酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮（共5篇）

第一篇：酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮

酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮代谢物

摘要建立养殖虾类中 AOZ残留 ELISA筛选方法。方法: 酸性条件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去杂质后进行 ELISA分析。结果: 方法最低检测限为 013 Lg/kg, 向样品中添加浓度为 015、110和 310Lg/kg3个梯度标准品溶液时,平均回收率范围为 9017% ~ 9519%, RSD 为 4124% ~ 5142%。结论: 实验证明该方法适合养殖虾类中 AOZ残留筛选。

关键词：虾肉;呋喃唑酮代谢物;ELISA

一、前言

呋喃唑酮（FZD）,又名痢特灵,是一种广谱抗菌药物，属于硝基呋喃类药物，是人工合成的化学药。常被掺放在饲料中，用于水产品养殖传染病的预防与治疗[1]。药代动力学研究表明，呋喃唑酮在动物体内的代谢非常快，现已明确此类抗生素的原型在体内 4 d 后，就已完全分解成其代谢物，所以分析呋喃唑酮时，只能分析其代谢物[2]。经研究表明，呋喃唑酮的代谢物中有相当数量是以其完整侧链 3-氨基-2-恶唑烷酮即 AOZ 与蛋白结合的残留物形式存在, AOZ 进一步代谢可产生具致癌、致突变作用的羟乙基肼[3]，因此检测呋喃唑酮代谢物(AOZ)的残留更具有现实意义。呋喃唑酮在畜产品和水产品中的残留，通过食物链传递给人类,会使人体受到损害。另外,其作为人畜共用药，长期微量摄入易使人体产生抗药性，导致呋喃唑酮药物失去医疗功效[4]。

1990 年 7 月欧盟颁布 2377/90/EEC 条例，将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为 A 类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为 1.0 μg/kg。由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自1995 年起欧盟、日本、美国等都开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用，并严格执行对输入的食用鱼，虾及禽类进行残留检测[5]。同许多国家一样，我国农业部制订的 NY5070-2002《无公害食品水产品中鱼药残留限量》及 GB18406.4-2001《无公害水产品安全要求》规定，水产品中不得检出呋喃唑酮，同时禁 止在饲料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中残留的监测方法主要有高效液相色谱法[7-8]、酶联免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶联免疫法已受到广泛重视。本试验主要 使用酶联免疫法对出口虾中呋喃唑酮代谢物AOZ 的残留做快速检测。

福建省诏安县海利水产有限公司，是一家集水产品加工、销售、研究、开发和养殖于一体的大型出口企业。该公司于2005年引进投建，厂房和生产布局按照《出口食品生产企业卫生注册登记管理规定》和美国FDA法规及欧盟指令进行设计建造，厂区占地面积八万平方米，全封闭配套中央空调的水产加工车间二万平方米，生产车间配套高效臭氧杀菌设施，制冷水机和大型制冰机等各种先进加工设备，冻库储存能力达6000吨，同时配套建设大型对虾养殖场及虾苗孵化场，拥有一支高素质员工队伍，年加工生产水产品15000吨以上，产品近二十种，主要有冻生虾、冻熟虾、冻面包虾、寿司虾、冻鱿鱼、冻罗非鱼等。公司秉承共同发展的目标，不断完善质量管理体系，执着追求品质,先后获得了《卫生注册证书》、《输美水产品HACCP验证证书》，2005年11月通过了BRC认证，2006年1月通过了ISO9001认证，2008年通过了欧盟相关质量认证，产品获得了国外消费者的肯定和喜欢，远销日本、美国、加拿大、墨西哥和香港等国家和地区，在国外赢得了市场。公司自建成投产以来，企业迅速发展壮大。

1材料与方法

1.1

样品

均来自福建省海利水产有限公司。

1.2

主要仪器及设备

MK3 型酶标仪: Thermo 公司；Scientz-10 型均质机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 电子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；4K15 型高速冷冻离心机：Sigma公司；HH-w600s 恒温水箱：山东鄄城新科教学仪器厂；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。

1.3

试剂与溶液

呋喃唑酮代谢产物-AOZ 试剂盒：北京望尔生物技术有限公司；灵敏度为 0.125 μg/kg，包括：AOZ 标准溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、浓缩缓冲液、浓缩提取/洗涤液、衍生试剂、浓缩酶标记物、底物溶液、反应终止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。

1.4方法

1.4.1

样品处理

虾去头去壳，取可食用部分，制成均质物。

1.4.2

样品制备

1）称取 1 g 已均质的样品于 50 mL 离心管中，依次加入 4 mL 超纯水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生试剂，漩涡振荡 1 min。置 37 ℃的恒温培养箱中温育，静置过夜（约 16 h）。

2）加入 5 mL 原倍缓冲液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振荡混合约 1 min。

3）离心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯层）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮气吹干。

4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先将残留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振荡 1 min。

5）将玻璃试管置于 80℃～100℃热水浴中约 3min，以减少水相与有机相间的乳化现象。6）离心 10 min（3 000 r/min），吸去上层液（正己烷），弃掉，再吸取下层液（水层）备用。

1.4.3测定

1）将 AOZ 试剂盒从冰箱中拿出，回温至室温。

2）取出相应数量的微孔，各个标准液和待测样品各做 2 个平行样，做好记录。

3）于适当的微孔中分别加入 50 μL 标准溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。

4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前处理的样品溶液。

5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀释的酶标记物。

6）轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温（25 ℃）下避光静置温育 50 min。

7）微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗 3 次。

8）最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，轻敲盘子四周，使其充分混合。

10）于室温（25 ℃）下避光静置温育 30 min。

11）于每一微孔中加入 100 μL 反应终止液。

12）用酶标仪于波长 450 nm 下判读。

1.5

数据处理

1）计算（B/B0）×100 值。用样品和标准溶液吸光度值（B）除以零标准吸光度值（B0）再乘以 100。

2）以（B/B0）×100 值为纵坐标，以样品浓度的对数值为横坐标，做标准对数曲线。

3）根据每个样品的 B/B0值就可以从曲线上读出相对应样品的浓度

2结果

2.1

标准曲线的绘制

AOZ 标准品的 ELISA 检测结果见表 1。

2.4

试验过程中的注意事项

1）A回温试剂（20℃-24℃）。B恒温孵育，避免光线照射。

2）、将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。

3）加入50ul标准或处理好的样品液到各自的微孔中，每个孔加入样品或标准时注意更换移液器的吸头。

4)加入50ul酶标记物溶液（红帽）到每一个微孔底部，充分混合。

5)加入50ul抗体溶液（黑帽）到每一个微孔底部充分混合，在室温孵育1小时，覆盖上薄膜。

6)倒出孔中的流体将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250ul样品洗涤缓冲液充入孔中，重复两次。

7)加入100ul基质/发色剂到每一微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15分钟。

8）加入100ul反应终止液到每一微孔中，混合好在450nm处测量吸光值以空气为空白，必须在加入停止液后60分钟内读取吸光值。

9）试剂盒内容物要完全回稳后再进行操作，否则，会出现吸光值偏低或没有吸光值。

10）温浴时若室温太低或太高，请适当延长或缩短温浴时间，或直接在恒温培养箱中进行。

11）加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

12）加样和洗板过程中，要避免微孔间的相互污染。

13）整个试验过程中，勿使微孔干燥。

结论

本试验用酶联免疫法检测了海利水产有限公司中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的残留状况，结果表明绝大多数的水产品符合规定，只有极少数部分有残留。用酶联免疫法对虾肉呋喃唑酮代谢物 AOZ 残留进行测定，操作简易，不需要复杂的仪器设备，样品预处理简单，作为一种快速筛选手段，在食品工业中有着广阔的推广应用前景，尤其在水产品出口企业中，但酶联免疫试剂盒的价格将是最大的制约因素。

参考文献：

[1] 景立新,孙武平,杨钦德,等.分光光度法快速测定海虾中呋喃唑酮残留量[J].光谱实验室，2006(5)：547-549

[2] 周新,张欣祥,王磊,等.UPLC-MS/MS 测定鱼干中的呋喃唑酮代谢物[J].分析测试学报,2007,26(9):262-263

[3]许蓓,徐志祥,王凤侠,等.动物性食品中呋喃唑酮代谢物酶联免疫检测方法的研究[J].食品研究与开发,2007,28(12):145-148

[4]罗杰,李健.呋喃唑酮间接竞争 ELISA(ciELISA)检测法的建立[J].中国海洋大学学报,2005,3,35(20):213-218

[5]许春兰,院榕生,刘小根,等.酶联技术在水产品中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的检测中的应用

[J].食品研究与开发,2007,28(5):124-126

[6]吴富忠, 欧阳立群.水产品中呋喃唑酮、呋喃西林药物残留的HPLC 法测定[J].中国卫生检验杂志,2006,16(7):812-813

[7]艾晓辉，刘长征，罗玉霜，等.水产品中呋喃唑酮含量的高效液相色谱检测法[J].淡水渔业，2003，33(1)：8-10

[8]于慧娟，蔡友穷，毕士川，等.高效液相色谱法测定水产品中呋喃唑酮的残留量[J].色谱，2005，23(1)：114

[9] 沈美罗,宋红波,耿雪冰，等.酶联免疫法测定水产品中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的残留[J].水产学报，2006，30(4)：520-524

[10] 焦更生，曹会兰.原子吸收法间接测定呋喃唑酮[J].分析试验室,2006,25(8):88-90

第二篇：酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则

附件1

酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则

一、前言

本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。

本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围

本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。

三、基本要求

（一）基本原则

1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。— 2 — 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。

3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

（二）原材料质量控制 1.主要生物原料

与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：（1）外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生

— 3 — 物原料应具备相应外观标准。

（2）纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳，一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位臵。

（3）蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其他适宜的方法进行检测。

（4）效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

（5）功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

2.生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。建议作以下检验：

（1）牛血清或羊血清

外 观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物。无菌试验：将血清直接37℃放臵7天，明亮处观察，不得出现混浊或— 4 — 沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化钠溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在1826℃时，溶解时间应≤15分钟，pH值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲法，其标准为≥95％。

总蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。（3）酪蛋白：

应符合生产所需的质量标准。（4）标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不能出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。3.化学原材料

化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材

— 5 — 料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。

4.其他物料（1）酶标板 ①外观

明亮处用肉眼观察板条的外观质量，如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。②吸附能力和精密性 采用合适的方法进行检验。

一般用一定浓度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，使用酶标仪读数，计算CV值。CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％，批间CV≤10％。

（2）液体试剂装量瓶

包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。

（3）其他材料

包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。— 6 — 5.企业质控品

企业质控品一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性、钩状效应（hook效应）等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。

（三）试剂盒各组分的生产

酶联免疫法检测试剂主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

1.各种工作液的配制

酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性、阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应具有量值溯源性。

应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的

— 7 — 功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、pH值等；酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。

2.包被酶标反应板

包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数量、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。

选择经检验合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内臵干燥剂），保存于28℃。

应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH值）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。

3.分装和包装

样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行过滤后再分装，分装量的误差应小于5%。

分装及包装均应按照相应的标准操作规程要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。

（四）质量控制 1.半成品质量控制（1）半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各— 8 — 组分，作号标记、待检。

（2）半成品检验

根据试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验。半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

检验指标一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应的质量标准要求。对于精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂CV不得高于20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和定量质控品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，28℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

2.成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批酶联免疫类检测试剂的试生产量应满足工艺研究、分析性能验证、稳定性研究、临床试验、自测及注册检验等各阶段所需样品量的要求。

（1）成品检验

成品检验时，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品，并达到相应质量要求。若该诊断试剂没有国家

— 9 — 标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（2）稳定性试验

在批放行前，每一批试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

四、名词解释

酶联免疫法：是指在酶标板上包被特定的抗原（和/或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（和/或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体和/或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体和/或抗原的存在。

五、参考文献：

1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社

— 10 —

第三篇：酶联免疫法检测试剂主要原材料、生产工艺及质量控制注册技术审查指导原则(报批稿)

酶联免疫法检测试剂主要原材料、生产工艺及质量控制注册技术审查指导原则（报批稿）

2010-11-09 01:27

酶联免疫法检测试剂主要原材料、生产工艺及 质量控制注册技术审查指导原则（报批稿）

一、前言

本指导原则的主要目的是规范申请人对酶联免疫类检测试剂的主要原材料研究资料、生产工艺及反应体系研究资料的准备，并对产品质量控制提出指导性技术要求。

本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围 本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查，其它酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。

三、基本要求

（一）基本原则

1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。

2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。

3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

（二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：（1）外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

（2）纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳，一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位臵。

（3）蛋白浓度 蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其他适宜的方法进行检测。

（4）效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

（5）功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

2.生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。建议作以下检验：

（1）牛血清或羊血清

外 观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物 无菌试验：将血清直接37℃放臵7天，明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量≥32mg/ml。球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在1826℃时，溶解时间应≤15分钟，pH值应为6.57.1。

总蛋白含量：用双缩脲法，其标准为≥95％。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。

（3）酪蛋白：

应符合生产所需的质量标准。（4）标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不能出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。3.化学原材料

化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质量检验报告。

4.其他物料（1）酶标板 ①外观

明亮处用肉眼观察板条的外观质量，如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。

②吸附能力和精密性 采用合适的方法进行检验。

一般用一定浓度的正常人IgG包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，使用酶标仪读数，计算CV值。CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％，批间CV≤10％。

（2）液体试剂装量瓶

包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。

（3）其他材料

包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。

5.企业质控品

企业质控品一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性、hook效应等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。

（三）试剂盒各组分的生产

酶联免疫法检测试剂主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。1.各种工作液的配制

酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性、阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应具有量值溯源性。

应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、pH值等；酶作用底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。

2.包被酶标反应板

包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数量、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。

选择经检验合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内臵干燥剂），保存于28℃。

应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH值）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。

3.分装和包装

样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行过滤后再分装，分装量的误差应小于5%。

分装及包装均应按照相应的SOP要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。

（四）质量控制 1.半成品质量控制（1）半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。

（2）半成品检验

根据试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验。半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

检验指标一般包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应的质量标准要求。对于精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂CV不得高于20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和校准品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，28℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

2.成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批酶联免疫诊断试剂报批批量应至少为10000人份。（1）成品检验

成品检验时，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品，并达到相应质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（2）稳定性试验

在批放行前，每一批试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

四、名词解释

酶联免疫法：是指在酶标板上包被特定的抗原（和/或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（和/或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体和/或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体和/或抗原的存在。

五、参考文献：

1.《中国生物制品规程》（2000年版），化学工业出版社

第四篇：食品中玉米赤霉烯酮的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201913）

附件13

食品中玉米赤霉烯酮快速检测

胶体金免疫层析法

(KJ201913)

1.范围

本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法。

本标准适用玉米、小麦及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速筛选测定。

第一法

比色法

2.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（T线）与控制线（C线）颜色深浅的比较，对样品中玉米赤霉烯酮进行结果判定。

3.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T

6682规定的二级水。

3.1.试剂

3.1.1.乙腈。

3.1.2.甲醇+水（7+3，体积比）。

3.1.3.稀释缓冲液（胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置）。

3.2.参考物质

玉米赤霉烯酮的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。

表1

玉米赤霉烯酮参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

玉米赤霉烯酮

Zearalenone

17924-92-4

C18H22O5

318.36

注：或等同可溯源物质。

3.3.标准溶液的配制

3.3.1.标准储备液：称取适量标准品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成浓度为100

μg/mL的标准储备液。﹣18

℃避光保存，有效期6个月。

3.3.2.标准工作液：准确量取标准储备液（100

μg/mL）（3.3.1）100

μL，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1

μ稀/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液，2

℃～8

℃避光保存，有效期1个月。

3.4.材料

玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为玉米、小麦及其碾磨加工品。

4.仪器和设备

4.1.移液器：100

μL、200

μL、1

mL和5

mL。

4.2.旋涡混合器。

4.3.离心机。

4.4.电子天平：感量为0.01

g。

5.环境条件

环境温度：20

℃～30

℃。

空气相对湿度：最佳测定湿度45

%～65

%。若湿度低于45

%，相应延长待测液-试纸条反应时间，以质控实验为准；若湿度为65

%～80

%，微孔与试纸条拆开后立即使用，避免微孔与试纸条长时间暴露在空气中受潮；避免在湿度80

%以上湿度进行实验。

6.分析步骤

6.1.试样制备

按GB

5491扦取的样品充分碾磨或粉碎混匀，过40目筛。

6.2.提取

准确称取试样5.0

g（精确至0.01

g）于50

mL离心管中，加入20

mL

甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3

min，离心分层或静置分层，上清液备用。

准确移取0.8

mL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5

mL离心管中，加入25

μL上清液，混匀，待检。

6.3.测定步骤

依检验所需，取相应数量的金标微孔和试纸条，做好标记。吸取待检液200

μL于金标微孔中，抽吸至孔底的紫红色颗粒完全溶解，孵育10

min。将试纸条插入金标微孔中，反应3

min～5

min。

从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色情况，进行结果判定。（若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验环境温度。）

7.质控试验

每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。

7.1.空白试验

7.1.1.试剂空白试验：除不称取试样外，均按6.2和6.3所述步骤操作。

7.1.2.基质空白试验：准确称取空白试样，按6.2和6.3所述步骤操作。

7.2.阳性质控试验

准确称取玉米赤霉烯酮含量为60

μg/kg的质控样，按6.2和6.3步骤操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60

μg/kg，按6.2和6.3步骤操作。

8.结果判定

通过对比控制C线和检测T线的颜色深浅进行结果判定。

8.1.无效结果

无论样品中有无玉米赤霉烯酮存在，控制C线均会出现一条紫红色条带。若C线未显色，表明操作不正确或试纸条已失效，检测结果无效（见图1）。

无效

图1

试纸条目视判定图

8.2.阳性结果

控制C线显色，检测T线显色比C线浅或者没有颜色，判定为阳性（见图2）。

8.3.阴性结果

控制C线显色，检测T线显色比C线深或者一致，判定为阴性（见图2）。

比色法

图2

试纸条目视判定图

8.4.质控试验要求

空白试验结果应为阴性，阳性质控试验结果应为阳性。

第二法

消线法

9.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过T线显色与否进行结果判定。

10.试剂及材料

同3。

11.仪器和设备

同4。

12.环境条件

环境温度：10

℃～40

℃。

空气相对湿度：同5。

13.分析步骤

13.1.试样制备

同6.1。

13.2.提取

准确称取试样5.0

g（精确至0.01

g）于50

mL离心管中，加入12.5

mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3

min，离心分层或静置分层，上清液备用。

准确移取400

μL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5

mL离心管中，加入上清液(小麦50

μL，玉米80

μL），混匀，待测。

13.3.测定步骤

同6.3。

14.质控试验

每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。

14.1.空白试验

14.1.1.试剂空白试验：除不称取试样外，均按13.2和13.3所述步骤操作。

14.1.2.基质空白试验：准确称取空白试样，按13.2和13.3所述步骤操作。

14.2.阳性质控试验

准确称取玉米赤霉烯酮含量为60

μg/kg的质控样，按13.2和13.3步骤操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60

μg/kg，按13.2和13.3步骤操作。

15.结果判定

通过观察检测T线显色与否进行结果判定。

15.1.无效

同8.1

15.2.阳性结果

控制C线显色，检测T线不显色，判定为阳性（见图3）。

15.3.阴性结果

控制C线显色，检测T线显色，判定为阴性（见图3）。

消线法

图3

试纸条目视判定图

16.质控试验要求

同8.4

第三法

读数仪法

17.具体检测步骤及结果判定可参考相应的说明书操作，质控试验参照第一法与第二法。

18.结论

本方法筛查出的阳性样品进行确认时，应按GB

2761指定方法标准检测并判定。

19.性能指标

19.1.检出限

μg/kg。

19.2.灵敏度

灵敏度≥95%。

19.3.特异性

特异性≥90%。

19.4.假阴性

假阴性≤5%。

19.5.假阳性

假阳性≤10%。

注：性能指标计算方法见附录A。

20.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。

本方法参比标准为GB

5009.209-2016

食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定。

附录A

快速检测方法性能指标计算表

样品情况a

检测结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异（c2）

c2=（½N12-N21½-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

灵敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特异性（p-，%）

p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-灵敏度

假阳性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特异性

相对准确度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a样品中实际的公议值结果；

b由玉米赤霉烯酮胶体金试纸条检验方法得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法起草单位：成都市食品药品检验研究院。

本方法参与单位：江南大学、国家粮食局科学研究院、广东省食品检验所、山东省食品药品检验研究院、浙江省食品药品检验研究院。

本方法主要起草人：肖全伟、姚蕾珺、王昕、张敏、胥传来、田洪芸、沈泓、周露

第五篇：WB03 酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿概要

农产品与食品质量检测技术教学资源库

酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿

准备好物品后即可进行检测操作，首先进行样品处理。取1mL纯牛奶样本，加入一根小试管，再加1mL去离子水，涡动1min混匀；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小试管，再加入960μL样本稀释液稀释，涡动1min混匀。

接下来，吸取50μL牛奶样本到微孔中，做2孔平行，并记录所在位置。再取三聚氰胺标准品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并记录所在位置。然后，每孔各加50μL酶标物，每孔再加入抗试剂50μL，轻轻振荡均匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境中反应30min。

取出微孔板，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤液250μL，充分洗涤4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。接下来各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境反应15～20min。取出微孔板，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。

测定完成后我们得到了三聚氰胺标品和样本的吸光度平均值，如表格所示。首先进行三聚氰胺的定性分析，根据样本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺浓度范围为1ppb-3ppb，再乘以稀释倍数50得出此纯牛奶中三聚氰胺的浓度为50ppb-150ppb。

接着我们进行三聚氰胺的定量分析，先计算百分吸光率和三聚氰胺浓度的对数，如表格中所示。

然后，以标准品百分吸光率为纵坐标，三聚氰胺标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线，如图所示。将样本的百分吸光率带入标准曲线的公式中，计算出样本所对应的浓度为1.77ppb，乘以稀释倍数50得到样本中三聚氰胺实际残留量为88.5ppb。