各省市PCR上岗证汇总大全

第一篇：各省市PCR上岗证汇总大全

根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》，技术人员参加省临检中心的PCR上岗证培训班，经过考核合格后方可从事临床基因扩增检验工作。

各省临检中心每年举办一次至两次，详见临床检验中心网站通知，上半年的培训已结束，具体情况如下：

1、天津

参加天津市临床检验中心培训，获得“天津市临床基因扩增检验实验室技术人员上岗证” 报名时间：2016年4月15日前（下次待定）

报名条件：开展或拟开展临床基因扩增检验项目的实验室人员；

从事分子生物学诊断技术（含分子病理）的人员；

其它相关人员。培训费用：

1600元/人（含理论培训费、实验材料费、资料费）、食宿自理

2、浙江省

参加“2016年浙江省临床基因扩增检验实验室质量保证暨上岗培训班”，合格后颁发证书

报名时间：2016年3月28日

报名条件：通过验收的PCR实验室中从事PCR检验的工作人员；

需领PCR上岗证的专业技术人员。

培训费用：理论课800元；实验操作800元；住宿费150/天；其它费用自理，回单位报销

培训内容：（1）PCR的基本原理与相关检测技术及进展；（2）临床基因扩增检验的质量保证；（3）临床PCR标本的处理、模板制备及保存；（4）荧光PCR检测的结果分析及常见问题；（5）临床基因扩增实验室的生物安全及防污染措施；（6）PCR实验室验收中存在问题与解决方案；（7）分子病理诊断中PCR质控。

3、上海

“上海市医疗机构临床基因扩增检验技术人员上岗培训暨分子诊断新技术学习班”，培训合格后，获得“上海市临床基因扩增检验实验室技术人员上岗证”，方可从事PCR检验工作。

培训班不接受现场报名。

培训时间：2016年3月21日-25日 培训费用：2000元/人

培训内容：1．医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法和工作导则；2．荧光定量PCR的原理与方法；3．临床基因扩增检验技术的质量要求；4．临床基因扩增检验标本管理、生物安全和防污染策略；5．临床PCR检测结果的分析、判断和报告；6．分子诊断技术方法学性能验证；7．临床PCR实验室常见问题分析及整改措施；8．个体化医学检测技术及质量控制。

4、北京

只查到2012年的 培训费用：2800元

第二篇：PCR经验总结

PCR经验总结

实验注意事项：

（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高温高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。

（2）PCR操作应戴手套并勤于更换，必要时应戴好帽子和口罩，就像做手术一样，要有“无菌观念”。

（3）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。（4）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。（5）最后加模板DNA，马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。（6）实验设阳性、阴性对照。

还有诸如：移液枪用完要放到最大计量位置，防止久了弹簧失灵；防止RNA酶污染标本；低温下操作，防降解；试剂有致癌致畸作用，做好个人防护；头脑中各操作步骤要清楚，不要加错试剂。

问题及解决方案汇总：

一、假阴性，扩增无条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

二、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR来减轻或消除。

三、出现非特异扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用两步法。

四、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。

五、出现大量引物二聚体

1.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；

3.模板浓度过小，适当加大模板量；

4.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出置于冰上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；

6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；

7.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加Taq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。

8.增加循环数；

9.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；

10.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mM没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。11.以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；

六、高GC与复杂结构的模板处理

将模板置于95℃水浴锅中处理10分钟以上，然后置于冰上瞬时冷却，可大大降低二级结构对PCR的影响。

七、长片段与短片段拼接失败（定点突变）

在做定点突变时，倘若突变位点距离基因的某一侧较近（短片段<200bp）时，通常拼接困难或者难以通过电泳结果直观判断是否拼接成功。此时，可在短片段的上方（突变近5’端）或下方（突变近3’端）选取一条载体通用引物与基因另一条引物PCR（控制产物大小>300bp），然后再做基因拼接。确认大小无误后，再以此产物为模板，用基因首尾引物PCR即可。

八、Long PCR无条带

对于>5Kb片段扩增，常规PCR很难得到较好的条带，建议①更换更适合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer调整体系；③设计多对引物分段扩增。

PCR增强剂（PCR Enhancer）：

常见的添加剂有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，甜菜碱，BSA等，它们对PCR反应的影响虽然有所不同，但都可提高PCR的扩增效率。

1.DMSO：解除模板DNA局部二级结构，增加引物与模板的特异性结合，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但是对酶活有抑制作用，且当其浓度大于10％时还会降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解温度（Tm），提高产量，但是对酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促进某些“引物－模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。4.硫酸铵：增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。5.甜菜碱：有利于DNA双链的解开，Polymerase的结合，提高PCR的效率。

第三篇：PCR学习心得

参加《临床基因扩增实验室技术人员上岗培训

班》心得

本人于2015年3月10至15日参加了广东省临检中心举办的临床基因扩增实验室技术人员上岗培训班。通过学习，除了取得广东省临检中心颁发的培训证书外，还极大的提高了理论和实验操作水平，现总结如下。

此次培训包括理论培训和实验操作。在理论培训课程当中，卫生部临床检验中心的李金明教授为我们详细讲解了《临床基因扩增实验室设计及质量管理体系的建立》、《临床基因扩增检验的质量保证》等内容。通过学习，了解到临床PCR实验室设计必须遵循各区独立、注意风向、因地制宜，方便工作的原则。质量管理的内涵：写你所做的，做你所写的，记录你已做的，分析你已做的。认识到临床标本的正确采集、运送、保存的重要性，是临床检验的质量保证的关键性环节，是解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一。同时通过病例分析，对于临床基因扩增检验的检验前，检验中，检验后的质量控制，还有实验的结果处理和分析有了重新认识。对于实验室是否出现污染的鉴别，以及出现污染的处理措施有了深刻了解。

临床实验医学的发展现在经历了三个时代，分别是生化诊断时代，免疫诊断时代，和和现在的分子（基因）诊断时代，而现今时代的标志性技术正是PCR技术，是反映疾病本质的实验。正是有临床基因扩增检验技术在癌症等疾病的诊断方面有了多方应用，通过驱动基因的选择，为靶向治疗患者延长了生存期。为个体化诊疗中对疾病的鉴别诊断，诊治方案的设定提供重要的参考依据，同时也为治疗过程中临床对于治疗方案的调整提供依据。临床基因扩增检验技术在个体化诊疗中是不可或缺的一部分，是其重要的组成部分，具有强大的发展潜力和前景。

实验操作内容为EGFR突变基因检测。实验操作过程中，通过认真学习和细致听讲带教老师的规范实验操作，了解到了实验的关键操作，纠正了平常在临床实际工作操作上的一些不良习惯，为日后规范检验操作提供了基础。通过分组亲自操做实验，分析和判断自己的实验结果，做实验记录笔记，基本掌握EGFR突变基因检测。

通过为期六天的理论和实验培训，从中学习到了很多知识，掌握了严格的防污染以及污染的处理措施，了解到实验室设置的人流、物流、气流的走向设计原则，解决了日常工作中的实际问题，为日后临床基因扩增检验工作的开展打下了坚实的基础。了解到临床基因扩增检验技术的发展方向，受益匪浅。

第四篇：PCR实验室

高端PCR实验室控制设计说明

PCR实验室即分子生物学实验室，在医疗、科研、生物技术方面得到广泛的应用。因其在不同行业的应用各有区别，在具体设计时也有不同之处，就医疗机构的应用而言，主要使用三区或四区设计，即试剂准备区、样品提取区、扩增分析区；此类三区设计时候应用于类似荧光定量型或同类PCR分析设备，及扩增与分析过程在设备内一次完成。而四区设计在三区的基础上讲扩增分析区拆分为扩增区与分析区适用于其他类型的pcr设备及手工处理。

在PCR实验的设计上，经过多年的经验累积，已经在一些关键技术上达成了共识。因为PCR实验中所产生的DNA与RNA片段过于微小，以至于可以穿透高效过滤器，所以在实验室设计上已经不在强制要求设计高效净化系统，但是为了提高实验环境水平及保护实验室内的敖贵设备方面，如果在具备条件的情况下可考虑追加高效空气净化系统；建议净化级别万级。在PCR实验中所产生的DNA与RNA片段污染是一直以来PCR实验的重点问题。此类污染主要至上次试验中所产生的基因片段对下次试验产生的污染，而且一旦试验环境中的污染形成后很难处理。因为消毒等传统方式对于基因污染没有很良好的效果。所以在PCR实验室设计中一般将整套实验室设计为全新风型实验室，这样而已通过有效的换气次数来达到净化室内污染的作用。而在控制方面也有很多不同之处，因为各单位对PCR实验的重视程度各有不同，所以在设计上也有不同，主要的控制设计有定送定排式压力控制系统、变送定排式压力控制系统变送变排式压力控制系统。在控制设备方面也有很多区分如压力无关型控制系统、压力有关型控制系统。

根据业主要求，本PCR实验室为三区设计，各区可独立使用，不设置高效过滤系统等相关要求，根据业主以上要求，我方给出的设计方案为压力无关型变送变排压力控制系统。本系统的特点是，设备启动后可根据实验室内使用节点调节送风量及排风量来控制各房间状态，系统说明见下图

 每个房间可分别控制，使用时通过房间开关输出启动信号，当设备接到启动信号时设备运行，运行中根据管道压力反馈决定变频器大小，房间内送排风量由压力无关型风量调节阀控制。 当有多个房间开启或关闭时，设备更加管道压力反馈，调节设备变频器增加或减少送排风量来稳定管道压力。各房间内压力又房间内的压力无关型定风量阀进行控制。

 当BSC（生物安全柜，B2全排）开启时BSC专用供风机组运行，BSC-供风机-排风机连锁运转。

 当BSC做变风量调节时，根据房间内压力变化，BSC专用供风机组前安装的压力无关型变风量调节阀根据压力变化增减送风量，确保房间压力执行在可控范围内。

 当房间不适用时，房间与缓冲间均关闭电动密闭阀，确保房间处在密闭状态避免布朗运动造成的可能污染风险。

 房间换气次数均按照一定净化标准设计，当室内污染发生时，通过一定时间的换气处理后，污染问题可以基本解决。 本系统如果业主需要，可在室内送风口末端加装高效过滤设备，房间可升级为净化型实验室。

 压力无关型风阀简介：压力无关型风阀的特点是不会根据管道压力的变化而影响风阀内部的送风量，在一定管道压力区间内能够自行调节阀体阻力，来稳定送风量，是高端实验室必备的关键部件，目前此类阀体技术均有国外生产厂家控制，目前国内主用使用的产品有妥思、文丘里、西门子等品牌。

第五篇：PCR实验室

简介

Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据

条件

1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室;实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它 有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广 泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍

2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求;荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证;

4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行

5、必须在无菌无尘环境下进行操作

功能

能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药，病毒复制模板难以治疗，人体免疫耐受状态不易打破等医学难题，能迅速消除临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗体的血清转换速度，杀灭血液及肝细胞内的病毒，为防止再感染提供了长期保护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。

建立方法

1、建立样品准备区

这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。

2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。

3、建立前PCR区。

该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

4、PCR实验室试剂的操作。

⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

5、在前PCR区建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。⑶作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。

6、控制污染的方法。

已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG，这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。

7、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动