PCR学习心得

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第一篇:PCR学习心得

参加《临床基因扩增实验室技术人员上岗培训

班》心得

本人于2015年3月10至15日参加了广东省临检中心举办的临床基因扩增实验室技术人员上岗培训班。通过学习,除了取得广东省临检中心颁发的培训证书外,还极大的提高了理论和实验操作水平,现总结如下。

此次培训包括理论培训和实验操作。在理论培训课程当中,卫生部临床检验中心的李金明教授为我们详细讲解了《临床基因扩增实验室设计及质量管理体系的建立》、《临床基因扩增检验的质量保证》等内容。通过学习,了解到临床PCR实验室设计必须遵循各区独立、注意风向、因地制宜,方便工作的原则。质量管理的内涵:写你所做的,做你所写的,记录你已做的,分析你已做的。认识到临床标本的正确采集、运送、保存的重要性,是临床检验的质量保证的关键性环节,是解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一。同时通过病例分析,对于临床基因扩增检验的检验前,检验中,检验后的质量控制,还有实验的结果处理和分析有了重新认识。对于实验室是否出现污染的鉴别,以及出现污染的处理措施有了深刻了解。

临床实验医学的发展现在经历了三个时代,分别是生化诊断时代,免疫诊断时代,和和现在的分子(基因)诊断时代,而现今时代的标志性技术正是PCR技术,是反映疾病本质的实验。正是有临床基因扩增检验技术在癌症等疾病的诊断方面有了多方应用,通过驱动基因的选择,为靶向治疗患者延长了生存期。为个体化诊疗中对疾病的鉴别诊断,诊治方案的设定提供重要的参考依据,同时也为治疗过程中临床对于治疗方案的调整提供依据。临床基因扩增检验技术在个体化诊疗中是不可或缺的一部分,是其重要的组成部分,具有强大的发展潜力和前景。

实验操作内容为EGFR突变基因检测。实验操作过程中,通过认真学习和细致听讲带教老师的规范实验操作,了解到了实验的关键操作,纠正了平常在临床实际工作操作上的一些不良习惯,为日后规范检验操作提供了基础。通过分组亲自操做实验,分析和判断自己的实验结果,做实验记录笔记,基本掌握EGFR突变基因检测。

通过为期六天的理论和实验培训,从中学习到了很多知识,掌握了严格的防污染以及污染的处理措施,了解到实验室设置的人流、物流、气流的走向设计原则,解决了日常工作中的实际问题,为日后临床基因扩增检验工作的开展打下了坚实的基础。了解到临床基因扩增检验技术的发展方向,受益匪浅。

第二篇:PCR实验室

简介

Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段,可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统,能迅速掌握患者体内的病毒含量,其精确度高达纳米级别,精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据

条件

1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室;实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它 有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广 泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍

2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求;荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证;

4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班,并持证上岗。PCR实验室通过验收,实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序(SOP)、建立系列质量管理文件等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求,确保检测结果准确、确保实验室卫生安全,确保实验室长期稳定运行

5、必须在无菌无尘环境下进行操作

功能

能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控,并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受,阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒,解决了乙肝病毒易变异、耐药,病毒复制模板难以治疗,人体免疫耐受状态不易打破等医学难题,能迅速消除临床症状,而且有效抑制乙肝病毒复制,明显加快e抗原、抗体的血清转换速度,杀灭血液及肝细胞内的病毒,为防止再感染提供了长期保护,有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。

建立方法

1、建立样品准备区

这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。

2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。

3、建立前PCR区。

该去专门用于准备各种反应,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

4、PCR实验室试剂的操作。

⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

5、在前PCR区建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。⑶作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。

6、控制污染的方法。

已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线,这种方法不能完全消除污染问题,但可以将污染降低几个数量级。

7、后PCR区PCR完成以后,需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动

第三篇:PCR实验室

高端PCR实验室控制设计说明

PCR实验室即分子生物学实验室,在医疗、科研、生物技术方面得到广泛的应用。因其在不同行业的应用各有区别,在具体设计时也有不同之处,就医疗机构的应用而言,主要使用三区或四区设计,即试剂准备区、样品提取区、扩增分析区;此类三区设计时候应用于类似荧光定量型或同类PCR分析设备,及扩增与分析过程在设备内一次完成。而四区设计在三区的基础上讲扩增分析区拆分为扩增区与分析区适用于其他类型的pcr设备及手工处理。

在PCR实验的设计上,经过多年的经验累积,已经在一些关键技术上达成了共识。因为PCR实验中所产生的DNA与RNA片段过于微小,以至于可以穿透高效过滤器,所以在实验室设计上已经不在强制要求设计高效净化系统,但是为了提高实验环境水平及保护实验室内的敖贵设备方面,如果在具备条件的情况下可考虑追加高效空气净化系统;建议净化级别万级。在PCR实验中所产生的DNA与RNA片段污染是一直以来PCR实验的重点问题。此类污染主要至上次试验中所产生的基因片段对下次试验产生的污染,而且一旦试验环境中的污染形成后很难处理。因为消毒等传统方式对于基因污染没有很良好的效果。所以在PCR实验室设计中一般将整套实验室设计为全新风型实验室,这样而已通过有效的换气次数来达到净化室内污染的作用。而在控制方面也有很多不同之处,因为各单位对PCR实验的重视程度各有不同,所以在设计上也有不同,主要的控制设计有定送定排式压力控制系统、变送定排式压力控制系统变送变排式压力控制系统。在控制设备方面也有很多区分如压力无关型控制系统、压力有关型控制系统。

根据业主要求,本PCR实验室为三区设计,各区可独立使用,不设置高效过滤系统等相关要求,根据业主以上要求,我方给出的设计方案为压力无关型变送变排压力控制系统。本系统的特点是,设备启动后可根据实验室内使用节点调节送风量及排风量来控制各房间状态,系统说明见下图

 每个房间可分别控制,使用时通过房间开关输出启动信号,当设备接到启动信号时设备运行,运行中根据管道压力反馈决定变频器大小,房间内送排风量由压力无关型风量调节阀控制。 当有多个房间开启或关闭时,设备更加管道压力反馈,调节设备变频器增加或减少送排风量来稳定管道压力。各房间内压力又房间内的压力无关型定风量阀进行控制。

 当BSC(生物安全柜,B2全排)开启时BSC专用供风机组运行,BSC-供风机-排风机连锁运转。

 当BSC做变风量调节时,根据房间内压力变化,BSC专用供风机组前安装的压力无关型变风量调节阀根据压力变化增减送风量,确保房间压力执行在可控范围内。

 当房间不适用时,房间与缓冲间均关闭电动密闭阀,确保房间处在密闭状态避免布朗运动造成的可能污染风险。

 房间换气次数均按照一定净化标准设计,当室内污染发生时,通过一定时间的换气处理后,污染问题可以基本解决。 本系统如果业主需要,可在室内送风口末端加装高效过滤设备,房间可升级为净化型实验室。

 压力无关型风阀简介:压力无关型风阀的特点是不会根据管道压力的变化而影响风阀内部的送风量,在一定管道压力区间内能够自行调节阀体阻力,来稳定送风量,是高端实验室必备的关键部件,目前此类阀体技术均有国外生产厂家控制,目前国内主用使用的产品有妥思、文丘里、西门子等品牌。

第四篇:PCR经验总结

PCR经验总结

实验注意事项:

(1)DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高温高压处理,常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染。

(2)PCR操作应戴手套并勤于更换,必要时应戴好帽子和口罩,就像做手术一样,要有“无菌观念”。

(3)成套试剂,小量分装,专一保存,防止它用。配制试剂用新器具,用后作一次性处理。(4)试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会。(5)最后加模板DNA,马上盖好,混匀,瞬时离心(10s),使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染,所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。(6)实验设阳性、阴性对照。

还有诸如:移液枪用完要放到最大计量位置,防止久了弹簧失灵;防止RNA酶污染标本;低温下操作,防降解;试剂有致癌致畸作用,做好个人防护;头脑中各操作步骤要清楚,不要加错试剂。

问题及解决方案汇总:

一、假阴性,扩增无条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。

物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

二、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR来减轻或消除。

三、出现非特异扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用两步法。

四、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:①减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量,减少循环次数。

五、出现大量引物二聚体

1.从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法; 2.可能模板有问题;

3.模板浓度过小,适当加大模板量;

4.Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;

5.取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出置于冰上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的;

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性;

7.PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加Taq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

8.增加循环数;

9.降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);

10.若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mM没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。11.以上次的PCR产物作模板二次PCR,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍;

六、高GC与复杂结构的模板处理

将模板置于95℃水浴锅中处理10分钟以上,然后置于冰上瞬时冷却,可大大降低二级结构对PCR的影响。

七、长片段与短片段拼接失败(定点突变)

在做定点突变时,倘若突变位点距离基因的某一侧较近(短片段<200bp)时,通常拼接困难或者难以通过电泳结果直观判断是否拼接成功。此时,可在短片段的上方(突变近5’端)或下方(突变近3’端)选取一条载体通用引物与基因另一条引物PCR(控制产物大小>300bp),然后再做基因拼接。确认大小无误后,再以此产物为模板,用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR无条带

对于>5Kb片段扩增,常规PCR很难得到较好的条带,建议①更换更适合于Long PCR的聚合酶;②添加PCR Enhancer调整体系;③设计多对引物分段扩增。

PCR增强剂(PCR Enhancer):

常见的添加剂有:DMSO,甘油,甲酰胺,硫酸铵,甜菜碱,BSA等,它们对PCR反应的影响虽然有所不同,但都可提高PCR的扩增效率。

1.DMSO:解除模板DNA局部二级结构,增加引物与模板的特异性结合,使聚合酶更容易在二级结构处延伸,但是对酶活有抑制作用,且当其浓度大于10%时还会降低保真性。

2.甘油:可降低模板溶解温度(Tm),提高产量,但是对酶活有抑制作用。3.甲酰胺:促进某些“引物-模板”退火,降低带有二级结构的DNA的变性温度。4.硫酸铵:增加反应体系的离子强度,改变DNA的变性及退火温度,调节酶活。5.甜菜碱:有利于DNA双链的解开,Polymerase的结合,提高PCR的效率。

第五篇:PCR防污染措施

【分享】PCR污染与对策

PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生.污染原因

(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染.(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性.还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.污染的监测

一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以 便采取措施,防止和消除污染.对照试验

1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳 性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照.2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染.3.重复性试验

4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 防止污染的方法 一. 污染的预防

进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。

(一)划分操作区:目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行: 1.标本处理区,包括扩增摸板的制备; 2.PCR扩增区,包括反应液的配制和PCR扩增;

3.产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。

切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

(二)分装试剂:PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA: 1. PCR用水应为高压的双蒸水;

2. 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;

3. 引物和dNTP应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。

(三)实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意: 1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;

2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;

3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度; 5.最后加入反应模板,加入后盖紧反应管; 6.操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性; 7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区; 8.重复实验,验证结果,慎下结论。二. 追踪污染源

如果不慎发生污染情况,应从下面几条出发,逐一分析,排除污染。

(一)设立阴阳性对照:有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好的样品,因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列,反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照,100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重,因为PCR敏感性极高,可以从其它方法(Sourthern 印迹或点杂交等)检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外,每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照,即包括PCR反应所需的全部成分,而不加模板DNA,这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果,就是某一种或数种试剂被污染了。此时,要全部更换一批新的试剂进行扩增,扩增时设立不同的反应管,每一管含有一种被检测试剂,在检出污染试剂后,应马上处理。

(二)环境污染:在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,如果预防措施比较严密,则考虑可能为环境污染。环境污染中常见的污染源主要有: 1.模板提取时真空抽干装置; 2.凝胶电泳加样器; 3.电泳装置; 4.紫外分析仪;

5.切胶用刀或手术刀片; 6.离心机;

7.冰箱门把手,冷冻架,门把手或实验台面等;

此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1)用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源;2)0.1ml去离子水浸泡;3)取5ml做PCR实验;4)电泳检测结果。

8.气溶胶。如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的,此时就应该更换实验场所,若条件不允许,则重新设计新的引物(与原引物无相关性)。三.污染处理

(一)环境污染

1.稀酸处理法:对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡,使残余DNA脱嘌呤;

2.紫外照射(UV)法:紫外波长(nm)一般选择254/300nm,照射30min即可。需要注意的是,选择UV作为消除残留PCR产物污染时,要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布,UV照射仅对500bp以上长片段有效,对短片段效果不大。UV照射时,PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体,这些二聚体可使延伸终止,但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体,且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长,嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上,形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基,其他非二聚体的光照损伤(如环丁烷型嘧啶复合体,胸腺嘧啶乙二醇,DNA链间与链内的交联和DNA断裂等)均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点(0.13/碱基)在DNA分子上随机分布,一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点,那么,105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反,如果100bp的片段,每条链上仅有6处损伤,105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。

(二)反应液污染

可采用下列方法之一处理:

1.DNase I法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活,然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列;

2.内切酶法:选择识别4个碱基的内切酶(如Msp I和Taq I等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h 后加热灭活进行PCR;

3.紫外照射法:未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述UV照射法; 4.g射线辐射法:1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA,2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子,4.0 kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。

(三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)法

由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右,因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。

1.原理:在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育,因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键,可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶,而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。

2.dUTP法:用dUTP代替dTTP,使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前,用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含dU的新的PCR产物。

3.dU引物法:合成引物时以dU 代dT,这样PCR产物中仅5%u2ca端带dU。UNG处理后,引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段(1-2kb以上)的扩增用dUTP法效率较用dTTP低,而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3%u2ca端或近%u2ca端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。

4.优点:可以去除任何来源的污染;UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行;由于扩增产物中有大量dU存在,可彻底消除污染源。

5.需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响,在进行PCR产物克隆时,应该转化UNG-(UNG缺陷)大肠杆菌受体菌,否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。

(四)固相捕获法

用于去除标本中污染的核酸和杂质,原理如下:1)用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交,杂交区域是非扩增区;2)用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸,通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质;3)洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2)步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。

(五)RS-PCR法(RNA-specific PCR)

也称为链特异性PCR,主要指用于RNA模板的特异性PCR法,该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物,逆转录引物的3%u2ca端(A区)有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列,5%u2ca端2 0个核苷酸(C区)为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后,经超速离心使 cDNA与多余引物分开,再用和第二引物(C)以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA,而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。

(六)抗污染引物法

该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中,在重组质粒中,这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本,也不能扩增出任何条带,即使出现了扩增带,其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增,因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。

四.其它PCR检测方法:

(一)两步法:是指在用套式PCR方法扩增某些含量低微的标本时,两对引物在同一个管中以简化步骤,减少污染。通常第一步进行20-25个循环,扩增外引物片段;第二步再进行10个循环,扩增内引物片段。两步法对内外引物的Tm值有特殊要求,即内外引物的退火温度高(如68℃),在此温度下内引物不与模板退火,然后降低退火温度(至55℃)再扩增内引物片段,这样,在操作过程中,仅打开PCR反应管一次,大大减少了污染的可能性。

(二)荧光法:亦称荧光PCR技术(fluoresence PCR, F-PCR),是1995年由美国PE公司首先研制成功的,它融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点,电脑同步跟踪,数据自动化处理,直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果,不需要做PCR后处理或检测,完全闭管操作。探针标记除用TET和FAM外,还可用HEX、JOE作为报告荧光,3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时,荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭,而在探针被切断后,荧光报告基团才发出报告荧光,且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。

主要有以下优点:

1.探针特异性强,假阳性率低; 2.操作快速,不需要PCR后处理;

3.定量范围宽,HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml); 4.闭管操作,PCR产物污染少; 5.灵敏度高。主要方法有: 1..荧光探针法:进行荧光PCR检测时,要求荧光探针必须完全与靶基因互补,长度以20-30个碱基为宜,必要时3′端磷酸化封闭,以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用Taq酶的3′→5′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性,可以在链延伸过程中实现链替换,并将被替换的探针切断,故可进行定性与定量检测。

荧光探针5′端标记的TAMRA,在480nm激发下产生530nm的红色荧光;3′端标记的FAM,激发后产生绿色荧光。PE公司推出的TaqMan系统,即采用双荧光探针,如配合使用PCR扩增与荧光检测合二为一的仪器,可进行实时(real-time)定量检测。2.分子信标法:分子信标(molecular beacon)是一个发夹样结构的特异探针,其环状部分与靶序列互补。在室温时,分子信标的发夹紧闭,荧光淬灭。PCR扩增时,随着温度升高,发夹松开,与单链模板特异结合,发出荧光。荧光强度与模板呈正比,故可用于PCR产物的定性及定量。

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