸序列构成的。
由于随从链是以一种不连续的形式合成岗崎片段，所以不能完成线性染色体末端的复制，如果这个问题不解决，真核生物在细胞分裂时DNA复制将产生5′末端隐缩，使DNA缩短。端粒酶(telomerase)由蛋白质和RNA两部分组成的，它以自身的RNA为模板，在随从链模板DNA的3′OH末端延长DNA，再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链。第三节 DNA损伤与修复
一、DNA的损伤
(一)DNA损伤的原因 1.DNA分子的自发性损伤
2.物理因素引起的DNA损伤
3.化学因素引起的DNA损伤 1.DNA分子的自发性损伤(1)DNA复制中的错误
碱基配对的错误频率约为10-1－10-2 在DNA复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10-5－10-6 DNA聚合酶还会暂停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸，然后再继续正确的复制但校正后的错配率仍约在10-10左右.(2)DNA的自发性化学变化
a.碱基的异构互变
DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化(例如烯醇式与酮式碱基间的互变)，这种变化就会使碱基配对间的氢键改变，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等，如果这些配对发生在DNA复制时，就会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤 b.碱基的脱氨基作用
碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤会变成黄嘌呤(X)等，遇到复制时，U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。c.脱嘌呤与脱嘧啶
自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。一个哺乳类细胞在37℃条件下，20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个 估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞(如神经细胞)在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，约占细胞DNA中总嘌呤数的3%。d.碱基修饰与链断裂
细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。此外，体内还可以发生DNA的甲基化，结构的其他变化等，这些损伤的积累可能导致老化。
2.物理因素引起的DNA损伤
(1)紫外线引起的DNA损伤
DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的。当DNA受到最易被其吸收波长(～260nm)的紫外线照射时，主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环(cyclobutane ring)连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体
(2)电离辐射引起的DNA损伤
电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤，间接效应是指DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。电离辐射可导致DNA分子的多种变化： a.碱基变化
主要是由OH－自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。b.脱氧核糖变化
脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH－反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。c.DNA链断裂
单链断裂:DNA双链中一条链断裂称单链断裂(single strand broken)双链断裂:DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂(doublestrand broken)。
虽然单链断裂发生频率为双链断裂的10-20倍，但还比较容易修复；对单倍体细胞来说(如细菌)一次双链断裂就是致死事件。
d.交联 同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间可以共价键结合 DNA与蛋白质之间也会以共价键相连，组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。这些交联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础，会影响细胞的功能和DNA复制。
3.化学因素引起的DNA损伤(1)烷化剂对DNA的损伤
烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤： a.碱基烷基化
烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化，例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对，而改与胸腺嘧啶配对，结果会使G－C转变成A－T。b.碱基脱落
烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变。c.断链
DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。d.交联
烷化剂有两类
单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化；
双功能基烷化剂，化学武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等，某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两处烷基化，结果就能造成DNA链内、DNA链间，以及DNA与蛋白质间的交联。
(2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等。由于其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成，例如5－BU结构与胸腺嘧啶十分相近，在酮式结构时与A配对，却又更容易成为烯醇式结构与G配对，在DNA复制时导致A－T转换为G－C。(二)DNA损伤的后果
1.点突变(point mutation)
指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition)；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。2.缺失(deletion)
指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。3.插入(insertion)
指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动(reading frame shift)，使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变 4.倒位或转位(transposition)
指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 5.双链断裂
已如前述，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。突变或诱变对生物可能产生4种后果 ①致死性；
②丧失某些功能；
③改变基因型而不改变表现型
④发生了有利于物种生存的结果，使生物进化。
二、DNA修复(一)回复修复
1.光修复
这是最早发现的DNA修复方式。
修复是由细菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300－600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。2.单链断裂的重接
DNA单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶(ligase)参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂几乎不能修复。3.碱基的直接插入
DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)识别结合，在K＋存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，㈡ 转录模板
对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链(模板链）而与之互补的另一条DNA链称为反意义链（编码链）。使DNA完全恢复。4.烷基的转移
在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。
(二)切除修复(excision repair)①首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5′侧切开磷酸二酯键。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。②由5′→3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。
③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5′→3′方向DNA链，填补已切除的空隙
④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。
（三)重组修复(recombinational repair)受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口 以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。
重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。
(四)SOS修复
SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为易误修复(error prone repair)，使细胞有较高的突变率。
Lecture 3 The expression of genetic information 转录（transcription): 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。
经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。
第一节 转录
一、转录与复制的比较
（一）转录与复制的相同点
1、均以DNA为模板
2、合成方向是5--3 `
3、服从碱基配对原则
4、均需要依赖DNA的聚合酶
二、转录作用及其特点 ㈠不对称转录
㈡真核细胞中的转录产物都是各种RNA的前体，既无活性，亦物功能，必须在细胞核内加工，形成由活性的RNA后，由核运至细胞质中才能执行翻译功能
三、原核生物RNA的生物合成
㈠ RNA聚合酶（RNA polymerase）
这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶。
该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5'→3'聚合RNA。
原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即α2ββ‘σ。σ亚基与转录起始点的识别有关，而在转录合成开始后被释放，余下的部分（α2ββ'）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。
㈢转录过程 1.起始阶段
⑴σ因子的识别作用
① RNA链的起始通常是在RNA聚合酶所结合DNA区域的一端，在解开的双链部分，离-10开始
②处第一个核苷酸通常是pppA或pppG,较少为pppC，但偶而亦可为pppU。大约12或13个碱基处 ③σ因子的解离
RNA链的延伸阶段开始后，σ因子即从核心酶-DNA-新生RNA复合体上解离下来，并可再用于和新的核心酶结合 延长阶段
⑴ RNA聚合酶在延伸新生RNA链时继续使DNA螺旋解链，以便暴露出模板链，RNA链的生长点是大约12bp长的RNA-DNA杂交区 在RNA链离开模板时，此杂交区即复原，同时两条DNA链即又重复螺旋化。终止阶段
细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子(terminator)终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。
在终止子处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。在某些位点处，终止需要一种辅助蛋白质，即ρ因子，但在其他位点处，核心酶本身即可终止转录。
不依赖ρ因子的终止子有两个特征:
DNA顺序有双重对称(dyad)，位于RNA3‘端之前15-20核苷酸处；
DNA模板链中有一串约6个A，转录为RNA3'端的U。双重对称的意义在于其转录本能形成发夹结构。
依赖ρ的终止子没有不依赖ρ的终止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成稳定的发夹。
ρ因子的作用机制，但有几种可能性
ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，说明它能与新生RNA链结合，并可能应用ATP放出的能量将RNA链从酶和模板中释出。ρ因子可能与RNA聚合酶结合。
编码ρ因子的基因rho发生突变时产生的某些ρ蛋白质仅能在RNA聚合酶的β亚基也发生相应突变时才能有RNA合成的活性。
已知RNA聚合酶本身能识别DNA模板中依赖ρ的终止顺序，而ρ因子是在以后才发挥作用而释出RNA的。即使是在没有ρ时，RNA聚合酶也在依赖ρ的终止子处暂停，不过以后仍继续向前进。
四、真核生物的转录作用 ㈠ 真核细胞中的RNA聚合酶
真核生物中的RNA聚合酶可按其对α-鹅膏蕈碱敏感性而分为三种，它们均由10～12个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同
㈡ RNA聚合酶Ⅰ
合成RNA的活性最显著。它位于核仁中，负责转录编码rRNA的基因(称rRNA)，而细胞内绝大部分RNA是rRNA。
聚合酶Ⅰ不被双环八肽──α-鹅膏蕈碱抑制。RNA聚合酶Ⅱ
它位于核浆中，负责核内不匀一RNA(hnRNA)的合成。而hnRNA是mRNA的前体。它是最直接和遗传调节相关的酶。
RNA聚合酶Ⅱ的活性均可被低浓度的α-鹅膏蕈碱所迅速抑制 ㈢RNA聚合酶Ⅲ
负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。对α-鹅膏蕈碱的反应则不尽相同
在动物细胞中聚合酶Ⅲ可被高浓度α-鹅膏蕈碱所抑制 在酵母和昆虫细胞中则不会被抑制。㈣常用的转录抑制剂
★转录单位
真核生物的一个转录单位就是一个基因，由一个结构基因和相应的顺式调控元件组成。
一个转录单位只有一个结构基因。㈤转录因子
真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一般可将这些转录所需的蛋白质分为三大类(1)RNA聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。(2)某些转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分。
这些因子可能是所有启动子起始转录所必须的。亦可能仅是转录终止所必须的。
在这一类因子中，要严格区分开哪些是RNA聚合酶的亚基，哪些仅是辅助因子，是很困难的。
(3)某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合。
如果这些顺序存在于启动子中，则这些顺序因子是一般转录机构的一部分。如果这些顺序仅存在于某些种类的启动子中，则识别这些顺序的因子也只是在这些特异启动子上起始转录必须的。
起始阶段
RNA聚合酶Ⅱ的转录起始
RNA聚合酶Ⅱ的转录产物是hnRNA 真核生物的转录起始较为复杂。目前已知RNA聚合酶Ⅱ至少有六种不同的蛋白因子参与转录复合体的形成。这些蛋白因子被称为转录因子（transcriptional factor, TF)。包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡ-I。终止阶段
RNA转录合成的终止机制有两种：
1．自动终止：模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的富含GC和AT的区域，使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形的二级结构，引起RNA聚合酶变构及移动停止，导致RNA转录的终止。2．依赖辅助因子的终止：由终止因子(ρ因子)识别特异的终止信号，并促使RNA的释放。
真核生物RNA转录后的加工修饰
一、mRNA的转录后加工 1．加帽(adding cap)：
即在mRNA的5'-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即HnRNA即可进行加帽。加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。
2．加尾(adding tail)：
这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA结构与mRNA的半寿期有关。3．剪接（splicing)：
真核生物中的结构基因基本上都是断裂基因。结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子，而不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子。
第二节 翻译
翻译（translation）
蛋白质的生物合成过程，就是将DNA传递给mRNA的遗传信息，再具体的解译为蛋白质中氨基酸排列顺序的过程，这一过程被称为翻译 蛋白质合成体系
① mRNA：作为蛋白质生物合成的模板，决定多肽链中氨基酸的排列顺序； ② tRNA：搬运氨基酸的工具；
③ 核蛋白体：蛋白体生物合成的场所； ④ 酶及其他蛋白质因子； ⑤ 供能物质及无机离子。
一、mRNA
作为指导蛋白质生物合成的模板。mRNA中每三个相邻的核苷酸组成三联体，代表一个氨基酸的信息，此三联体就称为密码(coden)。共有64种不同的密码。
遗传密码具有以下特点：
① 连续性； ② 简并性； ③ 通用性；（但在线粒体或叶绿体中特殊）④ 方向性，即解读方向为5′→ 3′； ⑤ 摆动性；
⑥ 起始密码：AUG；终止密码：UAA、UAG、UGA。
二、tRNA
在氨基酸tRNA合成酶催化下，特定的tRNA可与相应的 氨基酸结合，生成氨基酸tRNA，从而携带氨基酸参与蛋白质的生物合成。tRNA反密码环中部的三个核苷酸构成三联体，可以识别mRNA上相应的密码，此三联体就称为反密码(anticoden)。
反密码对密码的识别，通常也是根据碱基互补原则，即A—U，G—C配对。但反密码的第一个核苷酸与第三核苷酸之间的配对，并不严格遵循碱基互补原则。如反密码第一个核苷酸为Ⅰ，则可与A、U或C配对，如为U，则可与A或G配对，这种配对称为不稳定配对。
三、rRNA和核蛋白体
原核生物中的核蛋白体大小为70S，可分为30S小亚基和50S大亚基。小亚基：由16SrRNA和21种蛋白质构成。大亚基：由5SrRNA，23SRNA和35种蛋白质构成。
真核生物中的核蛋白体大小为80S，也分为40S小亚基和60S大亚基。小亚基：由18SrRNA和30多种蛋白质构成。大亚基：则由5S rRNA，28S rRNA和50多种蛋白质构成
蛋白质生物合成过程包括三大步骤： ①氨基酸的活化与搬运；
②活化氨基酸在核蛋白体上的缩合； ③多肽链合成后的加工修饰。
一、氨基酸的活化与搬运
氨基酸的活化以及活化氨基酸与tRNA的结合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。其反应过程为：
（一）起动阶段
1．40S起动复合物的形成：
在起动因子的促进下，40S小亚基与mRNA的起动部位，起动tRNA
（fmet-tRNAfmet），和GTP结合，形成复合体。
原核mRNA的起动部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸顺序组成，称为SD序列（核蛋白体结合位点，RBS），可被核蛋白体小亚基辨认结合。真核生物中的mRNA具有帽子结构，已知需一种特殊的帽子结合蛋白（CBP）以识别此结构。
2．80S起动前复合体的形成：IF3从40S起动复合体上脱落，60S大亚基与复合体结合，形成80S起动前复合
（二）肽链延长阶段
1．进位：与mRNA下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入核蛋白体的受位。此步骤需GTP，Mg2+，和EF参与。2．成肽：
在转肽酶的催化下，将给位上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基酰tRNA上，与其α-氨基缩合形成肽键。此步骤需Mg2+，1973年S.Cohen 也成功的进行了另一个体外重组实验，他将编码有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒DNA与编码有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101 DNA混合后加入内切酶EcoRI对DNA进行切割，再用T4连接酶将它们连接成重组分子，用这种连接后的重组DNA转化大肠杆菌，结果发现，某些转化菌落表现出了既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征。
以上两个实验带给人们的启示：
DNA是可以在体外进行切割和拼接的
利用细菌细胞可以快速的复制DNA并能够合成蛋白质。这两个实验也标致着基因工程技术的诞生 K+。给位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA 3．移位：
核蛋白体向mRNA的3'-端滑动相当于一个密码的距离，同时使肽酰基tRNA从受体移到给位。此步骤需EF（EFG）、GTP和Mg2+参与。此时，核蛋白体的受位留空，与下一个密码相对应的氨基酰tRNA即可再进入，重复以上循环过程，使多肽链不断延长。
（三）肽链终止阶段
核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入受位。1．识别：RF识别终止密码，进入核蛋白体的受位。
2．水解：RF使转肽酶变为水解酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放。
3．解离：通过水解GTP，使核蛋白体与mRNA分离，tRNA、RF脱落，核蛋白体解离为大、小亚基。
分子生物学研究的对象 蛋白质和核酸
对核酸、蛋白质的研究积累为分子生物学技术的成熟打下了重要性的基础。
70年代初是分子生物学成熟标致的重要时期，因为诞生了分子生物学应用的一个重要学科——基因工程。
80年代诞生的PCR技术将复杂的分子生物学技术简单化了，便得更加容易推广和应用。使得分子生物学技术一下普及到了一般的实验室。PCR技术，又称为聚合酶链式反应，它利用一对特异性的引物和耐高温的DNA聚合酶，在短短的2-3小时内将一段DNA扩增到1000万倍，对实验室的条件的要求也降到最低点。
1990年开始的“人类基因组计划”将分子生物学带入到一个高通量的发展时代。生命科学进入到了基因组和后基因组时代。
基因工程genetic engineering
1.基因工程诞生的理论基础
基因工程的诞生依赖于在此之前生命科学基础理论的发展成就，概括起来主要包括三个方面：
⑴ 40年代确定了遗传物质是DNA，它是遗传信息的载体。
⑵ 50年代发现DNA分子的双螺旋结构并揭示了半保留复制的机理，揭示了基因的自我复制和表达的机理。
⑶ 50年代末至60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。2．工具酶的发现为基因工程的诞生奠定了技术的基础： 3．基因工程的诞生
1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的体外重组实验，用E.coRI在体外对SV40的DNA和λ噬菌体的DNA进行了消化，然后用T4连接酶将消化后的DNA片段进行了连接，结果获得了重组的杂种DNA分子。
基因工程所使用的名称：
重组DNA技术(recombinant DNA technique)遗传工程(genetic engineering)基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)基因克隆(gene cloning)
分子克隆(molecular cloning)基因工程的基本内容：
1．将两种不同来源的DNA－－即目的DNA和载体DNA提取纯化。2．用限制性内切酶处理DNA。
3．用连接酶将切开的不同源的DNA连接到一起，构成重组DNA。4．将重组DNA转化到大肠杆菌中。
5．通过大量的培养细菌，以达到扩增目的基因或表达蛋白的目的。
基因工程的目的： 进行分子克隆
表达重组基因所编码的蛋白质
工具酶
一、限制酶(restriction enzyme)
全称限制性核酸内切酶、简称限制酶或内切酶。
1． 限制酶的分类
限制酶有三种：I型、II型、III型。2.限制酶的命名
一般的限制酶通常由四个拉丁文字母组成第1个字母代表产生该酶的细菌的属名，第2、3个字母代表产生该酶的细菌种名
第4个字母代表产生该酶的菌株号。
3.限制酶的识别和切割位点
根据Ⅱ型酶种类割双链DNA产生3种不同的切口： ⑴产生平末端
⑵产生5’端突出的粘性末端 ⑶产生3’端突出的粘性末端 6.限制酶使用的条件 ⑴ 缓冲系统：
50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反应体积
⑶ 反应温度和时间 ⑷ 限制酶的商业化 7.限制酶的商业化
试剂公司的名称： Promaga公司 安玛西亚公司
大连保生物公司 北京赛百胜公司 北京华美公司
购买酶时的注意事项：价格因素 供货时间 运输方式
酶的保存
修饰酶
⒈逆转录酶种类：
禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶
小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶 ⒉ T4DNA连接酶
从噬菌体中提取，用于DNA的连接 ⒊ 碱性磷酸酶
可将DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望发生的连接反应进行。⒋末端脱氧核苷酰转移酶
用于将已标记好的单核苷酸加到DAN的3’端上，起到标记的作用；有时也可用于DNA片段的同聚尾的形成。
载体(vector)在基因工程中的作用: 将外源DNA插入其中，并一同转化或转染到宿主细胞中，能够稳定的保存下来，完成外源DNA克隆和表达的功能。载体所必需的条件
1必须有自身的复制子，并能携带重组DNA一起复制。2载体分子上必须有限制性内切酶位点即多克隆位点。3载体必须具有可供选择的标置，便于重组分子的筛选。
4载体分子尽量小，便于能插入较大的外源DNA，最好是高考贝。5表达载体必须具备能在宿主细胞中表达的能力。
一、常用的克隆载体
㈠质粒plasmid 1．质粒的一般特点
细菌质粒是一些双链闭环的DNA分子，这些质粒都是独立于染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通常，质粒含编码某些基因的酶，这些酶在一定环境下对宿主细胞有利。由质粒产生的表型对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素，及限制酶、修饰酶等。
质粒都带有独立的复制子，能独立的自我复制。但在复制时必须依赖宿细菌的酶。
质粒的不亲和性(不相容性)
质粒的三种状态
松驰型和严紧型 质粒的转移性
多数质粒在自然条件下可以通过细菌结合的作用转移到新的宿细胞中。然而，由于质粒缺少一种转移所必须的mob基因，因此不能独立的从一个细菌到另一个细菌的接合转移。选择标记
质粒载体的发展经历了三个阶段：
第一阶段：将选择标记引入含有复制子的质粒中。
最早用作克隆载体的质粒子有多种局限性：复制效率低；带有不适合的选择标记；酶切位点少且不集中等，pBR322是早期最为成功的将所有理想的特性囊括于一身的质粒载体。第二阶段：高效型载体的发展
发展的趋势是调整载体的结构，提高载体的效率，减少载体的长度，扩充载体的容纳外源DNA的能力。这期间质粒的代表是：pUC19等。第三阶段：引入多种用途的辅助序列
这些用途包括通过组织化学检测方法肉眼鉴定重组克隆，产生用于序列分析的单链DNA，外源蛋白的大量表达等用途的质粒载体。
㈡λ噬菌体
1．λ噬菌体分子生物学
λ噬菌体的基因组是一长度50kb的双链DNA，其末端为长12bp的天然互补单链（粘端）。当它进入宿细胞后其粘端会配对结合成环形，它在侵入宿细胞后可以两种方式进行复制：
裂解性生长 溶源性生长
2．λ噬菌体作为载体所具有的特征
不利因素：野生型λ噬菌体有一个庞大的基因组，其DNA可分为头部、中央部分和尾部三个部分。其基因组由头部（由7个基因组成）、尾部（由11个基因组成）、重组基因（5个基因和一个识别位点）、正调控基因（2个基因）、负调控基因（5个基因）、DNA合成基因（2个基因）、裂解基因（2个基因）、转录调控及识别位点组成。在没有改造的情况下，λ噬菌体无法插入较大的外源DNA片段，无较集中的酶切位点和好的识别标置。3．λ噬菌体载体的改造：
在λ噬菌体DNA的中央部分（约占30%）是其生长的非必须区，当外源基因取代该区或该区缺失时，对噬菌体的生长不会造成影响。此外，外源基因不超过其本身的10倍数时，均可被包装为成熟颗粒，具有噬菌体活性。
目前使用的λ噬菌体载体都经过了改造，在其中加上了较集中的酶切位点、还加上了细菌的启动子，这不仅使其具有扩增外源DNA的能力，还使它能够表达外源基因的产物。
λ噬菌体的用途： λ噬菌体主要用于cDNA文库的构建。㈢粘性质粒
粘性质粒是一种将λ噬菌体和质粒两种载体结合起来形成的一种人工载体。它具有如下特征：
⑴含有质粒的抗药性标记，如Ampr基因。
⑵载体带有噬菌体的cos区，所以对其进行体包装是必不可少的。
⑶具有多克隆位点。
⑷形体本身的体积很小，但容量大，可插入40kb大小的DNA片段。
⑸一般非重组的载体体积小，而无法进行体外包装，因而无法转染细菌，只有包装了的重组体才能进入细菌，有利于筛选。㈣M13噬菌体
M13噬菌体是一种大肠杆菌的噬菌体它在转染大肠杆菌后进行一段时间的复制后开始进行不对称复制，而形成大量的单链DNA，而后将这些单链DNA进行包装病毒颗粒后释放到细菌外，利用这一特点，可大量克隆单链的DNA分子用于制备核酸探针和DNA测序的材料。㈤大容量测序用载体
在基因组学的研究中，需要将基因组的DNA片段切割成较的片段进行测序，以此来提高测序的速度。但我们前面提到的载体一般都无法满足这一需要，为了达到这一目的，人们开发出了酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)，前者可容纳100万个碱基的DNA片段，后者可容纳30万个碱基的DNA片段。
载体的表达
用于目的基因的表达。可分为大肠杆菌表达载体和哺乳动物表达载体。㈠大肠杆菌表达载体
一般具备有细菌转录的启动子，可人为的进行操纵，如多数质粒载
体中都带有乳糖操纵子的启动子，能在乳糖存在的情况进行诱表达。㈡哺乳动物表达载体
多数是一些真核细胞病毒经过改造而成形的。
重组DNA技术的基本过程
一、目的基因的制备 ㈠传统的办法 1.制备基因组DNA 将整个一个物种的基因组提取出来后用于基因工程的操作。常用于建立基因文库。
2.制备cDNA文库,并从中筛选目的基因
将一个物种或细胞中的全部RNA提取出来再从中提取mRNA，利用逆转录酶将其合成为cDNA，再将其重组于载体后，转录到大肠杆菌后形成cDNA文库。
㈡制备用于表达的基因片段 ⒈直接用限制性酶切取
⒉用PCR技术体外扩增目的基因 ⒊化学合成
㈢利用生物信息学的技术和原理来选择目的片段
是现在最普遍使用及最为方便的手段
二、载体的选择和制备
载体均是商品，根据实验的目的来选择合适的载体，如分子克隆、表达、测序或长期保存目的基因等。即可以购买，也可以索求
三、DNA分子体外重组 基因工程的策略
确定重组实验的目的——是获得目的基因，还是获得表达产物。
根据经济情况选择合适的用品——包括质粒（可以买成品，也可以向人索取质粒自己提取）、酶的选择等。
制定周密的实验计划，基因工程的实验周期都比较长，如计划不周，将造成时间和经济上的损失。
酶切位点的选择 选择合适的连接方式
四、将外源重组DNA导入宿主细胞
㈠转化：主要指将质粒转入宿主细菌的过程。通常是先将细菌细胞制备成感受态的菌，然后再进行转化。
转化常用的方法有两种：化学转化和电转移
㈡转染：主要指将噬菌体和病毒转入细胞的过程。
五、目的基因的筛选和鉴定
筛选和鉴定的方式有许多种，要仿照最初的实验方案来确定。常用的方式有：
用抗生素选择培养基来筛选
用蓝白斑选择培养基来筛选
根据酶切方案来筛选
直接提取质粒来筛选
提取质粒和酶相结合来筛选
分子杂交 DNA测序
在医学中的应用
1.基因工程用于生产蛋白质类药物
治疗糖尿病的胰岛素，是一种 51 个氨基酸残基组成的蛋白质1982 年美国 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。升发酵液中所得的干扰素相当于过去从 1000 升人血中所得。生产成本也大为降低。
目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物，现在用基因工程办法便可能大量生产。
正在开发的350种生物技术药物中，1/3以上用于肿瘤，其中有30种用于黑素瘤，20种用于结直肠癌，13种用于乳腺癌，13种用于前列腺癌。
正在开发的疫苗有77种，用于预防或治疗HIV感染、AIDS、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、多发性硬化、中风。
正在开发的生物技术药物中，有29种用于HIV感染、AIDS和AIDS相关疾病；19种用于自身免疫性疾病，其中11种用于类风湿性关节炎、3种用于狼疮；8种用于血液疾病，其中4种用于血友病，一种用于镰形细胞性贫血。
2.基因工程用于疫苗生产
常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种疫苗各有自身的弱点。活疫苗隐含着感染的危险性。死疫苗免疫活性不高，需加
大注射量或多次接种。
利用基因工程制备重组疫苗，可以克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白质的基因重组到载体上去，再送入细菌细胞或其他细胞中区大量生产。这样得到的重组疫苗往往效价很高，但决无感染毒性等危险。
在酵母中表达乙型肝炎表面抗原 HBsAg 产量可达每升 2.5mg，已于 1984 年问世。
基因工程生产疫苗有良好的发展前景。3.基因工程用于基因治疗
人体基因的缺失，导致一些遗传疾病，应用基因工程技术使缺失的基因归还人体，达到治疗的目的，已成为基因工程在医学方面应用的又一重要内容。
分子生物学常用技术
核酸的分子杂交Nucleic acid hybridization 分子杂交的原理：
DNA具有变性的特点 变性的DNA还能复性
分子杂交的概念 用已知的DNA序列制成探针，来检测末知的样本DNA。
核酸分子杂交的基本过程:
首先要确定检测的目标，即检测的目的核酸片段，这个片段的序列必须是已知的。
根据此设计一个探针（与检测目的核酸互补的序列），并对其进行合成和标记。
再通过杂交实验来完成探针对目的核酸的检测。
分子杂交的形式：
液相杂交 固相杂交 固相杂交的一般过程
1.首先设计、合成探针。2.收集标本，并提取核酸。
3.将提好的核酸样本点到固相支持物上。4.封闭。
5.通过变性和复性完成杂交。6.漂洗
7.放射自显影
核酸分子杂交技术的演变
斑点杂交 southern blot northern blot 原位杂交 芯片技术
聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction(PCR)PCR技术的形成及发展
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件——摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间, 合成DNA的原料。
PCR的改进与完善
Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现为PCR技术的广泛应用打下了基础。PCR 技术的实验原理
模拟细胞内DNA合成的过程
利用了DNA变性、复性和能进行杂交的特点，在引物存在的条件下DNA聚合酶开始对DNA进行体外合成。
通过全自动的热循环仪来完成 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
PCR反应的基本条件
模板的制备: 模板是进行DNA体外扩增的依据，它的来源于不同的材料。PCR对模板的质量要求很高，但对它量的要求不高。
制备模板的材料：
新鲜材料：人或动物的血液及组织中提取；
从少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法医学的材料：血斑、精斑等；
考古材料
从以往保存的材料，如石蜡切片的蜡块中。
提取的原理和方法：（略）
引物的设计：
引物的设计首先要依据你已知的序列来设计。即你要扩增的目的DNA片段。这些资料可以从文献上查找或从互联网上来检索。
实际做的过程中，引物也可借助于别人已经发表的引物来。但从经验上说，别人公开发表的引物常常含有一定的错误。所以要进行核查。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物-3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
PCR所用试剂： DNA聚合酶
buffer:包括两种，一种是含Mg++，一种是不含Mg++。dNTPs 纯净水
自己要准备的模板DNA的制备和引物的设计与合成。PCR的操作过程
设定一个加样配方： 标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 5ul
4种dNTP混合物
各200umol/L
引物
各10～100pmol
模板DNA
0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水至 50ul
加样：
单样本加样
多样本加样
加样的顺序 PCR反应条件的设定：
预就性温度： 94℃，5分
变性温度： 94℃，30秒
退火温度： 需要摸条件
延伸温度： 72℃，30秒
总延伸温度： 72℃，15分
PCR结果的鉴定
通过凝胶电泳的方式来进行。
RT-PCR(reverse transcription-PCR)RT－PCR技术的应用
用于制备基因工程的目的基因片段。
用于表达谱的检测。PCR技术的应用
PCR的初衷是为特异性的扩增某段DNA
现在PCR在医学研究中主要是用于基因诊断，常用于：
对遗传病的突变基因进行诊断
对病原体的基因诊断
通过PCR结合限制酶切的诊断 SSCP技术进行点突变的诊断 RT-PCR进行结构基因的扩增及定量表达 荧光定量PCR技术
PCR结合多态性分析
PCR扩增产物的多态性分析有2种情况：
限制片段多态性分析(A)、(B)重复序列多态性分析(A)、(C)SSCP技术进行点突变的诊断 实时荧光定量PCR技术
电泳技术electrophoresis technology 核酸的凝胶电泳
一、基本原理
1．核酸分子在水溶液中呈多聚阴离子。加上电场，它们会向正电极的方向迁移。2．在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型。
3．电泳环境的影响：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移速度。
当电泳缓冲液中无离子时，溶液导电性极小，电泳速度慢。当电泳缓冲液中离子浓度极强时，则导电性极高，并易产热。
pH值也影响迁移率，溶液的pH远离样品的等电点时，样品颗粒的电离程度大，相应的电泳速率就大。凝胶的浓度的不同对同样大小颗粒的电泳速
率也不相同，因此，不同浓度的凝胶分辨DNA分子大小的能力也不同。
表：琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力
凝胶类型及结构 分离DNA片段的大小范围(bp)0.3%琼脂糖 50 000-1 000 0.7%琼脂糖 20 000-1 000 1.4%琼脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500-25 20.0%聚丙烯酰 50-1
4．凝胶电泳的目的：
可将大小不等的DNA片段和蛋白分子进行分离，并通过标准分子量基本原理：
maker鉴定其大小。
对所要的目的分子进行纯化提取。
二、琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis 琼脂糖是从海藻中提取出的长链状多聚糖，当它被加热到90℃时可被溶解成半透明的液体，这时便于浇板并在冷却后固化成凝胶。其凝固点这40-45℃。
琼脂糖电泳的优点：操作方便，并可用来鉴定和纯化特定的DNA分子。
用低溶点琼脂糖来分离并纯化DNA。
琼脂糖电泳的不足之处：它的分辨范围在0.3-50kb之间，对一些分辨更小DNA分子的实验将无法进行。
琼脂糖电泳结果的显示：
利用核酸与溴化乙锭吸附性强的特点，用溴化乙锭来显色。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)电泳材料：
丙烯酰胺
CH2═CH─C—NH2 ║ O N,N¡¯-亚甲双丙烯酰胺
H H │ │ CH2═CH─C—N—CH2—N—CH═CH2 ║ O 两种丙烯酰胺在促凝剂存在的条件下可以凝集成胶。
PAGE的优点和不足：优点是分辨率高，不足是操作复杂，成本高。PAGE的凝胶可用溴化乙锭染色，也可以银染，后者的分辨率高。
四、SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SOS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
SDS-PAGE专门用于蛋白质电泳。
基本原理：在蛋白质电泳前，先将其变性成线结构，并使其表面都吸附上带负电荷的活性分子-----SDS。
蛋白质印迹技术
Western blotWestern blot 技术是借鉴了Southern blot 技术的原理而设计。它也是在凝胶电泳后通过转移电泳将电泳分离物移到固相支持物上再进行进一步的分析。
与Southern blot不同的是，它用来杂交的不是探针，而是特异性的物体。
Western blot的基本过程
先通过SDS-PAGE将样本中的蛋白质分离
通过转移电泳将凝胶上的样本移到硝酸纤维膜上 封闭硝酸纤维膜
用一抗来特异性的识别目标蛋白 用酶标二抗来识别一抗 显色
DNA序列分析
Sanger双脱氧终止法(手工测序)基本原理：
DNA在复制时，需要两个单核苷酸之间脱去一分子水后形成磷酸二酯键。如果在其中加入双脱氧的单核苷酸，将中止DAN的复制。通过自动化的DNA测序仪来进行测序
二、基因组的大规模的测序列 新一代测技术的出现
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。
酶联免疫吸附分析Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)
通过免疫学技术(抗原、抗体反应)对样本中的目标蛋白质进行特异性的定性或定量分析。被检测的蛋白质即可能是抗原，也可以是抗体。基本过程：
1.将抗体或抗原结合到固相支持物上
2.用特异性的抗原或抗体(被酶标记)对其进行免疫识别。3.通过酶标仪来检测结果
ELISA常用的方法有：
双抗体夹心法
间接法
一、转基因技术 1.转基因技术的概念
转基因技术指的是将一个物种的特定基因通过人工的方法转入到另一种生物的细胞中，并使它获得了转入基因的特性。
2.转基因技术的类型
转基因技术可分多个层次：
广义的讲，最基本的转基因技术就是基因工程，即将高等生物的基因通过体外重组后，转化入细菌或酵母细胞。
真正意义上的转基因技术是指转基因植物和转基因动物。它们多是将外源基因注入生殖细胞或受精卵子中，并让外源基因整合到其基因组中，并使其在胚胎及发育成熟的个体中获得表达，形成具有新特性的个体。
三、转基因动物 transgenic animal
1．转基因动物的简史
1980年，J.W.Gordon等人首次报道用显微注射的方法向小鼠胚胎注射纯化的DNA，开辟了转基因动物研究的先河。
1982年，R.D.Palmiter等又报道用转移生长激素基因的方法，获得了7只转基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被称为巨鼠，引起极大的轰动。相继有转基因猪、鱼、兔和羊等问世。
2．转基因动物研究概况
⑴转基因动物在培育新品种中的应用
在转基因动物历史上，培育高效益的家畜、家禽和水生动物新品种曾经是研究工作的主流。受“巨鼠”的影响，人们期望能通过转基因动物的研究，获得快速生长、节约饲料、产毛多、产蛋多和抗病的动物新品种。
主要是将生长激素和类胰岛激素的基因转入动物体内，并且取得了良好的增长效果，但也表现出一系列病理性副作用，关节炎和胃病尤其明显。但转基因鱼是一个例外。
⑵动物生物反应器(animal bioreactor)用动物乳腺生产医用蛋白质的优点：
动物乳腺是一个自我封闭的系统，它表达的蛋白质绝大多数不会回到血液循环系统中去，可以避免大量表达的外源蛋白质对动物的健康造成危害。
乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器，一头奶牛一年可产乳蛋白250-300千克，一只羊一年可产乳蛋白25-30千克。如果把百分之一的乳蛋白代换为医用蛋白质，产量十分可观。
乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，产品活性接近天然产品。
在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，一旦获得成功，可以用常规畜牧技术繁殖产生群体。
我国转基因动物研究的领军人物
——中国工程院院士曾溢滔教授
⑶抗病育种
将具有抗病能力的基因导入动物，使其具有较理想的抗病能力。目前已做的工作有：
抗猪瘟育种：
抗流感基因工程育种：1989年Young将INF基因质粒导入小鼠受精卵，获得表达，获得抗病转基因小鼠。
抗肿瘤动物模型：美国首先培育出易发乳腺癌的转基因小鼠，为研究癌诱发和抗肿瘤药物的筛选提供了研究的模型。迄今已培育出许多与癌基因有关的转基因小鼠。⑷基因治疗
⑸组织器官移植：
将人的标志基因移入猪，使其器官上具有了人的抗原标志，减小了排异反应。
3.转基因动物的技术路线 ⑴经典的技术路线
先从已交配的供体动物的输卵管中采取受精卵；
显微注射法向受精卵的雄性核导入人工构建的药物蛋白基因；
经外科手术把已导入外源基因的受精卵移入同步发情的受体母羊输卵管内；
让受精卵在“养母”体发育至分娩出生；
用分子生物学技术检测出生小羊是否已整合了导入的外源基因。
该法的缺点：实验周期长，注射的外源基因整合率低。
⑵整合胚胎移植技术路线
该技术是对前种方法的改进。它利用了生殖技术中的体外受精技术，使精子和卵子在体外受精；然后找到一个最佳时机向体外受精的细胞显微注射药物蛋白基因。然后在体对胚胎体进行整合的鉴定。从中挑选有目的基因整合的胚胎进行移植。采用经阴道的非手术胚胎移植法，减少了对受精卵的损伤。
⑶核移植（克隆）技术路线
利用克隆技术进行转基因实验。即在进行克隆之前，先目的基因注射到将进行移植的核中，在按克隆技术进行操作。其成功率比经典技术路线高2.5倍。
⑷整合卵受精技术路线
即在受精之前先将药物蛋白基因注射进入卵细胞，经检测已经完成整合后，再进行体外受精和胚胎移植。
基因组学(genomics)功能基因组学(functional genomics)蛋白质组学(proteomics)Genome这个述语是德国遗传学家Winkler在1920年创造的。它的含义是指一个细胞中所含有的全套遗传信息。也是泛指一个物种中所含的全部的遗传信息。
基因组学(genomics)主要是研究一个物种的基因组的组成，包括DNA碱基的排列顺序，基因的分布情况。
人类基因组计划简介(human genome project, HGP)HGP简介
人类基因组计划是由美国科学家于1985年率先提出、于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。
基因组(Genome):基因组就是一个物种中所有基因的整体组成 人类基因组有两层意义： ——遗传物质 ——遗传信息
从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系
人类基因组计划的目标：
1.测定人类基因组中32亿个单核苷酸（碱基）的排列顺序。
2.确定各个基因和功能元件在序列中的位置，也就通常说的基因定位。3.确定出与疾病相关的基因及找出有治疗和药用价值的基因。4.绘制出一个完整的人类基因图谱。
HGP是如何进行的： 1.基因组测序概观
基因组的测序的基本过程：
①选择物种
②从细胞中提取DNA ③把经纯化的DNA随机切割成大小合适的重叠片段
④指导DNA片段插入到载体中，并克隆
⑤测出第一DNA片段的碱基顺序
⑥确定片段间的重叠，把序列组装成最终的基因序列 敲碎基因组，分析研究内容所处的染色体位置
2.DNA的测序方法
在发明自动测序技术之前，人们用手工进行测序，最常用的方法是末端终止法（后面专门介绍）。
手工测序是通过凝胶电泳的手段将DNA片段进行分离，然后在胶上“读出”碱基的排列顺序。这就决定了被测序的DNA片段不可能太大，而且效率很低，在20世纪80年代时，一天只能完成500bp片段的测序工作。
3.自动化测序
1985年Leroy Hood, Lioyd Smith, Mike Hunkapiller发明了第一台自动测序仪，每天能测15 000个bp，1998年Hunkapiller领导的小组发明了一种新的测序列仪——ABI 3700G型DNA分析仪，每天可测多达400 000bp。测序的自动化推动了HGP的神速发展，研究人员仅用15个月的时间就完成了人类基因序列的90%。
技术的改进促进了测序的发展，每18个月全世界的测序总量翻一番，而测序成本则减少一半。从20世纪80年代末期到2001年，测序成本从10美元降到10美分。
4.测序用载体的改进
在进行基因组测序时，先要将提取的基因组DNA用限制性内切酶切成大小不等的片段，并使每个片段之间能够出现部分的重叠，然后需将这些片段放入载体大量克隆后才能完成测序的需要。
分子生物学中常用的载体是质粒，它一般能携带较小的DNA片段。但在HGP的测序中需要能携带更大片段的载体，人工染色体载体的出现解决了这一困难。现在用的人工染色体分为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome BAC)或酵母人工染色体(yeast artificial chromosome YAC)。BAC能携带300 000bp的DNA，YAC能携带1 000 000bp 的DNA，但不够稳定。
5.组装基因组的拼图游戏
基因测序后，要将一个个小的DNA片段拼装起来就象一个游戏，但是一个十困难的工作。一个原因是人的基因组过于庞大，32亿个碱基对被切成小片段也要有上千万个片段，把它们从头到尾找到一起本身就是很困难的工作。加上人的基因组中存在着大量的重复顺序，约占人基因组的一半以上，这样在拼接时很容易把一个区误认为另一个区域，因此在基因组测序和拼图中常常会出现空洞和错误。要弥补这些空洞和错误，基因组的工作草图的每一个碱基至少被测4-5次，人类基因组的最终目标是产生完全的序列，没有空隙，准确率要达到99.99%。
6.目前进行基因组计划的两种策略： 霰弹法测序：
先将人的基因组制备成各级小片段，并且小片段间有重叠的关系 然后对每个小片段进行测序 通过重叠的关系将相互联系着的小片段拼接成较大片段 当拼到比较大的片段时，就可用于构建图谱 最终全部基因的序列。
全基因组霰弹法测序：
将基因组分割成小片段 然后对小片段进行随机的测序
通过计算机的程序将所有这些小片段组装成连续的大片段，最终得到全基因组序列。
模式生物体的研究
通过对进化不同阶段的生物体基因组序列的比较，发现基因组结构组成和功能调节的规律。
人类基因组计划的完成示标志着生命基础科学的研究进入到后基因组时代。
HGP对人类的重要意义
1、HGP对人类疾病基因研究的贡献
人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。健康相关研究是HGP的重要组成部分，1997年相继提出：“肿瘤基因组解剖计划”“环境基因组学计划”。
2、HGP对医学的贡献
基因诊断、基因治疗和基于基因组知识的治疗、基于基因组信息的疾病预防、疾病易感基因的识别、风险人群生活方式、环境因子的干预
3、HGP对生物技术的贡献
（1）基因工程药物：分泌蛋白（多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受体。
（2）诊断和研究试剂产业：基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型。
（3）对细胞、胚胎、组织工程的推动：胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。
4、HGP对制药工业的贡献
筛选药物的靶点：与组合化学和天然化合物分离技术结合，建立高通量的受体、酶结合试验为基础的药物设计：基因蛋白产物的高级结构分析、预测、模拟—药物作用“口袋”
个体化的药物治疗：药物基因组学。
5、HGP对社会经济的重要影响
生物产业与信息产业是一个国家的两大经济支柱；发现新功能基因的社会和经济效益；转基因食品；转基因药物（如减肥药，增高药）
6、HGP对生物进化研究的影响
生物的进化史，都刻写在各基因组的“天书”上；草履虫是人的亲戚发现了大约一百四十万个单核苷酸多态性，并进行了精确的定位，初步确定了30多种致病基因。随着进一步分析，我们不仅可以确定遗传病、肿瘤、心血管病、糖尿病等危害人类生命健康最严重疾病的致病基因，寻找出个体化的防治药物和方法，同时对进一步了解人类的进化产生重大的作用。
9、蛋白组的复杂性
人类基因组编码的全套蛋白质（蛋白质组）比无脊椎动物编码的蛋白质组更复杂。人类和其他脊椎动物重排了已有蛋白质的结构域，形成了新的结构。也就是说人类的进化和特征不仅靠产生全新的蛋白质，更重要的是要靠重排和扩展已有的蛋白质，以实现蛋白质种类和功能的多样性。有人推测一个基因平均可以编码2-10种蛋白质，以适应人类复杂的功能 ——13亿年；人是由300～400万年前的一种猴子进化来的；人类第一次“走出非洲”——200万年的古猿；人类的“夏娃”来自于非洲，距今20万年——第二次“走出非洲”？
7、HGP带来的负面作用 侏罗纪公园不只是科幻故事 种族选择性灭绝性生物武器 基因专利战
基因资源的掠夺战 基因与个人隐私。
人类基因组带给我们的新发现
1、基础数据
全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因；平均的基因大小有27kbp；其中G+C含量偏低，仅占38%，而2号染色体中G+C的含量最多；到目前仍有9%的碱基对序列未被确定，19号染色体是含基因最丰富的染色体，而13号染色体含基因量最少等等（具体信息可参见cmbi 特别报道：生命科学的重大进展）。
2、基因的分布情况
目前已经发现和定位了26000多个功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能，在已知基因中酶占10.28%，核酸酶占7.5%，信号传导占12.2%，转录因子占6.0%，信号分子占1.2%，受体分子占5.3%，选择性调节分子占3.2%，等。发现并了解这些功能基因的作用对于基因功能和新药的筛选都具有重要的意义。
3、基因数量少得惊人：
一些研究人员曾经预测人类约有14万个基因，但Celera公司将人类基因总数定在2.6383万到3.9114万个之间，不超过40,000，只是线虫或果蝇基因数量的两倍，人有而鼠没有的基因只有300个。如此少的基因数目，而能产生如此复杂的功能，说明基因组的大小和基因的数量在生命进化上可能不具有特别重大的意义，也说明人类的基因较其他生物体更'有效'，人类某些基因的功能和控制蛋白质产生的能力与其他生物的不同。这将对我们目前的许多观念产生重大的挑战，它为后基因组时代中生物医学的发展提供新的非凡的机遇。但由于基因剪切，EST数据库的重复以及一些技术和方法上的误差，将来亦可能人类的基因数会多于4万。
4、不同各族间DNA的差异
人类单核苷酸多态性的比例约为1/1250bp，不同人群仅有140万个核苷酸差异，人与人之间99.99％的基因密码是相同的。并且发现，来自不同人种的人比来自同一人种的人在基因上更为相似。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。
5、人类基因组中存在大片“荒漠”。
在染色体上有基因成簇密集分布的区域，有大片的区域只有“无用DNA” ——不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有1／4的区域没有基因的片段。在所有的DNA中，只有1%-1.5%DNA能编码蛋白，在人类基因组中98%以上序列都是所谓的“无用DNA”，分布着300多万个长片断重复序列。这些重复的“无用”序列，决不是无用的，它一定蕴含着人类基因的新功能和奥秘，包含着人类演化和差异的信息。经典分子生物学认为一个基因只能表达一种蛋白质，而人体中存在着非常复杂繁多的蛋白质，提示一个基因可以编码多种蛋白质，蛋白质比基因具有更为重要的意义
6、男女性别间基因的差异
男性的基因突变率是女性的两倍，而且大部分人类遗传疾病是在Y染色体上进行的。所以，可能男性在人类的遗传中起着更重要的作用。
7、外来基因
人类基因组中大约有200多个基因是来自于插入人类祖先基因组的细菌基因。这种插入基因在无脊椎动物是很罕见的，说明是在人类进化晚期才插入我们基因组的。可能是在我们人类的免疫防御系统建立起来前，寄生于机体中的细菌在共生过程中发生了与人类基因组的基因交换。
8、新的遗传标记
蛋白质组学(Proteomics)
proteome一词于1994年提出，源于proteins和genome,意思是proteins expressed by a genome。研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学
蛋白质组的广义含义：
指某种细胞或组织中基因组所表达的所有的蛋白质。但与基因组不同的是，蛋白质组是一个动态的概念，因此有人用功能蛋白质组的概念，指的是细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。蛋白质组的狭义含义：
可以指不同类型细胞内蛋白质的变化，如正常细胞和异常细胞之间、细胞用药或不用药之间的蛋白质水平差异、不同组织细胞间的蛋白质类型的差异。
蛋白质组研究的意义和背景
蛋白组学可从另一方面来进行探索。即找到蛋白再来找其基因。
蛋白研究的困难性
蛋白质与核酸相比，结构更复杂
前者与后者残基的比为20:4；后者能在体外进行合成、前者则不能；后者结构和组成的差异不大、前者有着复杂的翻译后修饰如磷酸化、甲基化等内容。
蛋白质的结构易被破坏
核酸在变性后能够复性，并且结构不被破坏(这一点正是人们所利用的)。
蛋白质结构一旦变性则很难恢复。
蛋白质组研究主要分两个步骤
蛋白质组分离技术 蛋白质组分析技术 蛋白质的分离
将各种蛋白进行分离是进行后续分析的基础。分离的越细、分辨率越高将会为分析创造更好的条件。常用的蛋白质分离手段有：
亲和层析 分子筛 离子交换
毛细管电泳 一向电泳 双向电泳
双向电泳技术 样品的制备
等电聚焦电泳(1向)SDS-PAGE电泳(2向)扫描保留图象
强大的分析软件进行数据分析 选定目标蛋白 切胶 后续分析 对胶的染色 图象的采集 图象分析和处理
切胶收集目标蛋白
基因诊断
(Gene Diagnosis)基因诊断是以DNA或RNA为实验材料，通过对某种特异碱基序列的检出来确定某种疾病的发生或某种病原体的存在。
基因诊断要达到的目的 对已知突变基因的检出
临床应用和基础研究
对一些未知基因突变的筛选和分析。
对一些基因表达水平高低与某些疾病相关性的研究 对病原体基因的检出。基因诊断早期的方法
分子杂交(hybridization)限制片段长度多态性的研究
(restriction fragment length polymorphism RFLP)分子杂交应用于基因诊断的基本原理
根据被检测目标设计一个核酸探针，再用探针对来检测具体的样本，从而达到诊断的目的。
在实际应用中，常用southern blot的方法来进行突变基因的筛查。
PCR技术进行基因诊断的几种基本设计：
1.根据突变位点来设计特异性的引物。通过有无扩增片段来进行定性的。
2.通过基因片段长度的多态性来进行鉴定。3.PCR结合限制片段长度多态性来进行鉴定。
4.通过PCR-SSCP来进行鉴定。
5.通过设计特异性的引物来诊断病原体的特异性基因。
基因诊断的应用 多态性分析
对遗传病突变基因的诊断
已知突变位点的诊断
未知突变位点的筛查和定位 基因异常表达的诊断（定量表达）外源DNA的检测
肿瘤标记物的确定和诊断 在法医学中的应用
DNA多态性
序列多态性(SNPs – 单碱基多态性)同源染色体 5-GGTTTACACCTAA-同源染色体 5-GTTTTAAACCGAA-
长度多态性(VNTR-可变的串联重复顺序)同源染色体 5-AATCAATCAATC-
同源染色体 5-AATCAATCAATCAATCAATC-
核心序列较长者（如大于8bp）常称为小卫星DNA，或称可变数目串联重复序列（VNTR）核心序列较短者（如2-5bp）常称为微卫星DNA，或称短串联重复序列（STR）
微卫星多态性 单碱基多态性
遗传信息变异是所有基因组的共同特征。不同个体、群体在疾病易感性、对环境理、化、生、致病因子反应性和其他性状上的差别，都与基因组序列中的变异有关，这些变异最常见的形式是单核苷酸多态性（SNP）。
人类基因组中SNP的数目约为3百万－1千万。人类遗传多态性的意义 与性状相关；
与疾病相关，可用于预测发病风险； 个体医学发展的基础；
可作为遗传标志，用于疾病连锁诊断； 作为个人身份识别标识用于法医学。
遗传性状
遗传多态性在身份识别方面的应用
公安司法系统——罪犯及受害人的身份识别及亲子鉴定； 部队 —— 伤亡士兵的身份识别；
保安 —— 个人DNA身份证，用于人员识别；
何为RFLP? 限制性片段长度多态性
(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)
何为DNA指纹？用一种或几种限制性内切酶切割基因组DNA，用探针杂交并放射自显影。
中国人群的遗传学关系
主要成果：证实中国人群可分为南、北两大组，两者之间有明显的基因融汇；提出了东亚人群可能起源于东南亚、而东亚现代智人与其他各大洲现代人群都起源于10－20万年前“走出非洲”的群体的观点。
基因治疗Gene Therapy
依靠遗传物质来治疗疾病，包括纠正人自身基因的结构或功能上错乱、阻止病变的进展，杀灭病变的细胞，或抑制外源原体遗传物质的复制，从而达到治病的目的。这就是基因治疗的含义。基因工程与基因治疗有相似的一面：
二者都需将“目的基因”（基因治疗也可称为治疗基因）分离和纯化；都需要将选择合适的载体，并将“目的基因”与载体在体进行重组；都需要将重组体导入受体（靶）细胞。基因工程与基因治疗有不同的一面：
基因工程的主要目的是将重组体导入宿主细胞，并使得外源基因在宿主细胞中表达、纯化，最终获得重组蛋白。
基因治疗的主要目的是将具有治疗价值的基因形成的重组体导入体细胞直接表达，并无需对表达产物进行纯化。
基因工程的全部过程都在体外操作；而基因治疗需将外源基因导入体细胞中，因此技术上具有很大难度，而且对其有效性和安全性方面提出了
苛刻的要求
基因治疗有两种途径：
ex vivo in vivo ex vivo ：
将含有外源基因的载体在体外导入人体细胞或异体细胞（也称基因工程化细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。这种方法易于操作，并易于解决安全性的问题，但不易于工程化生产。in vivo途径
将外源的治疗基因装配于合适的真核细胞表达载体，直接导入人体内，这种方式的导入有利于在规模的工业生产。但是，这种方式导入治疗基因及其载体必须证明其安全性，而且导入体内后需能进入靶细胞，有效地表达并达到治疗的目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于前者。
致病基因的确定(定位)近日，来自国际上六个国家的科学家展开合作，通过分析全球不同人群之间的遗传基因信息，初步绘制出首张人类DNA序列中变异基因片段的遗传图谱“HapMap”。这张图谱对于基因治疗来讲，意义非凡。
所谓“HapMap计划”，是由加拿大、中国、日本、尼日利亚、英国和美国共同资助并联合展开的基因研究项目，全名为“国际人类基因组单体型图计划”(简称“HapMap计划”)，项目旨在建立一个帮助研究者发现人类疾病及其对药物反应相关基因的公众资源。
反义技术 又称反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技术，是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段,使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的、用反义RNA已对某些癌症进行临床试验。这类反义技术只能认为是一种从基因水平进行治疗的技术，它们以不同方式，在DNA复制、转录和翻译水平发挥作用。由于它们的分子量低，故而有潜力进入靶细胞，但其临床稳定性、毒性、细胞通透性等各方面都需要进一步研究。
药物靶向治疗（drugs targeting）此法机理可概括为病毒导向酶的药物前体治疗（virus directed enzyeme prodrug therapy,vdept），即用反转录病毒载体的外源基因转移到细胞内.该基因编码一种酶，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒素复合物。带有这一基因的病毒载体只在特殊组织或肿瘤细胞中而不在正常细胞中表达
第五篇：分子生物学论文
分子生物学论文
姓名：
专业：药学
班级：11级药学三班 学号：
基因工程抗体治疗白血病的研究进展
【摘要】目前采用基因工程药物治疗白血病逐渐成为热点。研究表明白血病在获得缓解后用基因工程药物治疗即可提高疗效，又可减轻化疗药物的毒副反应，并可望达到治愈白血病的目的。
【关键词】白血病；基因工程抗体；研究进展
引文
白血病是一类造血干细胞的克隆性疾病，在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚，并浸润其他器官和组织，而使正常造血受抑制。在儿童至35岁以下青壮年人群中因患恶性肿瘤致死的以白血病为首，故可称为“第一杀手” [1]。治疗白血病通常采用细胞毒药物，虽然能使大部分患者病状缓解和生存期延长，但治愈率仍很低。基因工程技术的发展为降低单克隆抗体的免疫源性提供了一个有力的手段。目前嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体三种人源抗体很好地克服了HAMA反应的缺陷。2 正文
Campath一1H是在体内外对大部分正常和恶性淋巴细胞都有溶解杀伤作用的人源化CD52抗体，但对造血干细胞没有杀伤作用。起初，Campath一1H主要集中在对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床试验中，但由于Campath一1H对血循环中的淋巴细胞有强力的清除作用，现已经将其应用到CLL、T— PLL疾病中。
氟达拉滨等嘌呤类似物在各种慢性淋巴细胞白血病的治疗中获得较高的缓解率，但完全根除疾病的报道很少。将Campath一1H给予预先接受氟达拉滨治疗的CLL患者，来清除微小残留病变(MRD)，从而提高完全缓解率和持续时间，这可以使难治性CLL患者的总生存率(overall survival，OS)得到改善。Galimbeai[2] 等对8名CLL患者在氟达拉滨治疗后给予Campath一1H治疗。在Campath一1H治疗后，5例患者获得分子学缓解(62．5％)，其中4例在治疗结束后一个月内获得。OR(overall response)率为72％，CR率为43％，因此Campath一1H对CLL的治疗作用是显著的。
另外，Keating[3]等 2002年对76例先前治疗过的T—PLL患者给予Campath—IH治疗的安全性和功效进行了回顾性的分析。接受Campath一1H治疗的患者，其OR率为51％，CR为39．5％，CR中位持续时间8．7个月，0s率为7．5个月(CR者14．8个月)。作者认为Campath一1H是补救T—PLL一线治疗失败__的较好药物。
在造血干细胞移植中，Campath一1H还能有效地清除供者的T淋巴细胞而不影响采集的干细胞的数目和功能，成为预防异基因移植中预防移植物抗宿主病(GVHD)较为理想的药物。
随着减轻强度的预处理(RIC)方案的发展，出现了“非清髓性”造血干细胞移植。这种方案主要是靠免疫活性细胞作用，目的是使供体干细胞既易于植入，又最终起到根除肿瘤的作用。通常是包括氟达拉滨等药物的联合应用，但仍然有较高的慢性GVHD的发生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴细胞，从而减少了排斥反应和GVHD的发生，为“非清髓性”移植提供了一种较为理想的免疫抑制效应。Faulkner[4] 等报道了65例接受BEAM+Campath一1H预处理方案进行异基因移植的患者，包括CLL、PLL，中位年龄为45．6岁。其中Campath—IH每天用10mg。11例发生了急性GVHD(I一Ⅱ)，9例发生了慢性GVHD。55例获得了反应，其中41例为CR，6例复发。2年Os率为68．1％，无事件生存率(EFS)为57．7％。结果2年移植相关死亡率(TRM)为13．3％。3 结语
基因工程药物治疗白血病首先可以有效的避免治愈白血病过程中由于肿瘤的微小残留病变(MRD)不能被彻底清除而引起的疾病复发；其次是避免单纯化疗带来的毒副反应而引起机体的损伤以及机体对化疗药物的耐受性。因此用基因工程药物治疗白血病的方法成为了国内外科学家研究热点。我国与国外相比，虽起步较晚，但也获得了较大的发展，取得了一定的科研成果。例如，已经研制成功和正在研制的基因工程产品就有几十种，有些已经投产并开始使用，女ⅡIFN一、rhIL一
2、rhG—CSF、rhGM—CSF等。总之，基因工程药物治疗前景是十分诱人的，还有待于科研工作者的继续努力，让它为人类的健康作出更大的贡献。
【参考献文】
[1] 杨进．血液病中西医结合治疗学[M]．北京：科学技术文献出版社，2005：65．
[2]Galimberti S，Cervetti G，Cecconi N，et a1．Quantitative molecular e．valuation of minimal residual disease in patients with chronic lym—phocytic leukemia：efficacy of in vivo purging by alemtuzumab(campath一1H)[J]．J Immunother，2004，27(5)：389—393．
[3]Keating MJ，Cazin B，Coutre S，et a1．Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J]．J Clin Oncol，2002，20(1)：205—213． [4] Faulkner RD，Craddock C，Byrne JI，et a1．BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases；GVHD，toxicity，and survival in 65patients[J]．Blood，2004，103(2)：428-434．
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