鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测（BJS 201907）

鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测

BJS

201907

范围

本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼（Anoplopoma

fimbria）、油鱼（Lepidocybium

flavobrunneum，Ruvettus

pretiosus）和南极犬牙鱼（Dissostichus

eleginoides，Dissostichus

mawsoni）源性成分的实时荧光PCR检测方法。

本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品（不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品）中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。

原理

使用商业化DNA提取试剂盒，获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。

试剂和材料

除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T

6682的一级水要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

3.1引物探针序列

3.1.1裸盖鱼源性成分NADH2基因

裸盖鱼源成分5

’端引物：5

’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3

’

裸盖鱼源性成分3

’端引物：5

’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3

’

裸盖鱼源性成分探针：5

’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3

’

3.1.2油鱼源性成分Cytb基因

油鱼源性成分5

’端引物：5

’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3

’

油鱼源性成分3

’端引物：5

’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3

’

油鱼源性成分探针：5

’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3

’

3.1.3

南极犬牙鱼源性成分CK基因

南极犬牙鱼源性成分5

’端引物：5

’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3

’

南极犬牙鱼源性成分3

’端引物：5

’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3

’

南极犬牙鱼源性成分探针：5

’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3

’

3.1.4内参照基因真核生物18SrRNA

内参照5

’端引物：5

’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3

’

内参照3

’端引物：5

’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3

’

内参照探针：5

’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3

’

3.2

商业化DNA提取试剂盒。

3.3

商业化PCR反应预混液。

仪器和设备

4.1实时荧光PCR仪。

4.2微量紫外分光光度计。

4.3恒温水浴锅。

4.4高速冷冻离心机：离心力18,000

g以上。

4.5微量移液器（0.5

μL-

μL，10

μL-

μL，20

μL-

200

μL，100

μL-

1000

μL）。

4.6

涡旋振荡器。

4.7

天平：感量0.001

g。

分析步骤

5.1

样品前处理

（1）样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。

（2）样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

（3）样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。

注：速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。

5.2

DNA提取

按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。

5.3

DNA浓度测定

取1

μL

DNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA（双链DNA）计算方式检测其浓度。

5.4

实时荧光PCR扩增

实时荧光PCR反应体系见表1。

表1

实时荧光PCR反应体系

PCR预混液（2

×）

μL

μmol/L上游引物

0.4

μL

μmol/L下游引物

0.4

μL

μmol/L

探针

0.2

μL

DNA

20-50

ng

灭菌去离子水

补充至总体积20

μL

PCR反应程序：95

℃

s；

℃

s，60

℃

s（读取荧光），40个循环。

5.5

实验对照

分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。

阳性对照：含相应物种的DNA。

阴性对照：不含相应物种的DNA。

PCR空白对照：以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系。

空白提取对照：以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取。

结果判断与表述

6.1

质量控制

若以下条件的其中一条不满足要求时，结果视为无效：

阳性对照：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；

阴性对照：Ct值≥35.0；

PCR空白对照：Ct值≥35.0；

空白提取对照：Ct值≥35.0；

内参照反应：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；

样品平行反应：Ct值经6.2结果判定后应一致。

6.2

结果判定

（1）如Ct值＜30.0，且质量控制符合要求，则判定为检出相应物种源性成分。

（2）如Ct值≥30.0，且质量控制符合要求，则判定为未检出相应物种源性成分。

6.3

结果表述

检出

XXX

源性成分。

未检出

XXX

源性成分。

防污染措施

检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T

27403中的规定执行。

方法检出限

裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1

%~5

%，油鱼引物探针检出限范围为1

%~10

%，南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1

%~2

%。

注：因使用的设备、试剂盒不同，其检出限有所差异。

本方法负责起草单位：深圳市计量质量检测研究院。

验证单位：河南省产品质量监督检验院、天津市食品安全检测技术研究院、重庆市食品药品检验检测研究院、福建省食品药品质量检验研究院、广东省食品检验所。

主要起草人：林霖、张世伟、吴佳辉、王坤、杨国武、杨俊。