细胞凋亡实验技术总结

第一篇：细胞凋亡实验技术总结

细胞凋亡实验技术总结 一形态学检测

1、光学显微镜和倒置显微镜观察法

未染色细胞:凋亡细胞体积变小、变形，膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩，变圆，脱落。染色细胞:姬姆萨染色，瑞氏染色等。凋亡细胞染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状，形成凋亡小体。

2、荧光显微镜检测法-荧光染料

例如，碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。选用536nm 激发光，细胞核呈红色荧光。

3、电子显微镜

收集细胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋剂浸透后环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

4、激光扫描共焦显微镜技术

FITC-AnnexinV+PI双染，观察凋亡过程中细胞膜PS表面的变化，并区分正常细胞(An-PI-)，早期凋亡细胞(An+PI-)，晚期凋亡细胞及坏死细胞(An+PI+)，细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)。

二、细胞凋亡的生化及分子生物学检测

1、DNA 断裂检测法

如使用琼脂糖凝胶电泳检测，细胞凋亡时，核染色质凝聚，染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段。

2、膜联蛋白V 法

磷脂酰丝氨酸(PS)位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD 的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，与PS高亲和力。将Annexin-Ⅴ进行荧光素或生物素标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

3、细胞凋亡的酶Caspase检测

检测Caspase活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物，或用人工底物检测酶活力，也可对活化的Caspase做亲和标记。例如分析底物的水解产物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一个被认识的caspase-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000 及相对分子质量为25000 的两个片段，用抗相对分子质量为85000 片段的抗体检测细胞是否发生凋亡。

4、线粒体膜势能变化的检测

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱反映了线粒体内膜电负性的增高或降低流式细胞仪检测细胞的荧光强度或荧光显微镜观察，拍照正常细胞中, Rh123 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而凋亡时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光。

第二篇：细胞凋亡总结

细胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。

1．细胞凋亡的意义 细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。由于细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义，至今仍是生物医学研究的热点。细胞凋亡过多可引起疾病发生，如：①爱滋病的发展过程中，CD4+T细胞数目的减少；②移植排斥反应中，细胞毒性T细胞介导的细胞死亡；③缺血及再灌注损伤，导致心肌细胞和神经细胞的凋亡增多；④神经系统退化性疾病（Alzheimer病、Parkinson's病）的重要原因是细胞凋亡的异常增加。神经细胞的凋亡参与老化及Alzheimer病的发生。Alzheimer氏病是一种常见的老年病，患者在临床上表现为进行性的智力减退。⑤暴露于电离辐射可引起多种组织细胞的凋亡。细胞凋亡过少也可引起疾病发生：在肿瘤的发生过程中，诱导凋亡的基因如p53等失活、突变，而抑制凋亡的基因如bCL-2等过度表达，都会引起细胞凋亡显著减少，在肿瘤发病学中具有重要意义；针对自身抗原的淋巴细胞的凋亡障碍可导致自身免疫性疾病；某些病毒能抑制其感染细胞的凋亡而使病毒存活。

2．细胞凋亡的形态变化 电镜下细胞凋亡的形态学变化是多阶段的，可分为 ①细胞浆浓缩，核糖体、线粒体等聚集，细胞体积缩小，结构更加紧密； ②染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边，嗜碱性增强。细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不一的片段：

③胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由胞膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies)。凋亡小体内可含细胞浆、细胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小体被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解： ⑤凋亡发生过程中，细胞膜保持完整，细胞内容物不释放出来，所以不引起炎症反应。左图 典型凋亡小体：染色质呈新月状，并可见细胞器 右图 凋亡细胞：凋亡细胞(↑)与邻近细胞分离 细胞凋亡 光镜下凋亡一般累及单个或少数几个细胞，凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状。由于凋亡细胞迅速被吞噬，又无炎症反应，因此，在常规切片检查时，一般不易发现，但在某些组织如反应性增生的次级淋巴滤泡生发中心则易见到。病毒性肝炎时，嗜酸性小体形成即是细胞凋亡。

3．细胞凋亡的机制 细胞凋亡是一系列依赖能量的分子水平变化的终点，细胞凋亡过程包括以下4个阶段，即：诱导启动、细胞内调控、实施和凋亡细胞的吞噬搬运阶段。

（1）诱导启动 引起凋亡的信号可以来自细胞外，通过跨膜传导对细胞内的调控分子起作用；也可以直接作用于细胞内的靶分子。一些跨膜作用的抑制因子(如生长因子、某些激素、细胞因子、某些病毒蛋白等)具有抑制凋亡的作用，有利于细胞的生存。当这些因子缺乏时，会激发细胞凋亡。另外一些跨膜作用的刺激因子通过受体与配体的结合而激活细胞凋亡程序，其中最重要的是肿瘤坏死因子受体家族。此外，尚有多种其它凋亡诱导因子。在胚胎发育过程中，形态发生蛋白、生长因子、分化因子对细胞凋亡可起促进作用，又可起抑制作用。

（2）细胞内调控 细胞内的某些特异蛋白与细胞死亡信号相连接，这些特异蛋白对细胞的死亡与否起决定作用。BCL-2蛋白家族(BCL-2 family of proteins)是调节线粒体通透性的主要成分，通过形成同源(BCL-2/BCL-2, Bax/Bax)和异源(BCL-2/Bax)二聚体对细胞凋亡进行调控。BCL-2同源二聚体抑制细胞凋亡，Bax同源二聚体促进细胞凋亡。此外，细胞表面受体Fas(CD95)，属TNFR家族，当免疫细胞产生的Fas的配体与T细胞表面的Fas结合时，也启动了死亡程序。这种Fas-Fas配体介导的凋亡在清除免疫反应(如自身免疫病)中被激活的淋巴细胞非常重要。细胞凋亡后的梯状DNA 足叶乙甙诱导白血病细胞凋亡后的梯状DNA

（3）凋亡的实施 细胞凋亡的实施是通过蛋白水解的一系列连锁反应实现的。各种组织的细胞凋亡都要激活caspase家族。Caspase成员作为酶原的形式存在于细胞内，经裂解激活后，迅速启动序列性酶解死亡程序，裂解细胞骨架和细胞核蛋白基质并激活了核酸内切酶。在内源性核酸内切酶作用下，DNA进行有控降解，产生长度为180～200 bp整倍数的DNA片段，这正好是缠绕组蛋白多聚体的长度，提示染色质DNA恰好是在核小体与核小体连接部被切断。DNA琼脂糖凝胶电泳出现ladder也成为检测凋亡发生的重要标志。

（4）凋亡细胞的吞噬搬运 凋亡细胞碎片的表面有标志分子(血小板反应素、粘附糖蛋白)有利于临近的巨噬细胞以及其他细胞的识别、吞噬和处理。凋亡细胞的吞噬搬运过程非常有效而迅速，凋亡细胞很快消失，不留痕迹，也无炎症反应。

4．细胞凋亡与坏死的区别 凋亡 坏死

1机制 基因调控的程序化（programmed）细胞死亡，主动进行（自杀性）意外事故性（accident）细胞死亡，被动进行（他杀性）

2诱因 生理性或轻微病理性刺激因子诱导发生，如生长因子缺乏 病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、感染、中毒 死亡范围 多为散在的单个细胞 多为聚集的大片细胞

3形态特征 细胞固缩，核染色质边集，细胞膜及各细胞器膜完整，膜可发泡成芽，形成凋亡小体 细胞肿胀，核染色质絮状或边集，细胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶酶体酶释放，细胞自溶

4生化特征 耗能的主动过程，有新蛋白合成，DNA早期规律降解为180-200bp片段，琼脂凝胶电泳呈特征性梯带状 不耗能的被动过程，无新蛋白合成，DNA降解不规律，片段大小不一，琼脂凝胶电泳不呈梯带状

5周围反应 不引起周围组织炎症反应和修复再生，但凋亡小体可被邻近细胞吞噬 引起周围组织炎症反应和修复再生

细胞自噬

细胞自噬的生理功能

1及时清除细胞中随时产生的“垃圾”（如破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、合成错误或折叠错误的蛋白质等），2维持细胞自稳状态.无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的

3.同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质，又可为细胞提供一定的能量和合成底物.可以说，细胞自噬就是一个“备用仓库”.鉴于上述作用，在正常生理情况下，细胞自噬可以帮助细胞在缺乏营养的恶劣环境中生存.自噬也可为肿瘤细胞带来几大好处：

（1）首先，肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机

（2）（2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件.(3)另外，抑制细胞自噬可以导致细胞更容易发生凋亡，然而，细胞自噬在肿瘤的生成和癌症的发展中到底扮演怎样的角色，目前还没有取得广泛一致的意见.细胞自噬可以抑制细胞发生癌变，可能产生于以下几种机制

(1)细胞自噬的抑制会加重坏死细胞的局部炎症反应，从而导致肿瘤的生长(2)而细胞自噬可以清除坏死的细胞器，调整内源性的压力，从而稳定基因组,减少细胞向癌细胞的转变.(3)细胞自噬既可以加强细胞检验点的检查作用，又起到了稳定基因组的作用，从而减少了细胞的癌变

第三篇：生物细胞凋亡总结

课程报告

都在说二十一世纪是生命科学的世纪，很荣幸能够进入生物科学这个行业。

关于对自己所学专业，可能最初是兴趣让我来到这个专业，不是太清楚为什么会对这个专业有这么大的热情，但真的很喜欢它。生物技术，最官方的定义是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。生物技术是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。它主要包括发酵技术和现代生物技术。现代生物技术综合基因工程、分子生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、有机化学、无机化学、物理化学、物理学、信息学及计算机科学等多学科技术，可用于研究生命活动的规律和提供产品为社会服务等。

再我自己看来生物技术其实是一个既可以看做一个基础学科也可以看做是一个很新兴的，综合性的学科。其实生物技术这是一个很综合性的学科，现在和很多领域接轨，对我们而言这是机遇和挑战。

对我自己而言，我想在生物技术这方面有所建树，最主要的还是在科研方面能攻克一些难题，虽然可能现在想法不是太成熟但是我相信经过几年的磨练与努力我能够攻破这些难题。希望能够在大一下就能够进入实验室，学一些基础的实验技能为以后自己做项目打下基础。

然后关于自己的专业，现在我们所学的知识其实普遍落后，教科书的编排更新不及时，可能我们学到的东西可能学校外面已经开始产业化了，测序技术已经开始第四代了，而我们可能毕业前一年才开始学习切片制作，学习的东西很古老，再就是我们这个专业，并没有像其他几大理科领域一样有清晰的逻辑和量化，这导致了很多小领域只有开头和结果而没有一个可复制的过程，而没有可复制的过程就代表着无法带领这个行业产业化，因此，这个行业在没有开源的情况下就无法支撑这个领域下的大多数学生的温饱，就只能节流，这样就导致了本专业的人才无法继续从事与本专业有关行业，转而从事其他行业，从而导致人才流失，最终专业发展缓慢。而谈到生物技术不得不说到它和其他行业接轨这一问题，的确，和其他领域接轨形成交叉学科是一个理想的出路，如合成生物学，生物信息学，的确给生物注入了一股生机。但是我们都知道越巨大的事物迈步子很大也很缓慢，何况在人才流失的情况下。

说到这里，可能真的学习这个专业我们更多的是在学习了基础课程后，自己学习最新更新的知识，在老师的指导下自己收集资料自己进行实验，再完成项目。

很多人对生物技术这个专业有很多的误解，我们在完成自己研究项目的同时也有义务科普大众。毕竟这也是吸引人才的重要途径，同时也是解决本专业人才流失的好方法。

我自己有一个不成熟的想法，很久之前曾了解到俄罗斯的“永生计划”它的设计活体意识转移到机器人身上，对此几乎大多数人是不看好，不支持的。而对于这个“永生计划” 我有一个想法，癌细胞是无限增殖，如果我们能够完全弄清楚癌细胞的增殖过程及机理，并能够运用到人体衰老细胞中，对衰老细胞进行基因修饰添加经过改良的癌细胞中能够无限增殖的基因，或许“永生”并非不可能。同样的癌细胞的无限增殖基因或许也能在器官移植这一领域有所贡献，也是利用无限增殖，让器官细胞增殖，成长成完整的细胞。或许研究出癌细胞无限增殖的机理并提取其这个基因对人类会有很大贡献。

至于疑惑这个方面就是在教材更新换代不及时的情况下，我们是否只能通过课外阅读这些方式来扩展自己的知识面，还有就是技术的更新我们是否能够跟的上，倘若有同学本科毕业便想进入行业工作，最新的技术他们又要从何学习。最后关于实验室，毕竟如果想要真的从事生物研究该如何合理利用现有资源来完成自己的项目。

最后我个人的话最想获得的是关于癌细胞无限增殖机理方面的指导，和我不成熟构想的可实施率。

以上是我个人对本专业的认识及理解，以及对未来设想。

谢谢老师阅读，有不正确的地方请老师批评指正。

第四篇：细胞凋亡检测方法总结

1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。右上象限为独立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。

PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合。

所以

Annexin-V阴性-PI阴性 代表正常细胞

Annexin-V阳性-PI阴性 代表凋亡早期的细胞

Annexin-V阳性-PI阳性 代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞

Annexin-V阴性-PI阳性 一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。（还有一种说法是凋亡最后阶段的细胞，细胞已经没有细胞膜了说以不结合Annexin-V而只结合PI）

2.线粒体膜电位变化的检测

实验原理

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（FL-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（FL-1 通道）。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1 单体的最大激发波长为 514nm，最大发射波长为 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为 585nm，最大发射波长为 590nm。

A-C 为对照，细胞亚群(R1)在 FL-2和FL-1 通道同时显示 JC-1 的荧光信号。D-F 显示 JC-1在FL-2通道荧光信号降低的细胞亚群(R2)显著增加，证明线粒体膜电位△Ψm 下降，细胞发生凋亡。凋亡与线粒体膜电位的去极化相关。细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，JC-1进入线粒体以单体形式存在，仅在Fl-1通道有荧光。

检测原理

正常细胞：JC-1聚集在线粒体内，形成多聚体，呈鲜红色荧光，细胞质内有绿色；即红光++，绿光++。

凋亡细胞：由于线粒体跨膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，红色荧光减弱，单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。即红光+，绿光++

3、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

(1)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

(2)荧光分光光度计分析

检测原理：活化的Caspsae与其特异性底物DEVD-pNA结合切割，释放出游离pNA，通过测定其吸光度，根据其发光强度的高低代表其活化程度。

(3)流式细胞术分析

PharMingen 多克隆或单克隆 Caspase-3 抗体可以识别 Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的 Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端, 荧光标记多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗体为流式细胞术分析凋亡细胞的 Caspase-3 而设计。1、2、3是早期凋亡现象；

4、5是晚期凋亡现象。

4、TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

5、DNA ladder 细胞凋亡晚期，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。在琼脂糖凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。坏死细胞---连续性条带。

一、形态学观察方法

1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。【苏木精 — 伊红染色法，(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。】

2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

一、细胞凋亡的形态学检测

1、光学显微镜和倒置显微镜

（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342(Hoechst 33342)，HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

3、透射电子显微镜观察

结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。图2

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

第五篇：细胞的衰老和凋亡说课稿

《细胞的衰老和凋亡》说 课 稿

老师、同学们，大家好！我叫XX，来自XX班。今天我要进行说课的内容是细胞的衰老和凋亡

首先，我对本节内容进行分析

1.说教材

1.1说教材的地位和作用

《细胞的衰老和凋亡》是教材高中生物必修本第6单元第3节内容。在此之前，学生们已经在第一节和第二节的学习中学习了细胞的增殖和分化, 细胞的分裂、分化、衰老、死亡是生命的必然。因此，细胞的衰老和凋亡是生命活动中必不可少的过程。对于细胞衰老和凋亡的学习，能使学生对细胞的整个生命过程有个完整的认识。同时细胞衰亡机制的研究与生物科技的发展息息相关。对细胞衰亡知识的学习，有助于培养学生的科学兴趣，培养学生的创新意识，而细胞的衰老及凋亡是细胞必须经过的阶段，因此，本节内容在细胞的生命历程中具有不容忽视的重要的地位。

1.2说教学目标

根据本教材的结构和内容分析，结合着高一年级学生的认知结构及其心理特征，我制定了以下的教学目标：

1.2.1认知目标：描述细胞衰老的特征

简述细胞凋亡与细胞坏死的区别

1.2.2能力目标：进行与社会老龄化相关的问题的资料搜集和分析 1.2.3情感、态度、价值观目标：探讨细胞的衰老和凋亡与人体健康的关系，关注老年人的健康状况，培养学生关爱老人、关注社会问题

1.3说教学的重、难点

1.3.1教学重点：

1、个体衰老与细胞衰老的关系，细胞衰老的特征

2、细胞凋亡的含义

1.3.2细胞坏死与细胞凋亡在形态学和生物化学上有着明显的区别，对于高一的学生来讲比较容易混淆，因为我把教学难点定为：细胞凋亡的含义以及细胞坏死的区别

1.4课时安排：1课时 1.5教具：多媒体课件 2.教材处理

2.1学情分析

学生已经学习了细胞的增殖、分化的内容，对本章的内容已经有了初步的认识和理解，明确了细胞的分化、衰老和死亡是一个完整的生命过程。本节的内容比较接近现实生活，可以利用现实生活中的例子加以说明，使学生有个直观的认识，同时也可以培养学生知识的应用能力和知识的迁移能力。

2.2教学策略

由于细胞的衰老和凋亡与人的衰老和寿命有关，学生易感兴趣。可以通过调查人体衰老的特征，讨论如何延缓衰老，延长寿命，引出个体衰老与细胞衰老的关系。个体衰老与细胞衰老有关，但二者又不能划等号。可围绕这一问题创设问题情境，让学生展开讨论，并为讲述细胞衰老的特征作铺垫。比如通过比较老年人和青年人的外形区别，引入到细胞衰老的特征。通过对老年人“老年斑、皱纹和白头发”的分析，共同归纳出细胞衰老的特征。细胞衰老的原因一直是研究的热点和难点，至今有多种学说，学生接受起来有一定的难度，教科书处理为选学内容，因此在讲到这一部分时点到即可，可适当引导学生自己进行阅读，有兴趣的也可以在课后通过其他途径进行学习。最后从生物的寿命引入，探讨细胞的死亡。强调细胞死亡有两种形式。1.细胞坏死，它是由某些外界因素造成细胞急速死亡，是一种被动性死亡；2.细胞凋亡，这是一种由特定基因控制的主动性死亡。并对他们的区别加以强调。

对学生进行关爱他人、关注社会问题的情感教育，应鼓励学生课下完成教材中的“资料搜集和分析——社会老龄化的相关问题”的活动。

2.3教学方法 2.3.1说教法

我们都知道生物是一门培养人的实践能力的重要学科。因此，在教学过程中，不仅要使学生“知其然”，还要使学生“知其所以然”。我们在以师生既为主体，又为客体的原则下，展现获取理论知识、解决实际问题方法的思维过程。

考虑到高一年级学生的现状，我主要采取学生活动的教学方法，让学生真正的参与活动，而且在活动中得到认识和体验，产生践行的愿望。培养学生将课堂教学和自己的行动结合起来，充分引导学生全面的看待发生在身边的现象，发展思辩能力，注重学生的心理状况。

当然教师自身也是非常重要的教学资源。教师本人应该通过课堂教学感染和激励学生，充分调动起学生参与活动的积极性，激发学生对解决实际问题的渴望，并且要培养学生以理论联系实际的能力，从而达到最佳的教学效果。同时也体现了课改的精神。

基于本节课内容的特点，我主要采用了以下的教学方法： 2.3.1.1直观演示法：

利用课本上的图片和现实生活中的实例进行直观演示，比如在讲到细胞衰老的特征时，可用图片进行比较，以此来激发学生的学习兴趣，活跃课堂气氛，促进学生对知识的掌握。

2.3.1.2活动探究法 引导学生通过创设情景等活动形式获取知识，以学生为主体，使学生的独立探索性得到了充分的发挥，培养学生的自学能力、思维能力、活动组织能力。比如在第一部分讲到个体衰老时，可让学生运用自己的经验来说说老人身上与我们相比有哪些不同，培养学生的总结组织能力等。

2.3.1.3集体讨论法

针对课堂上提出的问题，组织学生进行集体和分组讨论，促使学生在学习中解决问题，培养学生解决问题的能力以及团结协作的精神。比如在比较细胞凋亡与坏死的区别时可以让学生先进行小组讨论，再进行总结，而不是单一地接受教师传授的观点。

2.3.2说学法

我们常说：“现代的文盲不是不懂字的人，而是没有掌握学习方法的人”，因而，我在教学过程中特别重视学法的指导。让学生从机械的“学答”向“学问”转变，从“学会”向“会学”转变，成为真正的学习的主人。在本课的学习中，教师指导学生在自主学习的基础上，通过小组讨论，分析比较，归纳对比等方法完成学习任务，在学习过程中，教师可以将学生分为若干学习小组，让成员间协作学习，进行讨论，从而创设一个自主的良好的学习氛围，让每个学生积极参与其中，认真思索，充分体现主体作用。

3.说教学流程

（1）课前准备：对学生进行分组，布置学生进行预习，并对课本上的“问题探讨”进行思考及小组内部讨论

（2）以小组为单位，说说小组对“问题探讨”的讨论结果（3）由“问题探讨”引入个体衰老与细胞衰老的关系（4）总结细胞衰老的特征

（5）运用讲授法讲解细胞凋亡和细胞坏死的含义，并引导学生进行比较讨论，从而加深两者间区别的理解

（6）练习巩固，并引导学生进行课后进行书本中的关于社会老龄化相关问题的资料搜集和分析

4.教学设计 4.1课前准备 4.2导入新课：

由上节课学过的知识和教材开头的情景设置导入新课。

导语设计的依据：一是概括了旧知识，引出新知识，温故而知新，使学生能够知道新知识和旧知识之间的联系。二是使学生明确本节课要讲述的内容，以激发起学生的求知欲望。这是生物教学非常重要的一个环节。