基因工程的工具
一．基因工程
1.基因工程的别名：基因拼接技术或DNA重组技术
2.操作对象：基因
3.操作水平:DNA分子水平
4.原理：基因重组
5.不同生物DNA能拼接的原因：DNA规则的双螺旋结构
6.一种生物的基因可以在另一种生物体内表达的原因：生物共用一套遗传密码子
二．DNA重组的基本工具
三种工具
限制酶
两种工具酶
DNA连接酶
载体
1.限制酶（限制性核酸内切酶）
（1）来源：主要来自原核细胞
（2）作用：识别和切割特定DNA序列
（不能识别切割RNA和单链DNA）
（3）限制酶作用与磷酸二脂键，不作用氢键。
（4）限制酶是一类酶而不是一种酶，不同限制酶识别不同的DNA序列，限制酶具有特异性。
（4）末端：
平末端
粘性末端
（5）单酶切缺点：使目的基因和载体自身环化
使目的基因反向插入载体中
（6）双酶切的优点：防止目的基因和载体自身环化
使目的基因和载体正确连接
（7）用同种酶处理载体和目的基因的原因：
切割后获得的（粘性）末端相同。
2.DNA连接酶
（1）DNA连接酶连接的是磷酸二脂键，但不连接氢键。
（2）不具有特异性
（3）分类
E．coli
DNA连接酶（存在于大肠杆菌中）：
只连接粘性末端
T4DNA连接酶（存在T4噬菌体中）：
连接粘性末端和平末端，但连接平末端的效率低
3.载体
（1）载体的作用：
作为运输工具将目的基因导入受体细胞
携带目的基因在受体细胞内大量复制
（3）具备条件
1)能在受体细胞中复制并稳定存在2)有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入
3)具有标记基因，供重组DNA的选择与鉴定
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：
目的基因的获取
基因表达载体的构建（关键步骤）
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
一.目的基因的获取
1.获取目的基因常用的方法
（1）从基因文库中获取目的基因
（2）利用PCR技术扩增目的基因
（3）人工合成2.从基因文库中获取目的基因
基因组文库
（1）基因文库
部分基因文库（如：cDNA文库）
（2）基因组文库与cDNA文库的比较
基因组文库中有启动子，终止子，内含子
cDNA文库中没有启动子，终止子，内含子
3.利用PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）条件：
要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
（3）原料：模板DNA，Taq酶，引物，三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）
（4）过程：
变性：加热至90～95℃，DNA解链；
退火：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
（5）注意
引物需要满足条件：
引物1和引物2结构上不能互补，单个引物不能自身互补
引物GC含量高，则退火温度高
三磷酸脱氧核苷酸转变为脱氧核苷酸过程中，脱去磷酸基团释放高能磷酸键中能量。
二．基因表达载体的构建
（基因表达载体的构建是基因工程的核心）
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
目的基因：插入启动子和终止子之间
启动子
位置：基因的首端
功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA
终止子
位置:基因的尾端
功能：终止转录
标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因
复制原点：起始复制
三．将目的基因导入受体细胞
1.转化的概念：
是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.受体细胞的选择
动物：受精卵
受精卵具有全能性，能发育成完整的个体
植物：体细胞
植物的体细胞具有全能性，能发育成完整的个体
微生物：
原核（大肠杆菌）：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少
真核（酵母菌）：真核细胞具有内质网高尔基体，能对蛋白质进行加工修饰
3.常用的转化方法：
（1）将目的基因导入植物细胞：
农杆菌转化法（用于双子叶植物，裸子植物）植物细胞最常用的方法
基因枪法（常用于单子叶植物）
花粉管通道法
（2）
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术
（3）
将目的基因导入微生物细胞：Ca离子处理
用Ca离子处理细胞的目的：
使大肠杆菌成为感受态细胞，更容易吸收重组DNA分子
4．注意
（1）受体细胞是植物细胞，需要经过植物组织培养技术
（2）受体细胞是动物细胞，需要经过早期胚胎培养和胚胎移植
显微注射技术
早期胚胎培养
目的基因
受精卵
早期胚胎
胚胎移植
雌性动物的子宫
发育成具有新性状的动物
5.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
6.农杆菌转化法
四．目的基因的检测与鉴定
（1）分子水平鉴定
1.检测
转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
方法是采用
DNA分子杂交技术。
2.检测
目的基因是否转录出了mRNA
方法是采用核酸分子杂交技术
3.检测
目的基因是否翻译成蛋白质
方法是采用抗原－抗体杂交技术
DNA分子杂交技术，核酸分子杂交技术原理为碱基互补配对原则，探针为放射性同位素标记的目的基因。判断依据：是否出现杂交带。
抗原抗体杂交技术原理为抗原抗体特异性结合，例如检测受体细胞是否表达出胰岛素，用胰岛素抗体检测
（2）个体生物学水平的鉴定
转基因生物
检测方法
观察指标
抗虫植物
接种害虫
害虫是否死亡
抗病植物
接种病毒（菌）
是否出现病斑
抗盐植物
盐水浇灌
是否正常生长
抗除草剂植物
喷洒除草剂
是否正常生长
获取目的基因产物的转基因生物
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
细胞产物功能活性是否正常
一植物基因工程
1.抗病转基因植物所采用的目的基因：
病毒外壳蛋白基因，病毒的复制酶基因，2.抗真菌转基因植物所采用的目的基因：
几丁质酶基因，抗毒素合成基因
二．动物基因工程
1.将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，获得的转基因牛能表达出肠乳糖酶，肠乳糖酶能将乳糖分解成半乳糖，从而降低牛奶中的乳糖含量。
2．乳腺生物反应器
显微注射
早期胚胎培养
药用蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子
受精卵
早期胚胎
胚胎移植
泌乳期
子宫
转基因动物
分泌乳汁
提取药物
（2）药用蛋白基因前插入乳腺蛋白基因的启动子，目的是使药用蛋白基因只在乳腺组织细胞中表达
（3）膀胱生物反应器的优点
不受性别限制
不受个体发育时期的限制
3.器官移植
器官移植的两大难题：器官短缺和免疫排斥
从供体角度降低免疫排斥：
1）向器官供体基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达
2）设法除去抗原决定基因
4.基因治疗
基因治疗是把正常基因导入有基因缺陷的细胞中，使正常基因的表达产物发挥作用，原来的缺陷基因仍然存在。
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