PCR注意事项总结（五篇）

第一篇：PCR注意事项总结

PCR注意事项

PCR产物的电泳检测时间

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。

2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ A）涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为： 1000克隆X10（3次方）ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。

4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。

C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。

E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液

10ul

4种dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至

100ul

PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些

第二篇：PCR实验室报批细节、注意事项、常见问题问答

报 批 细 节

1、技术档案：

技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件

2、仪器档案：

实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等

实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。

扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。

5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值

3、其他细节: 垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。仪器简单操作流程

标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。仪器的申请、采购、使用、验证程序

样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序 样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本

标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。

检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。

抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认

注 意 事 项

1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致.“写你所做的,做你所写的”.2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如“消毒时间一到两小时”不能这样写,多少就是多少.3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外.4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程.5、每把枪的用途要清楚,不能弄乱.比如稀释阳模的枪和处理标本的枪不可混用.6、普通离心机处理分泌物标本时应在离心后静置20分钟才能开盖.(许斌这样认为)

7、所有仪器、设备都要有档案卡.8、所有的清洁消毒要在实验结束后马上进行,尤其是仪器、设备.像扩增仪，每天都要清洁，做完的反应管决对不能留在样品槽内。

9、各区的拖把、抹布不得混用,标记清楚.10、生物防护意识要强,手套要随时更换.生物防护安全的保证要从三个方面:制度、硬件、意识。

11、爆管如何处理:立即停止实验,水浴里的水要倒掉,冲洗.所有可能污染的地方要用消毒液擦洗,紫外照射,通风排风.12、各区应有日常工作核查表,做为每天工作记录的补充.13、各区要有泡有消毒液的生物污物桶,用来处理生物垃圾.14、验收组带来的标本要按平时对待临床标本一样处理,要有接收记录,结果登记等.15、拒绝电话或代领等非正常方式发放报告单.16、存放标本的冰箱要上锁,钥匙及电脑资料的密码要由本科室人员专人保管.17、报告单上要注明试剂的检测下限,不能写成参考范围.除了有操作者,还要有核校者,且两者姓名除了电子打印还要用手签.定量结果不能有阴阳性提示,只能报数值.18、SOP文件中PE5700的温湿度要求应该为温度15－30℃、湿度为< 80％。

19、SOP中

医院申报实验室注意事项

专家组参观实验室回答的问题

1，“你们的冰箱的铁链我可以从底下抽上来，实验室能做好保密性吗？

可以的，你们能做到就行，注意保密！

2，实验室需要配置冷冻离心机，生物安全柜，如果做HCV时,注意重新添置新实验室。

3，生物防护中是否有锐器的防护注意事项？ 4，实验室的温湿度计的放置位置？ 最好放在实验室内。

5，实验室中如何做好离心管抑制物的检测？ 而非爆管、裂管的检测！

6，在做HCV时规定从抽血化验到送达实验室要几个小时要有明规定！3小时左右！

7，溶血标本有何具体的判断标准？脂血呢？

实验室末次会议的提问

1，你们单位（达安）试剂，当我们新鲜标本做HBV时，提取中40微升+40微升提取液处理，待放置过夜后，第二天加样时，有的标本特难取样，有何处理办法？ 2，实验室中垃圾你们如何处理的？

3，实验室中阴性标准检测后变成阳性你怎么办？（我们实验室一共有三管阴性阴性对照，第一个阴性检测管是试剂什么都不加，直接上机，第二个阴性检测管是试剂中加入在实验开始时打开盖的1.5离心管带有蒸馏水的，第三个阴性检测管是与实验一起提取的阴性血清。）4，实验中如果阳性质控，阳性梯度，标本呈阴性请分别解释？ 5，实验室必须配置生物安全柜，高速离心机！

临床基因扩增检验实验室技术验收现场问卷

（口试和/或笔试）

一.现有一个患者向你提出：“我在你们医院检测HBV DNA为阳性，但在另一家医院检测为阴性，你们医院是怎么做的检测？”，此时，你怎么办？

（该题主要是考实验室人员是否知道并遵守所制定的抱怨处理程序）

二．现有一个临床大夫拿着几张HBV DNA定量PCR检验报告单找到PCR实验室，说：“你们的PCR结果到底准不准，我这个病人刚开始检测，HBV DNA是57×10拷贝数/ml，用了拉米呋啶治疗后二周，再检测结果为3×107拷贝数/ml，降了不少，但再过二周检测，又变成了6×107拷贝数/ml，升高不少，这到底是怎么回事？”，如果这个大夫刚好问的是你，你怎么办？并如何解释其提出的问题？

(该题除了考实验室人员是否知道并遵守所制定的抱怨处理程序外，还要求其对特定PCR检验的批间变异有充分的认识)

回答思路：

这两题分别对应患者和临床医生提出的抱怨。考点为你是否按照所制定的程序来处理：无论是患者还是医生提出抱怨，我们都应该“按照”程序先记录抱怨人姓名、抱怨内容等，然后等问题解决后记录处理结果等，最后记录反馈意见等。

注意：一般问题中出现“此时，你怎么办？”，其考核的重点均为“形式”而非“内容”。所以题目中无论病人抱怨的是服务态度不好还是结果报告不准，医生抱怨的是检测结果和临床诊断不符还是报告发放不及时，回答的方向都应该是：“我们接待他们后，先在登记表上记录抱怨的什么什么相关信息，做相应处理，解决后记录处理结果，最后填反馈表，归档总结，跟着以后改进等等等等”。对各种具体问题的处理就按照实际情况来回答就行。

如果题目中出现要你具体“解释某某提出的问题”时，这时是具体考察某一“内容细节”了。第二题中看你对PCR检验的批间变异有否充分的认识：一般PCR检测试剂盒存在着一定的批间甚至批内差异，而且PCR检测前处理也存在着一定的误差，分析软件相关参数的选择也会使定量结果发生变动，这是方法学造成的不可避免的事实。同一操作人、同一仪器、同一批号试剂、同一份标本同时做多份平行管，得到的结果都会不尽相同。所以我们都会允许结果存在一定范围的偏差，一般为一个数量级的拷贝数。5×107、3×107和6×107均在允许的误差范围内，排除了各种影响因素后，出现这种情况很正常，这说明了该病人用药效果不佳。若定量结果有1～2个数量级甚至更大的变化才能反映用药疗效。

三．现有一人打电话到科室，说：“我孩子在你们医院做了一项丙肝的PCR检测，名字叫XXX，请你告诉我检测结果好吗？”。如果是你刚好接了这个电话，你会怎样去做？

（该题考的是实验室人员在患者要求以电子邮件、电话、传真等方式传递报告时，是否能按相应的程序去做）

回答思路： 也是考形式。“对于这种非正常的报告发放形式，我们按照程序，是这样这样处理的。”因为各个医院实际情况不同，所以无论你怎样处理，只要程序中体现了对患者结果的保密原则，具体细节不会太要求。

在程序中按以下几个方式写都是可以的：

1、我们均不以任何非正常形式发放报告。（最干脆！就是有点不近人情，不过对我们来说省事）

2、实在有特殊情况，可以电话查结果，其它发放形式不行。但必须确认身份，包括核对其所查询的患者姓名、性别、年龄、检测项目、送检医生、送检日期、病区床号等情况，并提供患者ID号。

3、可以通过电话、图文传真、电子邮件等形式传送结果，和上面一样，需要核实身份。（最宽松了，不过麻烦了很多）

要注意的是：这些情况均应明确告知查询者，这几种非正常形式发放的报告均仅为临床提供参考，实验的最终结果以正式检测报告单为准。特殊情况报告发放后需详细登记，签署报告人姓名，实验室负责人签字。

“报告的正确发放”为考核重点，一般可能还会引申出“你们是如何发放检测结果报告？”之类的问题，按照程序中写的实际情况回答就行的了。只要遵循保密原则就OK。

最简单的无非把事情都推给医院：说门诊患者报告单送至服务台门诊报告发放处，由那里的医生确认身份后发放。（具体她们是怎么确认、确不确认这已经不关我们的事了）。

若写病人到科室领报告也行，只是“我们怎么确认病人身份”要在程序中体现：询问相关信息、根据收费单或病历唯一条形码（若医院采用计算机网络系统）确认等等。

四．现有你科室同事，拿了一份血清标本给你，说：“这是我一个熟人的标本，他要做HCV RNA检测，刚好他还做生化和免疫检测，我从生化标本分了一些出来，给你做HCV RNA。”你觉得这样行吗？为什么？

（该题主要是考实验室人员对有关标本的收集程序是否清楚并遵守）

回答思路：

问到了“为什么？”表示具体考到细节了。按照我们的收集程序，做PCR尤其是RNA项目需要独立取血，不能从其它检测的标本中分出一些来做。而且对RNA标本的采集、保存、运输都有严格的要求。

一般验收组会对这类问题加以引申。问你每天标本在哪儿采集？采血的人员有否经过专门培训？采集的标本如何保存？

还可以顺便问你结果发放后的标本如何保存、保存在哪儿？保存多久？甚至要你把这多久多久前的标本拿出来给他们看。

五．某一天，你在做HBV DNA荧光定量PCR检测（方法的定量测定范围为103～107拷贝数/ml）中，发现有1份标本的测定Ct值超出方法的测定上限，此时你怎么办？对于没有特异扩增曲线的标本你又怎么报告结果？

回答思路： 此为具体问题：题目已经假设了方法的定量测定范围为103～107拷贝数/ml，我们就按照这个假设来考虑。先看是否为特异扩增的曲线（即看曲线是否为标准的S形曲线），若为标准S形曲线表示的确为阳性标本，Ct值超出检测上限，表示未知标本HBV DNA浓度过大，不在检测线性范围内，应该进行浓度梯度稀释（1/

10、1/100、1/1000„„），重做实验，看哪个梯度处于线性范围内，得到原始浓度乘以相应稀释倍数即得。

若不是特异扩增的曲线（也就是常见的那种前面翘、与阈值线有交点的阴性曲线，计算机不会具体分析，见有交点就给Ct值，而且Ct值还很小，小于测定上限的Cycle数），按阴性报。

六．在PCR检测的核酸提取离心中，如发现有一管离心管出现破裂，此时你怎么办？

（该题是考实验室人员对于其制定的实验室及仪器设备消毒清洁程序是否知道并遵守）

回答思路：

按照离心机的消毒清洁程序：必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾 桶，再用75%酒精擦拭离心室消毒，用移动紫外灯照射30～60分钟后才能开始实验。

可以引申出：离心管破裂，可能质量有问题，为防止以后同类事情的发生，按照耗材质检程序进行离心管质检实验，若不合格停止使用，重新购买并进行质检，合格的耗材才能使用。

七．有一个PCR实验室的荧光定量PCR仪如ABI 7000因某种原因搬动到了另一个实验台面，实验室只是将仪器外表面擦了擦，即用于常规扩增检测工作，你觉得该实验室做得对吗？为什么？

（该题是考实验室人员对于其制定的PCR仪校准程序是否知道并遵守）

回答思路：

考核实验室人员对于其制定的PCR仪校准程序是否知道并遵守。仪器移动应该按照程序进行校准后才能重新用于常规扩增检测工作，以保证实验结果。

7000型核酸扩增荧光检测仪为复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师 进行。实验室联系仪器厂家派技术人员来校准仪器。

平时就算不搬动仪器，实验室也应与仪器厂家达成协议，定期校准仪器。八．有一位实验室工作人员在做PCR实验中，一开始将化验单带至标本处理区，核酸提取完成后，进入了扩增区，但将化验单忘在了标本处理区，此时，他应该怎样做？

（该题是考实验室人员对于其制定的实验室单一流向工作程序是否知道并遵守）

回答思路：

很简单，按照单一流向原则，该实验员不能直接回2区拿单，要么请其他当日未进过扩增实验室的人员帮拿，要么严格按要求淋浴、换衣服后再次进入2区拿化验单。

第三篇：PCR实验室

简介

Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据

条件

1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室;实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它 有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广 泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍

2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求;荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证;

4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行

5、必须在无菌无尘环境下进行操作

功能

能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药，病毒复制模板难以治疗，人体免疫耐受状态不易打破等医学难题，能迅速消除临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗体的血清转换速度，杀灭血液及肝细胞内的病毒，为防止再感染提供了长期保护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。

建立方法

1、建立样品准备区

这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。

2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。

3、建立前PCR区。

该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

4、PCR实验室试剂的操作。

⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

5、在前PCR区建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。⑶作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。

6、控制污染的方法。

已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG，这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。

7、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动

第四篇：PCR实验室

高端PCR实验室控制设计说明

PCR实验室即分子生物学实验室，在医疗、科研、生物技术方面得到广泛的应用。因其在不同行业的应用各有区别，在具体设计时也有不同之处，就医疗机构的应用而言，主要使用三区或四区设计，即试剂准备区、样品提取区、扩增分析区；此类三区设计时候应用于类似荧光定量型或同类PCR分析设备，及扩增与分析过程在设备内一次完成。而四区设计在三区的基础上讲扩增分析区拆分为扩增区与分析区适用于其他类型的pcr设备及手工处理。

在PCR实验的设计上，经过多年的经验累积，已经在一些关键技术上达成了共识。因为PCR实验中所产生的DNA与RNA片段过于微小，以至于可以穿透高效过滤器，所以在实验室设计上已经不在强制要求设计高效净化系统，但是为了提高实验环境水平及保护实验室内的敖贵设备方面，如果在具备条件的情况下可考虑追加高效空气净化系统；建议净化级别万级。在PCR实验中所产生的DNA与RNA片段污染是一直以来PCR实验的重点问题。此类污染主要至上次试验中所产生的基因片段对下次试验产生的污染，而且一旦试验环境中的污染形成后很难处理。因为消毒等传统方式对于基因污染没有很良好的效果。所以在PCR实验室设计中一般将整套实验室设计为全新风型实验室，这样而已通过有效的换气次数来达到净化室内污染的作用。而在控制方面也有很多不同之处，因为各单位对PCR实验的重视程度各有不同，所以在设计上也有不同，主要的控制设计有定送定排式压力控制系统、变送定排式压力控制系统变送变排式压力控制系统。在控制设备方面也有很多区分如压力无关型控制系统、压力有关型控制系统。

根据业主要求，本PCR实验室为三区设计，各区可独立使用，不设置高效过滤系统等相关要求，根据业主以上要求，我方给出的设计方案为压力无关型变送变排压力控制系统。本系统的特点是，设备启动后可根据实验室内使用节点调节送风量及排风量来控制各房间状态，系统说明见下图

 每个房间可分别控制，使用时通过房间开关输出启动信号，当设备接到启动信号时设备运行，运行中根据管道压力反馈决定变频器大小，房间内送排风量由压力无关型风量调节阀控制。 当有多个房间开启或关闭时，设备更加管道压力反馈，调节设备变频器增加或减少送排风量来稳定管道压力。各房间内压力又房间内的压力无关型定风量阀进行控制。

 当BSC（生物安全柜，B2全排）开启时BSC专用供风机组运行，BSC-供风机-排风机连锁运转。

 当BSC做变风量调节时，根据房间内压力变化，BSC专用供风机组前安装的压力无关型变风量调节阀根据压力变化增减送风量，确保房间压力执行在可控范围内。

 当房间不适用时，房间与缓冲间均关闭电动密闭阀，确保房间处在密闭状态避免布朗运动造成的可能污染风险。

 房间换气次数均按照一定净化标准设计，当室内污染发生时，通过一定时间的换气处理后，污染问题可以基本解决。 本系统如果业主需要，可在室内送风口末端加装高效过滤设备，房间可升级为净化型实验室。

 压力无关型风阀简介：压力无关型风阀的特点是不会根据管道压力的变化而影响风阀内部的送风量，在一定管道压力区间内能够自行调节阀体阻力，来稳定送风量，是高端实验室必备的关键部件，目前此类阀体技术均有国外生产厂家控制，目前国内主用使用的产品有妥思、文丘里、西门子等品牌。

第五篇：PCR经验总结

PCR经验总结

实验注意事项：

（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高温高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。

（2）PCR操作应戴手套并勤于更换，必要时应戴好帽子和口罩，就像做手术一样，要有“无菌观念”。

（3）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。（4）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。（5）最后加模板DNA，马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。（6）实验设阳性、阴性对照。

还有诸如：移液枪用完要放到最大计量位置，防止久了弹簧失灵；防止RNA酶污染标本；低温下操作，防降解；试剂有致癌致畸作用，做好个人防护；头脑中各操作步骤要清楚，不要加错试剂。

问题及解决方案汇总：

一、假阴性，扩增无条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

二、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR来减轻或消除。

三、出现非特异扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用两步法。

四、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。

五、出现大量引物二聚体

1.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；

3.模板浓度过小，适当加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出置于冰上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；

7.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加Taq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

8.增加循环数；

9.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；

10.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mM没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。11.以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；

六、高GC与复杂结构的模板处理

将模板置于95℃水浴锅中处理10分钟以上，然后置于冰上瞬时冷却，可大大降低二级结构对PCR的影响。

七、长片段与短片段拼接失败（定点突变）

在做定点突变时，倘若突变位点距离基因的某一侧较近（短片段<200bp）时，通常拼接困难或者难以通过电泳结果直观判断是否拼接成功。此时，可在短片段的上方（突变近5’端）或下方（突变近3’端）选取一条载体通用引物与基因另一条引物PCR（控制产物大小>300bp），然后再做基因拼接。确认大小无误后，再以此产物为模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR无条带

对于>5Kb片段扩增，常规PCR很难得到较好的条带，建议①更换更适合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer调整体系；③设计多对引物分段扩增。

PCR增强剂（PCR Enhancer）：

常见的添加剂有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，甜菜碱，BSA等，它们对PCR反应的影响虽然有所不同，但都可提高PCR的扩增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二级结构，增加引物与模板的特异性结合，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但是对酶活有抑制作用，且当其浓度大于10％时还会降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解温度（Tm），提高产量，但是对酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促进某些“引物－模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。4.硫酸铵：增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。5.甜菜碱：有利于DNA双链的解开，Polymerase的结合，提高PCR的效率。