PCR技术在临床检验中的应用

第一篇：PCR技术在临床检验中的应用

PCR技术在临床检验中的应用

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医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。PCR法检测乙肝的优势表现在：①早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。②对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。梅毒是由梅毒螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，梅毒螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺体其取样方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型民时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找共同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。

我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及生物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞中观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种，1969年Hubner根据Rous(1911)的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后来又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的细胞基因表达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称之为原癌基因（Proto Oncogene）。为了与病毒癌基因区分，分别用V-Onc及C-Onc基因来代表。目前了解较多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理有：①点突变，受到射线、化学因素、生物因素的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很大的区别。②获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。③基因易位，内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化。④原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因子受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤相关的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因较复杂，作用机理不太清楚。癌基因检测中常用的分子生物学技术有：杂交、DNA分子克隆、PCR扩增及序列分析。PCR扩增简便、快捷有较强的实用性，甚至可从病人体液样本中检测活化的癌基因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。Ras基因是1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分离出来取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性称C-H-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，从神经母细胞中又发现了N-ras基因。Ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤时点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用PCR扩增样本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。P53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53KD分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年Cane发现了P53蛋白Eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。P53突变后其产物突变蛋白稳定性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。PCR-RELP、PCR-SSCP则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在SSCP分析中，单链DNA因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改变，从布将变异的DNA与正常DNA区分开，统计表明100-300bp分子大小的ssDNA突变检出率可达97％，300-450bp标出率可达69％，因此大于400bp的片段多态性应采用其它方法检测。

遗传病是由于遗传基础异常而引起的疾病，人类遗传病约有3000多种，患者占总人口数的10％。遗传病大概可分为单基因、多基因及染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查（特别是显带法）、生物化分析等。随分子生物学发展，基因诊断愈来愈表现出其优越性，PCR技术是基因诊断的主要技术之一，为快速、准确地检测人类遗传病开辟了一个新的途径，预计与遗传相关的疾病的检测有80％将在3-5年内被PCR法所取代。PCR在遗传病诊断应用中，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的有PCR法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性X综合症及性别鉴定等。地中海贫血（Thalassmia）是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地中海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短臂上，a珠蛋白基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66％，贵州、四川等地高发可达2.2％。应用PCR技术可以直接检测突变的基因诊断此病。苯丙酮尿症（Phenylketouria,PKU）是一种常染色体隐性遗传病。病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化为酷氨酸血症，出现脑组织损伤，智力障碍。此病患者出生时正常，出生后一经确诊立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食治疗8-10年不致影响患者智力，但低苯丙氨酸饮食代价之昂贵是一般家庭所不能承受的，关键在于避免患儿出生。因此本病的早期诊断有极其重要的意义。PCR结合斑点杂交能有效诊断PKU。遗传性疾病的基因变化很复杂，单基因固定位点变异布致病的情况很少，因此基因诊断过程中往往需要PCR技术与限制性内切酶、斑点杂交、聚丙烯酰胺胶电泳图谱分析及扩增产物序列分析结合，作综合判断。

优生学包括基础优生学、社会优生学、临床优生学及环境优生学。孕期检查及产前诊断是临床优生学的最重要内容之一。孕期检查除一般项目外还能及时了解孕妇是患有某些对胎儿发育有严重影响的疾病如风疹病毒感染、沙眼衣原体、解脲支原体、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、弓体感染等，及时发现及时治疗并采取有效措施预防发展成为宫内感染。PCR技术对这些病原体的检测简便而确实，另外利用PCR技术可以对地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症、脆性X综合症等遗传性疾病进行宫内诊断。可见PCR在优生优育方面有很高的应用价值。

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。由于VNTR在等位基因中的多态性便构成了遗传标记。使用PCR技术对其进行扩增结合对扩增产物凝胶电泳图谱分析即可进行个人识别及亲子鉴定。由2-6核苷组成的重复串联序列称为微卫星。在人类基因组中，微卫星更加丰富。微卫星的重复序列比VNTR短，扩增分型简便，易于自动化，在VNTR或微卫星不仅重复片段的数量不同而且重复片段的核苷酸也具有多态性。在VNTR或微卫星多态性分析时，如再结合碱基配对分析可以藜得更大量的信息，这一种更有希望的标志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理论上其对嫌疑人的排除率为99.999％。PCR技术可以完成替代早期的Southern印迹法进行多态性分析而且操作简便，敏感性及准确性都有大幅度的提高。当然PCR技术在法医中的应用仍在起步阶段有许多技术问题等待解决，如样本中的抑制剂、检村中DNA的损报告伤、PCR扩增污染等。想念随着PCR技术的不断完善它将在法医学领域中有更加广泛的应用。

第二篇：临床检验中PCR技术的应用

临床检验中PCR技术的应用

青海红十字医院检验科 杨军 检验士 关键词：pcr ：pcr的应用

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。

PCR检测的临床应用范围：用于疾病的早期诊断，疾病的鉴别诊断，疾病的病因确定，药物疗效的评价，治疗效果的评价，治愈标准的确定

通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。PCR法检测乙肝的优势表现在：

① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。

② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT-PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA(RT)后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录-PCR(RT-PCR)。

PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎(NGU)可能更具有代表性意义。检测标本无特殊限制：

痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检PCR检测淋球菌。淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离培养法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系统法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，使淋病的快速诊断有重大突破。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下

PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况

（1）参考文献：《中国医学检验杂志》2001.11:13-14

(2)

姜怀春pcr技术研究新进展。重庆工商大学报，2005.22（4）：232-235

第三篇：PCR在临床检验中的应用

PCR在临床检验中的应用

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。PCR法检测乙肝的优势表现在： ① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR检测在性传播性疾病（STD）的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。是由螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期皮疹中也存在螺体其取样方法同埂下疳，三期皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。

我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及生物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞中观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种，1969年Hubner根据Rous（1911）的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后来又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的细胞基因表达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称之为原癌基因（Proto Oncogene）。为了与病毒癌基因区分，分别用V-Onc及C-Onc基因来代表。目前了解较多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理有：①点突变，受到射线、化学因素、生物因素的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很大的区别。②获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。③基因易位，内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化。④原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因子受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤相关的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因较复杂，作用机理不太清楚。癌基因检测中常用的分子生物学技术有：杂交、DNA分子克隆、PCR扩增及序列分析。PCR扩增简便、快捷有较强的实用性，甚至可从病人体液样本中检测活化的癌基因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。Ras基因是1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分离出来取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性称C-H-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，从神经母细胞中又发现了N-ras基因。Ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤时点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用PCR扩增样本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。P53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53KD分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年Cane发现了P53蛋白Eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。P53突变后其产物突变蛋白稳定性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。PCR-RELP、PCR-SSCP则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在SSCP分析中，单链DNA因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改变，从布将变异的DNA与正常DNA区分开，统计表明100-300bp分子大小的ssDNA突变检出率可达97％，300-450bp标出率可达69％，因此大于400bp的片段多态性应采用其它方法检测。

遗传病是由于遗传基础异常而引起的疾病，人类遗传病约有3000多种，患者占总人口数的10％。遗传病大概可分为单基因、多基因及染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查（特别是显带法）、生物化分析等。随分子生物学发展，基因诊断愈来愈表现出其优越性，PCR技术是基因诊断的主要技术之一，为快速、准确地检测人类遗传病开辟了一个新的途径，预计与遗传相关的疾病的检测有80％将在3-5年内被PCR法所取代。PCR在遗传病诊断应用中，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的有PCR法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性X综合症及性别鉴定等。地中海贫血（Thalassmia）是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地中海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短臂上，a珠蛋白基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66％，贵州、四川等地高发可达2.2％。应用PCR技术可以直接检测突变的基因诊断此病。苯丙酮尿症（Phenylketouria,PKU）是一种常染色体隐性遗传病。病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化为酷氨酸血症，出现脑组织损伤，智力障碍。此病患者出生时正常，出生后一经确诊立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食治疗8-10年不致影响患者智力，但低苯丙氨酸饮食代价之昂贵是一般家庭所不能承受的，关键在于避免患儿出生。因此本病的早期诊断有极其重要的意义。PCR结合斑点杂交能有效诊断PKU。遗传性疾病的基因变化很复杂，单基因固定位点变异布致病的情况很少，因此基因诊断过程中往往需要PCR技术与限制性内切酶、斑点杂交、聚丙烯酰胺胶电泳图谱分析及扩增产物序列分析结合，作综合判断。

优生学包括基础优生学、会优生学、临床优生学及环境优生学。孕期检查及产前诊断是临床优生学的最重要内容之一。孕期检查除一般项目外还能及时了解孕妇是患有某些对胎儿发育有严重影响的疾病如风疹病毒感染、沙眼衣原体、解脲支原体、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、弓体感染等，及时发现及时治疗并采取有效措施预防发展成为宫内感染。PCR技术对这些病原体的检测简便而确实，另外利用PCR技术可以对地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症、脆性X综合症等遗传性疾病进行宫内诊断。可见PCR在优生优育方面有很高的应用价值。

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。由于VNTR在等位基因中的多态性便构成了遗传标记。使用PCR技术对其进行扩增结合对扩增产物凝胶电泳图谱分析即可进行个人识别及亲子鉴定。由2-6核苷组成的重复串联序列称为微卫星。在人类基因组中，微卫星更加丰富。微卫星的重复序列比VNTR短，扩增分型简便，易于自动化，在VNTR或微卫星不仅重复片段的数量不同而且重复片段的核苷酸也具有多态性。在VNTR或微卫星多态性分析时，如再结合碱基配对分析可以藜得更大量的信息，这一种更有希望的标志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理论上其对嫌疑人的排除率为99.999％。PCR技术可以完成替代早期的Southern印迹法进行多态性分析而且操作简便，敏感性及准确性都有大幅度的提高。当然PCR技术在法医中的应用仍在起步阶段有许多技术问题等待解决，如样本中的抑制剂、检村中DNA的损报告伤、PCR扩增污染等。想念随着PCR技术的不断完善它将在法医学领域中有更加广泛的应用。

第四篇：PCR技术在食品工业中的应用

PCR技术在食品工业中的应用

姓名

专业

翟扬威 学号 11042106

食品科学与工程 班级 11-1

[摘要]: 如今食品营养、安全问题备受关注，是关系到人们健康和国家发展的重大课题，有关食品安全检测的技术受到重视,其中 PCR技术以其灵敏度高、特异性强以及快速准确等优势在食品检测领域得到广泛的认可.现主要介绍一下PCR技术检测食品微生物的优点，且分析了PCR技术在食品检测中的应用及一些新的PCR检测技术，并说明了这些技术在食品微生物检测中的发展。

[关键词]: 多聚酶链式反应 PCR 食品检测 微生物

近年来，PCR技术在食品工业中倍受重视，例如：基因克隆、转基因食品检测、微生物检测、食品成分及产地的检测等，推进了基因工程在食品产业的发展。

首先，我们得了解PCR技术是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

参加pcr反应的物质主要有五种即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

PCR 技术检测微生物的基本原理是在被检测微生物核酸序列, 在PCR 体系下经高温变性、低温退火、适温延伸三步循环将单个核酸分子序列以2的指数进行大量复制扩增的过程。即在检测时, 被检测微生物双链DNA 序列在94℃变性解链成双链, 55℃特异性引物与单链DNA 结合, 72℃在引物的引导延伸复制检测微生物DNA 序列。以上三步进行循环扩增得到大量的被检测微生物DNA 序列, 最后一般在凝胶电泳下检测目的DNA。理论上只要样品中有一个分子的微生物就可以在短时间内用PCR 技术检测到。食品中污染微生物种类很多, 即使是同一种食品中微生物种类也有很多, 用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检测食品中的弱势菌时, 可能很难用传统的方法检测出来, 特别是有些微生物很难培养, 而用PCR 技术检测这些微生物可以避免这些问题, 因此, 利用PCR 技术能够比较准确地检测食品中微生物。

PCR技术在食品成分测定方面的应用也倍受关注，如动物源性成分的测定等。

近年来，疯牛病、羊痒病及禽流感等疾病通过食品的传播，由于食品安全性与质量监督的需要及宗教信仰等问题，有必要对食品中的动物源成分进行检测，仅靠传统的外观鉴别，无法准确判定其实际成分。PCR 技术已被广泛应用于动物肉类的物种检测与饲料中的动物成分检测。陈文炳[20]等，应用了PCR技术检测12种加工食品中猪、牛、羊、鸡等动物源性成分，并开发了真核生物所共有的18S核糖体DNA(18S R-DNA)与食品中多种动物物种特异性基因片段之间的二重PCR检测方法，以提高检测效率与准确性，节约检测成本。王丽媛[21]等，利用单重PCR和多重PCR对部分市售肉制品进行检测，以确定食品中是否含有动物源性成分及其含量。此方法操作简便，快速准确，节省费用。植物源性成分的测定

我国是一个农产品出口大国，加入WTO后，随着农产品出口量的增加，国外对出口食品质量的要求也随之提高。为确保食品的品质和安全，为我国食品的进出口贸易严格把关，保证我国人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，开发出准确方便的鉴定食品有效成分的方法，具有重大意义。陈文炳[22]等本研究以豆粉与豆奶粉中的大豆成分(内源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、马铃薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖体DNA(18S R-DNA)片段为研究对象，进行单一与二重PCR扩增，以扩增产物作为分子标记，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物学鉴定技术，为食品质量与安全管理提供技术支持。

参考文献

[1]张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用.中国卫生检验杂志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [2]陈师勇、莫照兰、徐永立.水产养殖病原微生物检测技术研究进展.海洋科学,2002.26(9)P31-35 [3]杨卫军,张小军,张坤朋,张光杰.PCR技术在食品微生物检测中的应用.安阳工学院学报,2004(4)p16-18 [4]张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用.中国卫生检验杂志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [5]陈师勇、莫照兰、徐永立.水产养殖病原微生物检测技术研究进展.海洋科学,2002.26(9)P31-35 [6]杨卫军,张小军,张坤朋,张光杰.PCR技术在食品微生物检测中的应用.安阳工学院学报,2004(4)p16-18

第五篇：PCR技术将在临床检验领域迎来新契机

PCR技术将在临床检验领域迎来新契机

来源：广东医学2010年2月第31卷第3期

周高英，叶锋

北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司(北京100176)

1985年，Mullis发明的聚合酶链式反应(PCR)技术在医学界掀起了基因诊断技术的热潮，PCR技术凭借快速、简便、灵敏等优点以惊人的速度广泛应用于临床基因诊断等领域，成为现代医学发展的又一里程碑。但十多年的临床实践表明，PCR技术本身在工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR产品标准化等方面还存在着若干弊端，这导致检测结果上的差异，这已经成为当前困扰临床医师、实验室技术人员以及患者的普遍问题。本文将从PCR技术产业发展回顾、诊断试剂的标准化以及PCR技术在临床检验领域的新契机等3个方面进行阐述。PCR技术及产业发展历史回顾

1985年，美国MULLIS等[1]发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实，并依靠此项技术获得1993年诺贝尔化学奖。1989年，Hoffmann—La Roche公司和Cetus公司开始将PCR技术应用于临床诊断领域。1996年，美国Applied Biosystems公司推出全球首款实时荧光定量PCR技术，并在欧美各国悄然兴起，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点，因而在各级临床实验室得以迅速推广[3]。PCR技术于90年代中期在国内全面展开临床应用工作，但是由于传统的PCR技术本身存在着许多局限性(如产物不能准确定量、容易交叉污染、导致假阳性等)，在1998年遭到了卫生部门的明令禁止。此后，由于荧光定量PCR技术的出现以及国内外学者的不懈努力，政府相关部门于2002年颁布《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》等一系列准入文件，从制度上规范了PCR实验室运作，建立起有效的质量保障体系[4]。目前，已有多家国内外生产厂商涉足研发生产适用于临床诊断的PCR检测试剂盒，并在PCR产品市场中占得先机。经过多年的发展和完善，荧光定量PCR技术在国内科研、检测和诊断领域已得到广泛应用，无论是产品种类、产品质量、技术优势和市场规模均可与国外厂家相媲美，另外，由于试剂价格远低于进口产品，国产PCR诊断试剂占领了绝大部分国内市场份额。临床PCR诊断试剂产品的弊端

临床实验室检验标准化并非单一因素，它由诸多关键性环节组成，其中工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR试剂产品标准化是PCR临床检验标准化的核心内容。目前国家颁布的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》等一系列准入文件从根本上规范了工作流程标准化问题；对PCR仪器标准化而言，一些进口PCR仪器依靠高度的稳定性、可重复性和高效的数据分析软件，已实现了实验数据的可靠性和标准化操作流程；由于价格占优，国产PCR诊断试剂占据了国内的大部分市场，但是由于不同的厂家缺乏统一的检查标准，往往使得同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果存在较大差异。这已经成为困扰临床医生、患者以及实验室技术人员的普遍问题，这也是当前不同实验室间结果有条件互认的一个巨大障碍。目前对于PCR诊断产品标准化主要存在以下4个问题：

2.1 定量的目的和意义不明 除少数种类试剂外，目前已上市的大部分试剂盒并不是报告原始样本中病原体的浓度，而是核酸提取后产物的靶基因浓度，并不能真正反映原取材样本的靶基因的真正含量。选择合适的实验标本是减少实验误差的第一个过程，然而不同实验的实验样品并不具有通用性，很难确保实验样品的均一性。在人体，血液样本容易收集、相对恒定、能确保不同样本间的比较，对血液中病原体进行定量检测更精确且有实际意义。然而对于如尿液、痰液、淋巴液、拭子、组织块等样本，由于采样时患者的生理状况和取样部位等因素，虽然用物理、化学或酶的方法对标本进行了处理，但仍然无法做到均一性

和可比性，因此其所谓的定量仅仅是针对核酸提取物中靶基因定量。

2.2 定量的依据不妥据调查，目前市场上PCR定量试剂无一例外都采用质粒做为试剂盒定量标准。由于质粒是一种人为构建的脱氧核糖核酸载体，环状物理构象存在特殊性，和线性的基因组DNA相比，PCR扩增效率上具有差别。因此，先进行质粒拷贝数定值，再通过比较各个样品扩增曲线Ct值来获得病原体基因组DNA的浓度，这样的流程缺乏严谨的逻辑依据。有些厂家甚至用质粒标定RNA(有的病毒遗传物质为RNA)拷贝数，就更加无据可依。同时，采用与待检样本性质差异很大的质粒作为标准品或质控品，也无法回避检测过程的基质效应。

2.3 定量的准确性不能保证核酸提取：临床样本的多样性给核酸的提取和纯化提出了新的问题，目前提取方法有手工提取、柱提取、磁珠提取等，不同的提取方法各有其的优势，因此很难建立一个标准化的临床标本制作处理过程，这对于样本的预处理、核酸的提取、提取的效率评估，也是核酸纯化方法标准化的重要指标。内标选择：目前多数PCR试剂生产厂商并没有引入质量控制措施(如内标)和校正品，这对于病原体数量准确定量就无从谈起。虽然医院对于某一两次检测值的精确度要求不是太高，但对于那些引起重大疾病的病原体，如乙型肝炎病毒载量的长期监控，准确量化就成为临床十分迫切的要求，这也是现阶段体外诊断试剂生产厂家亟待突破的瓶颈。PCR实验过程：不同的PCR仪器、不同厂家的试剂、不同的操作者也是造成实验定量不准确的重要指标之一。

2.4 试剂缺乏稳定性稳定性是体外诊断试剂必须具有的基本属性，是确保产品在使用过程中安全有效的重要指标。通过对不同条件下产品的主要质量指标随时间变化情况的检测，可以为产品的保存条件和有效期的确定提供依据。而试剂方法的标准化以及标准物质的应用是保证实验室检验结果准确性的前提，在日常检验工作中应用标准物质，将极大地改善不同实验室间检验结果的可比性，从而逐步实现不同实验室间检验结果有条件的互认。PCR技术在临床检验领域的新契机

分子生物学发展至今，人类基因组的草图早已绘就[6]，许多信号传导通道也已阐明[7]，PCR技术已经成为分子生物学十分便利的工具。然而谈到与临床检验相结合，仍有许多待改进的地方，未来的PCR临床发展之路，需要更加紧密地结合临床、体外诊断(IVD)基本要求和新材料、自动化技术等研究领域的基础理论，并在产品设计、制造工艺上取得新的突破，只有这样方能有效弥补目前PCR技术存在的缺陷，进一步拓宽这项技术的应用空间。

3.1 标准化首先，PCR技术面临的历史任务是解决标准化问题。应该说，定量这一概念的提出为PCR标准化进程迈出了第一步，但这还远远不够。标准化不仅意味着统一的量化形式，更重要的是建立固定、可重复的流程，严谨完备的质量控制体系，一致且具可比性的评估方法。满足这些条件，机器自动化无疑是最好的选择。

3.2 自动化近2O年，检验医学以惊人的速度和规模获得了巨大的发展，其中自动化的迅速发展尤为迅猛，它将传统的人工检测手段提高到自动化检测的新水平，为精确、微量、快速和组合检验提供了有力的保障，自动化已成为临床检验的趋势。PCR扩增的自动化早已实现，因而核酸提取纯化的自动化就显得更为重要。近年来各仪器厂商纷纷推出磁珠法提取仪器，如Roche MagNA Pure LC，利用电磁效应以及纳米级的磁性颗粒进行核酸的分离纯化，其提取效率相比之前的自动化系统有了明显提高[8]。核酸提取纯化与PCR扩增联为一体的自动化检测系统则是临床诊断的趋势，如Handy-Lab公司的Jaguar全自动检测系统。仪器的自动化是临床PCR标准化的最佳选择，自动化程度越高，标准化越容易实现。虽然目前这些仪器以及配套耗材的价格偏高，但并不影响各大医院对这些新生技术平台的接纳。近年来，政府对重大传染病(如乙肝、丙肝、结核等)项目予以资金上的支持，旨在加强这些重大传染病的监控与防治。目前这些仪器设备已进入医院和院方检验的需求进一步磨合，加上生产成本平摊之后，完全取代人工操作的情景必将成为现实。

3.3 高通量(1)绝对通量的提高。过去PCR 由于通量不高而一直受人诟病，不久前挪威公司DiaGenic联合关国ABI公司开发出类似普通生物芯片的Taqman微量液体反应板，让人们看到了PCR微型化并实现高通量的希望[9-10]。该仪器含有384孔独立反应体系，具有良好的灵敏度、特异性和宽泛的动力学范围。

在新的技术平台下，精细繁琐PCR加样的工作将完全由仪器取代，精密度进一步得到改善。另外，新的加样方式进一步微缩反应体系，1块普通的PCR反应板便能同时进行上万个反应，1次即能检遍人体内的多种基因的表达情况。Abgene公司推出的水浴热循环仪PCR一次可完成24块板(96孔、384孔、1 536孔)的PCR，最大通量1次测序反应可达到24×1 536=36 864个样本，真正实现了仪器的高通量。(2)相对通量的提高。相比于那些体积大的高通量仪器，临床实验室更需要一些系统结构简单、体积小、容易实现自动化操作、分析通量高的仪器。如ABI公司推出的StepOnePlus采用了独特的的VerriFlexTM 加热模块，它具有6个独立控制的peltier加热块，相当于6台PCR，为具有优化得到的有不同的退火温度的引物和探针的用户提供了操作的灵活性。

3.4 PCR技术的发展扩大了临床应用(1)应用种类和范围扩展。受益于生物信息学迅速发展，PCR检测的种类和范围也在日渐扩大，从一开始纯粹检测人体中的感染源，到现在检测各种基因的突变缺失，判断病原体的耐药性或人体对于某些疾病的易感性，从而实现个体化用药和治疗[11]。目前已在遗传病的产前筛查、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证、动植物检疫等方面展现了良好的应用前景。(2)结合其他分子生物学技术扩展。近十年来，PCR技术衍生出许多精细分支，它与免疫学方法、核酸杂交以及测序技术的结合大大丰富了分子生物学的应用领域，目前众多PCR衍生技术和相关技术已应运而生，并在临床上得到广泛的应用，如TaqMan MGB探针技术使得单纯使用PCR技术对单个碱基的突变进行检测成为可能，在临床上可以对疾病相关位点(如耐药位点)进行检测；PCR结合测序技术，测序技术是在产生PCR产物的基础上，一次能获得更多的序列信息，被视为核酸序列研究的“金标准”，特别适用于多个疾病相关位点的检测(如乙肝病毒P区耐药位点检测、EGFR、KRAS等靶向药物耐药突变检测)；单碱基延伸技术(single base ex-tension，SBE)，该技术可对突变位点进行检测，这是很多高通量SNP分型技术的基础。高通量的SNP分型在临床上适用于大量标本的快速检测，如在人群中筛查携带某个疾病相关位点的个体。高分辨熔解曲线技术(HRM)是在PCR体系中加入饱和荧光染料，通过控制体系的温度变化，绘制PCR产物的温度熔解曲线图。依据杂合异源双链的原理，不同的DNA双链由于长度、GC含量、错配性等存在差异而具有不同的温度熔解曲线。该技术特别适用于那些无需确定突变位置和类型的快速筛查，如Kras基因12、13位密码子的任一突变，若使用TaqMan，需要多个反应检测8种基因型，而HRM 只需要检测野生型和非野生型。这些新技术的应用极大地增强了PCR技术对于基因细小差别的分辨能力，将PCR技术精细化的应用潜力提升到了一个新的层面。结语

尽管PCR技术已经进入临床检验领域多年，但当前仍被视为一种辅助的临床诊断方法。不过随着分子生物学理论的快速发展，PCR技术与新材料、自动化科学的结合日益紧密，并融合新的工艺设计，逐渐凸显出以标准化、自动化、高通量以及精细化为代表的几大发展趋势。这些因素不仅为将来的PCR诊断试剂产业的发展预留了广阔空间，而且指明了方向，同时对现有的PCR产品和产业格局提出了挑战和变革要求。综上所述，PCR技术以及相关产业即将在临床检验领域迎来全新的发展契机。

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