临床检验实验室自动化流水线的应用

第一篇：临床检验实验室自动化流水线的应用

临床检验实验室自动化流水线的应用

起来，在信息流的主导控制下，构成流水线作业的组合，形成大规模的全实验室常规检验过程的自动化，国内也有称自动化临床实验室流水线。

一、生化免疫流水线引进的效益

首先，流水线的引进推进了数字化医院的建没。配合流水线的需求，实现了标本管理的条码化及检验申请的无纸化，实现了资源整合，流程的优化。降低了运行成本，提高了服务质量、工作效率和管理水平。

其次，医学实验室生物安全的现状是对分析前和分析后处理过程中的生物安全缺少有效的控制手段，而流水线的引进改善了生化、免疫检验T作的生物安全状况，实现了检验分析全过程的生物安全控制，减少了职业暴露。

最后，流水线的引进促进了检验科检测设备的自动化、品牌化和集约化，减少了人为差错，优化了人力资源配置，增加了检验人员的自信心，增强了临床和患者的满意度；同时改进了实验定工作流程，免去了生化、免疫检验工作中的人工离心，分杯，样本装载、卸载和复检等环节，减少了人工环节出错的可能，二、拓展流水线模式的应用，优化与再造门诊检验流程

1．标本管理条码化：构建门诊条码生成系统，增加患者登记和标本签收环节，增设检验助理岗位，整合门诊抽血站工作。门诊条码生成系统的应用，优化了门诊检验流程，提高了工作效率，保证了检验结果的准确性和可靠性；标本窗口签收，检测后台操作，减轻了员工压力，降低了医疗隐患；解决了窗口及取单处排队拥挤状况，改善了就诊环境，对缩短患者等候时间、提高患者满意度有较大作用。

2．检验分析模块化：临床实验室自动化管理系统也称模块化，临床实验室检验流水线化，每个步骤进行模块化，形成一个完整系统。通过改进工作流程，重新调整实验室布局，使检验工作人员明确自己所处的流水线位置，检验技术人员只从事标本的检验工作，实现了临床实验室设备及人力资源效益最大化。

3．标本传输自动化：设计开发了标本运输机械轨道和标本点对点识别系统，使标本能够分门别类的自动、及时、准确传送，各类标本在轨道上运行后分别进入不同的分析领域，避免交叉感染，使整个工作流变得快速和稳定。标本传输自动化使患者就诊环境与检验工作环境得到了有序分隔。

4．数据管理网络化：实验室信息系统和医院信息系统，涉及各个分析仪工作站、采样工作站、流水线控制工作站甚至医生临床工作站与实验室信息系统和医院信息系统的通讯和管理，改造实验室信息系统，应用条形码技术，让分析仪与实验室自动化系统双向对话，使患者样品登记、实验数据存取、报告审核、打印分发、实验数据统计分析等繁杂的操作过程实现智能化、自动化和规范化；通过设计报告发放系统，增设终端显示屏和语音呼叫系统，将门诊报告的发放工作整合到发单处。

三、流水线引进后的管理 1．检验质量管理：重点是尽量控制误差和使检测工作具备可追溯性。充分发挥条形码技术及实验室信息系统的优势，实验室自动化系统可同时在自动化流水线上任何一台电脑对流水线工作进行控制，随时对流水线里的标本发出工作指令，实现了检验标本自动处理和分析．集中管理，实现了全而网络化管理，减少了临床样品准备和处理产生的误差。

2．检验医学技术人员的管理：实验室自动化系统应用后所节省的人员进行了人力资源重组和利用，增设专职的管理人员，加强了质量管理体系建设和科研；加强了血、尿、便、体液、骨髓、微生物等形态学检验诊断；加强了检验科与临床的沟通与交流，真正发挥临床检验在疾病诊断、鉴别诊断、疗效评价、预后判断、治疗监测中的作用，并可参与健康体检或疾病监测以及更多地从事科研活动等。

全实验室自动化使不同亚学科进行互相交叉与融合，对每一个临床实验室工作人员都提出了更高的综合素质要求。实验室自动化系统的引入不仅是设备的换代和更新，更重要的是工作理念和管理理念的更新。而对自动化流水线拓展式的应用更推动了检验流程的再造，工作环境的改善，检验等待时间的缩短及服务质量的提升，将给患者带来更多便利。

第二篇：流水线检验控制程序

流水线检验控制程序

1、领货程序：

由缝制生产经理下发生产任务单后，车间组长凭领货单到仓库领取辅料，同时将领料单交搬运工到裁床领取裁片。

2、产前会的召开：

由车间主任负责联合工艺员组织生产该订单的小组的组长、组检、进行产前的讲解，列出所要注明的重点事项，并有针对性地对该款提出明确的质量要求。

3、产前样的确认：

大货投产前一天或当天，由车间组长必须先做一件产前板出来，工艺员、生产经理批复后才能生产，否则，一律不准生产。批复的首件样挂在醒目处，供员工参考。

4、投产前工作：

1）每张新订单投产前，组长必须召集员工进行投产前的讲解，以及示范指导，并做一件当道工序标准样供员工参考，同时要求员工必须生产出来的第一件工序产品交组长认可后才能批量投产。

2）投产第二天就新开款发现的问题进行总结，提醒员工在生产过程中容易产生的错误，并采取防范措施。同时将犯错误的员工错误的过程讲解出来，以引起其他员工的警示。

5、初期检查：

1）组长必须每天不定期地对生产的流水工序进行抽检，对不合格的应要求员工立即改正，并找出产生不合格品的原因。

2）组检投产初期应到车位上进行工序的巡视检查，特别是对重点工序更是要深入细致地检查，将存在的问题及时检查出来，避免批量的返工。

3）对重点工序生产完毕后，组检必须先对工序进行100%检查合格后才能转入下一道工序生产，不合格的流水工序不能进入下一道（如贴后袋、装拉链、装前袋、埋夹等）。

6、工艺员首十件控制：

在不缺少物料的情况下，首十件产品一般应在第二天就下流水线，首十件产品下线后工艺员应进行洗水前的检查，包括所用的物料是否正确，工艺有无差错以及洗水前的尺寸是否吻合，并记录好所有的数据，等洗水回来后再进行重复测量。

7、根据首十件洗水尺寸的情况，再对出现问题的工序进行整改，以确保整张订单的产品质量。

8、中期检查：

在生产到一定的成品后，工艺员再对车间的流水工序进行抽检，看是否有生产走样；生产出来的批量成品是否符合要求，并按一定的比例进行抽检。

9、车间的尾期检查：

1）由组检对重要工序进行专业的检查合格后才能转入下一工序。

2）尾检成品检查：所有的工序生产完毕后，由车间尾检对洗水前的成品进行全方位的检查，检查项目包括产品的外观、线迹、工艺的正确否、套结、凤眼、前袋、后袋、腰头的高低、拉链等。

3）、工艺员的成品抽查：工艺员按一定的比例（约占5%）对总检后的成品进行抽查，符合工艺要求的，签放行报告予以放行，发现返工率较大或认为需要重新返查的，下达书面通知要求返查。

第三篇：临床基因扩增检验实验室规章制度

临床基因扩增检验实验室规章制度

一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理

临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。

清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

(一)试剂贮存和准备区

下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

(二)标本制备区

在该区进行下述操作：临床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。

(三)扩增区

下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。

(四)扩增产物分析区

下述操作在本区内进行：扩增片段的测定

二、临床基因扩增检验实验室质量保证

临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。

第四篇：临床基因扩增检验实验室技术验收报告

(一)实验室所属法人单位名称:

地址:

邮编:

法定代表人:实验室负责人:联系人:email:

电话:传真:

(二)接受现场技术验收的实验室代表姓名及职务:

二.验收依据:卫生部下发文《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》

三.验收时间:

四.验收评审地点:

五.技术验收结论:

合格,建议授予验收合格证书;

基本合格,尚存在部份缺陷,缺陷为项,限期改进,改进后授予验收合格证书;

不合格,停止验收,实验室改进后需重新申请.(一)验收中发现的问题及意见:

附件1:临床基因扩增检验实验室技术验收表;

附件2:临床基因扩增检验实验室技术验收意见汇总表;

附件3:整改要求.(二)需要说明的其它问题:□如果有的话见附件4;□无.(三)验收评审员姓名及签名:

主评审员姓名:签名:

评审员姓名:签名:

签名:

签名:

协调员姓名:签名:

签字时间:

(四)签字地点:

验收评审组意见:

附件1临床基因扩增检验实验室技术验收表

序号

验收内容

验收意见

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此项

暂不需考核

评论与说明

实验室设置和设备

1.1

实验室的规范化分区:原则上应分为四个区,但如使用全自动扩增检测仪,区域可适当合并

1.2

各工作区的明确标记

1.3

实验室应配备开展临床基因扩增检测所需的所有仪器设备(包括质控物).保证《临床基因扩增检验实验室管理办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》的有关要求得到满足.1.4

试剂贮存和准备区

冰箱;

混匀器;

微量加样器;

可移动紫外灯;

专用工作服和工作鞋;

消耗品(带滤心吸头,一次性手套等);

专用实验记录本,记号笔等.1.5

标本制备区

(a)冰箱(2~8℃和-20℃或-80℃);

高速台式冷冻离心机

(c)水浴箱和/或加热模块

(d)超净工作台或防污染罩

混匀器;

注:请在验收所选项打“

临床基因扩增检验实验室技术验收表

序号

验收内容

验收意见

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此项

暂不需考核

评论与说明

微量加样器;

可移动紫外灯;

专用工作服和工作鞋;

消耗品(带滤心吸头,一次性手套等);

专用实验记录本,记号笔等.1.6

扩增区

(a)核酸扩增仪;

微量加样器;

可移动紫外灯;

专用工作服和工作鞋;

消耗品(带滤心吸头,一次性手套等);

专用实验记录本,记号笔等.1.7

扩增产物分析区

微量加样器;

可移动紫外灯;

专用工作服和工作鞋;

消耗品(带滤心吸头,一次性手套等);

专用实验记录本,记号笔等.2.设施和环境

2.1

实验室的设施,工作区域,能源,照明,采暖,通风等

应便于检测工作的正常进行.2.2

实验室应配备温度湿度计,稳压电源等.2.3

进入和使用实验室各区域应有明确的限制和控制.注:请在验收所选项打”“.临床基因扩增检验实验室技术验收表

序号

验收内容

验收意见

符合基但本有

符缺

合陷

不符合缺此项

暂不需考核

评论与说明

2.4

应有实验室”内务管理"(如人员流动,清洁等)制度;

2.5

实验室应有关化学试剂管理,废弃血清处理,生物防护等的措施

3.人员

3.1

实验室应配备足够数量的人员;这些人员必须经过培训,并取得上岗证.3.2

实验室应有培训计划和措施,保证其技术人员得到及时培训.3.3

实验室应保存其技术人员有关资格证书(如上岗证),培训,技能和经历,发表论文,科研成果等技术业绩档案.4.设备管理和质控物

4.1

所有设备应有维护程序文件;

*

如

第五篇：临床基因扩增检验实验室工作规范

为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。

一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理

临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发

[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。

临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。

清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

(一)试剂贮存和准备区

下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。

主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于“热启动”技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。

在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。

严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。

工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯(254nm波长)，在工作完成后调至实验台上60~90cm内照射。由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。

(二)标本制备区

下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。

要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加 1

入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。

用过的加样器吸头必须放入专门的消毒(例如含次氯酸钠溶液)容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等)如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。

对实验台适当的紫外照射(254nm波长，与工作台面近距离)适合于灭活去污染。可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。

样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。

用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成，因为cDNA链较RNA稳定，保存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。

cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后再开盖以调节缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。

待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩增。

(三)扩增区

下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。

为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。用过的加样器必须注意清洁消毒。

完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。

(四)扩增产物分析区

下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。

核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记)、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法等。目前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探针杂交方法。

本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1mol/L HC1中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。

由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。

本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。

二、临床基因扩增检验实验室质量保证

临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。

(一)标本的采集

常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。

全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。

临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆，以避免RNA的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。

(二)标本的稳定化处理

用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。

(三)标本的运送

标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本。通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。

(四)标本的贮存

临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。

(五)标本的处理(核酸提取)

标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身(如血红素及其前体或降解产物)或核酸提取过程中残留的有机

溶剂(如酚、氯仿等)，这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的RNA酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有RNA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。

(六)靶核酸的逆转录(RT)和扩增

1、靶RNA的逆转录

cDNA合成为逆转录PCR中的第一个酶反应步骤，所产生的cDNA为靶RNA的反向互补链，为后面扩增的模板。下述因素通常影响cDNA合成的效率：(1)逆转录效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等；(2)用于逆转录的标本中存在逆转录或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血红素等)；(3)RNA酶的存在导致RNA的降解。

2、核酸的扩增

有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要，必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查，以避免假阴性结果。

(七)污染

在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染(产物污染)；天然基因组DNA的污染、试剂污染(贮存液或工作液)以及标本间交叉污染(如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本)。临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。

由于一旦发生污染后，再围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐，所以防止污染重在预防。但如果发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为止，并且实验结果必须作废。

1、测定分析前的污染源

测定分析前实验材料的污染主要来自非病人标本来源的核酸。

2、测定分析阶段的污染源

通常，测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及到的实验设备的任何部位都是可能的污染源。如受污染的试剂(例如牛血清白蛋白，明胶或矿物油)、商品酶制剂、消耗品(如反应管，吸头)和实验设备(如加样器、离心机)等。

在前面三个工作区中，不当的实验操作会引起所使用的试剂、消耗品或实验设备的污染。而在产物分析区，当吸取扩增产物用于检测时，非常容易引起污染，因此必须制定标准操作程序(SOP)，并严格执行。

3、污染的避免

要避免污染，首先应是预防而不是排除污染，前面所述对工作区的严格划分的目的即是为了预防污染。为避免以前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增反应中用dUTP取代部分dTTP，使得产生的特异扩增片段含有尿嘧啶，这样扩增前在反应混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG)，可破坏来自以前测定的扩增产物，从而避免其对以后要进行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射，通过异补骨脂素光化学产生DNA加合物，由于DNA加合物对扩增没有反应但又不妨碍PCR后杂交过程，所以这种方法也能防止污染。

上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其来替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩增的天然DNA的污染。

4、去除污染的措施

工作完后必须定期对实验室采取有效的去污染措施，结合各种不同的方法可达到最佳效果。去污染措施包括但不仅限下面几种：(1)用10%(v/v)次氯酸钠清洁表面；(2)试验后长时间的紫外照射实验操作台面和其他表面；(3)实验设备如加样器的高压消毒。

(八)扩增产物的分析

扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等，但临床PCR检验项目基本上都使用探针杂交方法。

杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适、标记方法不对、对探针的标记不够、杂交或洗涤方法不合适等。

最常使用的基因探针有：DNA片段、合成的寡核苷酸和体外转录的反义RNA探针。探针的标记物常用的有生物素、地高辛、荧光素和同位素等。

在扩增后的杂交检测中, 应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性，还会给检测信号的特异性带来负面影响。相反，提高温度和/或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此，严密控制温度和试剂的离子强度是避免假阳性和假阴性结果的先决条件。要注意的是，温度和离子强度不能同时改变。

(九)质量控制

质量控制包括两个方面，即室内质量控制(以下简称质控)和室间质量评价。

1、室内质量控制

必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和假阴性，保证测定结果的准确性和重复性。由于核酸扩增测定的高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每一步都要求有质控措施。

(1)标本制备：

常用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA提取效果，以判断所提取的DNA是否发生降解。用常规的手工提取方法制备的DNA的平均长度一般为~100kb，用适合PCR的DNA提取试剂盒制备的DNA的长度平均范围为30-40kb。明显出现降解的DNA(在1和10kb的低分子量范围内)在经琼脂糖凝胶电泳分离和用溴化乙锭染色后也可见强的荧光信号。用对甲基化不敏感的限制性内切酶(如EcoRI)消化DNA，然后电泳分离，能够对酶活性的抑制剂进行质控(在抑制剂存在的情况下，高分子量的片段不被酶切)。潜在的抑制剂的存在通常用260nm和280nm的分光光度测定来估计，质量好的DNA提取物，A260/A280比值应该在1.75~2.0之间;否则,残留的蛋白或酚可能会很高。仅用光度计比色方法不能对DNA的完整性下结论。

最快的对总RNA提取质量控制的方法是在非变性条件下作琼脂糖凝胶电泳,这一点跟DNA分离相同。但如果对结果有疑问,就应该在变性的条件下作琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的完整性。在理想情况下,三种主要的核糖体RNA(28S、18S和5S)在凝胶上出现的带相对较窄。如发生RNA的降解，则出现大量低分子量带或出现带的消失。测定核糖体RNA带的密度指数可作为对RNA制备的质量评价的实验室内的标准；对向低分子量拖尾的、不对称性的峰的评估也是RNA完整性的合适的指标。另外，琼脂糖凝胶电泳能显示出在RNA的制备中被DNA污染的程度。由于这些原因，单独的光度计比色方法也不能对RNA的完整性下结论。

对于血清（浆）中病毒的测定，则要评价标本出现溶血、脂血和黄胆情况下标本处理方法对扩增检测的影响，避免由于标本处理方法的不当而出现假阴性结果。此外，还可采用已知浓度标本评价核酸提取方法的效果。

(2)逆转录和扩增：本部份包括阳性质控和阴性质控。

对逆转录和核酸扩增的质控既可使用内标质控方法也可采用外标质控方法。逆转录-扩增检测的内标通常为在整个细胞周期中均匀表达的mRNA，如HLA、β肌动蛋白和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在标本制备时将外来内标加入到样本中共同提取、逆转录及扩增。当标本中存在逆转录抑制物，或核酸提取中发生RNA降解，或逆转录酶失活，内标即会表现为阴性结果。

对于DNA测定内标可使用对有机体存活所必须的靶基因，如维生素D血浆结合蛋白的基因。对于病原体的基因检测，内标多采用人工制备的竞争性内标。内标可以监控每一扩增孔中假阴性的产生情况。

目前的商品试剂盒大部分没采用内标方法质控。因此在测定血清/血浆病原体核酸如HBV DNA、HCV RNA等时，应使用已知的弱阳性血清/血浆作为质控样本，与待测临床标本等同处理提取核酸及扩增，以判断逆转录及扩增检测的效果。

使用这些外加弱阳性质控不但可检测扩增反应液的质量，还可获得有关PCR试剂的检测下限和特异性的信息。这些质控样本在扩增检测时必须使用与患者的标本相同的主反应混合液。

每一个PCR实验中都必须设有外加阴性质控(污染监测质控)，为判断扩增过程中污染出现的阶段，阴性质控可包括如下几种，即在样品制备的整个过程中所带的空白管、仅有扩增反应液但不含扩增模板的反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估PCR实验的综合质量。

在扩增靶RNA的RT-PCR实验中，可做省略逆转录的污染质控，通过这种方法，可发现以前扩增的DNA片段所引起的污染。

(3)板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。

(4)测定结果的评价与报告：采用实时荧光定量PCR检测方法，在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。

结果的报告必须简单清楚。定性测定报告“阳性”或“阴性”即可。定量测定则必须报告量的多少，如结果高于测定方法线性范围上限，则对样本稀释后再测，结果乘上稀释倍数；如结果低于方法的测定范围下限，则报?lt;多少即可，不能报告为“0”或“阴性”。

2、室间质量评价

所有开展临床基因扩增检验的实验室都必须参加由卫生部临床检验中心组织的全国临床基因扩增检验项目的室间质量评价，评价结果将作为其开展临床基因扩增检验的依据之一。

本工作规范自公布之日起实施。