2007博士分子生物学进展考试题专题

第一篇：2007博士分子生物学进展考试题专题

分子生物学进展考试题

2007级博士研究生（基础）用

一、iPS细胞研究最近成为热点，并被《自然》和《科学》杂志评为2007年重大科学进展之一。试详细论述iPS细胞的原理、具体鉴定方法，并对其应用前景和存在的问题加以评论。

二、三、基因表达调控研究中，常用EMSA 和ChIP技术。试分别详细论述其原试详细论述蛋白质相互作用研究的方法原理，并给出具体事例。理、具体方法，并比较两者区别。

四、小分子RNA在基因表达调控中起到重要作用，试论述其作用原理并比较其异同。

五、六、试详细介绍你最近所读的一篇你最感兴趣的科学论文。Real-time PCR的应用越来越广泛。试论述其原理及如何应用。

第二篇：分子生物学技术在医学检验中的应用进展

分子生物学技术在医学检验中的应用进展

[摘要] 分子生物学技术是医学检验的重要诊疗手段。本文概述医学检验中常用的分子生物学技术，列举其在临床病原微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、免疫系统疾病诊断中的具体应用，分析分子生物学技术应用中应注意的问题，并对发展趋势进行预测。

[关键词] 分子生物学技术；医学检验；应用；

进展分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科，分子生物学技术即建立在核酸生化基础上的一类研究手段，现已广泛应用于医学检验中。研究内容也从DNA鉴定、扩展到核酸及表达产物分析，技术不断进步为原微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、免疫系统疾病诊断提供重要依据和创新思路。现就分子生物学技术在医学检验中的应用进展进行综述，试分析应注意的问题及预测发展趋势。

医学检验中常用的分子生物学技术概述

分子生物学技术的核心是聚合酶链反应(PCR)，能在最短的时间内扩增。由此衍生出新PCR技术，如原位PCR技术、实时定量PCR、链置换扩增技术、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技术、核酸探针技术、生物传感器、SELEX技术、循环核酸分析技术都极大的完善了检验技术，直接解释生命规律，在临床诊断和治疗中意义重大。

分子生物学技术在临床中的具体应用

2.1 病原微生物检验 PCR和生物芯片技术用于病原微生物检验术与传统的培养鉴定、免疫测定相比，其具有高的敏感性，较短的耗时和更广的适用范围[1]。PCR通过向反应管中加入特异性引物可同时鉴定出单种或多种病原体，即便存在大量死菌也能得到准确结果，不受混合标本和微生物生长时间的限制。生物芯片技术则以其更高的灵敏性和高效率，同时检测出上百种病原微生物，可用于快速查找样本的耐药基因指导临床用药。

2.2 肿瘤及遗传病诊断 研究证实肿瘤及遗传病几乎都存在着一定的基因缺陷，只要找到人体中与基因相互作用的结合点，从基因水平诊断就能准确诊断。通过基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突变，通过分子蛋白质组学、生物传感器和流式细胞术诊断肿瘤特异性标志物。在遗传病中，分子生物技术能识别患病家族基因存在的特定多态性，常用技术有DNA限制性片段长度多态性分析，单链构象多态性分析，荧光原位杂交染色体分析，酶基因调控和微阵列技术。

2.3 免疫系统疾病诊断 免疫系统疾病诊断关键是确定基因水平上的调控表达。如在人类免疫缺陷病毒的研究中，分子生物纳米技术即以抗体为基础，用免疫分析和磁性修饰的方法来检测免疫物质，通过酶、荧光剂、同位素把特异的抗体抗原与纳米磁性微球固定，既能自动检测人免疫缺陷病毒1型和2型抗体，为人类防治病毒性疾病提供了有力的武器。

分子生物学技术在检验应用的新进展

现阶段分子生物学新技术的发展方兴未艾，给人们提供了探索人类生命科学的工具，推动了检验学发展。分子生物技术最显著的医学成就是对遗产病中的致病基因的准确定位及克隆，早在1998年就完成了遗传性耳聋的基因克隆；2003年SARS肆虐时，科学家就研制出专门诊断该病的基因芯片；2004年后实现了用多重PCR技术对我国新生儿多发的地中海贫血、苯丙酮尿症、G6DP缺乏症的产前和病例诊断；近年来，遗传标记技术的进步，结合现有分子学研究技术，加速了遗传基因图谱的制作和相关疾病的基因检测和鉴定，从而为医学检验的加速发展提供了有效的载体。

存在问题及发展趋势

现阶段面临的问题主要是技术相对复杂和仪器要求太高、药品和反应盒昂贵等[2]，限制了临床推广。首先，合理选用检验项目的问题，分子生物学方法具有高特异性和高灵敏性，但临床中仍要根据实际需要选用经济合理的检验项目，如结核菌培养和涂片镜检就能达到目的，不必舍廉选贵，增加患者负担。其次，疾病诊断过度依赖检验结果问题，应将临床资料综合考虑，不能仅靠分子生物学技术检验结果就妄下诊断，忽略标本取样和检验过程中的操作不当及病程发展规律造成的假阳性或是假阴性，贻误病情。再者，上级部门管理不足问题，国家相关部门要担任监管的职责，参考国际惯例，制定符合我国医学检验现状的实验操作管理规章制度，严格培训检验人员，规范试剂的准入和仪器的管理，最大程度保证检验结果的可信度。

虽然分子生物技术在临床推广应用中存在着许多尚待解决的问题，但是它仍然显现出了快速发展的趋势。未来其发展会倾向于：①现有、仅停留在实验室的分子生物学技术逐步向临床实用型改进，降低实验投入、简化操作步骤，推进实验过程全自动化的实施降低人为因素对结果的影响，根据临床实际修正技术，提高检验的特异性和敏感性。②积极推进实验室建设，加大仪器和检验人员的培训投入，为分子生物学的临床应用提供必要的基础保障，以先进的、可持续性的实验检验手段为临床提供可靠的依据。

参考文献

[1] Yuregir OO,Sahin FI,Yilmaz Z,et al.Fluorescent in situ hybrid-ization studies in multiple myeloma[J].Hematology,2009,14(2):90-94.[2] 李鹏.现代分子生物学技术在医学检验中的应用[J].临床和实验医学杂志,2007,3(6):161.PCR在现代医学检验中的应用 关键词：医学检验应用PCR现代医学检验

王耿新 刘德亮 王志群 陈献业

山东省青岛市肿瘤医院 青岛 266042

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）又称体外基因扩增技术或 DNA 扩增技术。自 1985 年美国 PE-Cetus 公司的 K.B Mullis 等人首创了 PCR 技术之后，它以相当惊人的速度被广泛地应用于医学及分子生物学等各个领域。现今，PCR 技术已成为一种对标本中特定的 DNA 片段进行分析研究和检测鉴定的重要方法。近20 年来 PCR 技术在生物医学等各个研究领域和临床应用中发挥了重大的作用，在病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及治疗等方面都作出了相应的贡献。

1.PCR 技术的基本原理与特点 [1-2]

PCR 技术的基本原理是模仿 DNA 体内复制的机制，在体外进行扩增特异的 DNA 片段。它主要是由三个基本步骤组成的循环反应。首先是变性，用加热的方法使双链 DNA 解链成两股单链；其次是复性，用降温的办法使这两股单链按碱基互补的原则分别与加入的两条人工合成的寡聚核苷酸链（引物）结合成双链；最后是延伸，在合适的缓冲液、镁离子及脱氧核苷酸存在的条件下，用 DNA 聚合酶进行催化，按碱基配对的原则合成互补链。引物从 3 '端进行延伸，合成的方向为 5 '端（一条人工合成的引物）至 3 '端，从而合成与模板 DNA 结构相同的片段。重复上述三步骤，变性→复性→引物延伸的过程，经过约 30 个周期的循环（每三个步骤为一周期，约需 2-3 分钟），1-2 小时就能将所需基因扩增几百万倍，使极微量的所需 DNA 达到极易检测的水平。其扩增效率公式为： Y=（1+X）n，式中 Y 为扩增数目，X 为放大效率，n 为循环次数。

PCR 技术具有敏感性高、特异性强、操作简便、快速省时等特点。其灵敏度可达到 Pg 级，甚至达到 fg 级 [3] 水平，而被扩增的基因片段能与原基因片段保持不变。PCR 技术操作简便、快速而易掌握，并且对标本要求不高。用过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动 DNA 扩增仪，整个 PCR 过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，用极微量的粗制标本就可获取目的产物。

2.常用的几种 PCR 及主要用途 [4-5]

2.1 定量 PCR ：用于 mRNA 定量及转录水平的研究。

2.2 抗原捕获 PCR（AC-PCR）：用于病毒感染的检测。

2.3 不对称 PCR（Asymmetric PCR）：用于制备探针或测序。

2.4 彩色 PCR（CCA-PCR）“用于检测某些多型别病毒的混合感染。

2.5 原位逆转录 PCR（In Situ RT-PCR）：定位检测细胞中 RNA 病毒感染。

2.6 逆转录 PCR（RT-PCR）：用于克隆 cDNA、检测 RNA 病毒、cDNA 探针。

2.7 反向 PCR（inverted PCR）：用于扩增已知基因片段两侧的未知序列。

2.8 膜 PCR（membrane-bound PCR）：可去除污染的杂质或 PCR 产物残留，检测低丰度靶 DNA。

2.9 间接原位 PCR（Indirect In Situ PCR）：定位检测细胞中 DNA 病毒感染，是目前应用较广泛的一种原位 PCR 技术，其特异性比直接 PCR 强。

3.PCR 技术在医学检验中的地位

现代医学研究证明，人类疾病多数是直接或间接与基因有关 [6]，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等。在医学实验诊断中我们经历了生化和免疫诊断的发展过程，由于各类扩增技术的出现使我们进入了基因诊断的新时代并成就了现代意义基因诊断的崛起。这将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断，从本质上认识疾病和诊断疾病。在各类扩增技术中，PCR 的地位尤为突出。目前，全世界利用 PCR 技术诊断感染性疾病每年达几千万人次，其费用早已大幅下降，说明 PCR 有着巨大的潜在市场。美国临床检验标准化委员会于 1995 年颁布了关于感染性疾病分子诊断应用范围、条件和质量控制细则等准则文件 [7]。而国际临床化学学会于 1998 年又发布了关于分子扩增在临床诊断中应用的质量评估基础的文件并对 PCR 操作的各个环节进行了详细论述 [8]。由此可见，两个权威性文件也都肯定了 PCR 技术在医学检验方面的重要性。基因诊断可能将是以后的发展方向并作为疾病的常规诊断技术。

4.PCR 技术在医学检验中的应用

4.1 PCR 技术在肿瘤方面的应用

目前，肿瘤发病的分子机制尚不完全清楚。研究表明，人类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系。PCR 技术的肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。

据有关资料表明 [1，4] 前列腺癌、结肠癌和 Kaposi 肉瘤等与人巨细胞病毒（CMV）有关；鼻咽癌和 Burkitt 淋巴瘤与 EB 病毒有关；原发性肝癌与乙型肝炎病毒（HBV）有关；泌尿道肿瘤和食道肿瘤等与人乳头瘤病毒（HPV）有关。人类肿瘤病毒病因中较为重要的一类病毒是 HPV，其中大部分只与良性增生有关，只有 16、18、31、35、39 等十余型与恶性肿瘤关系密切。PCR 在检测 HPV，尤其是第 16、18 型有无感染，对子宫颈癌的早期诊断及预防有着显著的意义。

目前，已知肿瘤相关基因有上百多种，但较常见的是 ras 家族的 H-ras、K-ras 和 N-ras 三种癌基因。它们的结构相似，其表达产物是 P21 蛋白。在不同肿瘤中 ras 家族癌基因的 H-ras、K-ras 点突变多集中在第 12 和 61 号密码子上，而 N-ras 在第 13 号密码子上多发生突变。PCR 在癌基因的研究方面主要是 ras 基因与肿瘤的关系。现已查明与 ras 基因突变有关 [1，2，4，9，10] 的肿瘤有几十种。如：各种急性慢性白血病、精原细胞癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、结肠癌、子宫瘤等。Rb 基因 [11] 是人类最早（1986 年）发现的抑癌基因，其后又相继发现了 P53、WT1、NF1、DCC、MCC、APC、P16 和 P21 等抑癌基因。在遗传性视网膜母细胞瘤研究中发现位于 13 号染色体上 Rb 基因的缺失与癌变有关。在许多常见肿瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤中，常发现该基因失活 [11]。在对 P53 基因的研究中 [12-14] 发现该基因的突变和缺失是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤主要有子宫颈癌、肝癌、成骨肉瘤等。遗传学改变主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因发生突变、缺失、增加和易位等而导致了细胞癌变。PCR 不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估等。

近年，刚兴起的荧光定量逆转录（RT）-PCR [10] 在肿瘤诊断、治疗和微转移以及微小残留病灶检测等方面具有广泛的应用价值。研究表明，癌细胞或癌前期细胞在进入血液循环以后，通过定量 RT-PCR 检测外周血肿瘤特异性标志物 mRNA，可进行实体肿瘤的筛查，检测肿瘤术后及淋巴转移阴性的病人外周血肿瘤细胞的数量，以便估计肿瘤的复发和转移，制订合理的治疗方案。另外，定量 RT-PCR 还可用于肿瘤耐药基因（MDR1）[10] 表达水平检测，为临床筛选化疗药物及治疗方法提供依据。

4.2 PCR 技术在遗传病方面的应用

PCR 技术首次临床应用 [10] 就是从检测镰状细胞和 β-地中海贫血的基因突变开始的。十几年来，该技术在遗传病诊断的临床应用方面获得了极大的成功。它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变，如倒位、缺失 / 插入、动态突变、部分高发的点突变及表达量的异常等都可通过基因分析直接检测用于临床进行诊断，像地中海贫血、血友病、杜氏肌营养不良症、脆 X 综合征、苯丙酮尿症等这些遗传性疾病。PCR 在遗传病诊断及遗传病预防与产前基因诊断方面具有明显的应用价值，PCR 产物直接测序已成为检测遗传病基因突变的常用方法。另外，PCR 在鉴定编码抗生素耐药性基因 [10]，尤其是在细菌不携带同源性序列且取单个菌落进行 PCR 扩增时，具有较高的特异性和敏感性。

4.3 PCR 技术在感染性疾病方面的应用 目前 PCR 在医学检验中对感染性疾病的诊断 [10，15] 极具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以检测到任何有限的病原体。一般实验室可检出 10-100 个基因拷贝，而目前，病原体抗原检测方法一般需要 10 5 ～ 10 7 个病原体才能检测到。PCR 技术的运用解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。再者，抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染时，也需要用 PCR 方法来确定。另外，病原体感染后的发病时间和病情轻重均与病原体数量有关。如艾滋病（AIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根据 HIV 检测的含量预知发病的时间。因为 AIDS 潜伏期的长短和临床症状的轻重与血液中的病毒量呈显著相关。在其它病毒性疾病中也多半存在类似情况，这均需 PCR 来定量说明。

PCR 在 HBV 定量研究中表明，HBV 载量与肝炎的发生、发展、预后以及与药物疗效有关，并证明定量 PCR 是鉴别 HBV 感染各期的良好工具。该技术能有效地确定血清 HBeAg 转阴和非活动性携带者病人的 HBV DNA 水平，而常规杂交法则对这些低病毒血症的 HBV DNA 探测不到。在抗病毒治疗中，通过定量 PCR 检测 HBV 的载量，来观察拉咪呋啶及多种联合用药治疗慢性乙型肝炎的疗效具有指导意义。

PCR 对某些传染性疾病疫苗接种后感染的鉴别也是极为重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接种后感染的病例时有发生，是疫苗引起的还是野生型腮腺炎病毒引起的，这就需要一种行之有效的方法来进行鉴别，以往的血清学、病毒培养及探针杂交等方法都很难做到。

过去，对结核病等其他分支杆菌病的诊断方法虽然很多，但均不够理想。简便易行的方法经常查不到抗酸杆菌，也无法鉴别结核杆菌与其他分支杆菌。用分支杆菌培养的方法且阳性率较低又耗时，而麻风杆菌在体外又不能培养，主要靠感染组织的涂片或切片镜检。其他方法，如血清学、气相色谱等方法的敏感性及特异性都不够理想，PCR 技术的运用使上述问题得到了解决。还有 PCR 技术在技术性病监控和性病病原体的检测方面也正在扩大，并列为监控手段和作为检测的金标准。

5.PCR 技术在医学检验应用中的问题 5.1 假阳性

通常 PCR 在医学检验应用中所面临的问题之一是扩增产物污染带来的假阳性，而实验室污染又是假阳性的主要因素。只要实验室被扩增产物污染，扩增片段随时都可能污染新的样本并又被同一 PCR 反应体系扩增出来而产生假阳性。解决的根本措施就是在封闭状态下进行扩增和产物分析。近年发展了一种荧光定量 PCR 技术，从根本上解决了 PCR 扩增产物污染和不能定量的问题。该技术把基因扩增 PCR、分子杂交和光化学融为一体，实现了对 PCR 扩增产物进行全过程的封闭，并进行实时动态检测和自动分析结果，进一步提高了其特异性。由于造成假阳性的因素相对单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。

5.2 假阴性

PCR 假阴性的原因相对较为复杂，主要包括有仪器设备的质量、试剂开壳剂和操作问题、PCR 产物的电泳检测时间及有关 PCR 反应的关键环节等。PCR 仪本身的质量问题能使扩增效率下降或造成非特异性扩增而出现假阴性或假阳性。离心机的质量问题或使用不正确，可造成离心标本模板不能分离而产生假阴性。试剂开壳剂和操作问题造成标本 DNA 没有暴露出来，致使扩增无法进行而导致假阴性。PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，大于 48h 后带型不规则甚致消失不出现扩增条带而程现假阴性。PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量及 PCR 循环条件等，在这些环节中操作不当都可引起假阴性。另外，Mg 2+ 浓度和物理因素变性等对 PCR 扩增效率影响也很大。Mg 2+ 浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量。而变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率，最终都可导致 PCR 扩增失败。还有靶序列变异使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增也不会成功。

6.PCR 技术的应用前景 自从 PCR 技术诞生以来，随着其深入不断的发展与完善，许多与其相关的新类型及改良的新方法在不断的涌现，这些派生出的新类型和新方法解决了以往传统 PCR 的瓶颈问题。虽然，PCR 可对基因分析直接检测用于临床进行诊断，但大部分基因突变还是难以直接检测。近年来，分子诊断技术最大突破就是集扩增、检测和靶定量于一体的实时荧光 PCR 技术的问世。该技术的出现，对基因检测和基因分型的应用范围将进一步扩大，为 PCR 的临床应用带来曙光。因此，PCR 技术将有极大的发展空间和广泛的应用前景，它将对肿瘤学、遗传学、免疫学、微生物学、寄生虫学和基因治疗等进一步研究及临床应用起着积极重要的作用。在现代医学检验中，PCR 的应用将更加广泛和深入。相信在不久的将来，随着 PCR 技术的更进一步完善，它将作为常规检验方法进行全面普及，发挥更大的作用，为全人类健康做出更大的贡献。

参考文献

1.杨道理 , 王宝成主编.DNA 扩增技术与医学应用.济南：山东科学技术出版社.1992,51-54,283,396.2.郭永军.聚合酶链式反应在肿瘤研究中的应用.国外医学肿瘤分册.1991,18(1):1-3.3.陈志杰主编.医学检验新技术.济南 : 山东科学技术出版社.1993 ： 544.4.陈意生 , 史景泉主编.肿瘤分子细胞生物学.北京：人民军医出版社.2002 ： 190-192,270,287-288.5.杨占秋 , 刘建军 , 肖红 , 等主编.诊断与实验病毒学.郑州 : 郑州大学出版社.2002:167-169.6.T.D.盖莱哈特 , F.S.柯林斯 , D.金斯伯格主编.孙开来主译.医学遗传学原理.北京 : 科学出版社.2001:92-116.7.Enns RK, Bromley SE, Day SP, et al.Molecular diagnostic methods for infectious diseases;approved guideline.Natl Commit Clin Lab Stand, 1995:1-10.8.Neumaier M, Braun A, Wagener C.Fundamentals of quiality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics(IFCC document).Clin Chem, 1998,44:12-26.9.王俊茹 , 邓国仁 , 刘为俊.ras 基因突变与人类肿瘤.癌症.1993,12(1):82-83.10.卢圣栋主编.生物技术与疾病诊断——兼论人类基因治疗.北京：化学工业出版社.2002 ： 83-98,117,142.11.顾健人 , 曹雪涛 , 主编.基因治疗.北京：科学出版社.2001:120-121.12.May Wong, Jack Gruber.Viral Interactions with the P53 Gene in Human Cancer.Journal of the National Cancer Institute, 1994,86(3):177.13.李贷宗 , 曹宇清 , 何丽萍 , 等.人原发性肝癌 P53 基因缺失和突变.肿瘤.1991,11(5):195.14.陈竺 , 强伯勤 , 方福德主编.基因组科学与人类疾病.北京：科学出版社.2001 ： 176.15.Tang YW, Procop GW.Persing DH.Molecular diagnostics of infectious diseases.Clin Chem.1997,43:2021-2038.

第三篇：在分子生物学博士与地理信息学博士婚礼上的致辞(原创)

在分子生物学博士与地理信息学博士婚礼上的致辞

尊敬的各位领导、各位来宾，女士们、先生们：

大家中午好！欢迎各位亲朋好友参加李海峰先生、王慧敏小姐的婚礼，受新娘父母的委托，由我担任本场婚礼的司仪。

首先，我们为这一对新人的结合感到由衷的骄傲，大家知道：新郎李海峰先生是武汉大学的博士研究生，目前在广州无限极博士后流动站从事研究工作；新娘王慧敏小姐是中国地质大学的硕士研究生，目前在武汉大学攻读博士学位。在座的亲朋好友当中，也有很多硕士、博士研究生，可以毫不夸张的说，两位是江汉假日酒店开业以来学历最高的一对新人，大家的到来使这里蓬荜生辉，华堂添彩。

其次，我们这一对新人的结合可以说是佳偶天成，大家知道：新郎李海峰先生所研究的专业为分子生物学（molecular biology science），基于微观的角度，从研究分子的结构和功能进而阐明生命现象的本质；新娘王慧敏小姐所研究的专业为地理信息系统（geographic information system），基于宏观的角度，运用信息技术和数据分析的方法研究国家地理。一个是微观世界的分子，一个是宏观世界的地理，大家说这样的结合是不是一种绝配！

最后，为我们今天这一对新人的结合送上希望和祝福：

一是希望你们孝顺父母、尊重师长、关爱他人，运用作用力与反作用力的原理，用等量的爱回报父母师长对你们的馈赠；遵循能量守恒的原则，将大家的给予化成爱的分子，回报社会。

二是希望你们处理好学业、工作和生活的关系，对于你们而言学业和工作就像是银河系，而日常生活像是太阳系，当太阳系在银河系中运转的时候，它自身的运转也一刻没有停歇，所以不要为了科学研究而忘却生活。

三是希望你们正确对待爱情和婚姻的转变，爱因斯坦的关于相对论曾经有一个注明的论断，“到底是鸡过马路，还是马路过鸡，这取决于你的参考坐标。”其实，他想说的是，很多事情其实都不是非得分出一个对错，这也许就是婚姻的真谛。

最后，我还要由衷地祝福两位新人！愿你们的爱情充满正能量，在今后的生活中不断地发光、发热。同时也衷心地祝福各位来宾，愿大家万事如意，幸福安康！

第四篇：协和医科大学2004年分子生物学(博士入学考试试题 回忆版)

协和医科大学2004年分子生物学（博士）

1.名解:

同工酶 染色体 染色质 核基质 转化 密码子的偏嗜性 基因簇

2.简答

为什么核酸和蛋白都是有方向的?

信号转导的cAMP通路

什么是内切酶的星号活性

3.判断对错,说明理由

关于乳糖操纵子的4.论述

给定一个cDNA序列,如何表达,纯化到蛋白质

5.填空

协和生化的老主任是谁(这道题好变态)

谁用什么实验证明了核酸是遗传物质

可以磷酸化的氨基酸是哪三个

带苯环的氨基酸是哪三个

DNA在多少nm有最大的光吸收,为什么?

第五篇：分子生物学

分子生物技术在微生物鉴定中的应用

摘要：微生物多样性是生物多样性的重要组成部分。由于微生物和 动、植物 相比, 存在着多种显著差异。而传统的基于微生物培养与纯种分离的技术具有很大的局限性，分子生物学及其有关技术的长足进展及其在为生物中的使用, 使微生物的研究进入了分子的阶段。

关键词：16SrDNA PCR 温度梯度电泳 变性梯度凝胶电泳 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物: 细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒, 是生物多样性的重要组成部分。此外, 微生物多样性与其他生物类群相比有许多独特之处, 包括: 1)生存环境多样;2)生长、繁殖速度多样;3)营养、代谢类型多样;4)生活方式多样。因而, 微生物多样性的研究无论对于生态系统功能的完整理解, 还是对于微生物资源的利用和开发都具有特殊重要的意义[1]。微生物作为生态系统中极重要的一员, 对动植物的生长，生态系统中的能流和物质循环及环境污染物的降解和解毒等方面起着重要作用并且与人的生活健康息息相关。随着微生物的不断发现及研究，传统微生物技术越来越不能满足其发展的需要，最主要的不足是丢失了微生物的多样性, 许多报道都指出, 在自然环境中有相当多的菌种(约90%-99%)用传统方法无法培养出来[2].这对于微生物基因组学研究来说是很不利的.，导致研究的片面性并且效率低下。而分子生物学技术则避开了传统微生物培养分离的环节, 而是采取直接从样品中抽取所含微生物总DNA, 然后通过16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多种分子生物学研究手段, 对直接提取的总DNA进行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的种类和含量, 以研究样品中微生物的实际组成, 同时可以利用直接提取得到的总DNA 建立基因文库, 并从中筛选有用的基因。由于是直接从样品中提取总DNA, 中间没有任何筛选性的过程, 因此, 所得DNA 能够准确地反映样品中微生物的实际情况, 避免了传统培养方法不能真实反映微生态实际情况的缺点, 也不会丢失样品中存在的任何微生物,同时, 这种方法能够很容易、大批量地取得同一环境下乃至不同环境下的不同微生物的同源基因, 为微生物比较基因组学研究开辟了道路.此外, 用直接提取的总DNA 构建的基因文库, 包含了大量以前因为无法培养而不能获得的微生物基因, 从这些文库中发现全新的具有巨大应用价值的抗生素类、酶类及其他生物活性物质的基因应该是非常有潜力的。1．16SrRNA比较测序

16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因，长度约1500bp，存在于所有的原核生物的基因组中，由多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异[3]。2.PCR近年来,对环境样品总DNA 进行PCR 扩增, 推动了利用分子标记技术研究微生物的多样性。PCR技术是美国letus公司人类遗传研究室的科学家与1983年发明的一种在体外快速扩增特异基因或DNA 序列的方法, 其目的是将极微量DNA大量扩增。该技术模仿生物体内DNA 的复制过程,首先使DNA 变性, 两条链解开;然后使引物模板退火, 二者碱基配对;耐高温的Taq DNA 聚合酶以4种dNTP为底物, 在引物的引导下合成与模板链互补的DNA 新链[4]。PCR 技术可在体外快速扩增DNA, 具有快速、简便、灵敏度高的特点。当然常规 PCR技术也存在很多的问题，如出现假阳性、形成引物二聚体、传统的PCR技术一次扩增只能检测一种微生物、RNA病毒的PCR检测操作繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果等.为了弥补上面这些不足，一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践，如热启动PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA 多态性扩增（RAPD）、限制性长度多态性分析（RFLP）、实时荧光PCR（real-time PCR）等[5]。3.电泳分离及其显示方法

除过我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE 分离)银染方法外, 还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记, 如变性梯度凝胶电泳(DGGE), 可分离长度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。对于特异性引物PCR 扩增的环境微生物的16SrRNA 基因, 一般的电泳很难将序列不同的片段分开。DGGE胶在聚丙烯酰氨胶中添加了线性梯度的变性剂, 可以形成从低到高的线性梯度, 在一定温度下, 同一浓度的变性剂中, 不同序列的产物，其部分解链程度不同。DNA 解链程度不同决定其电泳的迁移率, 结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下, 该技术能分辨一个碱基对。DGGE 技术在微生物群落结构 的研究、微生物种群的动态分析、富集培养以及分离物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到广泛应用[6]。

温度梯度电泳(TGGE)是利用不同构象的分子具有不同的变 性温度来进行分离, 最先应用于DNA /RNA 的分子构象分析和序列变异分析, 是一种新出现的检测点突变的电泳技术, 其最大特点上具有高分辨能力。单链构象多态性(SSCP)也是根据不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大, 结果不同序列的DNA 片段在凝胶上得以高分辨率的分离。基因芯片可分为cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因组芯片。在一定条件下, 载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记, 在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号[7]。

分子生物学技术在环境微生物研究中的应用中rRNA 技术提供了一种摆脱传统的纯种培养方法而鉴定环境微生的途径,并已被广泛应用于微生物的各个领域。虽然当前,标准rRNA 技术的灵敏度还难以检测到低丰度的(低于1/ 1 000)在群落中仅占很小比例的微生物种类, 从而使之在微生物生态以及环境学上的应用受到很大的限制。然而, rRNA 技术与其它的分子技术以及特别是与传统的纯种培养方法相结合, 具备分析微生物多样性的巨大潜力。随着这些新的分子方法的不断改进以及rRNA 数据库中序列信息的不断增加, 我们能探知更多的未知的微生物世界。

参考文献：

[1]杨永华，姚健.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用[J].生物多样性，2000 8(3):337-342.[2]李 红,周友兵,陈炳耀,胡锦矗.分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用[J].河北大学学报(自然版),2003 12(23).[3]朱诗应，戚中田.１６ＳｒＤＮＡ扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用[J].微生物与感染,2013 8(2):104-109.[4，7] 高小朋, 张欠欠, 任桂梅.分子生物学技术在环境微生物研究中的应用[J].延安大学学报(自然科学版),2008 9(27)：27-45.[5] 路则宝，白现广。分子生物学技术在微生物检验中的应用研究进展[J].红河学院学报，2013 4（1）38-46.[6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技术在微生物鉴定中的应用[J].湖北生态工程职业技术学院学报，2006 1（4）：35-45.