张绍阳 20130524 《分子生物学》实验讲稿20130223五篇

第一篇：张绍阳 20130524 《分子生物学》实验讲稿20130223

铜仁学院

Tong ren xue yuan

讲 稿

课 程 分子生物学 实验 专 业 生物科学科 年 级 2010级 教 师 张 绍 阳 职 称、学 位 讲 师 博 士 部系、教研室 生物科学与化学系植物教研室

2012至2013学年度第二学期

实验1 CTAB法提取植物基因组DNA

一、实验目的和原理 基因组DNA提取实验意义

基因组DNA提取是植物生物技术的基本环节，所得DNA可用于基因克隆、分子标记分析、基因文库构建以及Southern杂交等试验操作。2 基因组DNA提取方法

关于植物基因组DNA提取的方法有诸多文献报道，但基本步骤和原理是相近的，其提取液主要成份不外乎两种试剂，即十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyl-ammonium bromide，CTAB）和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），并以CTAB为多。本次实验介绍CTAB法提取植物基因组DNA原理和相应方法。基因组DNA提取CTAB法基本原理

植物组织是由多种组分构成的，如糖、脂类、蛋白质、DNA和RNA构成。提取基因组DNA就是要先将组织细胞进行破碎，然后通过试剂作用和离心作用将其余杂质去除。植物组织经液氮粉碎后用含表面活性剂的CTAB提取液提取，经氯仿抽提，DNA和RNA得到回收而蛋白质及细胞碎片和脂溶性杂质得到去除。经有机溶剂沉淀，DNA和RNA得以沉淀而水溶性杂质被去除。RNA经RNase处理可被降解，最终获得基因组DNA。

以下是提取方法和基本步骤。

4.本实验要掌握事项：移液器使用注意事项、离心机操作注意事项

二、实验材料、试剂、仪器及用具

1.实验材料及选取标准：健康无病虫害的植物鲜嫩组织，通常是芽和未完全展开的幼叶。思考题：为什么要选用鲜嫩组织？说明不同植物材料DNA提取难易程度有显著差别。本实验实验材料为：青瓯柑幼叶。

2.试剂种类及其作用

2.1 试剂种类： 液氮、2×CTAB提取缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（水不溶性）、β-巯基乙醇、氯仿:异戊醇（24:1）、酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）、异丙醇、70%乙醇、RNase（10mg/ml）、TE缓冲液等。

2.2 试剂作用：（1）液氮和PVP。液氮就是保持研磨时低温降低组织内生理生化反应，同时使得组织变脆易于研磨。PVP是防止组织发生醌类反应而褐化。（2）2×CTAB提取缓冲液（由2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl , 20 mmol/L EDTA, 1.4 mol/L NaCl, pH 8.0)，其作用就是细胞破碎，基因组DNA从核内游离出来；其中，EDTA成分为DNase抑制剂，防止DNA被该酶降解。β-巯基乙醇，在提取前CTAB溶液中，具有抑制氧化作用，其具有臭鸡蛋难闻气味。加入该试剂要在通风厨内进行。

（3）氯仿:异戊醇（24:1），该溶液密度比水大，其作用去除叶绿素等脂溶性物质，包括糖和大部分蛋白质。

（4）RNase A ,其作用就是去除RNA（5）酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）,去除蛋白质，尤其是染色体上的组蛋白（6）异丙醇，使DNA沉淀。用前要-20度低温遇冷半小时或更长时间。（7）乙醇，漂洗DNA，使得到的DNA更为纯净

（8）TE缓冲液（10 mM Tris和 1 mM EDTA，pH8.0）。溶解DNA。溶解完毕的DNA溶液，即为最终提取产物。也可以用超纯水（或双蒸水）进行溶解。在TE缓冲液中，DNA更为稳定。

3.仪器及用具：冷冻离心机、研钵、移液器、通风厨、水浴锅等。分子生物学实验中，氯仿、甲醛、醋酸、-巯基乙醇，都具有刺激性气味，进行相关操作时要在通风厨内进行。

三、实验步骤（实验操作顺序，以一A1小小组为例）

1.一A1-1 加提取缓冲液。将600 l 2×CTAB提取缓冲液和20 l -巯基乙醇加入1.5 ml 离心管中（在通风厨内进行）, 将该离心管放入65℃水浴中进行预热。

2.液氮研磨组织。取适量植物组织（约0.5-1.0g），加入适量PVP，于液氮中研磨成粉末。（已有研磨好样品，在本实验中，此步骤已省略）

3.一A1-2 65℃水浴45-60 min。取0.10-0.12g研磨好的组织粉末，转入提取液已预热过的离心管中，盖好盖子后，旋窝震荡10-15s左右，然后随浮板放入在65℃水浴中保温45-60 min, 并每隔10-15min颠倒混匀10次左右。（待水浴完成后，将温度设置为37℃，加入适量水，使其水温降到37℃，以备后续RNA消解用）

4.一A1-3 等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提。加600 l 氯仿:异戊醇（24:1）到管中（在通风厨内进行），盖紧离心管盖，颠倒混匀50-100次，12000 rpm 离心10 min。（在本实验中，4℃12000 rpm离心10min，只有异丙醇沉淀所必需，其他相应操作可以不采用此条件。但为方便起见，均采用此条件）

5.一A1-1 RNase消解RNA。吸取500 l上清液（注意不要洗到下层溶液）转入新的离心管中。（注A4和A5在此可直接跳到步骤6）。加入0.5 l RNase溶液，颠倒混匀后，随浮板放入37℃水浴锅内，放置30min。

6.一A1-2 酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提。加入500 l（在通风厨内进行），盖紧离心管盖，颠倒混匀50-100次，12000 rpm 离心10 min。

7.一A1-3 异丙醇沉淀。用1 ml 移液器吸取400 l上清液（注意不要洗到下层溶液）转入新的离心管中，加入等体积的已遇冷的异丙醇，盖紧离心管盖，轻轻颠倒1-2次，-20℃冰柜内放置30 min左右，然后于4℃下12000 rpm离心10 min。

8.一A1-1 70%乙醇漂洗两次。小心倒弃上清液，在含DNA沉淀的离心管中加入1 ml 70%乙醇，轻轻颠倒1次，小心倒弃上清液，此为一次漂洗。重复一次漂洗。然后，短暂离心，充分吸弃残液，敞开离心管口，散除乙醇10-15min；

9.一A1-2 TE缓冲液溶解DNA。加入30-50 l TE缓冲液（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA，pH8.0），用移液器吸头轻柔吸打溶解沉淀，沉淀溶解后，即为DNA提取产物，DNA提取到此结束；取5l 产物用于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余放置在-20℃冰柜保存备用。DNA琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光度计检测，见后续实验。

四、思考题与作业

1.把你认为在实验过程中最应该注意的事项写下来。

实验2 核酸琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的和原理

核酸电泳是分子生物学实验室最频繁的基本操作之一，它可用于分析核酸片段的长度从而检查特定长度的目的核酸片段是否存在，也可用于判断核酸的质量（如有无严重多糖污染）和降解程度，它也常用于粗略估计核酸的浓度以及用于核酸片段的纯化。

核酸为多元酸，具有较强的酸性，因此在呈碱性的电泳缓冲液中带有正电荷，在电场作用下由负极向正极移动，核酸在琼脂糖凝胶中的泳动距离与凝胶浓度、核酸长度和构象等因素相关。线性核酸在凝胶中的泳动距离与核酸长度的对数呈线性负相关，根据这一特性，可以依据已知长度的核酸标准物计算目的条带的长度。本实验的目的是掌握核酸琼脂糖凝胶电泳的原理、影响因素及其应用。

二、实验材料、试剂、仪器及用具

1.材料：先前实验获得的DNA或RNA样品。本实验为青瓯柑基因组DNA。2.试剂：琼脂糖、1倍TAE 缓冲液、溴化乙锭（EB）、6 倍 loading buffer、DNA Marker(本实验用DL 2000 和 λ-Hind III，如下图所示)等。

3.仪器及用具：电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪（或手提紫外灯）、凝胶成像系统、微波炉等。

三、实验步骤（有待调整，见5月25日早上正式版本；先看先了解）1.根据胶模面积计算制备琼脂糖凝胶所需体积，控制凝胶的厚度在5-7mm左右。取所需体积的1×TAE电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液的配法：24.2克Tris，3.72克EDTANa2•2H2O，加适量水，搅拌并稍加热溶解后加5.71ml冰乙酸，加水至100 ml）于合适大小的三角瓶中。

[提示：（1）凝胶过薄影响点样体积以及凝胶强度，低于1%的琼脂糖凝胶宜厚些。过厚导致凝胶成像时背景较深且易导致条带变得模糊（由于上下泳动速度不完全一致所致）；（2）琼脂糖凝胶电泳可采用的电泳缓冲液包括1×TAE和0.5×TBE，但后者不适于从琼脂糖凝胶中回收DNA的操作，故实验室统一作用1×TAE为佳；（3）三角瓶的容量以达到电泳缓冲液的3-5倍以上为佳。] 2.根据所分离核酸片段大小确定琼脂糖凝胶浓度，具体如下。

基因组DNA（约50 kb）

0.7%

质粒（＞3kb）、RNA

0.8%

1000-3000 bp

1.0%

500-1000 bp

1.5%

<500 bp

2.0%

[提示：（1）凝胶浓度过低会导致凝固不良或凝胶强度低，而过高则会导致凝胶成像时背景较深；（2）浓度使用不当会导致条带间分离不良；（3）低于300 bp的片段进行电泳时条带间往往难以获得良好分离，使用高分辨率琼脂糖可改善短片段间的分离效果，从而可应用于AFLP或SSR产物的电泳，但所使用的浓度相应提高。] 3.根据上两步骤确定琼脂糖用量，称取琼脂糖倒入已装有电泳缓冲液的三角瓶中，混匀，置微波炉中加热至微沸或接近微沸，取出，再次混匀，再用微波炉加热至沸腾，取出，若溶液中尚有琼脂糖颗粒的迹象，需重复加热步骤。

[提示：（1）琼脂糖的充分熔化对于最终电泳图片的质量十分重要。多次反复加热比一次持续加热更有利于琼脂糖的熔化且可避免琼脂糖溶液在沸腾时溢出；（2）选择具透明炉门的微波炉有利于避免因过度沸腾导致的溶液溢出；（3）需戴防热手套以防烫伤。] 4.取出三角瓶，在室温放置0.5-1 min，然后加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5 g/ml，迅速混匀，然后将琼脂糖溶液倒入胶模并插入电泳梳子。

[提示：（1）EB为致癌物质，操作时需戴乳胶手套。EB在沸腾的琼脂糖溶液中易挥发，因此，在室温放置琼脂糖溶液0.5-1 min使温度稍降之后加入EB为佳。已添加EB的凝胶不宜再次熔化以避免EB挥发；（2）EB通常配制成10 mg/ml的贮存液，因此，每100 ml凝胶溶液中加入5 l贮存液即可。] 5.待琼脂糖凝胶充分凝固后方可用于电泳。拔出电泳梳子，将凝胶连胶模放入电泳槽，点样孔一端靠负极，倒入1×TAE电泳缓冲液至高出凝胶表面0.5 cm。

[提示：（1）琼脂糖的充分凝固对于最终电泳图片的质量十分重要。夏天低浓度琼脂糖凝胶的凝固需要较长时间，可在凝胶基本凝固后将凝胶连胶模放入4℃冰箱加速凝固；（2）凝胶长时间（如过夜）不用时需用保鲜膜包裹以防止水分蒸发，且不应拔下电泳梳子。] 6.将5-10 l样品与1-2 l 6×上样缓冲液（0.25%溴酚兰, 40%蔗糖）按大约5：1的比例混匀，然后点到凝胶点样孔中；

[提示：（1）上样体积宜根据核酸浓度确定，通常电泳条带的量以20-200 ng为宜，过小导致条带信号弱难以观察，过大导致条带间不易分离；（2）当上样体积较大时，可在制胶时使用梳孔较厚的梳子，但电泳分辨率不及梳孔较窄时；（3）随凝胶浓度不同，溴酚兰指标对应的DNA条带长度约为300-1000 bp，当溴酚兰与目的条带同一位置时会影响目的条带的荧光观察和摄像，此时可将上样缓冲液用40%蔗糖稀释3倍后使用；（4）出于DNA长度或浓度计算需要，需要同时点商业化的DNA Marker。] 7.点样完毕后开始电泳，电泳电压以5V/cm [即两电极间的长度（以cm为单位）×5为宜]。用紫外分析仪或手提紫外灯监测电泳进程，待条带间达到理想分离程度时停止电泳，进行凝胶摄像。

[提示：（1）电泳时间过短不利于条带分离，过长则易导致短片段条带变宽模糊且荧光信号变弱；（2）阅读凝胶摄像仪说明书，进行合理的参数设置对于获得理想图片十分重要。]

四、思考题与作业（可以思考，但不做要求）1.影响核酸泳动距离的因素有哪些？

2.如何根据电泳结果计算目标核酸片段的长度？ 3.如何获得一张理想的电泳图片？

第二篇：分子生物学实验讲义

实验 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

二、实验试剂

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。

三、实验操作

1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

2、取1.0ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀,4℃离心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量离心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.0倍体积（1ml）预冷的无水乙醇，混匀，室温放置５min，4℃离心12000g×10min，弃上清。

8、加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干或吹干（不能过于干燥，造成溶解困难）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存备用。

四、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

五、注意事项

本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

六、习题：

1、什么是质粒？质粒有什么主要用途？

2、分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？

3、制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？

实验 琼脂糖凝胶电泳实验

一、实验目的

（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：

（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。

（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。

常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。

三、试剂与器材

（一）材料

电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等

（二）试剂 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。

3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量标准

四、操作方法

常规的水平式琼脂糖电泳：

制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：

琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

2、胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

3、加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。

4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板中央时，停止电泳。

5、观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。

五、注意事项

1、EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。

2、由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、实验报告要求与思考题

1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）

M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？

4、为什么分子生物学实施时要担心EB？

5、琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？

电泳流程图：

实验 PCR扩增eGFP基因

一、PCR技术的基本原理

PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。

1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。

2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。

4、引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。

5、引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退

二、实验试剂

（一）仪器与器皿

PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性eppendorf管，凝胶成像仪

（二）试剂与材料

1、琼脂糖凝胶电泳试剂

1）电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖

3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水

4）琼脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5´反应缓冲液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、无菌水

三、实验步骤

1、按顺序在200μl 指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP质粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）总体积共50μl

2、在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数。）

1)预变性 94℃ 3 分种

2)循环条件（30 次）

变性 94℃ 30 秒

复性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延长延伸 72℃ 7 分钟

编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。

3、PCR 扩增完毕，配1.5%琼脂糖凝胶，电泳观察结果。

4、凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段

四、习题

1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？

2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

实验 从动物组织（猪肝）中提取DNA

一、实验内容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法从猪肝中提取DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法从猪肝中的原理和方法；(2)巩固DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验。

二、实验原理

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

三、实验材料

新鲜猪肝

TES 缓冲液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、实验步骤

1、剪取约0.5g肝脏组织，放入到研钵中磨碎；

2、向研钵中再加入1 ml TES轻轻研磨，将TES与破碎的组织混匀；

3、吸取535 µl组织匀浆液于2 ml EP管中，再加入60 µl SDS（10%），5.0 µl蛋白酶K，充分混匀后，于56°C保温1 h，每30分钟轻摇1次；

4、放置到室温，加入等体积饱和酚（600µl），颠倒混匀，11000 rpm，离心10 min，吸取400 µl水相，并转移至一个新的1.5 ml离心管中；

5、加入2倍体积（1000 µl）的无水乙醇和1/10倍体积（40 µl）3 M 醋酸钠沉淀DNA，12000 rpm离心10 min，弃乙醇；

6、加入适量TE溶解DNA和RNAse A（具体依DNA的多少而定），并利用0.7%的琼 脂溏进行电泳分析。

五、注意事项

1、在将猪肝剪碎前要将猪肝清洗干净，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

3、取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

4、乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

5、离心后，不要晃动离心管，拿管要稳。

6、在乙醇沉淀后，经离心要观察留在EP管中的小白点，其主要成分就是DNA，在以后的实验中都要细心观察，防止因将小白点丢失。

六、习题

1、为了获得高质量的肝脏DNA，在实验过程中应注意什么。

2、结合本人操作体会，总结在提取过程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白质的方法有哪些？ 实验 限制性内切酶切割DNA

一、实验目的

1． 通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子； 2． 根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶； 3． 掌握DNA的酶切技术。

二、实验原理

限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的 EcoR I识别„GAATTC„ 切割后产生„CTTAAG„、„G 和

AATTC„的末端，„CTTAAG„该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团，即„G-OH和„CTTAA-P。

有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如 San3A识别„GATC „；有的识别六

碱基对，如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I„GCGGCCGC„、„CGCCGGCG„ 则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。

＋

限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、实验材料

待酶切的DNA样品

四、实验仪器、器皿及试剂

1、仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯

2、器皿：Eppendorf管、Tip、试管架

3、试剂：标准DNA(Marker)

EcoRI限制性内切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫苏糖醇）

五、实验步骤

1、将DNA样品8.5μl(质粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由厂家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性内切酶EcoRI（限制性酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱）。

4、混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育１小时。

5、进行电泳检查酶切结果，100V 25分钟。

6、紫外灯下观察消化效果。

六、注意事项

1、分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方法：

(1)吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的样品，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。

(2)用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取0.2~0.5μl的样量。

(3)目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。

2、限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要求每次吸酶时要用新的无菌Tip。另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能快，以使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。

若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量（可稍多计一点），取出此量的酶与1×缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩短操作过程、减少污染机会。

3、开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酶污染。

4、样品在37℃与65℃保温时，要注意将Eppendorf管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

5、无实验必要应尽量避免长时间酶消化样品。因长时间消化，限制酶溶液中可能存在的杂酶会影响试验结果。

七、习题

1、限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？

2、什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？

3、限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？

4、限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？

5、酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？ 6、1个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？

实验 质粒的转化

一、实验目的

掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：质粒DNA；大肠杆菌感受态细胞。

二、实验原理

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。

三、实验步骤

1、制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；

2、取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；

4、热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；

5、冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；

6、复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；

7、布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。

四、结果与分析

计算转化效率

菌落数/DNA质量（μg）*稀释倍数

五、习题

1、制备感受态细胞的关键是什么？

2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。

3、如何提高转化效率？

第三篇：分子生物学实验方案

实验一 分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备的使用（2学时）实验二 分子材料的采集、保存和植物/动物基因组DNA 的分离（8学时）实验三 DNA/RNA 的琼脂糖凝胶检测（4学时）实验三 聚合酶链式反应（PCR）（3学时）

实验四 PCR产物的琼脂糖凝胶检测与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（6学时）实验五 分子生物学软件的使用（4学时）

实验六 生物信息学（3学时）生物信息获取与利用 实验考试

实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA

【目的要求】

学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳基本原理和操作，了解如何通过电泳判断DNA纯度、含量和分子量。

【实验原理】

凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA的常用方法。因为DNA分子是两性解离分子，在pH高于其等电点（约3.5）的中性或碱性溶液中带负电荷，在电场中向正极方向泳动。DNA凝胶电泳的介质主要有两种：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯凝胶的孔径较小，适合于分离5-500bp的小片段DNA；而琼脂糖凝胶的孔径较大，可以分离100bp-60kb的较大片段DNA。不同浓度的琼脂糖凝胶适合于分离不同大小的DNA片段（表7-1）。

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，当熔化后再凝固时就会形成固体基质，具有多孔的网状结构，孔径大小取决于琼脂糖浓度。DNA在琼脂糖凝胶中泳动时，受到电荷效应和分子筛效应的双重影响。电荷效应由分子所带的电荷量多少来决定，而分子筛效应则与分子大小和构象有关。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度主要取决于分子量大小和构象。线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶介质中的迁移率与其分子量的对数值成反比。分子越大，迁移速度越慢，从而可以将不同大小的DNA分子分开。因此，通过与DNA标准分子量参照物（MW marker）的迁移率对照，可以鉴定DNA分子的大小。DNA分子的构象也可以明显影响其迁移率。在细胞内质粒DNA有3种构象：超螺旋的共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的开环DNA（open circular DNA，ocDNA）和线性DNA，在琼脂糖凝胶电泳中，其泳动速度依次为：cccDNA >线性DNA >ocDNA，因而未酶切的质粒DNA在电泳中多显示为3条带，泳动速度最快的超螺旋带越亮，说明质粒DNA提取质量越好。

表7-1：不同浓度琼脂糖凝胶对DNA的有效分离范围

琼脂糖浓度（%）线性DNA有效分离范围(kb)0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA的迁移率还与电场强度（即单位长度的电压降）有关，电场强度越大，泳动速度越快。当需要快速观察电泳结果时，可以适当加大电场强度。但是电泳分辨率会随着电场强度的增大而缩小，因为高分子高速流动时摩擦力增加，相对分子质量与移动速度就不一定成正比，因此一般电场强度应不超过5V/cm。特别是当需要较精确测定DNA片段大小、获得理想的分辨率和漂亮的带型时，应该适当降低电场强度，相应的适当延长电泳时间，并选用相对较低的凝胶浓度。

为了显示凝胶中DNA的泳动位置，需要加入染色剂染色。最常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下发出橘红色荧光。一般是在凝胶中直接加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，这样可以在电泳过程中随时利用紫外灯观察核酸的迁移情况。但是EB与DNA的结合会影响DNA的迁移率，因此对于需要较精确测定DNA片段大小、或需根据荧光强度测定DNA含量时，EB染色应在电泳结束后再进行（将凝胶浸入0.5μg/ml的溴乙锭水溶液中10min即可）。注意：EB是强诱变剂，使用EB必须戴一次性手套，不要洒在桌面地面上，被污染的物品必须专门处理后（加少量漂白粉可使EB分解），再彻底清洗或丢弃。

指示剂溴酚蓝和二甲苯青的作用是指示样品在凝胶中的迁移过程，以确定终止电泳时间。在0.6 %、1%、2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝分别约与1kb、600bp、150bp双链线状DNA片段的迁移率大致相同。在1%琼脂糖凝胶中，二甲苯青大致相当于2kb双链线状DNA的位置。【试剂器材】

1．5×TAE：

2．10mg/ml溴化乙锭（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常温保存。3．6×上样缓冲液（配方见附录）4．（电泳）琼脂糖

5． DNA、PCR扩增产物

6．DNA标准分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式电泳槽、电泳仪 8．透射式紫外灯 9．胶带

10．微波炉或恒温水浴 11．微量移液器 【操作步骤】

1．称取琼脂糖1g，置三角烧瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波炉中加热，使充分溶解。注意：微波炉煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反复加热1-2次，注意此时可能出现爆沸现象，避免蒸汽烫伤。

2．待琼脂糖溶液冷却至60-65℃左右时加入溴化乙锭/5ulGold View，使终浓度为0.5μg/ml，混匀。

3．用胶带把制胶模具的两端边缘封好，置水平位置，选择孔径适宜的加样孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齿必须与模具底面保持一定距离（约0.5-1mm），防止样品槽破裂，导致样品泄漏。

图3-1：凝胶灌胶过程示意图

4．将冷却至50-60℃左右的琼脂糖溶液缓慢倒入制胶模具中，使凝胶液缓慢展开，直至形成厚度适当（一般为0.3-0.5cm）的胶层。小心去除加样孔周围的气泡。室温静置30-60分钟。（如图3-1）

5．琼脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具两端的胶带，将凝胶放入电泳槽中。6．电泳槽中注入适量0.5×TBE缓冲液，使液面高于凝胶约1mm左右。7．分别取5μl DNA或者2μl PCR产物和约0.5μg DNA分子量marker，加入1/5体积（2ul）的上样缓冲液，混匀。

8．小心缓慢将样品上样于凝胶加样孔中。记录样品加样孔顺序。

9．上样完成后，尽快开始电泳，以防止样品漂流。接通电源，注意正负极是否正确。调节电压在1-5V/cm左右，样品进胶前电压不要太高。电泳开始后不久就可以观察到溴酚蓝从加样孔迁移到凝胶中。

10．根据指示剂迁移的位置，或根据反射紫外灯显示的DNA迁移位置，判断是否需要终止电泳。切断电源后，取出凝胶。

11．将凝胶置于透射紫外灯上，打开紫外灯（注意尽量避免使用254nm短波紫外灯，并戴好防护眼镜或防护罩），观察染色后发出橘红色荧光的DNA条带，拍照记录。

注意观察样品DNA条带是否清晰，有无拖尾现象，条带数量、大小是否正确，判断样品DNA分子大小，与预期大小是否相符，并目测粗略估算样品DNA含量。【注意事项】

（1）凝胶不能有气泡。（2）电泳是从负极到正极。

（3）EB是致癌剂，操作要带手套。【实验安排】

本实验一天内可做完。【作业】

写出实验步骤及注意事项。

相关溶液配制

1,50倍TAE缓冲液的配制(pH8.5)配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：

1）称取Tris碱242.3g，置于烧杯中

2）称取EDTA固体29.3g或Na2EDTA-2H2O固体37.2g 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分搅拌 5）用HAc调pH至8.5 6）定容至1L，室温保存

2，溴化乙锭(EB)【强致癌物】 配制量：100mL 配制方法：

1）1gEB于专用容器中

2）加入100mLddH2O,搅拌数小时至溶解完全 3）转移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上样缓冲液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；0.05%溴酚蓝；pH7.0 配制量：100mL 配置方法：

1）6mL EDTA（500mM，pH8.0）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚蓝 3）取36mL丙三醇

4)用2N的NaOH调pH=7.0 5）定容至100mL 4，6×甘油上样缓冲液Loading Buffer 配方、配制量：

成分及终浓度 0.15%溴酚蓝

0.15%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水

配制10ml溶液各成分用量 1.5ml 1%溴酚蓝

1.5ml 1%二甲苯靑EF

100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3ml 3.9ml

5.GoldView(GV)GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView™即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

由于未发现GoldView™有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。

概 述

GoldView™是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。

通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Goldview™代替EB不失为一种明智的选择。

使用方法

1.将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。

2.加入5ul GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。

3.冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。

4.电泳完毕在紫外灯下观察。若使用数码相机照相记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。

注意事项

1.胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。

2.加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。

3.通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。

4.虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。

第四篇：分子生物学讲稿

硕士研究生公共选修课

分子生物学讲稿

浙江大学生物技术研究所

胡东维

二零零三年八月修改

概

论

一、分子生物学的基本含义

分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。

所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。

二、分子生物学的主要研究内容

1.核酸的分子生物学

核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（molecular genetics）是其主要组成部分。由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（central dogma）是其理论体系的核心。

2.蛋白质的分子生物学

蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及 1 其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。

3.细胞信号转导的分子生物学

细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。

三、分子生物学发展简史

1．准备和酝酿阶段

19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：

确定了蛋白质是生命的主要基础物质

19世纪末Buchner兄弟证明酵母无细胞提取液能使糖发酵产生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名称，酶是生物催化剂。20世纪20-40年代提纯和结晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黄酶、细胞色素C、肌动蛋白等），证明酶的本质是蛋白质。随后陆续发现生命的许多基本现象（物质代谢、能量代谢、消化、呼吸、运动等）都与酶和蛋白质相联系，可以用提纯的酶或蛋白质在体外实验中重复出来。在此期间对蛋白质结构的认识也有较大的进步。1902年Emil Fisher证明蛋白质结构是多肽；40年代末，Sanger创立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman发展异硫氰酸苯酯法分析肽链N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一个

多肽分子--胰岛素A链和B链的氨基全序列分析。由于结晶X-线衍射分析技术的发展，1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋结构模型。所以在这阶段对蛋白质一级结构和空间结构都有了认识。确定了生物遗传的物质基础是DNA

虽然1868年F.Miescher就发现了核素（nuclein），但是在此后的半个多世纪中并未引起重视。20世纪20-30年代已确认自然界有DNA和RNA两类核酸，并阐明了核苷酸的组成。由于当时对核苷酸和碱基的定量分析不够精确，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的结果，因而曾长期认为DNA结构只是“四核苷酸”单位的重复，不具有多样性，不能携带更多的信息，当时对携带遗传信息的侯选分子更多的是考虑蛋白质。40年代以后实验的事实使人们对核酸的功能和结构两方面的认识都有了长足的进步。1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA；1952年A.D.Hershey和M.Chase用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了是遗传物质。在对DNA结构的研究上，1949-52年S.Furbery等的X-线衍射分析阐明了核苷酸并非平面的空间构像，提出了DNA是螺旋结构；1948-1953年Chargaff等用新的层析和电泳技术分析组成DNA的碱基和核苷酸量，积累了大量的数据，提出了DNA碱基组成A=T、G=C的Chargaff规则，为碱基配对的DNA结构认识打下了基础。2．现代分子生物学的建立和发展阶段

这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。DNA双螺旋发现的最深刻意义在于：确立了核酸作为信息分子的结构基础;提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。在此期间的主要进展包括： 遗传信息传递中心法则的建立

在发现DNA双螺旋结构同时，Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl 用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明；1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型；1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物；70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性做了分析研究；这些都逐渐完善了对DNA复制机理的认识。

在研究DNA复制将遗传信息传给子代的同时，提出了RNA在遗传信息传到蛋白质过程中起着中介作用的假说。1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补；逐步阐明了RNA转录合成的机理。

在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。50年代初Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体（microsome）是细胞内蛋白质合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设；1961年Brenner及Gross等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合；1965年Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构；特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码，随后研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性，从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。

上述重要发现共同建立了以中心法则为基础的分子遗传学基本理论体系。1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶，又进一步补充和完善了遗传信息传递的中心法则。对蛋白质结构与功能的进一步认识

1956-58年Anfinsen和White根据对酶蛋白的变性和复性实验，提出蛋白质的三维空间结构是由其氨基酸序列来确定的。1958年Ingram证明正常的血红蛋白与镰刀状细胞溶血症病人的血红蛋白之间，亚基的肽链上仅有一个氨基酸残基的差别，使人们对蛋白质一级结构影响功能有了深刻的印象。与此同时，对蛋白质研究的手段也有改进，1969年Weber开始应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量；60年代先后分析得血红蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白质的一级结构；1973年氨基酸序列自动测定仪问世。中国科学家在1965年人工合成了牛胰岛素；4 在1973年用1.8AX-线衍射分析法测定了牛胰岛素的空间结构，为认识蛋白质的结构做出了重要贡献。

3．初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段

70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。其间的重大成就包括： 重组DNA技术的建立和发展

分子生物学理论和技术发展的积累使得基因工程技术的出现成为必然。1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌，使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成，打破了种属界限；1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽；1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功；1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素。至今我国已有人干扰素、人白介素

2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用，世界上还有几百种基因工程药物及其它基因工程产品在研制中，成为当今农业和医药业发展的重要方向，将对医学和工农业发展作出新贡献。

转基因动植物和基因剔除动植物的成功是基因工程技术发展的结果。1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内，培育得到比原小鼠个体大几倍的“巨鼠”，激起了人们创造优良品系家畜的热情。我国水生生物研究所将生长激素基因转入鱼受精卵，得到的转基因鱼的生长显著加快、个体增大；转基因猪也正在研制中。用转基因动物还能获取治疗人类疾病的重要蛋白质，导入了凝血因子Ⅸ基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子Ⅸ，能有效地用于血友病的治疗。在转基因植物方面，1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场，1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产，美国最早研制得到抗虫棉花，我国科学家将自己发现的蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。到1996年全世界已有250万公顷土地种植转基因植物。

基因诊断与基因治疗是基因工程在医学领域发展的一个重要方面。1991年美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入 重组的ADA基因，获得成功。我国也在1994年用导入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。在我国用作基因诊断的试剂盒已有近百种之多。基因诊断和基因治疗正在发展之中。

这时期基因工程的迅速进步得益于许多分子生物学新技术的不断涌现。包括：核酸的化学合成从手工发展到全自动合成，1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法；90年代全自动核酸序列测定仪的问世；1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技术，更以其高灵敏度和特异性被广泛应用，对分子生物学的发展起到了重大的推动作用。

基因组研究的发展

目前分子生物学已经从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。1977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的序列；1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对碱基序列；80年代λ噬菌体DNA全部48，502碱基对的序列全部测出；一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因组的全序列也陆续被测定；1996年底许多科学家共同努力测出了大肠杆菌基因组DNA的全序列长4x106碱基对。测定一个生物基因组核酸的全序列无疑对理解这一生物的生命信息及其功能有极大的意义。1990年人类基因组计划（Human Genome Project）开始实施，这是生命科学领域有史以来全球性最庞大的研究计划。2002和2003年完成了水稻和人类全基因组。更多的基因组学研究工作正在铺开。

此外。功能基因组学的研究正在生命各学科快速展开。单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展

1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体以来，人们利用这一细胞工程技术研制出多种单克隆抗体，为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。80年代以后随着基因工程抗体技术而相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌合抗体、重构抗体、双功能抗体等为广泛和有效的应用单克隆抗体提供了广阔的前景。基因表达调控机理

分子遗传学基本理论建立者Jacob和Monod最早提出的操纵元学说打开了人类认识基因表达6 调控的窗口，在分子遗传学基本理论建立的60年代，人们主要认识了原核生物基因表达调控的一些规律，70年代以后才逐渐认识了真核基因组结构和调控的复杂性。1977年最先发现猴SV40病毒和腺病毒中编码蛋白质的基因序列是不连续的，这种基因内部的间隔区（内含子）在真核基因组中是普遍存在的，揭开了认识真核基因组结构和调控的序幕。1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接，从而发现核酶（ribozyme）。80-90年代，使人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式转录因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是基因表达调控根本所在。

细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域

细胞信号转导机理的研究可以追述至50年代。Sutherland1957年发现cAMP、1965年提出第二信使学说，是人们认识受体介导的细胞信号转导的第一个里程碑。1977年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，将G蛋白与腺苷环化酶的作用相联系起来，深化了对G蛋白偶联信号转导途径的认识。70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的发现、蛋白酪氨酸激酶的发现及其结构与功能的深入研究、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等，使近10年来细胞信号转导的研究更有了长足的进步。目前，对于某些细胞中的一些信号转导途径已经有了初步的认识，尤其是在免疫活性细胞对抗原的识别及其活化信号的传递途径方面和细胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，当然要达到最终目标还需相当长时间的努力。

以上简要介绍了分子生物学的发展过程，可以看到在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，推动着整个生命科学的发展。至今分子生物学仍在迅速发展中，新成果、新技术不断涌现，这也从另一方面说明分子生物学发展还处在初级阶段。分子生物学已建立的基本规律给人们认识生命的本质指出了光明的前景，但分子生物学的历史还短，积累的资料还不够，例如：在地球上千姿万态的生物携带庞大的生命信息，迄今人类所了解的只是极少的一部分，还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律；又如人类基因组DNA 3x109 bp的全序列，包括了3万多个基因的一级结构，但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调，要理解近90%不为蛋白质编码的序列的作用等等，都还要经历漫长的研究道路。

第五篇：医学分子生物学与实验

1.简述动物组织蛋白质，DNA ,RNA提取的大致过程及原理。

答：共同的第一步都是取动物组织进行清洗剪碎，然后用高速组织捣碎机破碎。

DNA的提取：

通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。

RNA的提取:

取组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚液，室温下剧烈振荡10分钟。置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。

蛋白质的提取:

1.组织称重，切小块放入管中。

2.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。

4.用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。

5.裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

原理：在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，因此在提取和制备DNA或RNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl 浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0 mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14 mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。

提取出DNA或RNA-蛋白质复合体（DNP）后，在将其中的蛋白质除去

2.简述基因工程的原理及过程。

答：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

所谓基因工程（genetic engineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。一般步骤：1克隆重组：提取供体生物目的基因，酶解，连接到另一个DNA分子（克隆载体）上形成重组DNA；2转化：将重组子转入受体细胞，并在其中复制保存；3筛选鉴定：已吸收重组子的细胞；4大量培养监测外源性基因是否表达。

3.比较原核生物与真核生物的基因表达调控机制。

答：

原核生物基因表达调控 真核生物基因表达调控

启动因子：σ因子决定RNA聚合酶识别的特异性TF2D决定RNA聚合酶识别的特异性

转录激活：操纵子 调节蛋白顺式作用元件转录因子

主要机制：操纵子模型具有普遍性顺式作用元件具有普遍性

主要为负性调节（阻遏调节）主要为正性调节

特有机制：转录衰减染色体结构变化

共同点： 1.基因表达都有时间特异性和空间特异性2.基因调控的多层次性和复杂性3转录起始部分是基因表达的基本调控点

4.简述 PCR的原理及其应用，引物设计的原则。

答：PCR的原理：以扩增的DNA分子为模板，以1对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，依半保留机制沿模板链延伸直至完成2条新链合成。通过变性，退火和延伸重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。反应体系基本成分有模板DNA，特异引物，耐热性DNA聚合酶，dNTP和含有 Mg²+的缓冲液。

PCR的主要用途：1目的基因的克隆；2.基因的体外突变3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列测定5.基因突变分析

PCRD的衍生技术：1锚定PCR(anchored PCR)2..不对称PCR(asymmetric PCR)3.反向PCR(inverse PCR)4.多重PCR(multiplex PCR)5.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。⑥引物3„端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

5.简southern blot的原理及其应用。

答：原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。可用于检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

主要应用于1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.PCR产物分析。例如在研究转基因的时候，可用于检测外源基因的插入和整合情况。