分子生物学讲稿（共五篇）

第一篇：分子生物学讲稿

硕士研究生公共选修课

分子生物学讲稿

浙江大学生物技术研究所

胡东维

二零零三年八月修改

概

论

一、分子生物学的基本含义

分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。

所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。

二、分子生物学的主要研究内容

1.核酸的分子生物学

核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（molecular genetics）是其主要组成部分。由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（central dogma）是其理论体系的核心。

2.蛋白质的分子生物学

蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及 1 其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。

3.细胞信号转导的分子生物学

细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。

三、分子生物学发展简史

1．准备和酝酿阶段

19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：

确定了蛋白质是生命的主要基础物质

19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，酶是生物催化剂。20世纪20-40年代提纯和结晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黄酶、细胞色素C、肌动蛋白等），证明酶的本质是蛋白质。随后陆续发现生命的许多基本现象（物质代谢、能量代谢、消化、呼吸、运动等）都与酶和蛋白质相联系，可以用提纯的酶或蛋白质在体外实验中重复出来。在此期间对蛋白质结构的认识也有较大的进步。1902年Emil Fisher证明蛋白质结构是多肽；40年代末，Sanger创立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman发展异硫氰酸苯酯法分析肽链N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一个

多肽分子--胰岛素A链和B链的氨基全序列分析。由于结晶X-线衍射分析技术的发展，1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋结构模型。所以在这阶段对蛋白质一级结构和空间结构都有了认识。确定了生物遗传的物质基础是DNA

虽然1868年F.Miescher就发现了核素（nuclein），但是在此后的半个多世纪中并未引起重视。20世纪20-30年代已确认自然界有DNA和RNA两类核酸，并阐明了核苷酸的组成。由于当时对核苷酸和碱基的定量分析不够精确，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的结果，因而曾长期认为DNA结构只是“四核苷酸”单位的重复，不具有多样性，不能携带更多的信息，当时对携带遗传信息的侯选分子更多的是考虑蛋白质。40年代以后实验的事实使人们对核酸的功能和结构两方面的认识都有了长足的进步。1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA；1952年A.D.Hershey和M.Chase用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了是遗传物质。在对DNA结构的研究上，1949-52年S.Furbery等的X-线衍射分析阐明了核苷酸并非平面的空间构像，提出了DNA是螺旋结构；1948-1953年Chargaff等用新的层析和电泳技术分析组成DNA的碱基和核苷酸量，积累了大量的数据，提出了DNA碱基组成A=T、G=C的Chargaff规则，为碱基配对的DNA结构认识打下了基础。2．现代分子生物学的建立和发展阶段

这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。DNA双螺旋发现的最深刻意义在于：确立了核酸作为信息分子的结构基础;提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。在此期间的主要进展包括： 遗传信息传递中心法则的建立

在发现DNA双螺旋结构同时，Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl 用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明；1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型；1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物；70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性做了分析研究；这些都逐渐完善了对DNA复制机理的认识。

在研究DNA复制将遗传信息传给子代的同时，提出了RNA在遗传信息传到蛋白质过程中起着中介作用的假说。1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补；逐步阐明了RNA转录合成的机理。

在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。50年代初Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体（microsome）是细胞内蛋白质合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设；1961年Brenner及Gross等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合；1965年Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构；特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码，随后研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性，从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。

上述重要发现共同建立了以中心法则为基础的分子遗传学基本理论体系。1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶，又进一步补充和完善了遗传信息传递的中心法则。对蛋白质结构与功能的进一步认识

1956-58年Anfinsen和White根据对酶蛋白的变性和复性实验，提出蛋白质的三维空间结构是由其氨基酸序列来确定的。1958年Ingram证明正常的血红蛋白与镰刀状细胞溶血症病人的血红蛋白之间，亚基的肽链上仅有一个氨基酸残基的差别，使人们对蛋白质一级结构影响功能有了深刻的印象。与此同时，对蛋白质研究的手段也有改进，1969年Weber开始应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量；60年代先后分析得血红蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白质的一级结构；1973年氨基酸序列自动测定仪问世。中国科学家在1965年人工合成了牛胰岛素；4 在1973年用1.8AX-线衍射分析法测定了牛胰岛素的空间结构，为认识蛋白质的结构做出了重要贡献。

3．初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段

70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。其间的重大成就包括： 重组DNA技术的建立和发展

分子生物学理论和技术发展的积累使得基因工程技术的出现成为必然。1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌，使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成，打破了种属界限；1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽；1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功；1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素。至今我国已有人干扰素、人白介素

2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用，世界上还有几百种基因工程药物及其它基因工程产品在研制中，成为当今农业和医药业发展的重要方向，将对医学和工农业发展作出新贡献。

转基因动植物和基因剔除动植物的成功是基因工程技术发展的结果。1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内，培育得到比原小鼠个体大几倍的“巨鼠”，激起了人们创造优良品系家畜的热情。我国水生生物研究所将生长激素基因转入鱼受精卵，得到的转基因鱼的生长显著加快、个体增大；转基因猪也正在研制中。用转基因动物还能获取治疗人类疾病的重要蛋白质，导入了凝血因子Ⅸ基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子Ⅸ，能有效地用于血友病的治疗。在转基因植物方面，1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场，1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产，美国最早研制得到抗虫棉花，我国科学家将自己发现的蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。到1996年全世界已有250万公顷土地种植转基因植物。

基因诊断与基因治疗是基因工程在医学领域发展的一个重要方面。1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入 重组的ADA基因，获得成功。我国也在1994年用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。在我国用作基因诊断的试剂盒已有近百种之多。基因诊断和基因治疗正在发展之中。

这时期基因工程的迅速进步得益于许多分子生物学新技术的不断涌现。包括：核酸的化学合成从手工发展到全自动合成，1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法；90年代全自动核酸序列测定仪的问世；1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技术，更以其高灵敏度和特异性被广泛应用，对分子生物学的发展起到了重大的推动作用。

基因组研究的发展

目前分子生物学已经从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。1977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的序列；1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对碱基序列；80年代λ噬菌体DNA全部48，502碱基对的序列全部测出；一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因组的全序列也陆续被测定；1996年底许多科学家共同努力测出了大肠杆菌基因组DNA的全序列长4x106碱基对。测定一个生物基因组核酸的全序列无疑对理解这一生物的生命信息及其功能有极大的意义。1990年人类基因组计划（Human Genome Project）开始实施，这是生命科学领域有史以来全球性最庞大的研究计划。2002和2003年完成了水稻和人类全基因组。更多的基因组学研究工作正在铺开。

此外。功能基因组学的研究正在生命各学科快速展开。单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展

1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体以来，人们利用这一细胞工程技术研制出多种单克隆抗体，为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。80年代以后随着基因工程抗体技术而相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌合抗体、重构抗体、双功能抗体等为广泛和有效的应用单克隆抗体提供了广阔的前景。基因表达调控机理

分子遗传学基本理论建立者Jacob和Monod最早提出的操纵元学说打开了人类认识基因表达6 调控的窗口，在分子遗传学基本理论建立的60年代，人们主要认识了原核生物基因表达调控的一些规律，70年代以后才逐渐认识了真核基因组结构和调控的复杂性。1977年最先发现猴SV40病毒和腺病毒中编码蛋白质的基因序列是不连续的，这种基因内部的间隔区（内含子）在真核基因组中是普遍存在的，揭开了认识真核基因组结构和调控的序幕。1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接，从而发现核酶（ribozyme）。80-90年代，使人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式转录因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是基因表达调控根本所在。

细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域

细胞信号转导机理的研究可以追述至50年代。Sutherland1957年发现cAMP、1965年提出第二信使学说，是人们认识受体介导的细胞信号转导的第一个里程碑。1977年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，将G蛋白与腺苷环化酶的作用相联系起来，深化了对G蛋白偶联信号转导途径的认识。70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的发现、蛋白酪氨酸激酶的发现及其结构与功能的深入研究、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等，使近10年来细胞信号转导的研究更有了长足的进步。目前，对于某些细胞中的一些信号转导途径已经有了初步的认识，尤其是在免疫活性细胞对抗原的识别及其活化信号的传递途径方面和细胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，当然要达到最终目标还需相当长时间的努力。

以上简要介绍了分子生物学的发展过程，可以看到在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，推动着整个生命科学的发展。至今分子生物学仍在迅速发展中，新成果、新技术不断涌现，这也从另一方面说明分子生物学发展还处在初级阶段。分子生物学已建立的基本规律给人们认识生命的本质指出了光明的前景，但分子生物学的历史还短，积累的资料还不够，例如：在地球上千姿万态的生物携带庞大的生命信息，迄今人类所了解的只是极少的一部分，还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律；又如人类基因组DNA 3x109 bp的全序列，包括了3万多个基因的一级结构，但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调，要理解近90%不为蛋白质编码的序列的作用等等，都还要经历漫长的研究道路。

第二篇：分子生物学技术

生物实验室安全常识（废液处理篇）生物谷

生物谷编者按：

我们的生物实验室存在多少危险？

生物实验对我们操作人员造成了怎样的危害？ 实验室工程菌外流对我们环境的影响有几多？

这些平时并不引起我们注意的隐患也许会给我们自身健康，或者环境带来长远的影响，因此生物通网站联合《遗传》、《中国生物工程杂志》、《生命世界》杂志开展2007赛默飞世尔中国生物实验室安全现状调查活动，提出警示，珍惜生命！此次活动的现状调查报告将发于相关部门，提出宝贵意见的读者将有机会获得精美礼品。

实验室的污染主要有生物性污染和化学污染两种。如按形态分则可大致分为废水、废气和固体污染物三种。其中生物污染包括生物废弃物污染和生物细菌毒素污染，如血液、尿、粪便、各种电泳液、特种生物试剂等。而化学污染则包括有机物污染和无机物污染。除此以外，还有部分实验室存在放射性污染。在此次赛默飞世尔中国生物实验室安全调查活动中，从现有调查结果中，我们惊讶的发现许多生物实验室存在严重的污染问题，而其中又以废液废品的处理为最，大部分实验室在进行生物实验过程中产生的大量高浓度含有害微生物的培养液、培养基，未经适当的灭菌处理而直接外排，而且许多实验室的下水道与附近居民的下水道相通，污染物通过下水道形成交叉污染，最后流入河中或者渗入地下，时间长了将造成不可估量的危害。

由于目前虽然国家环保总局将各类实验室纳入环保监管范围，但是许多实验室仍然处于监控真空状态，缺乏规章制度、缺乏实验室污染控制的经费投入、缺乏对实验室的监管等各种原因导致了实验室成为了污染源，对环境造成了威胁，这些种种都需要社会各界的共同关注。

生物实验室产生的废液污染主要是化学性污染和生物性污染，另外还有放射性污染，化学性污染包括有机物污染和无机物污染。有机物污染主要是有机试剂污染和有机样品污染。在大多数情况下，实验室中的有机试剂并不直接参与发生反应，仅仅起溶剂作用，因此消耗的有机试剂以各种形式排放到周边的环境中，排放总量大致就相当于试剂的消耗量。日复一日，年复一年，排放量十分可观。有机样品污染包括一些剧毒的有机样品，如农药、苯并(α)芘、黄曲霉毒素、亚硝胺等。无机物污染有强酸、强碱的污染，重金属污染，氰化物污染等。其中汞、砷、铅、镉、铬等重金属的毒性不仅强，且有在人体中有蓄积性。

生物性污染包括生物废弃物污染和生物细菌毒素污染。生物废弃物有检验实验室的标本，如血液、尿、粪便、痰液和呕吐物等；检验用品，如实验器材、细菌培养基和细菌阳性标本等。生物实验室的通风设备设计不完善或实验过程个人安全保护漏洞，会使生物细菌毒素扩散传播，带来污染，甚至带来严重不良后果。2003年非典流行肆虐后，许多生物实验室加强对SAS病毒的研究，之后报道的非典感染者，多是科研工作者在实验室研究时被感染的。在对这些污染处理的时候，需要注意以下几个方面：

废液的浓度超过规定的浓度时，必须进行处理。但处理设施比较齐全时，往往把废液的处理浓度限制放宽。 最好先将废液分别处理，如果是贮存后一并处理时，虽然其处理方法将有所不同，但原则上要将可以统一处理的各种化合物收集后进行处理。 处理含有络离子、螯合物之类的废液时，如果有干扰成份存在，要把含有这些成份的废液另外收集。

下面所列的废液不能互相混合：

①过氧化物与有机物；②氰化物、硫化物、次氯酸盐与酸；③盐酸、氢氟酸等挥发性酸与不挥发性酸；④浓硫酸、磺酸、羟基酸、聚磷酸等酸类与其它的酸；⑤铵盐、挥发性胺与碱。

要选择没有破损及不会被废液腐蚀的容器进行收集。将所收集的废液的成份及含量，贴上明显的标签，并置于安全的地点保存。特别是毒性大的废液，尤要十分注意。 对硫醇、胺等会发出臭味的废液和会发生氰、磷化氢等有毒气体的废液，以及易燃性大的二硫化碳、乙醚之类废液，要把它加以适当的处理，防止泄漏，并应尽快进行处理。 含有过氧化物、硝化甘油之类爆炸性物质的废液，要谨慎地操作，并应尽快处理。 含有放射性物质的废弃物，用另外的方法收集，并必须严格按照有关的规定，严防泄漏，谨慎地进行处理。

另外不同种类的废液等污染也要进行不同的处理：

一、化学类废物

一般的有毒气体可通过通风橱或通风管道，经空气稀释排出。大量的有毒气体必须通过与氧充分燃烧或吸收处理后才能排放。废液应根据其化学特性选择合适的容器和存放地点，通过密闭容器存放，不可混合贮存，容器标签必须标明废物种类、贮存时间，定期处理。一般废液可通过酸碱中和、混凝沉淀、次氯酸钠氧化处理后排放，有机溶剂废液应根据性质进行回收。

1.含汞废液的处理

排放标准3：废液中汞的最高容许排放浓度为0.05mg/L(以Hg计)。

处理方法：①硫化物共沉淀法：先将含汞盐的废液的pH值调至8-10，然后加入过量的Na2S，使其生成HgS沉淀。再加入FeS04(共沉淀剂)，与过量的S2-生成FeS沉淀，将悬浮在水中难以沉淀的HgS微粒吸附共沉淀．然后静置、分离，再经离心、过滤，滤液的含汞量可降至0.05mg/L以下。[2] ②还原法：用铜屑、铁屑、锌粒、硼氢化钠等作还原剂，可以直接回收金属汞。2.含镉废液的处理 ①氢氧化物沉淀法：在含镉的废液中投加石灰，调节pH值至10.5以上，充分搅拌后放置，使镉离子变为难溶的Cd(OH)2沉淀．分离沉淀，用双硫腙分光光度法检测滤液中的Cd离子后(降至0.1mg/L以下)，将滤液中和至pH值约为7，然后排放。

②离子交换法：利用Cd2+离子比水中其它离子与阳离子交换树脂有更强的结合力，优先交换． 3.含铅废液的处理 在废液中加入消石灰，调节至pH值大于11，使废液中的铅生成Pb(OH)2沉淀．然后加入Al2(S04)3(凝聚剂)，将pH值降至7-8，则Pb(OH)2与Al(OH)3共沉淀，分离沉淀，达标后，排放废液。4.含砷废液的处理

在含砷废液中加入FeCl3，使Fe／As达到50，然后用消石灰将废液的pH值控制在8-10。利用新生氢氧化物和砷的化合物共沉淀的吸附作用，除去废液中的砷。放置一夜，分离沉淀，达标后，排放废液。

5.含酚废液的处理

酚属剧毒类细胞原浆毒物，处理方法：低浓度的含酚废液可加入次氯酸钠或漂白粉煮一下，使酚分解为二氧化碳和水。如果是高浓度的含酚废液，可通过醋酸丁酯萃取，再加少量的氢氧化钠溶液反萃取，经调节pH值后进行蒸馏回收．处理后的废液排放。6.综合废液处理

用酸、碱调节废液PH为3-

4、加入铁粉，搅拌30min，然后用碱调节p H为9左右，继续搅拌10min，加入硫酸铝或碱式氯化铝混凝剂、进行混凝沉淀，上清液可直接排放，沉淀于废渣方式处理。

二、生物类废物

生物类废物应根据其病源特性、物理特性选择合适的容器和地点，专人分类收集进行消毒、烧毁处理，日产日清。

液体废物一般可加漂白粉进行氯化消毒处理。固体可燃性废物分类收集、处理、一律及时焚烧。固体非可燃性废物分类收集，可加漂白粉进行氯化消毒处理。满足消毒条件后作最终处置。

1.一次性使用的制品如手套、帽子、工作物、口罩等使用后放入污物袋内集中烧毁。

2.可重复利用的玻璃器材如玻片、吸管、玻瓶等可以用1000-3000mg/L有效氯溶液浸泡2-6h．然后清洗重新使用，或者废弃。3.盛标本的玻璃、塑料、搪瓷容器可煮沸15min.或者用1000mg/L有效氯漂白粉澄清液浸泡2-6h，消毒后用洗涤剂及流水刷洗、沥干；用于微生物培养的，用压力蒸汽灭菌后使用。4.微生物检验接种培养过的琼脂平板应压力灭菌30min，趁热将琼脂倒弃处理。

5.尿、唾液、血液等生物样品，加漂白粉搅拌后作用2-4h，倒入化粪池或厕所。或者进行焚烧处理。

三、放射性废弃物

一般实验室的放射性废弃物为中低水平放射性废弃物，将实验过程中产生的放射性废物收集在专门的污物桶内，桶的外部标明醒目的标志，根据放射性同位素的半衰期长短，分别采用贮存一定时间使其衰变和化学沉淀浓缩或焚烧后掩埋处理。

1.放射性同位素的半衰期短(如：碘131、磷32等)的废弃物，用专门的容器密闭后，放置于专门的贮存室，放置十个半衰期后排放或者焚烧处理。

2.放射性同位素的半衰期较长(如：铁

59、钻60等)的废弃物，液体可用蒸发、离子交换、混凝剂共沉淀等方法浓缩，装入容器集中埋于放射性废物坑内。除了这些需要注意的事项以外，处理废液等污染也需要一些安全可靠的产品，目前国际上公认的安全废液处理，回收等方面的产品来自赛默飞世儿公司，这在之前[驻外观察员特稿]美国与加拿大生物实验室废弃物处置 文中也可以看出来。这些废液处理小器具包括：

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。第二节 材料、设备及试剂

一、材料

含pBS的E.coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。

二、设备

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。

三、试剂

1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。

2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。

3、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。

4、溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。

5、3mol/l NaAc(pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。

6、溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。

7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％ SDS。

8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。

10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl(pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

11、氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。

按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

12、TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。

13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。

14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

15、电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液(5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。（2）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。第三节 操作步骤

一、细菌的培养和收集

将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。

二、质粒DNA少量快速提取

质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

（一）、煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

[注意] 1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。

2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。

3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。

（二）、碱法

1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。

6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。

7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。

9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

[注意] 1.提取过程应尽量保持低温。

2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。

3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。

（三）、Wizard少量 DNA 纯化系统

Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。

该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml)和50支Wizard微型柱。

1、1-3ml过夜培养细胞液4℃下 12000g离心1-2分钟。

2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。

3、加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。

4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。

6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。

7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。

8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。

9、取出微型柱置于eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。

10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，静止1分钟后，4℃下12000g离心20秒。

11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。

[注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。

三、质粒DNA的大量提取和纯化

在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

（一）、碱法

1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。

2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。

3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。

4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。

5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。

6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。

7、4℃下5000g离心15分钟。

8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。

9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。

11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。

13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

[注意] 1.提取过程中应尽量保持低温。

2.加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。

3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时),使DNA酶失活。

（二）、Wazard大量DNA纯化系统

碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。

该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA纯化树脂，125ml Wizard柱子洗脱溶液和10支 Wizard带有存储离心管的柱子。1、100-500ml细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g离心10分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。

2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20分钟。

3、加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。

4、14000g,22-25℃离心15分钟。

5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。

6、加0.5倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心15分钟。

7、弃上清,悬浮DNA沉淀于2ml TE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。

8、加10ml Wizard大量DNA纯化树脂溶液, 并涡旋混合。

9、每一个样品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega产品,与此配套)。

10、将树脂/DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA混合液。

11、将树脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。

12、真空抽干所加入的洗脱。

13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。

14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。

15、取出柱子，真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。

16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5分钟。

17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。[注意] 1.在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。

2.纯化树脂必须混匀后再用.（三）、Sephrose 2B柱纯化质粒DNA

碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA纯化。

1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。

2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。

3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。

4、以1ml流出液为1份进行收集。

5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。

6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。

7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟,然后4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。

8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。

9、沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。

[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱内的凝胶均匀。

思考题

1.质粒的基本性质有哪些？

2.质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？

3.在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？ 第二章 DNA酶切及凝胶电泳 未知

第二章 DNA酶切及凝胶电泳 第一节 概 述

一.DNA的限制性内切酶酶切分析

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。

构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。

在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。

二.凝胶电泳

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

1、DNA的分子大小:

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2、琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3、DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

4、电源电压

在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。

5、嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。

6、离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。

第二节 材料、设备及试剂

一、材料

λDNA: 购买或自行提取纯化;重组pBS质料或pUC19质粒;EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品;HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。

二、设备

水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。

三、试剂1、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。

2、6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液，贮存于 4℃。

3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。第三节 操作步骤

一、DNA酶切反应

1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。

3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。

二、DNA分子量标准的制备

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。

三、琼脂糖凝胶的制备

1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。

2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。

向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。

6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。

7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。

8、DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。

9、DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。

10、DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。[注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。

4、观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。

5、EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

6、当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。思考题

1.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动, 你认为可能是什么原因？

2.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？ 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 未知

第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第一节 概 述

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：

1.细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

2.质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

3.试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。第二节 材料、设备及试剂

一.材料

E.coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。

二.设备

恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。

三.试剂

1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。

2.Amp母液：配方见第一章。

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

第三节 操作步骤

一、受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

二、感受态细胞的制备(CaCl2 法)

1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

三、转化

1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。

5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

同时做两个对照:

对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

四、计算转化率

统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

思考题

1.制备感受态细胞的原理是什么？

2.如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？

第四章 RNA的提取和cDNA合成 未知

第四章 RNA的提取和cDNA合成 第一节 概 述

从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。

一、RNA制备

模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。

细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、cDNA第一链的合成

所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。

AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。

三、cDNA第二链的合成

cDNA第二链的合成方法有以下几种:

(1)自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。

(2)置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点:(1)非常有效;(2)直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化;(3)不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。

四、cDNA的分子克隆

已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。第二节 动植物组织mRNA提取

一、材料

水稻叶片或小鼠肝组织。

二、设备

研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

三、试剂

1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。

4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.05% SDS。

四、操作步骤

（一）动植物总RNA提取-Trizol法

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]

1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA提取

由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4、将

（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。[注意]

1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。第三节 植物病毒RNA提取

大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。

一、材料

提纯TMV病毒液（10mg/ml）。

二、设备

冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。

三、试剂

TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA酶的双菌水。

四、操作步骤

1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。

4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。

7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。[注意]

1、整个操作应尽可能在低温下进行。

2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。第四节 cDNA合成技术

一、Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技术

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H-)cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：

20μg 特异性引物

200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时);375mmol/l KCl;

15mmol/L MgCl2;50mmol/L DTT;10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂

10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H-

5μg 对照RNA

400μl M-MLV第二链缓冲液(10×)，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2;850mmol/L KCl;44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT;0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

（一）第一链合成 1.试剂

[α-32 P] dCTP(>400Ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液。

2.操作步骤

(1)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入

5×第一链缓冲液 5μl

rRNasin RNA酶抑制剂 25U

M-MLV(H-)反转录酶 200U

H2 O 调至总体积25μl

(2)用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP(>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

(3)37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时

(4)取出置于冰上

(5)掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。

(6)第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成

注：以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。

（二）第二链合成

1、取第一链反应液 20μl, 再依次加入

10×第二链缓冲液 20μl

DNA聚合酶Ⅰ 23μ

RNase H 0.8μ

H2O 加至终体积为100μl

2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA, 则需延长至3-4小时)。

4、掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。

5、cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟, 低速离心后置冰上。

6、加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃温浴10分钟。

7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。

8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。

9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃),-20℃放置30分钟后离心5分钟。

10、小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。

11、小心移去上清液,干燥沉淀。

12、沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。

（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析

1.试剂

1mg/ml鲑鱼精DNA，三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（30mM NaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。

2.操作步骤

(1)各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。

(2)同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。

(3)用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 这些样品代表掺入放射性活性。

(4)分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。

3.第一链产量测定

第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%

掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)

设330为每mol dNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=掺入dNTP(nmol)×330ng/nmol

mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng)/ 模板RNA量(ng)×100%

例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则:

掺入率＝3040/254000×100%=1.2

掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。

4.第二链产量计算

除需去除第一链掺入dNTP外,方法同第一链产量计算

第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??

掺入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率

第二链cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol

双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ng)/ 单链cDNA合成量(ng)

例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm.第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%

第二链合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol

合成第二链cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng

双链cDNA转变率=155ng /158ng×100%=98%

一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。

（四）电泳分析

通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章

（二）第二链合成中的9-12步，一般第一链和第二链上样量相同。

1.标准分子量DNA参照物的同位素标记

(1)通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶进行32 P标记

10×HindⅢ缓冲液 2.5μl

dATP 0.2mmol/L

dGTP 0.2mmol/L

[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol)2μCi

λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg

Klenow DNA聚合酶 1μ

加H2O 到总体积25μl

(2)室温放置10分钟, 加2.5μl 200mM EDTA终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。

2.电泳分析

(1)用50mM NaCl, 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。

(2)取样品液, 用TE调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉兰）。

(3)加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处，电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。

(4)将胶浸入7% TCA中,室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。

(5)用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。

二、其它cDNA合成技术

除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技术外，Promega公司还提供有多个AMV合成试剂盒，不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等，其余试剂一样，这些系统包括：

20mg 引物

20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下：

250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L

MgCl2;2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine);50mmol/L DTT;

20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。

50ml 40mM焦碳酸钠

625m rRNasin RNA酶抑制剂

600m AMV反转录酶

5mg 1.2kb对照RNA

200ml 10×第二链缓冲液，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl,pH7.2;900mmol/L KCl;30mmol/L

MgCl2;30mmol/L DTT;0.5mg/ml BSA。

2m E.Coli RNaseH

500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ

100m T4 DNA PolymeraseⅠ

1.5ml 不含核酸酶的水

以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。

（一）第一链合成

下面介绍的是25ml体积反应系统，该系统可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反应体积10ml，如5mg mRNA需55ml反应体积。

引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA的比例应分别保持为0.5mg/mg（对NotⅠ引物-延接头为0.3mg/mg）和15m/mg.1、试剂：

[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM和200mM)，TE饱和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE缓冲液(10mM Tris·Cl,pH8.0,1mm EDTA)。

2、操作步骤：

（1）取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管加入的RNA样品，及引物或引物-延接头，用H2O调节0.5mg引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接头/mg mRNA）的体积至15ml，70℃加热5分钟，待冷至室温，离心数秒钟使溶液集中在管底，然后依次加入：

5×第一链缓冲液 5ml

rRNasinR RNA酶抑制剂 25ml

40mM焦碳酸钠2.5ml

AMV反转录酶 15m/mg RNA

加无水RNA酶水至总体积25ml

在加入焦碳酸钠和AMV反转录酶前，需将反应液42℃温浴5分钟，以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。

（2）轻弹eppendorf管，取出5ml至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其体积不能超过1ml），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

（3）42℃温浴1小时。

（4）取出置冰上。

（5）掺入测定的eppendorf管加入50mM EDTA，终止反应，并使总体积为100ml。可取90ml进行电泳分析，另10ml进行同位素掺入测定。

（6）第一链合成离心管可直接用于第二链合成。

（二）第二链合成

第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。

1、第一链反应液（20ml）中依次加入

10X 第二链缓冲液 10ml

E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m

E.Coli RNaseH 0.8m

加无核酸酶水至总体积 100ml

余下步骤同本章第四节一

（二）2-12步及

（三）和

（四）。

思考题:

1.为什么mRNA提取是cDNA合成成败的关键？

2.试比较自导引导法和置换合成法合成cDNA的优缺点。第五章 重组质粒的连接、转化及筛选 未知

第五章 重组质粒的连接、转化及筛选

第一节 概 述

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：

1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E.coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。

特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E.coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。

因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。

pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E.coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。第二节 材料、设备及试剂

一、材料

外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知;载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知;宿主菌: E.coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。

二、设备

恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。

三、试剂

1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl(pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。

2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。

3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。

4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。

5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。

6、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。

7、感受态细胞制备试剂: 见第三章。

8、煮沸法快速分离质粒试剂: 见第一章。

9、质粒酶及电泳试剂: 见第二章。第三节 操作步骤

一、连接反应

1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。

2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。

3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。

4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。

同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。

二、E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化

每组连接反应混和物各取2μl转化E.coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。

三、重组质粒的筛选

1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

3、放于4℃数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。

不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。

四、酶切鉴定重组质粒

用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。

[注意]

1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。

3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。

4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。

5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。

6、麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。

7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。

8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。

思考题

1.在用质粒载体进行外源DNA片段克隆时主要应考虑哪些因素？

2.利用α－互补现象筛选带有插入片段的重组克隆的原理是什么？ 第六章 基因组DNA的提取 未知

第六章 基因组DNA的提取 第一节 概 述

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。

本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。第二节 从植物组织提取基因组DNA

一、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。

二、设备

移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。

三、试剂

1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。

2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。

3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4、RnaseA母液：配方见第一章。

5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步骤：

（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取

1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。

2.水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4.室温下5000rpm离心5分钟。

5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。

9.加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10.加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12.将DNA重溶解于1ml TE,-20贮存。

13.取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。

[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。

（二）.从李(苹果)叶子提取基因组DNA

1.取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。

2.加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。

3.去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。

4.同本节

（一）中步骤3-13操作。第三节 从动物组织提取基因组DNA

一、材料

哺乳动物新鲜组织。

二、设备

移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。

三、试剂

1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。

2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步骤:

1.切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。

2.倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。

3.加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。

4.加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。

5.加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。

7.取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8.移去上层乙醚,保留下层水相。

9.加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。第四节 细菌基因组DNA的制备

一、材料

细菌培养物。

二、设备

移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。

三、试剂

1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

四、操作步骤：

1.100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。

2.加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。

3.加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。

4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。

5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。

6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。

7.加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。

8.用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE,-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。

9.如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。

第五节 基因组DNA的检测

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。

1.DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。

2.取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。

3.取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。

如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：

（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。

（2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。

（3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。

（4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。思考题:

1.为什么构建DNA文库时,一定要用大分子DNA？

2.如何检测和保证DNA的质量？ 第七章 RFLP和RAPD技术 未知

第七章 RFLP和RAPD技术 第一节 概 述

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。

运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

本实验将学习RFLP的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。第二节 RFLP技术

一、材料

基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。

二、设备

电泳仪及电泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大)4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf管(0.5ml)若干。

三、试剂：

1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。

2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。

3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。

4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl。

5、10×SSC：配方见第九章。

6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl。

四.操作步骤

1.基因组DNA的酶解

(1)大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50kb, 没有降解。

(2)在50μl反应体系中,进行酶切反应:

5μg基因组DNA

5μl 10×酶切缓冲液

20单位（U）限制酶(任意一种)

加ddH2 O, 至50μl

(3)轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。

(4)取5μl反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。

[注意] 未酶切的DNA要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。

2.Southern转移

（1）酶解的DNA经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。

（2）将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤, 10分钟。

（3）取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。

（4）预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。

（5）取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速转至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。

（6）将膜夹于2层滤纸内, 80℃真空干燥2小时。

（7）探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。[注意]

1、步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。

2、除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。

3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。

4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。

第三节 RAPD技术

一、材料

不同来源的DNA(50ng/ul)。

二、设备

PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。

三、试剂

1、随机引物(10mer)(5umol/L)：购买成品。

2、Taq酶：购买成品。3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。

4、MgCl2 ：25mmol/L。

5、dNTP：每种2.5mmol/L。

四、操作步骤：

1.在25ul反应体系中,加入

模板DNA 1ul(50ng)

随机引物 1ul(约5pmol)

10xPCR Buffer 2.5ul

MgCl2 2ul

dNTP 2ul

Taq酶 1单位（U）

加ddH2O 至 25ul

混匀稍离心, 加一滴矿物油。

2.在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟，36℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共40轮循环。

3.循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。

4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐，分辨率高）。

5.电泳结束，观察、拍照。

[注意]

1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。

2、特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。思考题

1.DNA酶切反应不彻底会有何结果? DNA发生降解有何影响？

2.Southern转移中脱嘌呤时间为何不能太长？

3.随机引物扩增,为什么会产生DNA双链产物? 第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 未知

第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第一节 概 述

PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。

一、PCR反应中的主要成份

1.引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3)四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。(9)简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算： X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。

2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

3.Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。

第三篇：分子生物学

分子生物技术在微生物鉴定中的应用

摘要：微生物多样性是生物多样性的重要组成部分。由于微生物和 动、植物 相比, 存在着多种显著差异。而传统的基于微生物培养与纯种分离的技术具有很大的局限性，分子生物学及其有关技术的长足进展及其在为生物中的使用, 使微生物的研究进入了分子的阶段。

关键词：16SrDNA PCR 温度梯度电泳 变性梯度凝胶电泳 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物: 细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒, 是生物多样性的重要组成部分。此外, 微生物多样性与其他生物类群相比有许多独特之处, 包括: 1)生存环境多样;2)生长、繁殖速度多样;3)营养、代谢类型多样;4)生活方式多样。因而, 微生物多样性的研究无论对于生态系统功能的完整理解, 还是对于微生物资源的利用和开发都具有特殊重要的意义[1]。微生物作为生态系统中极重要的一员, 对动植物的生长，生态系统中的能流和物质循环及环境污染物的降解和解毒等方面起着重要作用并且与人的生活健康息息相关。随着微生物的不断发现及研究，传统微生物技术越来越不能满足其发展的需要，最主要的不足是丢失了微生物的多样性, 许多报道都指出, 在自然环境中有相当多的菌种(约90%-99%)用传统方法无法培养出来[2].这对于微生物基因组学研究来说是很不利的.，导致研究的片面性并且效率低下。而分子生物学技术则避开了传统微生物培养分离的环节, 而是采取直接从样品中抽取所含微生物总DNA, 然后通过16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多种分子生物学研究手段, 对直接提取的总DNA进行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的种类和含量, 以研究样品中微生物的实际组成, 同时可以利用直接提取得到的总DNA 建立基因文库, 并从中筛选有用的基因。由于是直接从样品中提取总DNA, 中间没有任何筛选性的过程, 因此, 所得DNA 能够准确地反映样品中微生物的实际情况, 避免了传统培养方法不能真实反映微生态实际情况的缺点, 也不会丢失样品中存在的任何微生物,同时, 这种方法能够很容易、大批量地取得同一环境下乃至不同环境下的不同微生物的同源基因, 为微生物比较基因组学研究开辟了道路.此外, 用直接提取的总DNA 构建的基因文库, 包含了大量以前因为无法培养而不能获得的微生物基因, 从这些文库中发现全新的具有巨大应用价值的抗生素类、酶类及其他生物活性物质的基因应该是非常有潜力的。1．16SrRNA比较测序

16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因，长度约1500bp，存在于所有的原核生物的基因组中，由多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异[3]。2.PCR近年来,对环境样品总DNA 进行PCR 扩增, 推动了利用分子标记技术研究微生物的多样性。PCR技术是美国letus公司人类遗传研究室的科学家与1983年发明的一种在体外快速扩增特异基因或DNA 序列的方法, 其目的是将极微量DNA大量扩增。该技术模仿生物体内DNA 的复制过程,首先使DNA 变性, 两条链解开;然后使引物模板退火, 二者碱基配对;耐高温的Taq DNA 聚合酶以4种dNTP为底物, 在引物的引导下合成与模板链互补的DNA 新链[4]。PCR 技术可在体外快速扩增DNA, 具有快速、简便、灵敏度高的特点。当然常规 PCR技术也存在很多的问题，如出现假阳性、形成引物二聚体、传统的PCR技术一次扩增只能检测一种微生物、RNA病毒的PCR检测操作繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果等.为了弥补上面这些不足，一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践，如热启动PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA 多态性扩增（RAPD）、限制性长度多态性分析（RFLP）、实时荧光PCR（real-time PCR）等[5]。3.电泳分离及其显示方法

除过我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE 分离)银染方法外, 还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记, 如变性梯度凝胶电泳(DGGE), 可分离长度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。对于特异性引物PCR 扩增的环境微生物的16SrRNA 基因, 一般的电泳很难将序列不同的片段分开。DGGE胶在聚丙烯酰氨胶中添加了线性梯度的变性剂, 可以形成从低到高的线性梯度, 在一定温度下, 同一浓度的变性剂中, 不同序列的产物，其部分解链程度不同。DNA 解链程度不同决定其电泳的迁移率, 结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下, 该技术能分辨一个碱基对。DGGE 技术在微生物群落结构 的研究、微生物种群的动态分析、富集培养以及分离物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到广泛应用[6]。

温度梯度电泳(TGGE)是利用不同构象的分子具有不同的变 性温度来进行分离, 最先应用于DNA /RNA 的分子构象分析和序列变异分析, 是一种新出现的检测点突变的电泳技术, 其最大特点上具有高分辨能力。单链构象多态性(SSCP)也是根据不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大, 结果不同序列的DNA 片段在凝胶上得以高分辨率的分离。基因芯片可分为cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因组芯片。在一定条件下, 载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记, 在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号[7]。

分子生物学技术在环境微生物研究中的应用中rRNA 技术提供了一种摆脱传统的纯种培养方法而鉴定环境微生的途径,并已被广泛应用于微生物的各个领域。虽然当前,标准rRNA 技术的灵敏度还难以检测到低丰度的(低于1/ 1 000)在群落中仅占很小比例的微生物种类, 从而使之在微生物生态以及环境学上的应用受到很大的限制。然而, rRNA 技术与其它的分子技术以及特别是与传统的纯种培养方法相结合, 具备分析微生物多样性的巨大潜力。随着这些新的分子方法的不断改进以及rRNA 数据库中序列信息的不断增加, 我们能探知更多的未知的微生物世界。

参考文献：

[1]杨永华，姚健.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用[J].生物多样性，2000 8(3):337-342.[2]李 红,周友兵,陈炳耀,胡锦矗.分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用[J].河北大学学报(自然版),2003 12(23).[3]朱诗应，戚中田.１６ＳｒＤＮＡ扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用[J].微生物与感染,2013 8(2):104-109.[4，7] 高小朋, 张欠欠, 任桂梅.分子生物学技术在环境微生物研究中的应用[J].延安大学学报(自然科学版),2008 9(27)：27-45.[5] 路则宝，白现广。分子生物学技术在微生物检验中的应用研究进展[J].红河学院学报，2013 4（1）38-46.[6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技术在微生物鉴定中的应用[J].湖北生态工程职业技术学院学报，2006 1（4）：35-45.

第四篇：分子生物学课件整理

注：根据课件内容简单整理，为了方便大家理解，内容较多;如果仅仅为了考试，可以根据自己的需要进行内容的删减。Lecture 1.Introduction

1.What is Molecular Biology? Molecular biology seeks to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relationships contribute to the operation and control of biochemical processes.Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA

（一）基因的概念的产生和发展

2、Morgan 基因的物质载体是染色体

3、G.Beadle & R.Tatum

基因是决定蛋白质一级结构的遗传物质单位

5、O.Avery

基因的化学本质是DNA

6、Jacob & Monod

基因是在特定的遗传调控系统的调节下和控制下表达其功能的遗传物质单位

7、现代的基因概念

基因是核酸分子中储存遗传信息的遗传单位，是指储存有功能的蛋白replication, recombination and translocation.分子生物学的研究内容

Major content of molecular biology ◆ Structure and Function of nucleic acid ★conformation and function of DNA ★conformation and function of RNA ◎mRNA ◎tRNA◎rRNA ◎ ribozyme ◎antisence RNA ◎ microRNA ◎ RNA interfrence 人们开发出：RNAi、RNAa、ncRNA、SiRNA、microRNA、Antisene RNA、SatellileRNA、TelomereRNA、lincRNA、InCRNA、PiRNA、qiRNA、endoSiRNA等等，其他还有RNA结合蛋白(RNPs)、RNA酶等成百上千种RNA相关的新成员，组成了一个庞大的RNA新世界

这些RNA不仅在基因-蛋白质的合成中发挥重要作用，它更调节和管理着—基因的转录、表达、表型等几乎所有的功能。

在细胞增殖、分化、生长、凋亡、生殖、发育、遗传、损伤、修复、炎症、感染、防治等一切生命活动中发挥着重要作用；

RNA还是生命起源的“先驱’’，近年来研究证明，RNA比DNA更古老，它是地球上最早出现的生命形式；它可以携带遗传信息，能自我复制，自我进化，自我编译，又具有催化分子功能------,以后才有了DNA和蛋白质，才有了今天的生物世界。

RNA更是人类生命健康的维护者，它不仅调节和管理着人类的一切生命活动，而且它还是防治许多重大的疾病和开发新药物的靶分子和预警分子，并可直接和间接的发挥防治疾病的作用。

◆Functional Genomics ◎As the Human Genome Project has mostly determined the genetic sequence, the next step is functional genomics, which will reveal each gene's functions and controls ◎ Human Genome Diversity Project ◎ Environmental Genome Project ◎Pharmacogenomics ◎Comparative Genomics

Artificial life 人工生命是通过人工模拟生命系统,来研究生命的领域。人工生命的概念，包括两个方面内容

1.属于计算机科学领域的虚拟生命系统，涉及计算机软件工程与人工智能技术，以及

2.基因工程技术人工改造生物的工程生物系统，涉及合成生物学技术。

分子生物学与医学

◆人体发育调控和人体功能调控的分子生物学基础 ◎发育、分化与衰老的分子生物学基础 ◎细胞增殖调控的分子生物学基础

◎神经、内分泌和免疫调控的分子生物学基础

◆ 基因与疾病 ◎疾病的分子机理

致病基因的克隆

复杂疾病的分子基础 ◎基因诊断 ◎基因治疗

Lecture 2 structure and function of gene 第一节 基因的概念及其发展 一 基因（gene）

质多肽链或RNA序列信息所必需的全部核苷酸序列

二、基因组（genomic）The genome is the entirety of an organism's hereditary information.It is encoded either in DNA or, for many types of virus, in RNA.The genome includes both the genes and the non-coding sequences of the DNA

细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。

人类基因组包含24条染色体以及线粒体上的全部的遗传物质。

第二节 真核生物基因组

一、基因分类

1、结构基因（strutual gene）可被转录形成mRNA并进而翻译位多肽链，构成各种结构蛋白的基因

2、调节基因（regulatory gene）可调节、控制结构基因表达的基因。其突变可能会影响一个或多个结构基因的功能，导致一个（或多个）蛋白质的改变。

3、rRNA基因和tRNA基因

二、基因的结构

enhancer pr omoter e xon 5UTR, 3UTR intron

（一）编码区、外显子（exon）

2、内含子（intron）★GT—AG规则：

内含子多是以GT开始，并以AG结尾

★一个基因的内含子可以是另一个基因的外显子。★外显子的数量是描述基因结构特征的重要指标。三、调控元件（acting elements）

（二）前导区：

位于编码区的上游，相当于mRNA5端的非编码区

（三）调节区：

包括启动子、增强子等基因编码区的两侧，也称侧翼序列

◎顺式调控元件（cis-acting elements）：与结构基因表达调控相关。能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。◎反式调控元件（trans-acting elements）:一些可以通过结合顺式元件而调节基因转录活性的蛋白因子。

（一）启动子（promoter）

启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。2 启动子的类型

(1)一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子 这类启动子应当总是能被转录。

但实际上也不都如此，外来蛋白质可对其有影响，即该蛋白质可直接阻断启动子，也可间接作用于邻近的DNA结构，使聚合酶不能和启动子结合(2)另一类启动子在和聚合酶结合时需要有蛋白质辅助因子的存在。这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的DNA顺序。3 启动子的共同顺序

⑴ 真核生物基因启动子 位于RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。

-10序列又称为Pribnow盒(原核生物)。是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序

⑵真核生物基因启动子

▲TATA box（Goldberg-Hogness box）：

位于-35bp处，序列为TATA（A/T）A（T/A）是RNA聚合酶Ⅱ的结合部位

▲CAAT盒：在转录起始位点上游70-80bp处

保守的共同顺序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以识别这一顺序。⑶启动子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序 [1]RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主 链中的磷酸基相接触;[2]离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱;[3]最重要的是，破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，沉默子的作用机理

沉默子介导产生的沉默是一种状态的变化,在此过程中,产生类似于异染色质的结构阻止转录因子与DNA的相互作用,使转录被抑制,沉默子作为异染色质形成中的失活中心参与沉默状态的建立和扩散

沉默子含阻遏蛋白结合序列，阻遏蛋白与其结合后阻遏基因的转录。直接阻遏(direct repression)沉默子结合蛋白与转录复合物中的成员结合后将其固定，使基础转录复合物无法形成而丧失活性

竞争(competition)在一些基因中沉默子与增强子等正调控元件相邻或相重叠，阻遏蛋白结合后阻止激活蛋白与邻近正调控元件的结合从而阻遏转录

淬灭

沉默子与增强子相邻，阻遏蛋白与沉默子结合后,虽不影响激活蛋白与DNA的结合能力,却通过蛋白之间的相互作用阻止激活蛋白与转录复合物的正确接触来抑制其活性 可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像，它能“感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状。”

（三）增强子（enhancer)★位于结构基因附近，能够增强该基因转录活性的一段DNA顺序称为增强子(enhancer)。

★增强子是另一类顺式作用的DNA片段，可使基因转录的速率大大提高。

增强子的类型

①组织和细胞专一性增强子

许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能。②诱导性增强子

这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。

例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。

增强子的特点

①增强子可提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常距离l～4kb，个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

②增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒置就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。③增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现其活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。

④增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。

例如，人类胰岛素基因5’端上游约250个核苷酸处有一组织特异性增强子。在胰岛素p细胞中有一种特异性蛋白因子，可以作用于这个区域，以增强胰岛素基因的转录。在其他组织细胞中没有这种蛋白因子，所以也就没有此作用。

⑤大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列，即(G)TGGA／TA／TA／T(G)，是产生增强效应时所必需的。

⑥许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。

增强子的作用机理

①增强子中有Z-DNA结构，这种结构的双链间距离大于B-DNA，与蛋白质的亲和力更高一些，有利于转录。

②增强子中有DNA水解酶容易切断的部位，可与一些转录因子蛋白形成复合物，促进转录。

③增强子可与核基质结合形成结构体，促进转录。

3．沉默子（Silencer）

Silencers are control regions of DNA that, like enhancers, may be located thousands of base pairs away from the gene they control.However, when transcription factors bind to them, expression of the gene they control is repressed.沉默子的特点

(1)可以在远距离作用于启动子

(2)对基因的阻遏作用没有方向的限制，即无论其位于启动子的上游或下游均可阻遏启动子的表达

某些沉默子中含有骨架结合位点保守序列

沉默子与蛋白结合,通过蛋白之间的相互作用形成DNA环后与启动子作用，破坏起始复合物而抑制转录;

或者产生的DNA环发生了组蛋白的修饰和拓扑结构的变化,这种变化使关键的转录因子不能正确结合从而阻止转录

也可能沉默子和核基质相互作用将转录单元固定于缺乏转录因子的亚显微结构

4.绝缘子(insulator)

绝缘子(insulator)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子(为异染色质)之间的一种调控序列。

绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。绝缘子的功能

①有序地装置庞大的染色体DNA以及确保其中上万种基因每一种都能在时空上正确无误地表达。

绝缘子在这里起着关键的阻断作用,保护启动子的功能不受其它异常增强子或其它激发信号的有害影响

②防止基因免受邻近沉默信号的作用。这类沉默信号系来自细胞核的内环境中遍布的大量致密染色质的“扩张”或“溢出”。

绝缘子的这种功能可以维持染色质区域的分界以及保护基因座位的独立性。

绝缘子的作用原理

①结构域边界模型(Domain boundary model,)

绝缘子能使它所限定的染色质区域发生折叠成环,促使该区域内各种调节元件彼此相互作用,同时也阻止了不同区域调节元件之间互相影响。染色质形成环状结构域能对抗附近致密染色质结构的扩展。这样一来,绝缘子能防止位置效应也能得到合理的解释。②“跟踪”模型(“Tracking” model):

结合在增强子元件上的转录因子沿DNA链向它的目标启动子追逐。此时绝缘子的特异结合蛋白在中途阻挡转录因子,使其不能抵达启动子区域。③转录诱捕模型(Transcription decoy model)

在绝缘子与其特异结合蛋白结合所形成的复合物可成为捕捉增强子的笼子,将增强子复合物吸引到其中而使之失去功能。

四、基因家族（gene family）

（一）基因家族的概念

1、基因家族：核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。由同一祖先基因进化而来。

2、假基因（pseudogene）

在多基因家族中，某些成员并不能表达出有功能的产物，这些基因称为假基因。

假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因。

与相应的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列。

人们推测，假基因的来源之一，可能是基因经过转录后生成的RNA前体通过剪接失去内含子形成mRNA，如果mRNA经反转录产cDNA，再整合到染色体DNA中去，便有可能成为假基因，因此该假基因是没有内含子的，在这个过程中，可能同时会发生缺失，倒位或点突变等变化，从而使假基因不能表达。

（二）、基因家族大致可分为两类

1、一类是基因家族成簇地分布在某一条染色体上，它们可同时发挥作

用，合成某些蛋白质，如组蛋白基因家族就成簇地集中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内；

2、另一类是一个基因家族的不同成员成簇地分布 在不同的染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族

五、重复序列：高度重复序列 中度重复顺序 单拷贝顺序

（一）高度重复序列

高度重复序列在基因组中重复频率高，可达百万(106)以上，因此复性速度很快。

在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60％，在人基因组中约占20％。

高度重复顺序又按其结构特点分为三种。

1、倒位（反向）重复序列（inverted repeats）

反向重复序列由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成。约占人基因组的5％。

2、卫星DNA

卫星DNA(satelliteDNA)是另一类高度重复序列，这类重复顺序的重复单位一般由2-10bp组成，成串排列。由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA或随体DNA。在人细胞组中卫星DNA约占5-6％。§大卫星DNA（macrosatellite DNA）§小卫星DNA（minisatellite DNA）

§微卫星DNA（microsatellite DNA）

3、较复杂的重复单位组成的重复顺序

这种重复顺序为灵长类所独有。用限制性内切酶HindⅢ消化非洲绿猴DNA，可以得到重复单位为172bp的高度重复顺序，这种顺序大部份由交替变化的嘌呤和嘧啶组成。有人把这类称为α卫星DNA。而人的α卫星DNA更为复杂，含有多顺序家族。

4、高度重复顺序的功能

⑴参与复制水平的调节反向序列常存在于DNA复制起点区的附近。另外，许多反向重复序列是一些蛋白质（包括酶）和DNA的结合位点。

⑵参与基因表达调控DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA分子中，而有些反向重复顺序可以形成发夹结构，这对稳定RNA分子，免遭分解有重要作用

⑶参与转位作用几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到1400bp。由于这种顺序可以形成回文结构，因此在转位作用中即能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别。

⑷与进化有关 不同种属的高度重复顺序的核苷酸序列不同，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如人的α卫星DNA长度仅差1个碱基（前者为171bp，后者为172bp），而且碱基序列有65％是相同的，这表明它们来自共同的祖先。在进化中某些特殊区段保守的，而其他区域的碱基序列则累积着变化。

⑸同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹。

（二）中度重复顺序

中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（<105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。少数在基因组中成串排列在一个区域，大多数与单拷贝基因间隔排列。依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为两种类型。（1）短分散片段

（short interspersed repeated segments, SINES）这类重复顺序的平均长度约为300bp（〈500bp），它们与平均长度约为1000bp的单拷贝顺序间隔排列。拷贝数可达10万左右。如Alu家族，Hinf

家族等属于这种类型的中度重复序列（2）长分散片段

（Long interspersed repeated segments, LINES）

这类重复顺序的长度大于1000bp，平均长度为3500-5000bp，它们与平均长度为13000bp（个别长几万bp）的单拷贝顺序间隔排列。

也有的实验显示人基因组中所有LINES之间的平均距离为2.2kb,拷贝数一般在1万左右，如KpnⅠ家族等。

中度重复顺序在基因组中所占比例在不同种属之间差异很大，一般约占10-40％，在人约为12％。这些顺序大多不编码蛋白质。这些非编码的中度重复顺序的功能可能类似于高度重复顺序。

在结构基因之间，基因簇中，以及内含子内都可以见到这些短的和长的中度重复顺序。如HLA基因，rRNA基因，tRNA基因,组蛋白基因,免疫球蛋白基因等。

中度重复顺序一般具有种属特异性；在适当的情况下，可以应用它们作为探针区分不同种哺乳动物细胞的DNA。下面介绍几种典型的中度重复顺序。

Alu家族是哺乳动物包括人基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族，在单倍体人基因组中重复达30万-50万次，约占人基因组的3-6％。Alu家族每个成员的长度约300bp，由于每个单位长度中有一个限制性内切酶Alu的切点（AG↓CT）从而将其切成长130和170bp的两段，因而定名为Alu序列（或Alu家族）。

Alu序列分散在整个人体或其他哺乳动物基因组中，在间隔DNA，内含子中都发现有Alu序列，平均每5kbDNA就有一个Alu顺序。

KpnⅠ家族是中度重复顺序中仅次于Alu家族的第二大家族。用限制性内切酶KpnⅠ消化人类及其它灵长类动物的DNA，在电泳谱上可以看到4个不同长度的片段，分别为1.2,1.5,1.8和1.9kb，这就是所谓的KpnⅠ家族。

KpnⅠ家族成员顺序比Alu家族更长（如人KpnⅠ顺序长6.4kb），而且更加不均一，呈散在分布，属于中度重复顺序的长分散片段型。

尽管不同长度类型的KpnⅠ家族（称为亚类，subfamily）之间同源性比较小，不能互相杂交，但它们的3'端有广泛的同源性。KpnⅠ家族的拷贝数约为3000￣4800个，占人体基因组的1％,与散在分布的Alu家族相似，KpnⅠ家族中至少有一部份也是通过KpnⅠ顺序的RNA转录产物的cDNA拷贝的重新插入到人基因组DNA中而产生的。

Hinf家族：

这一家族以319bp长度的串联重复存在于人体基因组中。用限制性内切酶HinfⅠ消化人体DNA，可以分离到这一片段。Hinf家族在单位基因组内约有50 100个拷贝，分散在不同的区域。319bp单位可以再分成两个亚单位，分别为172bp和147bp,它们之间有70%的同源性。

rRNA基因：在原核生物如大肠杆菌基因组中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重复次数更多。在真核生物基因组中18S和28S,rRNA基因是在同一转录单位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一转录单位中；

而在高等生物中，5SrRNA是单独转录的，而且其在基因组中的重复次数高于18S和28S基因。和一般的中度重复顺序不一样，各重复单位中的rRNA基因都是相同的。

rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因组中，这样的区域称为rDNA，如染色体的核仁组织区（nucleolus organizer region）即为rDNA区。

（三）单拷贝顺序

单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次或数次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序在基因组中占50-80％，如人基因组中，大约有60-65％的顺序属于这一类。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。

六、真核生物基因组的特点

1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组。

2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。

3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。4.基因组中不编码的区域多于编码区域。

5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。

6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小

重叠基因有以下几种情况

（1）一个基因完全在另一个基因里面。如基因Ａ和Ｂ是两个不同基因，而Ｂ包含在基因Ａ内。同样，基因Ｅ在基因Ｄ内。（2）部分重叠。（3）两个基因只有一个碱基重叠。

八、原核生物基因组的结构和功能

（1）基因组通常仅由一条环状双链DNA 分子组成。

（2）具有操纵子结构，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。

（3）在大多数情况下，结构基因在细菌基因组中都是单拷贝，但是编码rRNA的基因rDNA往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。

（4）和病毒的基因组相似，不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。

（5）具有编码同工酶的同基因（isogene）例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸（chorismicacid）变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。

（6）和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象。

（7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区TerC,转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序。

（8）在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。

例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。

终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。

Lecture 3 DNA replication 第一节 DNA的复制

一、DNA复制的基本特点

（一）复制的起始点和方向

★复制起始点：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(origin of replication)常用ori或o表示

★复制子： replicon DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元

★复制叉：在复制开始时，复制起始点出呈现一叉形结构，称为复制叉（replication fork）

1、复制起始点：

DNA复制起始点有结构上的特殊性。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。§大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置

2、DNA复制的方向

(1)定点开始双向复制：这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡。

(2)定点开始单向复制：质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制

(3)两点开始单向复制：腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。

二、复制的基本方式

(一)DNA的半保留复制(semiconservative replication)

（二）半不连续复制 前导链(leading strand)：在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的 随从链(lagging strand)：另一条母链DNA是5′→3′方向，它作为模板时，复制合成许多条5′→3′方向的短链，叫做随从链，随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。

随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做岗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物岗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链。

由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制

三、复制过程

（一）DNA复制的起始阶段

1、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质

⑴解链酶(helicase)：解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。

大肠杆菌中DnaB蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5′→3′方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。

⑵.单链结合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP)

它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。

⑶ 引发体的形成

DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由Dna B.Dna C和单链结合蛋白组成。★引物酶(primase)它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置

★引发体(primosome)高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′OH末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。

（二）DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子

1、DNA的聚合反应和DNA聚合酶

★DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerse Ⅰ）：

DNA polⅠ是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn++，是聚合活性必须的。

(1)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合活性 这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸顺序，将互补的dNTP逐个加到引物RNA3′-OH末端，并促进3′-OH与dNTP的5′-OH形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用。

(2)DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′外切核酸酶活性

这种酶活性的主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。

(3)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切核酸酶活性

这种酶活性是从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必须的。

DNA polⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。

DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ）

分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而没有5′→3′外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ）

这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体 DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，解链酶等构成一个复制体。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNA polⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制

2、与超螺旋松驰有关的酶

拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。

在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。

在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。

DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。

DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。

拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用

将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解，利于DNA复制叉继续向前打开。

对环状单链DNA还有打结或解结作用，对环状双链DNA的环连或解连以及使环状单链DNA形成环状双链DNA都有作用

拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)的主要作用

是在大肠杆菌中发现的，曾被称为旋转酶(gyrase)，它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的部分经切口穿过而旋转，然后封闭切口。还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态，此反应不需要ATP参与。DNA复制完成后，TopoⅡ在ATP参与下，DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋。

催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连，以及打结或解结。

DNA连接酶(DNA ligase)作用：消耗ATP，将随从链中相邻的两个DNA片段连接起来

催化同一模板DNA链上的两个相邻DNA片段的3＇端与5＇端间形成磷酸二酯键，把相邻的两段DNA连成完整的链

（三）DNA复制的终止阶段

DNA在复制过程中，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。

DNA复制的过程 延长:

DNA-pol Ⅲ(DDDP-Ⅲ)的5 → 3的聚合活性使核苷酸之间生成3，5磷酸二酯键

模板 以DNA单链为模板

底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

引物 以小片段RNA为引物，在 RNA引物的 3-OH末端上开始逐个添加dNTP

按碱基配对原则（A = T G ≡ C）按5 → 3 方向

第二节 真核生物DNA复制的特点 1.复制起始点及方向

与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点，例如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点，因此，虽然真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒钟)慢得多，但复制完全部基因组DNA也只要几分钟的时间。2.在真核生物DNA复制叉处，需要两种不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)

polα和引物酶紧密结合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延长DNA链，这种活性还要复制因子C参与。

同时结合在引物模板上的PCNA，此时释放了polα，然后由polδ结合到生长链3′末端，并与PCNA结合，继续合成前导链。

而随从链的合成靠polα紧密与引物酶结合并在复制因子C帮助下，合成岗崎片段

3、末端复制与端粒酶 端区(telomeres)由于真核生物染色体是线性DNA，它的两端叫做端区(telomeres)，端区是由重复的寡核苷酸序列构成的。

由于随从链是以一种不连续的形式合成岗崎片段，所以不能完成线性染色体末端的复制，如果这个问题不解决，真核生物在细胞分裂时DNA复制将产生5′末端隐缩，使DNA缩短。端粒酶(telomerase)由蛋白质和RNA两部分组成的，它以自身的RNA为模板，在随从链模板DNA的3′OH末端延长DNA，再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链。第三节 DNA损伤与修复

一、DNA的损伤

(一)DNA损伤的原因 1.DNA分子的自发性损伤

2.物理因素引起的DNA损伤

3.化学因素引起的DNA损伤 1.DNA分子的自发性损伤(1)DNA复制中的错误

碱基配对的错误频率约为10-1－10-2 在DNA复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10-5－10-6 DNA聚合酶还会暂停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸，然后再继续正确的复制但校正后的错配率仍约在10-10左右.(2)DNA的自发性化学变化

a.碱基的异构互变

DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化(例如烯醇式与酮式碱基间的互变)，这种变化就会使碱基配对间的氢键改变，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等，如果这些配对发生在DNA复制时，就会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤 b.碱基的脱氨基作用

碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤会变成黄嘌呤(X)等，遇到复制时，U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。c.脱嘌呤与脱嘧啶

自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。一个哺乳类细胞在37℃条件下，20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个 估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞(如神经细胞)在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，约占细胞DNA中总嘌呤数的3%。d.碱基修饰与链断裂

细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。此外，体内还可以发生DNA的甲基化，结构的其他变化等，这些损伤的积累可能导致老化。

2.物理因素引起的DNA损伤

(1)紫外线引起的DNA损伤

DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的。当DNA受到最易被其吸收波长(～260nm)的紫外线照射时，主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环(cyclobutane ring)连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体

(2)电离辐射引起的DNA损伤

电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤，间接效应是指DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。电离辐射可导致DNA分子的多种变化： a.碱基变化

主要是由OH－自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。b.脱氧核糖变化

脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH－反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。c.DNA链断裂

单链断裂:DNA双链中一条链断裂称单链断裂(single strand broken)双链断裂:DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂(doublestrand broken)。

虽然单链断裂发生频率为双链断裂的10-20倍，但还比较容易修复；对单倍体细胞来说(如细菌)一次双链断裂就是致死事件。

d.交联 同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间可以共价键结合 DNA与蛋白质之间也会以共价键相连，组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。这些交联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础，会影响细胞的功能和DNA复制。

3.化学因素引起的DNA损伤(1)烷化剂对DNA的损伤

烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤： a.碱基烷基化

烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化，例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对，而改与胸腺嘧啶配对，结果会使G－C转变成A－T。b.碱基脱落

烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变。c.断链

DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。d.交联

烷化剂有两类

单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化；

双功能基烷化剂，化学武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等，某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两处烷基化，结果就能造成DNA链内、DNA链间，以及DNA与蛋白质间的交联。

(2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等。由于其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成，例如5－BU结构与胸腺嘧啶十分相近，在酮式结构时与A配对，却又更容易成为烯醇式结构与G配对，在DNA复制时导致A－T转换为G－C。(二)DNA损伤的后果

1.点突变(point mutation)

指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition)；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。2.缺失(deletion)

指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。3.插入(insertion)

指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动(reading frame shift)，使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变 4.倒位或转位(transposition)

指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 5.双链断裂

已如前述，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。突变或诱变对生物可能产生4种后果 ①致死性；

②丧失某些功能；

③改变基因型而不改变表现型

④发生了有利于物种生存的结果，使生物进化。

二、DNA修复(一)回复修复

1.光修复

这是最早发现的DNA修复方式。

修复是由细菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300－600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。2.单链断裂的重接

DNA单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶(ligase)参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂几乎不能修复。3.碱基的直接插入

DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)识别结合，在K＋存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，㈡ 转录模板

对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链(模板链）而与之互补的另一条DNA链称为反意义链（编码链）。使DNA完全恢复。4.烷基的转移

在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。

(二)切除修复(excision repair)①首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5′侧切开磷酸二酯键。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。②由5′→3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。

③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5′→3′方向DNA链，填补已切除的空隙

④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。

（三)重组修复(recombinational repair)受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口 以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。

重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。

(四)SOS修复

SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为易误修复(error prone repair)，使细胞有较高的突变率。

Lecture 3 The expression of genetic information 转录（transcription): 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录。

经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。

第一节 转录

一、转录与复制的比较

（一）转录与复制的相同点

1、均以DNA为模板

2、合成方向是5--3 `

3、服从碱基配对原则

4、均需要依赖DNA的聚合酶

二、转录作用及其特点 ㈠不对称转录

㈡真核细胞中的转录产物都是各种RNA的前体，既无活性，亦物功能，必须在细胞核内加工，形成由活性的RNA后，由核运至细胞质中才能执行翻译功能

三、原核生物RNA的生物合成

㈠ RNA聚合酶（RNA polymerase）

这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶。

该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5'→3'聚合RNA。

原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即α2ββ‘σ。σ亚基与转录起始点的识别有关，而在转录合成开始后被释放，余下的部分（α2ββ'）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。

㈢转录过程 1.起始阶段

⑴σ因子的识别作用

① RNA链的起始通常是在RNA聚合酶所结合DNA区域的一端，在解开的双链部分，离-10开始

②处第一个核苷酸通常是pppA或pppG,较少为pppC，但偶而亦可为pppU。大约12或13个碱基处 ③σ因子的解离

RNA链的延伸阶段开始后，σ因子即从核心酶-DNA-新生RNA复合体上解离下来，并可再用于和新的核心酶结合 延长阶段

⑴ RNA聚合酶在延伸新生RNA链时继续使DNA螺旋解链，以便暴露出模板链，RNA链的生长点是大约12bp长的RNA-DNA杂交区 在RNA链离开模板时，此杂交区即复原，同时两条DNA链即又重复螺旋化。终止阶段

细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子(terminator)终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。

在终止子处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。在某些位点处，终止需要一种辅助蛋白质，即ρ因子，但在其他位点处，核心酶本身即可终止转录。

不依赖ρ因子的终止子有两个特征:

DNA顺序有双重对称(dyad)，位于RNA3‘端之前15-20核苷酸处；

DNA模板链中有一串约6个A，转录为RNA3'端的U。双重对称的意义在于其转录本能形成发夹结构。

依赖ρ的终止子没有不依赖ρ的终止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成稳定的发夹。

ρ因子的作用机制，但有几种可能性

ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，说明它能与新生RNA链结合，并可能应用ATP放出的能量将RNA链从酶和模板中释出。ρ因子可能与RNA聚合酶结合。

编码ρ因子的基因rho发生突变时产生的某些ρ蛋白质仅能在RNA聚合酶的β亚基也发生相应突变时才能有RNA合成的活性。

已知RNA聚合酶本身能识别DNA模板中依赖ρ的终止顺序，而ρ因子是在以后才发挥作用而释出RNA的。即使是在没有ρ时，RNA聚合酶也在依赖ρ的终止子处暂停，不过以后仍继续向前进。

四、真核生物的转录作用 ㈠ 真核细胞中的RNA聚合酶

真核生物中的RNA聚合酶可按其对α-鹅膏蕈碱敏感性而分为三种，它们均由10～12个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同

㈡ RNA聚合酶Ⅰ

合成RNA的活性最显著。它位于核仁中，负责转录编码rRNA的基因(称rRNA)，而细胞内绝大部分RNA是rRNA。

聚合酶Ⅰ不被双环八肽──α-鹅膏蕈碱抑制。RNA聚合酶Ⅱ

它位于核浆中，负责核内不匀一RNA(hnRNA)的合成。而hnRNA是mRNA的前体。它是最直接和遗传调节相关的酶。

RNA聚合酶Ⅱ的活性均可被低浓度的α-鹅膏蕈碱所迅速抑制 ㈢RNA聚合酶Ⅲ

负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。对α-鹅膏蕈碱的反应则不尽相同

在动物细胞中聚合酶Ⅲ可被高浓度α-鹅膏蕈碱所抑制 在酵母和昆虫细胞中则不会被抑制。㈣常用的转录抑制剂

★转录单位

真核生物的一个转录单位就是一个基因，由一个结构基因和相应的顺式调控元件组成。

一个转录单位只有一个结构基因。㈤转录因子

真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一般可将这些转录所需的蛋白质分为三大类(1)RNA聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。(2)某些转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分。

这些因子可能是所有启动子起始转录所必须的。亦可能仅是转录终止所必须的。

在这一类因子中，要严格区分开哪些是RNA聚合酶的亚基，哪些仅是辅助因子，是很困难的。

(3)某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合。

如果这些顺序存在于启动子中，则这些顺序因子是一般转录机构的一部分。如果这些顺序仅存在于某些种类的启动子中，则识别这些顺序的因子也只是在这些特异启动子上起始转录必须的。

起始阶段

RNA聚合酶Ⅱ的转录起始

RNA聚合酶Ⅱ的转录产物是hnRNA 真核生物的转录起始较为复杂。目前已知RNA聚合酶Ⅱ至少有六种不同的蛋白因子参与转录复合体的形成。这些蛋白因子被称为转录因子（transcriptional factor, TF)。包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡ-I。终止阶段

RNA转录合成的终止机制有两种：

1．自动终止：模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的富含GC和AT的区域，使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形的二级结构，引起RNA聚合酶变构及移动停止，导致RNA转录的终止。2．依赖辅助因子的终止：由终止因子(ρ因子)识别特异的终止信号，并促使RNA的释放。

真核生物RNA转录后的加工修饰

一、mRNA的转录后加工 1．加帽(adding cap)：

即在mRNA的5'-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即HnRNA即可进行加帽。加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。

2．加尾(adding tail)：

这一过程也是细胞核内完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些过剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA结构与mRNA的半寿期有关。3．剪接（splicing)：

真核生物中的结构基因基本上都是断裂基因。结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序被称为外显子，而不能指导多肽链合成的非编码顺序就被称为内含子。

第二节 翻译

翻译（translation）

蛋白质的生物合成过程，就是将DNA传递给mRNA的遗传信息，再具体的解译为蛋白质中氨基酸排列顺序的过程，这一过程被称为翻译 蛋白质合成体系

① mRNA：作为蛋白质生物合成的模板，决定多肽链中氨基酸的排列顺序； ② tRNA：搬运氨基酸的工具；

③ 核蛋白体：蛋白体生物合成的场所； ④ 酶及其他蛋白质因子； ⑤ 供能物质及无机离子。

一、mRNA

作为指导蛋白质生物合成的模板。mRNA中每三个相邻的核苷酸组成三联体，代表一个氨基酸的信息，此三联体就称为密码(coden)。共有64种不同的密码。

遗传密码具有以下特点：

① 连续性； ② 简并性； ③ 通用性；（但在线粒体或叶绿体中特殊）④ 方向性，即解读方向为5′→ 3′； ⑤ 摆动性；

⑥ 起始密码：AUG；终止密码：UAA、UAG、UGA。

二、tRNA

在氨基酸tRNA合成酶催化下，特定的tRNA可与相应的 氨基酸结合，生成氨基酸tRNA，从而携带氨基酸参与蛋白质的生物合成。tRNA反密码环中部的三个核苷酸构成三联体，可以识别mRNA上相应的密码，此三联体就称为反密码(anticoden)。

反密码对密码的识别，通常也是根据碱基互补原则，即A—U，G—C配对。但反密码的第一个核苷酸与第三核苷酸之间的配对，并不严格遵循碱基互补原则。如反密码第一个核苷酸为Ⅰ，则可与A、U或C配对，如为U，则可与A或G配对，这种配对称为不稳定配对。

三、rRNA和核蛋白体

原核生物中的核蛋白体大小为70S，可分为30S小亚基和50S大亚基。小亚基：由16SrRNA和21种蛋白质构成。大亚基：由5SrRNA，23SRNA和35种蛋白质构成。

真核生物中的核蛋白体大小为80S，也分为40S小亚基和60S大亚基。小亚基：由18SrRNA和30多种蛋白质构成。大亚基：则由5S rRNA，28S rRNA和50多种蛋白质构成

蛋白质生物合成过程包括三大步骤： ①氨基酸的活化与搬运；

②活化氨基酸在核蛋白体上的缩合； ③多肽链合成后的加工修饰。

一、氨基酸的活化与搬运

氨基酸的活化以及活化氨基酸与tRNA的结合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。其反应过程为：

（一）起动阶段

1．40S起动复合物的形成：

在起动因子的促进下，40S小亚基与mRNA的起动部位，起动tRNA

（fmet-tRNAfmet），和GTP结合，形成复合体。

原核mRNA的起动部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸顺序组成，称为SD序列（核蛋白体结合位点，RBS），可被核蛋白体小亚基辨认结合。真核生物中的mRNA具有帽子结构，已知需一种特殊的帽子结合蛋白（CBP）以识别此结构。

2．80S起动前复合体的形成：IF3从40S起动复合体上脱落，60S大亚基与复合体结合，形成80S起动前复合

（二）肽链延长阶段

1．进位：与mRNA下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入核蛋白体的受位。此步骤需GTP，Mg2+，和EF参与。2．成肽：

在转肽酶的催化下，将给位上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基酰tRNA上，与其α-氨基缩合形成肽键。此步骤需Mg2+，1973年S.Cohen 也成功的进行了另一个体外重组实验，他将编码有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒DNA与编码有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101 DNA混合后加入内切酶EcoRI对DNA进行切割，再用T4连接酶将它们连接成重组分子，用这种连接后的重组DNA转化大肠杆菌，结果发现，某些转化菌落表现出了既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征。

以上两个实验带给人们的启示：

DNA是可以在体外进行切割和拼接的

利用细菌细胞可以快速的复制DNA并能够合成蛋白质。这两个实验也标致着基因工程技术的诞生 K+。给位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA 3．移位：

核蛋白体向mRNA的3'-端滑动相当于一个密码的距离，同时使肽酰基tRNA从受体移到给位。此步骤需EF（EFG）、GTP和Mg2+参与。此时，核蛋白体的受位留空，与下一个密码相对应的氨基酰tRNA即可再进入，重复以上循环过程，使多肽链不断延长。

（三）肽链终止阶段

核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入受位。1．识别：RF识别终止密码，进入核蛋白体的受位。

2．水解：RF使转肽酶变为水解酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放。

3．解离：通过水解GTP，使核蛋白体与mRNA分离，tRNA、RF脱落，核蛋白体解离为大、小亚基。

分子生物学研究的对象 蛋白质和核酸

对核酸、蛋白质的研究积累为分子生物学技术的成熟打下了重要性的基础。

70年代初是分子生物学成熟标致的重要时期，因为诞生了分子生物学应用的一个重要学科——基因工程。

80年代诞生的PCR技术将复杂的分子生物学技术简单化了，便得更加容易推广和应用。使得分子生物学技术一下普及到了一般的实验室。PCR技术，又称为聚合酶链式反应，它利用一对特异性的引物和耐高温的DNA聚合酶，在短短的2-3小时内将一段DNA扩增到1000万倍，对实验室的条件的要求也降到最低点。

1990年开始的“人类基因组计划”将分子生物学带入到一个高通量的发展时代。生命科学进入到了基因组和后基因组时代。

基因工程genetic engineering

1.基因工程诞生的理论基础

基因工程的诞生依赖于在此之前生命科学基础理论的发展成就，概括起来主要包括三个方面：

⑴ 40年代确定了遗传物质是DNA，它是遗传信息的载体。

⑵ 50年代发现DNA分子的双螺旋结构并揭示了半保留复制的机理，揭示了基因的自我复制和表达的机理。

⑶ 50年代末至60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。2．工具酶的发现为基因工程的诞生奠定了技术的基础： 3．基因工程的诞生

1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的体外重组实验，用E.coRI在体外对SV40的DNA和λ噬菌体的DNA进行了消化，然后用T4连接酶将消化后的DNA片段进行了连接，结果获得了重组的杂种DNA分子。

基因工程所使用的名称：

重组DNA技术(recombinant DNA technique)遗传工程(genetic engineering)基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)基因克隆(gene cloning)

分子克隆(molecular cloning)基因工程的基本内容：

1．将两种不同来源的DNA－－即目的DNA和载体DNA提取纯化。2．用限制性内切酶处理DNA。

3．用连接酶将切开的不同源的DNA连接到一起，构成重组DNA。4．将重组DNA转化到大肠杆菌中。

5．通过大量的培养细菌，以达到扩增目的基因或表达蛋白的目的。

基因工程的目的： 进行分子克隆

表达重组基因所编码的蛋白质

工具酶

一、限制酶(restriction enzyme)



全称限制性核酸内切酶、简称限制酶或内切酶。

1． 限制酶的分类

限制酶有三种：I型、II型、III型。2.限制酶的命名

一般的限制酶通常由四个拉丁文字母组成第1个字母代表产生该酶的细菌的属名，第2、3个字母代表产生该酶的细菌种名

第4个字母代表产生该酶的菌株号。

3.限制酶的识别和切割位点

根据Ⅱ型酶种类割双链DNA产生3种不同的切口： ⑴产生平末端

⑵产生5’端突出的粘性末端 ⑶产生3’端突出的粘性末端 6.限制酶使用的条件 ⑴ 缓冲系统：

50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反应体积

⑶ 反应温度和时间 ⑷ 限制酶的商业化 7.限制酶的商业化

试剂公司的名称： Promaga公司 安玛西亚公司

大连保生物公司 北京赛百胜公司 北京华美公司

购买酶时的注意事项：价格因素 供货时间 运输方式

酶的保存

修饰酶

⒈逆转录酶种类：

禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶

小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶 ⒉ T4DNA连接酶

从噬菌体中提取，用于DNA的连接 ⒊ 碱性磷酸酶

可将DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望发生的连接反应进行。⒋末端脱氧核苷酰转移酶

用于将已标记好的单核苷酸加到DAN的3’端上，起到标记的作用；有时也可用于DNA片段的同聚尾的形成。

载体(vector)在基因工程中的作用: 将外源DNA插入其中，并一同转化或转染到宿主细胞中，能够稳定的保存下来，完成外源DNA克隆和表达的功能。载体所必需的条件

1必须有自身的复制子，并能携带重组DNA一起复制。2载体分子上必须有限制性内切酶位点即多克隆位点。3载体必须具有可供选择的标置，便于重组分子的筛选。

4载体分子尽量小，便于能插入较大的外源DNA，最好是高考贝。5表达载体必须具备能在宿主细胞中表达的能力。

一、常用的克隆载体

㈠质粒plasmid 1．质粒的一般特点

 细菌质粒是一些双链闭环的DNA分子，这些质粒都是独立于染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通常，质粒含编码某些基因的酶，这些酶在一定环境下对宿主细胞有利。由质粒产生的表型对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素，及限制酶、修饰酶等。

 质粒都带有独立的复制子，能独立的自我复制。但在复制时必须依赖宿细菌的酶。



质粒的不亲和性(不相容性)

质粒的三种状态

松驰型和严紧型 质粒的转移性

多数质粒在自然条件下可以通过细菌结合的作用转移到新的宿细胞中。然而，由于质粒缺少一种转移所必须的mob基因，因此不能独立的从一个细菌到另一个细菌的接合转移。选择标记

质粒载体的发展经历了三个阶段：

第一阶段：将选择标记引入含有复制子的质粒中。

最早用作克隆载体的质粒子有多种局限性：复制效率低；带有不适合的选择标记；酶切位点少且不集中等，pBR322是早期最为成功的将所有理想的特性囊括于一身的质粒载体。第二阶段：高效型载体的发展

发展的趋势是调整载体的结构，提高载体的效率，减少载体的长度，扩充载体的容纳外源DNA的能力。这期间质粒的代表是：pUC19等。第三阶段：引入多种用途的辅助序列

这些用途包括通过组织化学检测方法肉眼鉴定重组克隆，产生用于序列分析的单链DNA，外源蛋白的大量表达等用途的质粒载体。

㈡λ噬菌体

1．λ噬菌体分子生物学

λ噬菌体的基因组是一长度50kb的双链DNA，其末端为长12bp的天然互补单链（粘端）。当它进入宿细胞后其粘端会配对结合成环形，它在侵入宿细胞后可以两种方式进行复制：

裂解性生长 溶源性生长

2．λ噬菌体作为载体所具有的特征

不利因素：野生型λ噬菌体有一个庞大的基因组，其DNA可分为头部、中央部分和尾部三个部分。其基因组由头部（由7个基因组成）、尾部（由11个基因组成）、重组基因（5个基因和一个识别位点）、正调控基因（2个基因）、负调控基因（5个基因）、DNA合成基因（2个基因）、裂解基因（2个基因）、转录调控及识别位点组成。在没有改造的情况下，λ噬菌体无法插入较大的外源DNA片段，无较集中的酶切位点和好的识别标置。3．λ噬菌体载体的改造：

在λ噬菌体DNA的中央部分（约占30%）是其生长的非必须区，当外源基因取代该区或该区缺失时，对噬菌体的生长不会造成影响。此外，外源基因不超过其本身的10倍数时，均可被包装为成熟颗粒，具有噬菌体活性。

目前使用的λ噬菌体载体都经过了改造，在其中加上了较集中的酶切位点、还加上了细菌的启动子，这不仅使其具有扩增外源DNA的能力，还使它能够表达外源基因的产物。

λ噬菌体的用途： λ噬菌体主要用于cDNA文库的构建。㈢粘性质粒

粘性质粒是一种将λ噬菌体和质粒两种载体结合起来形成的一种人工载体。它具有如下特征：

⑴含有质粒的抗药性标记，如Ampr基因。

⑵载体带有噬菌体的cos区，所以对其进行体包装是必不可少的。

⑶具有多克隆位点。

⑷形体本身的体积很小，但容量大，可插入40kb大小的DNA片段。

⑸一般非重组的载体体积小，而无法进行体外包装，因而无法转染细菌，只有包装了的重组体才能进入细菌，有利于筛选。㈣M13噬菌体

M13噬菌体是一种大肠杆菌的噬菌体它在转染大肠杆菌后进行一段时间的复制后开始进行不对称复制，而形成大量的单链DNA，而后将这些单链DNA进行包装病毒颗粒后释放到细菌外，利用这一特点，可大量克隆单链的DNA分子用于制备核酸探针和DNA测序的材料。㈤大容量测序用载体

在基因组学的研究中，需要将基因组的DNA片段切割成较的片段进行测序，以此来提高测序的速度。但我们前面提到的载体一般都无法满足这一需要，为了达到这一目的，人们开发出了酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)，前者可容纳100万个碱基的DNA片段，后者可容纳30万个碱基的DNA片段。

载体的表达

用于目的基因的表达。可分为大肠杆菌表达载体和哺乳动物表达载体。㈠大肠杆菌表达载体

一般具备有细菌转录的启动子，可人为的进行操纵，如多数质粒载

体中都带有乳糖操纵子的启动子，能在乳糖存在的情况进行诱表达。㈡哺乳动物表达载体

多数是一些真核细胞病毒经过改造而成形的。

重组DNA技术的基本过程

一、目的基因的制备 ㈠传统的办法 1.制备基因组DNA 将整个一个物种的基因组提取出来后用于基因工程的操作。常用于建立基因文库。

2.制备cDNA文库,并从中筛选目的基因

将一个物种或细胞中的全部RNA提取出来再从中提取mRNA，利用逆转录酶将其合成为cDNA，再将其重组于载体后，转录到大肠杆菌后形成cDNA文库。

㈡制备用于表达的基因片段 ⒈直接用限制性酶切取

⒉用PCR技术体外扩增目的基因 ⒊化学合成

㈢利用生物信息学的技术和原理来选择目的片段

是现在最普遍使用及最为方便的手段

二、载体的选择和制备

载体均是商品，根据实验的目的来选择合适的载体，如分子克隆、表达、测序或长期保存目的基因等。即可以购买，也可以索求

三、DNA分子体外重组 基因工程的策略

确定重组实验的目的——是获得目的基因，还是获得表达产物。

根据经济情况选择合适的用品——包括质粒（可以买成品，也可以向人索取质粒自己提取）、酶的选择等。

制定周密的实验计划，基因工程的实验周期都比较长，如计划不周，将造成时间和经济上的损失。

酶切位点的选择 选择合适的连接方式

四、将外源重组DNA导入宿主细胞

㈠转化：主要指将质粒转入宿主细菌的过程。通常是先将细菌细胞制备成感受态的菌，然后再进行转化。

转化常用的方法有两种：化学转化和电转移

㈡转染：主要指将噬菌体和病毒转入细胞的过程。

五、目的基因的筛选和鉴定

筛选和鉴定的方式有许多种，要仿照最初的实验方案来确定。常用的方式有：

用抗生素选择培养基来筛选

用蓝白斑选择培养基来筛选

根据酶切方案来筛选

直接提取质粒来筛选

提取质粒和酶相结合来筛选

分子杂交 DNA测序

在医学中的应用

1.基因工程用于生产蛋白质类药物

治疗糖尿病的胰岛素，是一种 51 个氨基酸残基组成的蛋白质1982 年美国 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰岛素，商品名为(Humulin)。干扰素用于治疗肝炎等病毒感染性疾病，有良好疗效。升发酵液中所得的干扰素相当于过去从 1000 升人血中所得。生产成本也大为降低。

目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物，现在用基因工程办法便可能大量生产。

正在开发的350种生物技术药物中，1/3以上用于肿瘤，其中有30种用于黑素瘤，20种用于结直肠癌，13种用于乳腺癌，13种用于前列腺癌。

正在开发的疫苗有77种，用于预防或治疗HIV感染、AIDS、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、多发性硬化、中风。

正在开发的生物技术药物中，有29种用于HIV感染、AIDS和AIDS相关疾病；19种用于自身免疫性疾病，其中11种用于类风湿性关节炎、3种用于狼疮；8种用于血液疾病，其中4种用于血友病，一种用于镰形细胞性贫血。

2.基因工程用于疫苗生产

常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种疫苗各有自身的弱点。活疫苗隐含着感染的危险性。死疫苗免疫活性不高，需加

大注射量或多次接种。

利用基因工程制备重组疫苗，可以克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白质的基因重组到载体上去，再送入细菌细胞或其他细胞中区大量生产。这样得到的重组疫苗往往效价很高，但决无感染毒性等危险。

在酵母中表达乙型肝炎表面抗原 HBsAg 产量可达每升 2.5mg，已于 1984 年问世。

基因工程生产疫苗有良好的发展前景。3.基因工程用于基因治疗

人体基因的缺失，导致一些遗传疾病，应用基因工程技术使缺失的基因归还人体，达到治疗的目的，已成为基因工程在医学方面应用的又一重要内容。

分子生物学常用技术

核酸的分子杂交Nucleic acid hybridization 分子杂交的原理：

DNA具有变性的特点 变性的DNA还能复性

分子杂交的概念 用已知的DNA序列制成探针，来检测末知的样本DNA。

核酸分子杂交的基本过程:

首先要确定检测的目标，即检测的目的核酸片段，这个片段的序列必须是已知的。

根据此设计一个探针（与检测目的核酸互补的序列），并对其进行合成和标记。

再通过杂交实验来完成探针对目的核酸的检测。

分子杂交的形式：

液相杂交 固相杂交 固相杂交的一般过程

1.首先设计、合成探针。2.收集标本，并提取核酸。

3.将提好的核酸样本点到固相支持物上。4.封闭。

5.通过变性和复性完成杂交。6.漂洗

7.放射自显影

核酸分子杂交技术的演变

斑点杂交 southern blot northern blot 原位杂交 芯片技术

聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction(PCR)PCR技术的形成及发展

PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件——摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间, 合成DNA的原料。

PCR的改进与完善

Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视

1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现为PCR技术的广泛应用打下了基础。PCR 技术的实验原理

模拟细胞内DNA合成的过程

利用了DNA变性、复性和能进行杂交的特点，在引物存在的条件下DNA聚合酶开始对DNA进行体外合成。

通过全自动的热循环仪来完成 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点

PCR反应的基本条件

模板的制备: 模板是进行DNA体外扩增的依据，它的来源于不同的材料。PCR对模板的质量要求很高，但对它量的要求不高。

制备模板的材料：

新鲜材料：人或动物的血液及组织中提取；

从少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法医学的材料：血斑、精斑等；

考古材料

从以往保存的材料，如石蜡切片的蜡块中。

提取的原理和方法：（略）

引物的设计：

引物的设计首先要依据你已知的序列来设计。即你要扩增的目的DNA片段。这些资料可以从文献上查找或从互联网上来检索。

实际做的过程中，引物也可借助于别人已经发表的引物来。但从经验上说，别人公开发表的引物常常含有一定的错误。所以要进行核查。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物-3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

PCR所用试剂： DNA聚合酶

buffer:包括两种，一种是含Mg++，一种是不含Mg++。dNTPs 纯净水

自己要准备的模板DNA的制备和引物的设计与合成。PCR的操作过程

设定一个加样配方： 标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液 5ul

4种dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加双或三蒸水至 50ul

加样：

单样本加样

多样本加样

加样的顺序 PCR反应条件的设定：

预就性温度： 94℃，5分

变性温度： 94℃，30秒

退火温度： 需要摸条件

延伸温度： 72℃，30秒

总延伸温度： 72℃，15分

PCR结果的鉴定

通过凝胶电泳的方式来进行。

RT-PCR(reverse transcription-PCR)RT－PCR技术的应用

用于制备基因工程的目的基因片段。

用于表达谱的检测。PCR技术的应用

PCR的初衷是为特异性的扩增某段DNA

现在PCR在医学研究中主要是用于基因诊断，常用于：

对遗传病的突变基因进行诊断

对病原体的基因诊断

通过PCR结合限制酶切的诊断 SSCP技术进行点突变的诊断 RT-PCR进行结构基因的扩增及定量表达 荧光定量PCR技术

PCR结合多态性分析

PCR扩增产物的多态性分析有2种情况：

限制片段多态性分析(A)、(B)重复序列多态性分析(A)、(C)SSCP技术进行点突变的诊断 实时荧光定量PCR技术

电泳技术electrophoresis technology 核酸的凝胶电泳

一、基本原理

1．核酸分子在水溶液中呈多聚阴离子。加上电场，它们会向正电极的方向迁移。2．在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型。

3．电泳环境的影响：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移速度。

当电泳缓冲液中无离子时，溶液导电性极小，电泳速度慢。当电泳缓冲液中离子浓度极强时，则导电性极高，并易产热。

pH值也影响迁移率，溶液的pH远离样品的等电点时，样品颗粒的电离程度大，相应的电泳速率就大。凝胶的浓度的不同对同样大小颗粒的电泳速

率也不相同，因此，不同浓度的凝胶分辨DNA分子大小的能力也不同。

表：琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力

凝胶类型及结构 分离DNA片段的大小范围(bp)0.3%琼脂糖 50 000-1 000 0.7%琼脂糖 20 000-1 000 1.4%琼脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500-25 20.0%聚丙烯酰 50-1

4．凝胶电泳的目的：

可将大小不等的DNA片段和蛋白分子进行分离，并通过标准分子量基本原理：

maker鉴定其大小。

对所要的目的分子进行纯化提取。

二、琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis 琼脂糖是从海藻中提取出的长链状多聚糖，当它被加热到90℃时可被溶解成半透明的液体，这时便于浇板并在冷却后固化成凝胶。其凝固点这40-45℃。

琼脂糖电泳的优点：操作方便，并可用来鉴定和纯化特定的DNA分子。

用低溶点琼脂糖来分离并纯化DNA。

琼脂糖电泳的不足之处：它的分辨范围在0.3-50kb之间，对一些分辨更小DNA分子的实验将无法进行。

琼脂糖电泳结果的显示：

利用核酸与溴化乙锭吸附性强的特点，用溴化乙锭来显色。

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)电泳材料：

丙烯酰胺

CH2═CH─C—NH2 ║ O N,N¡¯-亚甲双丙烯酰胺

H H │ │ CH2═CH─C—N—CH2—N—CH═CH2 ║ O 两种丙烯酰胺在促凝剂存在的条件下可以凝集成胶。

PAGE的优点和不足：优点是分辨率高，不足是操作复杂，成本高。PAGE的凝胶可用溴化乙锭染色，也可以银染，后者的分辨率高。

四、SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(SOS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

SDS-PAGE专门用于蛋白质电泳。

基本原理：在蛋白质电泳前，先将其变性成线结构，并使其表面都吸附上带负电荷的活性分子-----SDS。

蛋白质印迹技术

Western blotWestern blot 技术是借鉴了Southern blot 技术的原理而设计。它也是在凝胶电泳后通过转移电泳将电泳分离物移到固相支持物上再进行进一步的分析。

与Southern blot不同的是，它用来杂交的不是探针，而是特异性的物体。

Western blot的基本过程

先通过SDS-PAGE将样本中的蛋白质分离

通过转移电泳将凝胶上的样本移到硝酸纤维膜上 封闭硝酸纤维膜

用一抗来特异性的识别目标蛋白 用酶标二抗来识别一抗 显色

DNA序列分析

Sanger双脱氧终止法(手工测序)基本原理：

DNA在复制时，需要两个单核苷酸之间脱去一分子水后形成磷酸二酯键。如果在其中加入双脱氧的单核苷酸，将中止DAN的复制。通过自动化的DNA测序仪来进行测序

二、基因组的大规模的测序列 新一代测技术的出现

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

酶联免疫吸附分析Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)

通过免疫学技术(抗原、抗体反应)对样本中的目标蛋白质进行特异性的定性或定量分析。被检测的蛋白质即可能是抗原，也可以是抗体。基本过程：

1.将抗体或抗原结合到固相支持物上

2.用特异性的抗原或抗体(被酶标记)对其进行免疫识别。3.通过酶标仪来检测结果

ELISA常用的方法有：

双抗体夹心法

间接法

一、转基因技术 1.转基因技术的概念

转基因技术指的是将一个物种的特定基因通过人工的方法转入到另一种生物的细胞中，并使它获得了转入基因的特性。

2.转基因技术的类型

转基因技术可分多个层次：

广义的讲，最基本的转基因技术就是基因工程，即将高等生物的基因通过体外重组后，转化入细菌或酵母细胞。

真正意义上的转基因技术是指转基因植物和转基因动物。它们多是将外源基因注入生殖细胞或受精卵子中，并让外源基因整合到其基因组中，并使其在胚胎及发育成熟的个体中获得表达，形成具有新特性的个体。

三、转基因动物 transgenic animal

1．转基因动物的简史

1980年，J.W.Gordon等人首次报道用显微注射的方法向小鼠胚胎注射纯化的DNA，开辟了转基因动物研究的先河。

1982年，R.D.Palmiter等又报道用转移生长激素基因的方法，获得了7只转基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被称为巨鼠，引起极大的轰动。相继有转基因猪、鱼、兔和羊等问世。

2．转基因动物研究概况

⑴转基因动物在培育新品种中的应用

在转基因动物历史上，培育高效益的家畜、家禽和水生动物新品种曾经是研究工作的主流。受“巨鼠”的影响，人们期望能通过转基因动物的研究，获得快速生长、节约饲料、产毛多、产蛋多和抗病的动物新品种。

主要是将生长激素和类胰岛激素的基因转入动物体内，并且取得了良好的增长效果，但也表现出一系列病理性副作用，关节炎和胃病尤其明显。但转基因鱼是一个例外。

⑵动物生物反应器(animal bioreactor)用动物乳腺生产医用蛋白质的优点：

动物乳腺是一个自我封闭的系统，它表达的蛋白质绝大多数不会回到血液循环系统中去，可以避免大量表达的外源蛋白质对动物的健康造成危害。

乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器，一头奶牛一年可产乳蛋白250-300千克，一只羊一年可产乳蛋白25-30千克。如果把百分之一的乳蛋白代换为医用蛋白质，产量十分可观。

乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和后加工，产品活性接近天然产品。

在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，一旦获得成功，可以用常规畜牧技术繁殖产生群体。

我国转基因动物研究的领军人物

——中国工程院院士曾溢滔教授

⑶抗病育种

将具有抗病能力的基因导入动物，使其具有较理想的抗病能力。目前已做的工作有：

抗猪瘟育种：

抗流感基因工程育种：1989年Young将INF基因质粒导入小鼠受精卵，获得表达，获得抗病转基因小鼠。

抗肿瘤动物模型：美国首先培育出易发乳腺癌的转基因小鼠，为研究癌诱发和抗肿瘤药物的筛选提供了研究的模型。迄今已培育出许多与癌基因有关的转基因小鼠。⑷基因治疗

⑸组织器官移植：

将人的标志基因移入猪，使其器官上具有了人的抗原标志，减小了排异反应。

3.转基因动物的技术路线 ⑴经典的技术路线

先从已交配的供体动物的输卵管中采取受精卵；

显微注射法向受精卵的雄性核导入人工构建的药物蛋白基因；

经外科手术把已导入外源基因的受精卵移入同步发情的受体母羊输卵管内；

让受精卵在“养母”体发育至分娩出生；

用分子生物学技术检测出生小羊是否已整合了导入的外源基因。

该法的缺点：实验周期长，注射的外源基因整合率低。

⑵整合胚胎移植技术路线

该技术是对前种方法的改进。它利用了生殖技术中的体外受精技术，使精子和卵子在体外受精；然后找到一个最佳时机向体外受精的细胞显微注射药物蛋白基因。然后在体对胚胎体进行整合的鉴定。从中挑选有目的基因整合的胚胎进行移植。采用经阴道的非手术胚胎移植法，减少了对受精卵的损伤。

⑶核移植（克隆）技术路线

利用克隆技术进行转基因实验。即在进行克隆之前，先目的基因注射到将进行移植的核中，在按克隆技术进行操作。其成功率比经典技术路线高2.5倍。

⑷整合卵受精技术路线

即在受精之前先将药物蛋白基因注射进入卵细胞，经检测已经完成整合后，再进行体外受精和胚胎移植。

基因组学(genomics)功能基因组学(functional genomics)蛋白质组学(proteomics)Genome这个述语是德国遗传学家Winkler在1920年创造的。它的含义是指一个细胞中所含有的全套遗传信息。也是泛指一个物种中所含的全部的遗传信息。

基因组学(genomics)主要是研究一个物种的基因组的组成，包括DNA碱基的排列顺序，基因的分布情况。

人类基因组计划简介(human genome project, HGP)HGP简介

人类基因组计划是由美国科学家于1985年率先提出、于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。

基因组(Genome):基因组就是一个物种中所有基因的整体组成 人类基因组有两层意义： ——遗传物质 ——遗传信息

从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系

人类基因组计划的目标：

1.测定人类基因组中32亿个单核苷酸（碱基）的排列顺序。

2.确定各个基因和功能元件在序列中的位置，也就通常说的基因定位。3.确定出与疾病相关的基因及找出有治疗和药用价值的基因。4.绘制出一个完整的人类基因图谱。

HGP是如何进行的： 1.基因组测序概观

基因组的测序的基本过程：

①选择物种

②从细胞中提取DNA ③把经纯化的DNA随机切割成大小合适的重叠片段

④指导DNA片段插入到载体中，并克隆

⑤测出第一DNA片段的碱基顺序

⑥确定片段间的重叠，把序列组装成最终的基因序列 敲碎基因组，分析研究内容所处的染色体位置

2.DNA的测序方法

在发明自动测序技术之前，人们用手工进行测序，最常用的方法是末端终止法（后面专门介绍）。

手工测序是通过凝胶电泳的手段将DNA片段进行分离，然后在胶上“读出”碱基的排列顺序。这就决定了被测序的DNA片段不可能太大，而且效率很低，在20世纪80年代时，一天只能完成500bp片段的测序工作。

3.自动化测序

1985年Leroy Hood, Lioyd Smith, Mike Hunkapiller发明了第一台自动测序仪，每天能测15 000个bp，1998年Hunkapiller领导的小组发明了一种新的测序列仪——ABI 3700G型DNA分析仪，每天可测多达400 000bp。测序的自动化推动了HGP的神速发展，研究人员仅用15个月的时间就完成了人类基因序列的90%。

技术的改进促进了测序的发展，每18个月全世界的测序总量翻一番，而测序成本则减少一半。从20世纪80年代末期到2001年，测序成本从10美元降到10美分。

4.测序用载体的改进

在进行基因组测序时，先要将提取的基因组DNA用限制性内切酶切成大小不等的片段，并使每个片段之间能够出现部分的重叠，然后需将这些片段放入载体大量克隆后才能完成测序的需要。

分子生物学中常用的载体是质粒，它一般能携带较小的DNA片段。但在HGP的测序中需要能携带更大片段的载体，人工染色体载体的出现解决了这一困难。现在用的人工染色体分为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome BAC)或酵母人工染色体(yeast artificial chromosome YAC)。BAC能携带300 000bp的DNA，YAC能携带1 000 000bp 的DNA，但不够稳定。

5.组装基因组的拼图游戏

基因测序后，要将一个个小的DNA片段拼装起来就象一个游戏，但是一个十困难的工作。一个原因是人的基因组过于庞大，32亿个碱基对被切成小片段也要有上千万个片段，把它们从头到尾找到一起本身就是很困难的工作。加上人的基因组中存在着大量的重复顺序，约占人基因组的一半以上，这样在拼接时很容易把一个区误认为另一个区域，因此在基因组测序和拼图中常常会出现空洞和错误。要弥补这些空洞和错误，基因组的工作草图的每一个碱基至少被测4-5次，人类基因组的最终目标是产生完全的序列，没有空隙，准确率要达到99.99%。

6.目前进行基因组计划的两种策略： 霰弹法测序：

先将人的基因组制备成各级小片段，并且小片段间有重叠的关系 然后对每个小片段进行测序 通过重叠的关系将相互联系着的小片段拼接成较大片段 当拼到比较大的片段时，就可用于构建图谱 最终全部基因的序列。

全基因组霰弹法测序：

将基因组分割成小片段 然后对小片段进行随机的测序

通过计算机的程序将所有这些小片段组装成连续的大片段，最终得到全基因组序列。

模式生物体的研究

通过对进化不同阶段的生物体基因组序列的比较，发现基因组结构组成和功能调节的规律。

人类基因组计划的完成示标志着生命基础科学的研究进入到后基因组时代。

HGP对人类的重要意义

1、HGP对人类疾病基因研究的贡献

人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿舞蹈病、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。健康相关研究是HGP的重要组成部分，1997年相继提出：“肿瘤基因组解剖计划”“环境基因组学计划”。

2、HGP对医学的贡献

基因诊断、基因治疗和基于基因组知识的治疗、基于基因组信息的疾病预防、疾病易感基因的识别、风险人群生活方式、环境因子的干预

3、HGP对生物技术的贡献

（1）基因工程药物：分泌蛋白（多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受体。

（2）诊断和研究试剂产业：基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型。

（3）对细胞、胚胎、组织工程的推动：胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。

4、HGP对制药工业的贡献

筛选药物的靶点：与组合化学和天然化合物分离技术结合，建立高通量的受体、酶结合试验为基础的药物设计：基因蛋白产物的高级结构分析、预测、模拟—药物作用“口袋”

个体化的药物治疗：药物基因组学。

5、HGP对社会经济的重要影响

生物产业与信息产业是一个国家的两大经济支柱；发现新功能基因的社会和经济效益；转基因食品；转基因药物（如减肥药，增高药）

6、HGP对生物进化研究的影响

生物的进化史，都刻写在各基因组的“天书”上；草履虫是人的亲戚发现了大约一百四十万个单核苷酸多态性，并进行了精确的定位，初步确定了30多种致病基因。随着进一步分析，我们不仅可以确定遗传病、肿瘤、心血管病、糖尿病等危害人类生命健康最严重疾病的致病基因，寻找出个体化的防治药物和方法，同时对进一步了解人类的进化产生重大的作用。

9、蛋白组的复杂性

人类基因组编码的全套蛋白质（蛋白质组）比无脊椎动物编码的蛋白质组更复杂。人类和其他脊椎动物重排了已有蛋白质的结构域，形成了新的结构。也就是说人类的进化和特征不仅靠产生全新的蛋白质，更重要的是要靠重排和扩展已有的蛋白质，以实现蛋白质种类和功能的多样性。有人推测一个基因平均可以编码2-10种蛋白质，以适应人类复杂的功能 ——13亿年；人是由300～400万年前的一种猴子进化来的；人类第一次“走出非洲”——200万年的古猿；人类的“夏娃”来自于非洲，距今20万年——第二次“走出非洲”？

7、HGP带来的负面作用 侏罗纪公园不只是科幻故事 种族选择性灭绝性生物武器 基因专利战

基因资源的掠夺战 基因与个人隐私。

人类基因组带给我们的新发现

1、基础数据

全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因；平均的基因大小有27kbp；其中G+C含量偏低，仅占38%，而2号染色体中G+C的含量最多；到目前仍有9%的碱基对序列未被确定，19号染色体是含基因最丰富的染色体，而13号染色体含基因量最少等等（具体信息可参见cmbi 特别报道：生命科学的重大进展）。

2、基因的分布情况

目前已经发现和定位了26000多个功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能，在已知基因中酶占10.28%，核酸酶占7.5%，信号传导占12.2%，转录因子占6.0%，信号分子占1.2%，受体分子占5.3%，选择性调节分子占3.2%，等。发现并了解这些功能基因的作用对于基因功能和新药的筛选都具有重要的意义。

3、基因数量少得惊人：

一些研究人员曾经预测人类约有14万个基因，但Celera公司将人类基因总数定在2.6383万到3.9114万个之间，不超过40,000，只是线虫或果蝇基因数量的两倍，人有而鼠没有的基因只有300个。如此少的基因数目，而能产生如此复杂的功能，说明基因组的大小和基因的数量在生命进化上可能不具有特别重大的意义，也说明人类的基因较其他生物体更'有效'，人类某些基因的功能和控制蛋白质产生的能力与其他生物的不同。这将对我们目前的许多观念产生重大的挑战，它为后基因组时代中生物医学的发展提供新的非凡的机遇。但由于基因剪切，EST数据库的重复以及一些技术和方法上的误差，将来亦可能人类的基因数会多于4万。

4、不同各族间DNA的差异

人类单核苷酸多态性的比例约为1/1250bp，不同人群仅有140万个核苷酸差异，人与人之间99.99％的基因密码是相同的。并且发现，来自不同人种的人比来自同一人种的人在基因上更为相似。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。

5、人类基因组中存在大片“荒漠”。

在染色体上有基因成簇密集分布的区域，有大片的区域只有“无用DNA” ——不包含或含有极少基因的成分。基因组上大约有1／4的区域没有基因的片段。在所有的DNA中，只有1%-1.5%DNA能编码蛋白，在人类基因组中98%以上序列都是所谓的“无用DNA”，分布着300多万个长片断重复序列。这些重复的“无用”序列，决不是无用的，它一定蕴含着人类基因的新功能和奥秘，包含着人类演化和差异的信息。经典分子生物学认为一个基因只能表达一种蛋白质，而人体中存在着非常复杂繁多的蛋白质，提示一个基因可以编码多种蛋白质，蛋白质比基因具有更为重要的意义

6、男女性别间基因的差异

男性的基因突变率是女性的两倍，而且大部分人类遗传疾病是在Y染色体上进行的。所以，可能男性在人类的遗传中起着更重要的作用。

7、外来基因

人类基因组中大约有200多个基因是来自于插入人类祖先基因组的细菌基因。这种插入基因在无脊椎动物是很罕见的，说明是在人类进化晚期才插入我们基因组的。可能是在我们人类的免疫防御系统建立起来前，寄生于机体中的细菌在共生过程中发生了与人类基因组的基因交换。

8、新的遗传标记

蛋白质组学(Proteomics)

proteome一词于1994年提出，源于proteins和genome,意思是proteins expressed by a genome。研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学

蛋白质组的广义含义：

指某种细胞或组织中基因组所表达的所有的蛋白质。但与基因组不同的是，蛋白质组是一个动态的概念，因此有人用功能蛋白质组的概念，指的是细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。蛋白质组的狭义含义：

可以指不同类型细胞内蛋白质的变化，如正常细胞和异常细胞之间、细胞用药或不用药之间的蛋白质水平差异、不同组织细胞间的蛋白质类型的差异。

蛋白质组研究的意义和背景

蛋白组学可从另一方面来进行探索。即找到蛋白再来找其基因。

蛋白研究的困难性

蛋白质与核酸相比，结构更复杂

前者与后者残基的比为20:4；后者能在体外进行合成、前者则不能；后者结构和组成的差异不大、前者有着复杂的翻译后修饰如磷酸化、甲基化等内容。

蛋白质的结构易被破坏

核酸在变性后能够复性，并且结构不被破坏(这一点正是人们所利用的)。

蛋白质结构一旦变性则很难恢复。

蛋白质组研究主要分两个步骤

蛋白质组分离技术 蛋白质组分析技术 蛋白质的分离

将各种蛋白进行分离是进行后续分析的基础。分离的越细、分辨率越高将会为分析创造更好的条件。常用的蛋白质分离手段有：

亲和层析 分子筛 离子交换

毛细管电泳 一向电泳 双向电泳

双向电泳技术 样品的制备

等电聚焦电泳(1向)SDS-PAGE电泳(2向)扫描保留图象

强大的分析软件进行数据分析 选定目标蛋白 切胶 后续分析 对胶的染色 图象的采集 图象分析和处理

切胶收集目标蛋白

基因诊断

(Gene Diagnosis)基因诊断是以DNA或RNA为实验材料，通过对某种特异碱基序列的检出来确定某种疾病的发生或某种病原体的存在。

基因诊断要达到的目的 对已知突变基因的检出

临床应用和基础研究

对一些未知基因突变的筛选和分析。

对一些基因表达水平高低与某些疾病相关性的研究 对病原体基因的检出。基因诊断早期的方法

分子杂交(hybridization)限制片段长度多态性的研究

(restriction fragment length polymorphism RFLP)分子杂交应用于基因诊断的基本原理

根据被检测目标设计一个核酸探针，再用探针对来检测具体的样本，从而达到诊断的目的。

在实际应用中，常用southern blot的方法来进行突变基因的筛查。

PCR技术进行基因诊断的几种基本设计：

1.根据突变位点来设计特异性的引物。通过有无扩增片段来进行定性的。

2.通过基因片段长度的多态性来进行鉴定。3.PCR结合限制片段长度多态性来进行鉴定。

4.通过PCR-SSCP来进行鉴定。

5.通过设计特异性的引物来诊断病原体的特异性基因。

基因诊断的应用 多态性分析

对遗传病突变基因的诊断

已知突变位点的诊断

未知突变位点的筛查和定位 基因异常表达的诊断（定量表达）外源DNA的检测

肿瘤标记物的确定和诊断 在法医学中的应用

DNA多态性

序列多态性(SNPs – 单碱基多态性)同源染色体 5-GGTTTACACCTAA-同源染色体 5-GTTTTAAACCGAA-

长度多态性(VNTR-可变的串联重复顺序)同源染色体 5-AATCAATCAATC-

同源染色体 5-AATCAATCAATCAATCAATC-

核心序列较长者（如大于8bp）常称为小卫星DNA，或称可变数目串联重复序列（VNTR）核心序列较短者（如2-5bp）常称为微卫星DNA，或称短串联重复序列（STR）

微卫星多态性 单碱基多态性

遗传信息变异是所有基因组的共同特征。不同个体、群体在疾病易感性、对环境理、化、生、致病因子反应性和其他性状上的差别，都与基因组序列中的变异有关，这些变异最常见的形式是单核苷酸多态性（SNP）。

人类基因组中SNP的数目约为3百万－1千万。人类遗传多态性的意义 与性状相关；

与疾病相关，可用于预测发病风险； 个体医学发展的基础；

可作为遗传标志，用于疾病连锁诊断； 作为个人身份识别标识用于法医学。

遗传性状

遗传多态性在身份识别方面的应用

公安司法系统——罪犯及受害人的身份识别及亲子鉴定； 部队 —— 伤亡士兵的身份识别；

保安 —— 个人DNA身份证，用于人员识别；

何为RFLP? 限制性片段长度多态性

(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

何为DNA指纹？用一种或几种限制性内切酶切割基因组DNA，用探针杂交并放射自显影。

中国人群的遗传学关系

主要成果：证实中国人群可分为南、北两大组，两者之间有明显的基因融汇；提出了东亚人群可能起源于东南亚、而东亚现代智人与其他各大洲现代人群都起源于10－20万年前“走出非洲”的群体的观点。

基因治疗Gene Therapy

依靠遗传物质来治疗疾病，包括纠正人自身基因的结构或功能上错乱、阻止病变的进展，杀灭病变的细胞，或抑制外源原体遗传物质的复制，从而达到治病的目的。这就是基因治疗的含义。基因工程与基因治疗有相似的一面：

二者都需将“目的基因”（基因治疗也可称为治疗基因）分离和纯化；都需要将选择合适的载体，并将“目的基因”与载体在体进行重组；都需要将重组体导入受体（靶）细胞。基因工程与基因治疗有不同的一面：

基因工程的主要目的是将重组体导入宿主细胞，并使得外源基因在宿主细胞中表达、纯化，最终获得重组蛋白。

基因治疗的主要目的是将具有治疗价值的基因形成的重组体导入体细胞直接表达，并无需对表达产物进行纯化。

基因工程的全部过程都在体外操作；而基因治疗需将外源基因导入体细胞中，因此技术上具有很大难度，而且对其有效性和安全性方面提出了

苛刻的要求

基因治疗有两种途径：

ex vivo in vivo ex vivo ：

将含有外源基因的载体在体外导入人体细胞或异体细胞（也称基因工程化细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。这种方法易于操作，并易于解决安全性的问题，但不易于工程化生产。in vivo途径

将外源的治疗基因装配于合适的真核细胞表达载体，直接导入人体内，这种方式的导入有利于在规模的工业生产。但是，这种方式导入治疗基因及其载体必须证明其安全性，而且导入体内后需能进入靶细胞，有效地表达并达到治疗的目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于前者。

致病基因的确定(定位)近日，来自国际上六个国家的科学家展开合作，通过分析全球不同人群之间的遗传基因信息，初步绘制出首张人类DNA序列中变异基因片段的遗传图谱“HapMap”。这张图谱对于基因治疗来讲，意义非凡。

所谓“HapMap计划”，是由加拿大、中国、日本、尼日利亚、英国和美国共同资助并联合展开的基因研究项目，全名为“国际人类基因组单体型图计划”(简称“HapMap计划”)，项目旨在建立一个帮助研究者发现人类疾病及其对药物反应相关基因的公众资源。

反义技术 又称反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技术，是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段,使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的、用反义RNA已对某些癌症进行临床试验。这类反义技术只能认为是一种从基因水平进行治疗的技术，它们以不同方式，在DNA复制、转录和翻译水平发挥作用。由于它们的分子量低，故而有潜力进入靶细胞，但其临床稳定性、毒性、细胞通透性等各方面都需要进一步研究。

药物靶向治疗（drugs targeting）此法机理可概括为病毒导向酶的药物前体治疗（virus directed enzyeme prodrug therapy,vdept），即用反转录病毒载体的外源基因转移到细胞内.该基因编码一种酶，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒素复合物。带有这一基因的病毒载体只在特殊组织或肿瘤细胞中而不在正常细胞中表达

第五篇：分子生物学论文

分子生物学论文

姓名：

专业：药学

班级：11级药学三班 学号：

基因工程抗体治疗白血病的研究进展

【摘要】目前采用基因工程药物治疗白血病逐渐成为热点。研究表明白血病在获得缓解后用基因工程药物治疗即可提高疗效，又可减轻化疗药物的毒副反应，并可望达到治愈白血病的目的。

【关键词】白血病；基因工程抗体；研究进展

引文

白血病是一类造血干细胞的克隆性疾病，在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚，并浸润其他器官和组织，而使正常造血受抑制。在儿童至35岁以下青壮年人群中因患恶性肿瘤致死的以白血病为首，故可称为“第一杀手” [1]。治疗白血病通常采用细胞毒药物，虽然能使大部分患者病状缓解和生存期延长，但治愈率仍很低。基因工程技术的发展为降低单克隆抗体的免疫源性提供了一个有力的手段。目前嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体三种人源抗体很好地克服了HAMA反应的缺陷。2 正文

Campath一1H是在体内外对大部分正常和恶性淋巴细胞都有溶解杀伤作用的人源化CD52抗体，但对造血干细胞没有杀伤作用。起初，Campath一1H主要集中在对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床试验中，但由于Campath一1H对血循环中的淋巴细胞有强力的清除作用，现已经将其应用到CLL、T— PLL疾病中。

氟达拉滨等嘌呤类似物在各种慢性淋巴细胞白血病的治疗中获得较高的缓解率，但完全根除疾病的报道很少。将Campath一1H给予预先接受氟达拉滨治疗的CLL患者，来清除微小残留病变(MRD)，从而提高完全缓解率和持续时间，这可以使难治性CLL患者的总生存率(overall survival，OS)得到改善。Galimbeai[2] 等对8名CLL患者在氟达拉滨治疗后给予Campath一1H治疗。在Campath一1H治疗后，5例患者获得分子学缓解(62．5％)，其中4例在治疗结束后一个月内获得。OR(overall response)率为72％，CR率为43％，因此Campath一1H对CLL的治疗作用是显著的。

另外，Keating[3]等 2002年对76例先前治疗过的T—PLL患者给予Campath—IH治疗的安全性和功效进行了回顾性的分析。接受Campath一1H治疗的患者，其OR率为51％，CR为39．5％，CR中位持续时间8．7个月，0s率为7．5个月(CR者14．8个月)。作者认为Campath一1H是补救T—PLL一线治疗失败__的较好药物。

在造血干细胞移植中，Campath一1H还能有效地清除供者的T淋巴细胞而不影响采集的干细胞的数目和功能，成为预防异基因移植中预防移植物抗宿主病(GVHD)较为理想的药物。

随着减轻强度的预处理(RIC)方案的发展，出现了“非清髓性”造血干细胞移植。这种方案主要是靠免疫活性细胞作用，目的是使供体干细胞既易于植入，又最终起到根除肿瘤的作用。通常是包括氟达拉滨等药物的联合应用，但仍然有较高的慢性GVHD的发生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴细胞，从而减少了排斥反应和GVHD的发生，为“非清髓性”移植提供了一种较为理想的免疫抑制效应。Faulkner[4] 等报道了65例接受BEAM+Campath一1H预处理方案进行异基因移植的患者，包括CLL、PLL，中位年龄为45．6岁。其中Campath—IH每天用10mg。11例发生了急性GVHD(I一Ⅱ)，9例发生了慢性GVHD。55例获得了反应，其中41例为CR，6例复发。2年Os率为68．1％，无事件生存率(EFS)为57．7％。结果2年移植相关死亡率(TRM)为13．3％。3 结语

基因工程药物治疗白血病首先可以有效的避免治愈白血病过程中由于肿瘤的微小残留病变(MRD)不能被彻底清除而引起的疾病复发；其次是避免单纯化疗带来的毒副反应而引起机体的损伤以及机体对化疗药物的耐受性。因此用基因工程药物治疗白血病的方法成为了国内外科学家研究热点。我国与国外相比，虽起步较晚，但也获得了较大的发展，取得了一定的科研成果。例如，已经研制成功和正在研制的基因工程产品就有几十种，有些已经投产并开始使用，女ⅡIFN一、rhIL一

2、rhG—CSF、rhGM—CSF等。总之，基因工程药物治疗前景是十分诱人的，还有待于科研工作者的继续努力，让它为人类的健康作出更大的贡献。

【参考献文】

[1] 杨进．血液病中西医结合治疗学[M]．北京：科学技术文献出版社，2005：65．

[2]Galimberti S，Cervetti G，Cecconi N，et a1．Quantitative molecular e．valuation of minimal residual disease in patients with chronic lym—phocytic leukemia：efficacy of in vivo purging by alemtuzumab(campath一1H)[J]．J Immunother，2004，27(5)：389—393．

[3]Keating MJ，Cazin B，Coutre S，et a1．Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J]．J Clin Oncol，2002，20(1)：205—213． [4] Faulkner RD，Craddock C，Byrne JI，et a1．BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases；GVHD，toxicity，and survival in 65patients[J]．Blood，2004，103(2)：428-434．