PCR技术在微生物鉴定中的应用5篇

第一篇：PCR技术在微生物鉴定中的应用

昆虫分子生物学

课程论文

学

院: 课

程: 学

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姓

名:

植物保护学院

昆虫分子生物学

任课教师:

职称:

教授

成 绩:

2015年8月29日

PCR技术在微生物鉴定中的应用

摘要 随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测中的应用。细菌16S rDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸置疑。同时，随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中也已得到应用。使用真菌ITS区域序列通用引物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。

关键词 PCR；16S rDNA；BOX-PCR；ITS；细菌；真菌

PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了PCR技术并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库、遗传病传染病的诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病学调查等。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplex，PCR）技术[4]、实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技术[5]、单分子PCR技术[6]等。PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸，引物在体外将待检DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’~3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR技术在细菌鉴定中的应用

细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中

第二篇：PCR技术在食品工业中的应用

PCR技术在食品工业中的应用

姓名

专业

翟扬威 学号 11042106

食品科学与工程 班级 11-1

[摘要]: 如今食品营养、安全问题备受关注，是关系到人们健康和国家发展的重大课题，有关食品安全检测的技术受到重视,其中 PCR技术以其灵敏度高、特异性强以及快速准确等优势在食品检测领域得到广泛的认可.现主要介绍一下PCR技术检测食品微生物的优点，且分析了PCR技术在食品检测中的应用及一些新的PCR检测技术，并说明了这些技术在食品微生物检测中的发展。

[关键词]: 多聚酶链式反应 PCR 食品检测 微生物

近年来，PCR技术在食品工业中倍受重视，例如：基因克隆、转基因食品检测、微生物检测、食品成分及产地的检测等，推进了基因工程在食品产业的发展。

首先，我们得了解PCR技术是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

参加pcr反应的物质主要有五种即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

PCR 技术检测微生物的基本原理是在被检测微生物核酸序列, 在PCR 体系下经高温变性、低温退火、适温延伸三步循环将单个核酸分子序列以2的指数进行大量复制扩增的过程。即在检测时, 被检测微生物双链DNA 序列在94℃变性解链成双链, 55℃特异性引物与单链DNA 结合, 72℃在引物的引导延伸复制检测微生物DNA 序列。以上三步进行循环扩增得到大量的被检测微生物DNA 序列, 最后一般在凝胶电泳下检测目的DNA。理论上只要样品中有一个分子的微生物就可以在短时间内用PCR 技术检测到。食品中污染微生物种类很多, 即使是同一种食品中微生物种类也有很多, 用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检测食品中的弱势菌时, 可能很难用传统的方法检测出来, 特别是有些微生物很难培养, 而用PCR 技术检测这些微生物可以避免这些问题, 因此, 利用PCR 技术能够比较准确地检测食品中微生物。

PCR技术在食品成分测定方面的应用也倍受关注，如动物源性成分的测定等。

近年来，疯牛病、羊痒病及禽流感等疾病通过食品的传播，由于食品安全性与质量监督的需要及宗教信仰等问题，有必要对食品中的动物源成分进行检测，仅靠传统的外观鉴别，无法准确判定其实际成分。PCR 技术已被广泛应用于动物肉类的物种检测与饲料中的动物成分检测。陈文炳[20]等，应用了PCR技术检测12种加工食品中猪、牛、羊、鸡等动物源性成分，并开发了真核生物所共有的18S核糖体DNA(18S R-DNA)与食品中多种动物物种特异性基因片段之间的二重PCR检测方法，以提高检测效率与准确性，节约检测成本。王丽媛[21]等，利用单重PCR和多重PCR对部分市售肉制品进行检测，以确定食品中是否含有动物源性成分及其含量。此方法操作简便，快速准确，节省费用。植物源性成分的测定

我国是一个农产品出口大国，加入WTO后，随着农产品出口量的增加，国外对出口食品质量的要求也随之提高。为确保食品的品质和安全，为我国食品的进出口贸易严格把关，保证我国人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，开发出准确方便的鉴定食品有效成分的方法，具有重大意义。陈文炳[22]等本研究以豆粉与豆奶粉中的大豆成分(内源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、马铃薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖体DNA(18S R-DNA)片段为研究对象，进行单一与二重PCR扩增，以扩增产物作为分子标记，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物学鉴定技术，为食品质量与安全管理提供技术支持。

参考文献

[1]张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用.中国卫生检验杂志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [2]陈师勇、莫照兰、徐永立.水产养殖病原微生物检测技术研究进展.海洋科学,2002.26(9)P31-35 [3]杨卫军,张小军,张坤朋,张光杰.PCR技术在食品微生物检测中的应用.安阳工学院学报,2004(4)p16-18 [4]张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用.中国卫生检验杂志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [5]陈师勇、莫照兰、徐永立.水产养殖病原微生物检测技术研究进展.海洋科学,2002.26(9)P31-35 [6]杨卫军,张小军,张坤朋,张光杰.PCR技术在食品微生物检测中的应用.安阳工学院学报,2004(4)p16-18

第三篇：PCR技术在临床检验中的应用

PCR技术在临床检验中的应用

http://www.xiexiebang.com 生物技术支持

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。PCR法检测乙肝的优势表现在：①早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。②对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。梅毒是由梅毒螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，梅毒螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺体其取样方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型民时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找共同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。

我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及生物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞中观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种，1969年Hubner根据Rous(1911)的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后来又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的细胞基因表达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称之为原癌基因（Proto Oncogene）。为了与病毒癌基因区分，分别用V-Onc及C-Onc基因来代表。目前了解较多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理有：①点突变，受到射线、化学因素、生物因素的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很大的区别。②获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。③基因易位，内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化。④原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因子受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤相关的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因较复杂，作用机理不太清楚。癌基因检测中常用的分子生物学技术有：杂交、DNA分子克隆、PCR扩增及序列分析。PCR扩增简便、快捷有较强的实用性，甚至可从病人体液样本中检测活化的癌基因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。Ras基因是1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分离出来取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性称C-H-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，从神经母细胞中又发现了N-ras基因。Ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤时点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用PCR扩增样本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。P53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53KD分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年Cane发现了P53蛋白Eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。P53突变后其产物突变蛋白稳定性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。PCR-RELP、PCR-SSCP则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在SSCP分析中，单链DNA因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改变，从布将变异的DNA与正常DNA区分开，统计表明100-300bp分子大小的ssDNA突变检出率可达97％，300-450bp标出率可达69％，因此大于400bp的片段多态性应采用其它方法检测。

遗传病是由于遗传基础异常而引起的疾病，人类遗传病约有3000多种，患者占总人口数的10％。遗传病大概可分为单基因、多基因及染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查（特别是显带法）、生物化分析等。随分子生物学发展，基因诊断愈来愈表现出其优越性，PCR技术是基因诊断的主要技术之一，为快速、准确地检测人类遗传病开辟了一个新的途径，预计与遗传相关的疾病的检测有80％将在3-5年内被PCR法所取代。PCR在遗传病诊断应用中，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的有PCR法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性X综合症及性别鉴定等。地中海贫血（Thalassmia）是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地中海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短臂上，a珠蛋白基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66％，贵州、四川等地高发可达2.2％。应用PCR技术可以直接检测突变的基因诊断此病。苯丙酮尿症（Phenylketouria,PKU）是一种常染色体隐性遗传病。病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化为酷氨酸血症，出现脑组织损伤，智力障碍。此病患者出生时正常，出生后一经确诊立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食治疗8-10年不致影响患者智力，但低苯丙氨酸饮食代价之昂贵是一般家庭所不能承受的，关键在于避免患儿出生。因此本病的早期诊断有极其重要的意义。PCR结合斑点杂交能有效诊断PKU。遗传性疾病的基因变化很复杂，单基因固定位点变异布致病的情况很少，因此基因诊断过程中往往需要PCR技术与限制性内切酶、斑点杂交、聚丙烯酰胺胶电泳图谱分析及扩增产物序列分析结合，作综合判断。

优生学包括基础优生学、社会优生学、临床优生学及环境优生学。孕期检查及产前诊断是临床优生学的最重要内容之一。孕期检查除一般项目外还能及时了解孕妇是患有某些对胎儿发育有严重影响的疾病如风疹病毒感染、沙眼衣原体、解脲支原体、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、弓体感染等，及时发现及时治疗并采取有效措施预防发展成为宫内感染。PCR技术对这些病原体的检测简便而确实，另外利用PCR技术可以对地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症、脆性X综合症等遗传性疾病进行宫内诊断。可见PCR在优生优育方面有很高的应用价值。

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。由于VNTR在等位基因中的多态性便构成了遗传标记。使用PCR技术对其进行扩增结合对扩增产物凝胶电泳图谱分析即可进行个人识别及亲子鉴定。由2-6核苷组成的重复串联序列称为微卫星。在人类基因组中，微卫星更加丰富。微卫星的重复序列比VNTR短，扩增分型简便，易于自动化，在VNTR或微卫星不仅重复片段的数量不同而且重复片段的核苷酸也具有多态性。在VNTR或微卫星多态性分析时，如再结合碱基配对分析可以藜得更大量的信息，这一种更有希望的标志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理论上其对嫌疑人的排除率为99.999％。PCR技术可以完成替代早期的Southern印迹法进行多态性分析而且操作简便，敏感性及准确性都有大幅度的提高。当然PCR技术在法医中的应用仍在起步阶段有许多技术问题等待解决，如样本中的抑制剂、检村中DNA的损报告伤、PCR扩增污染等。想念随着PCR技术的不断完善它将在法医学领域中有更加广泛的应用。

第四篇：微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用

微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用

msw生物处理技术主要包括好氧和厌氧生物处理。好氧生物处理如：好氧堆肥、生物反应器填埋等，其工艺中的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等微生物种群。厌氧生物处理，如：厌氧消化、厌氧填埋等，其工艺中的微生物又称“瘤胃微生物”，主要有水解细菌、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等。

在msw好氧生物降解过程中，细菌凭借强大的比表面积，可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，进行胞内代谢。总的来说，其数量要比放线菌和真菌多得多。当然，在不同的环境中分离的细菌在分类学上具有多样性，主要有假单胞菌属（pseudomonas）、克雷伯氏菌属（klebsiella）以及芽孢杆菌属（bacillus）的细菌。在堆肥过程中，细菌总数的变化趋势是高-低-高。堆肥初期，有机废物中携带有的大量细菌分解有机物质释放能量，使堆体温度上升，此时，常温细菌受到抑制，嗜温细菌活跃；当堆温升至高温阶段，只有少量的嗜热细菌可以活动；高温期过后，随着有机成分的减少，堆体温度降低，嗜温及常温细菌又开始活跃，使细菌总数上升。整个好氧降解过程中，嗜温细菌是堆肥系统中最主要的微生物。

现代生物技术与环境保护

现代生物技术是以DNA分子技术为基础，包括微生物工程，细胞工程，酶工程，基因工程等一系列生物高新技术的总称。现代生物技术不仅在农作物改良、医药研究、食品工程方面发挥着重要作用，而且也随着日益突出的环境问题在治理污染、环境生物监测等方面发挥着重要的作用。自20 世纪 80年代以来生物技术作为一种高新技术，已普遍受到世界各国和民间研究机构的高度重视，发展十分迅猛。与传统方法比较，生物治理方法具有许多优点。

（1）生物技术处理垃圾废弃物是降解破坏污染物的分子结构，降解的产物以及副产物，大都是可以被生物重新利用的，有助于把人类活动产生的环境污染减轻到最小程度，这样既做到一劳永逸，不留下长期污染问题,同时也对垃圾废弃物进行了资源化利用。

（2）利用发酵工程技术处理污染物质，最终转化产物大都是无毒无害的稳定物质，如二氧化碳、水、氮气和甲烷气体等，常常是一步到位，避免污染物的多次转移而造成重复污染，因此生物技术是一种既安全又彻底消除污染的手段。

（3）生物技术是以酶促反应为基础的生物化学过程，而作为生物催化剂的酶是一种活性蛋白质，其反应过程是在常温常压和接近中性的条件下进行的，所以大多数生物治理技术可以就地实施，而且不影响其他作业的正常进行，与常常需要高温高压的化工过程比较，反应条件大大简化，具有设备简单、成本低廉、效果好、过程稳定、操作简便等优点。

所以，当今生物技术已广泛应用于环境监测、工业清洁生产、工业废弃物和城市生活垃圾的处理，有毒有害物质的无害化处理等各个方面。

第五篇：PCR及其改进技术在食品安全检测中的应用

PCR及其改进技术在食品安全检测中的应用

当今社会，食品中存在的污染情况越来越严重。猪肉注水、奶粉掺假、蔬菜有机农药含量超标等等，严重影响着人们的身体健康。PCR改进技术可以简化检测步骤、提高检测精准度，具有操作简便、检测速度快、检测精度高等优点，在食品安全检测工作中的使用率高、使用范围广泛。

食品安全检测的主要内容

食品安全检测的内容比较复杂，涉及面广泛，主要的检测内容是：食品污染成分、食品营养成分、食品是否具有添加剂以及食品质量的总体检测等等。食品安全检测的指标主要包括：成分分析、农药残留分析、食品添加剂分析、微量元素分析和有害物质分析等。常用的食品安全就按册方法有两种：一种是传统的常规分析法，一种是仪器分析法。仪器分析法是食品安全检测中的最常用的方法。

食品安全检测人员对食品检测的检验要求有三部分内容：①要严格按照标准中规定的分析步骤依次进行，在实验室中，要对所有的不安全因素采取防护措施，其中，不安全因素都包括：爆炸、腐蚀、烧伤等等；②在实验室中，检测人员需要准确、详细地记录检测的方法和数据等信息；③在食品安全检测完成后，检测人员需要检测数据的统计和整理工作。

PCR及其改进技术概括

PCR的是指聚合酶链反应技术或者多聚酶链反应技术，常用于放大特定的DNA，主要优点有简洁、方便、敏感、重复性好和自动化等.传统的PCR技术在很多方面存在着不足，经过改进后有了很多较为明显的优点，但是，实时定量PCR技术和多重PCR技术在某些方面仍然有问题。使用实时定量PCR技术时首先需要有专门的仪器，技术成本高，存在的检测结果偏差大。多重PCR技术具有非特性结合问题，在使用多重PCR技术时如果不注意观察样本和样本之间的反应和作用，会发生假阳性或者假阴性的问题。

传统的PCR技术在食品检测中的具体应用

检测食品中所含成分。比如，人们在买肉的时候会考虑到肉里面有没有掺假、是否注过水、屠宰前的家畜有没有患有疾病等等。为了保证消费者的合法权益和身体健康，食品安全检测人员可以使用PCR技术方便、快捷的将食品中存在的不合格现象检测出来，降低食品安全隐患。

用于检测食品中的病菌。在1992年，有些相关报道中提出了PCR检测技术，经过多年的研究和实践，将PCR技术应用到食品安全检测中得到了很大的回响。用PCR技术检测食品中携带的病菌，例如，猪羊牛肉中的大肠杆菌。

检测食品中包含的营养成分。随着人们生活水平的逐渐提升，人们越来越注重养生。食物中含有的营养成分和主要物质都是人们关心的重点。在走亲访友的时候，一般会送老人和孩子营养价值比较高的礼品。有很多经过加工的食品，人们对肉眼看不出食品质量的好坏，那么如何判断食品中含有的营养成分，就需要食品检测人员使用PCR技术进行检测。

PCR改进技术在食品检测中的具体应用

PCR-DGGE在食品检测中的应用。DGGE技术又称变性梯度凝胶电泳技术。PCR-DGGE技术是一种聚合酶链反应技术和变性梯度凝胶电泳技术结合在一起的新技术，具有敏感性高、特异性强的优点。使用PCR-DGGE技术进行食品检测技术，可以将食品中DNA提取出来，利用食品的基因和食品的核酸对食品进一步的监测。比如：利用PCR-DGGE技术对奶酪进行检测，可以检测出奶酪中存在乳杆菌、乳酸菌和乳球菌包括污染物等等。

实时定量PCR技术在食品检测中的应用。实时定量PCR技术是在PCR技术的基础上，结合荧光信号来进行实时检测。实时定量PCR技术主要采用的是完全闭管检测，实时定量PCR技术是PCR改进技术中操作最方便、结果最准确、用时最短的一种。在各种食品安全检测中得到了广泛使用。

多重PCR技术在食品检测中的具体应用。多重PCR技术是在传统、单一的PCR技术基础上改进后的技术。多重PCR技术一次可以?z测出多种病菌，像是大肠埃希菌、沙门菌属、霍乱弧菌等菌类均可一次检测出来。多重PCR技术操作简单、快速、结果精准，多用于对番茄、大豆、玉米等转基因食品的检测中。

随着毒豆芽、瘦肉精、地沟油等各种食品污染问题的产生，人们对食品的质量产生了很大的怀疑。一些黑心商家只注重经济效益，违规经营，生产食品质量不合格。通过对食品进行安全检验，分析食品中所含的成分和营养比例，促进食品事物的健康、安全发展，提高人们的饮食安全。在食品安全检测工作中使用PCR技术可以很大程度上解决食品安全中存在的问题。

作者简介：

陈冬梅，硕士，伊犁州食品药品检验所，高级工程师，食品负责人