PCR在临床检验中的应用[推荐5篇]

第一篇：PCR在临床检验中的应用

PCR在临床检验中的应用

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。PCR法检测乙肝的优势表现在： ① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR检测在性传播性疾病（STD）的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。是由螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期皮疹中也存在螺体其取样方法同埂下疳，三期皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。

我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及生物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞中观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种，1969年Hubner根据Rous（1911）的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后来又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的细胞基因表达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称之为原癌基因（Proto Oncogene）。为了与病毒癌基因区分，分别用V-Onc及C-Onc基因来代表。目前了解较多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理有：①点突变，受到射线、化学因素、生物因素的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很大的区别。②获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。③基因易位，内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化。④原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因子受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤相关的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因较复杂，作用机理不太清楚。癌基因检测中常用的分子生物学技术有：杂交、DNA分子克隆、PCR扩增及序列分析。PCR扩增简便、快捷有较强的实用性，甚至可从病人体液样本中检测活化的癌基因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。Ras基因是1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分离出来取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性称C-H-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，从神经母细胞中又发现了N-ras基因。Ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤时点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用PCR扩增样本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。P53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53KD分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年Cane发现了P53蛋白Eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。P53突变后其产物突变蛋白稳定性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。PCR-RELP、PCR-SSCP则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在SSCP分析中，单链DNA因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改变，从布将变异的DNA与正常DNA区分开，统计表明100-300bp分子大小的ssDNA突变检出率可达97％，300-450bp标出率可达69％，因此大于400bp的片段多态性应采用其它方法检测。

遗传病是由于遗传基础异常而引起的疾病，人类遗传病约有3000多种，患者占总人口数的10％。遗传病大概可分为单基因、多基因及染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查（特别是显带法）、生物化分析等。随分子生物学发展，基因诊断愈来愈表现出其优越性，PCR技术是基因诊断的主要技术之一，为快速、准确地检测人类遗传病开辟了一个新的途径，预计与遗传相关的疾病的检测有80％将在3-5年内被PCR法所取代。PCR在遗传病诊断应用中，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的有PCR法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性X综合症及性别鉴定等。地中海贫血（Thalassmia）是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地中海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短臂上，a珠蛋白基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66％，贵州、四川等地高发可达2.2％。应用PCR技术可以直接检测突变的基因诊断此病。苯丙酮尿症（Phenylketouria,PKU）是一种常染色体隐性遗传病。病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化为酷氨酸血症，出现脑组织损伤，智力障碍。此病患者出生时正常，出生后一经确诊立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食治疗8-10年不致影响患者智力，但低苯丙氨酸饮食代价之昂贵是一般家庭所不能承受的，关键在于避免患儿出生。因此本病的早期诊断有极其重要的意义。PCR结合斑点杂交能有效诊断PKU。遗传性疾病的基因变化很复杂，单基因固定位点变异布致病的情况很少，因此基因诊断过程中往往需要PCR技术与限制性内切酶、斑点杂交、聚丙烯酰胺胶电泳图谱分析及扩增产物序列分析结合，作综合判断。

优生学包括基础优生学、会优生学、临床优生学及环境优生学。孕期检查及产前诊断是临床优生学的最重要内容之一。孕期检查除一般项目外还能及时了解孕妇是患有某些对胎儿发育有严重影响的疾病如风疹病毒感染、沙眼衣原体、解脲支原体、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、弓体感染等，及时发现及时治疗并采取有效措施预防发展成为宫内感染。PCR技术对这些病原体的检测简便而确实，另外利用PCR技术可以对地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症、脆性X综合症等遗传性疾病进行宫内诊断。可见PCR在优生优育方面有很高的应用价值。

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。由于VNTR在等位基因中的多态性便构成了遗传标记。使用PCR技术对其进行扩增结合对扩增产物凝胶电泳图谱分析即可进行个人识别及亲子鉴定。由2-6核苷组成的重复串联序列称为微卫星。在人类基因组中，微卫星更加丰富。微卫星的重复序列比VNTR短，扩增分型简便，易于自动化，在VNTR或微卫星不仅重复片段的数量不同而且重复片段的核苷酸也具有多态性。在VNTR或微卫星多态性分析时，如再结合碱基配对分析可以藜得更大量的信息，这一种更有希望的标志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理论上其对嫌疑人的排除率为99.999％。PCR技术可以完成替代早期的Southern印迹法进行多态性分析而且操作简便，敏感性及准确性都有大幅度的提高。当然PCR技术在法医中的应用仍在起步阶段有许多技术问题等待解决，如样本中的抑制剂、检村中DNA的损报告伤、PCR扩增污染等。想念随着PCR技术的不断完善它将在法医学领域中有更加广泛的应用。

第二篇：PCR技术在临床检验中的应用

PCR技术在临床检验中的应用

http://www.xiexiebang.com 生物技术支持

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。PCR法检测乙肝的优势表现在：①早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。②对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。梅毒是由梅毒螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，梅毒螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺体其取样方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型民时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找共同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。

我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及生物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞中观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种，1969年Hubner根据Rous(1911)的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后来又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的细胞基因表达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称之为原癌基因（Proto Oncogene）。为了与病毒癌基因区分，分别用V-Onc及C-Onc基因来代表。目前了解较多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理有：①点突变，受到射线、化学因素、生物因素的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很大的区别。②获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。③基因易位，内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化。④原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因子受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤相关的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因较复杂，作用机理不太清楚。癌基因检测中常用的分子生物学技术有：杂交、DNA分子克隆、PCR扩增及序列分析。PCR扩增简便、快捷有较强的实用性，甚至可从病人体液样本中检测活化的癌基因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。Ras基因是1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分离出来取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性称C-H-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，从神经母细胞中又发现了N-ras基因。Ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤时点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用PCR扩增样本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。P53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53KD分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年Cane发现了P53蛋白Eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。P53突变后其产物突变蛋白稳定性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。PCR-RELP、PCR-SSCP则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在SSCP分析中，单链DNA因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改变，从布将变异的DNA与正常DNA区分开，统计表明100-300bp分子大小的ssDNA突变检出率可达97％，300-450bp标出率可达69％，因此大于400bp的片段多态性应采用其它方法检测。

遗传病是由于遗传基础异常而引起的疾病，人类遗传病约有3000多种，患者占总人口数的10％。遗传病大概可分为单基因、多基因及染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查（特别是显带法）、生物化分析等。随分子生物学发展，基因诊断愈来愈表现出其优越性，PCR技术是基因诊断的主要技术之一，为快速、准确地检测人类遗传病开辟了一个新的途径，预计与遗传相关的疾病的检测有80％将在3-5年内被PCR法所取代。PCR在遗传病诊断应用中，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的有PCR法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性X综合症及性别鉴定等。地中海贫血（Thalassmia）是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地中海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短臂上，a珠蛋白基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66％，贵州、四川等地高发可达2.2％。应用PCR技术可以直接检测突变的基因诊断此病。苯丙酮尿症（Phenylketouria,PKU）是一种常染色体隐性遗传病。病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化为酷氨酸血症，出现脑组织损伤，智力障碍。此病患者出生时正常，出生后一经确诊立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食治疗8-10年不致影响患者智力，但低苯丙氨酸饮食代价之昂贵是一般家庭所不能承受的，关键在于避免患儿出生。因此本病的早期诊断有极其重要的意义。PCR结合斑点杂交能有效诊断PKU。遗传性疾病的基因变化很复杂，单基因固定位点变异布致病的情况很少，因此基因诊断过程中往往需要PCR技术与限制性内切酶、斑点杂交、聚丙烯酰胺胶电泳图谱分析及扩增产物序列分析结合，作综合判断。

优生学包括基础优生学、社会优生学、临床优生学及环境优生学。孕期检查及产前诊断是临床优生学的最重要内容之一。孕期检查除一般项目外还能及时了解孕妇是患有某些对胎儿发育有严重影响的疾病如风疹病毒感染、沙眼衣原体、解脲支原体、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、弓体感染等，及时发现及时治疗并采取有效措施预防发展成为宫内感染。PCR技术对这些病原体的检测简便而确实，另外利用PCR技术可以对地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症、脆性X综合症等遗传性疾病进行宫内诊断。可见PCR在优生优育方面有很高的应用价值。

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。由于VNTR在等位基因中的多态性便构成了遗传标记。使用PCR技术对其进行扩增结合对扩增产物凝胶电泳图谱分析即可进行个人识别及亲子鉴定。由2-6核苷组成的重复串联序列称为微卫星。在人类基因组中，微卫星更加丰富。微卫星的重复序列比VNTR短，扩增分型简便，易于自动化，在VNTR或微卫星不仅重复片段的数量不同而且重复片段的核苷酸也具有多态性。在VNTR或微卫星多态性分析时，如再结合碱基配对分析可以藜得更大量的信息，这一种更有希望的标志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理论上其对嫌疑人的排除率为99.999％。PCR技术可以完成替代早期的Southern印迹法进行多态性分析而且操作简便，敏感性及准确性都有大幅度的提高。当然PCR技术在法医中的应用仍在起步阶段有许多技术问题等待解决，如样本中的抑制剂、检村中DNA的损报告伤、PCR扩增污染等。想念随着PCR技术的不断完善它将在法医学领域中有更加广泛的应用。

第三篇：临床检验中PCR技术的应用

临床检验中PCR技术的应用

青海红十字医院检验科 杨军 检验士 关键词：pcr ：pcr的应用

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。

PCR检测的临床应用范围：用于疾病的早期诊断，疾病的鉴别诊断，疾病的病因确定，药物疗效的评价，治疗效果的评价，治愈标准的确定

通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。PCR法检测乙肝的优势表现在：

① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。

② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT-PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA(RT)后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录-PCR(RT-PCR)。

PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎(NGU)可能更具有代表性意义。检测标本无特殊限制：

痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检PCR检测淋球菌。淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离培养法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系统法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，使淋病的快速诊断有重大突破。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下

PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况

（1）参考文献：《中国医学检验杂志》2001.11:13-14

(2)

姜怀春pcr技术研究新进展。重庆工商大学报，2005.22（4）：232-235

第四篇：PCR技术在食品工业中的应用

PCR技术在食品工业中的应用

姓名

专业

翟扬威 学号 11042106

食品科学与工程 班级 11-1

[摘要]: 如今食品营养、安全问题备受关注，是关系到人们健康和国家发展的重大课题，有关食品安全检测的技术受到重视,其中 PCR技术以其灵敏度高、特异性强以及快速准确等优势在食品检测领域得到广泛的认可.现主要介绍一下PCR技术检测食品微生物的优点，且分析了PCR技术在食品检测中的应用及一些新的PCR检测技术，并说明了这些技术在食品微生物检测中的发展。

[关键词]: 多聚酶链式反应 PCR 食品检测 微生物

近年来，PCR技术在食品工业中倍受重视，例如：基因克隆、转基因食品检测、微生物检测、食品成分及产地的检测等，推进了基因工程在食品产业的发展。

首先，我们得了解PCR技术是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

参加pcr反应的物质主要有五种即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

PCR 技术检测微生物的基本原理是在被检测微生物核酸序列, 在PCR 体系下经高温变性、低温退火、适温延伸三步循环将单个核酸分子序列以2的指数进行大量复制扩增的过程。即在检测时, 被检测微生物双链DNA 序列在94℃变性解链成双链, 55℃特异性引物与单链DNA 结合, 72℃在引物的引导延伸复制检测微生物DNA 序列。以上三步进行循环扩增得到大量的被检测微生物DNA 序列, 最后一般在凝胶电泳下检测目的DNA。理论上只要样品中有一个分子的微生物就可以在短时间内用PCR 技术检测到。食品中污染微生物种类很多, 即使是同一种食品中微生物种类也有很多, 用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检测食品中的弱势菌时, 可能很难用传统的方法检测出来, 特别是有些微生物很难培养, 而用PCR 技术检测这些微生物可以避免这些问题, 因此, 利用PCR 技术能够比较准确地检测食品中微生物。

PCR技术在食品成分测定方面的应用也倍受关注，如动物源性成分的测定等。

近年来，疯牛病、羊痒病及禽流感等疾病通过食品的传播，由于食品安全性与质量监督的需要及宗教信仰等问题，有必要对食品中的动物源成分进行检测，仅靠传统的外观鉴别，无法准确判定其实际成分。PCR 技术已被广泛应用于动物肉类的物种检测与饲料中的动物成分检测。陈文炳[20]等，应用了PCR技术检测12种加工食品中猪、牛、羊、鸡等动物源性成分，并开发了真核生物所共有的18S核糖体DNA(18S R-DNA)与食品中多种动物物种特异性基因片段之间的二重PCR检测方法，以提高检测效率与准确性，节约检测成本。王丽媛[21]等，利用单重PCR和多重PCR对部分市售肉制品进行检测，以确定食品中是否含有动物源性成分及其含量。此方法操作简便，快速准确，节省费用。植物源性成分的测定

我国是一个农产品出口大国，加入WTO后，随着农产品出口量的增加，国外对出口食品质量的要求也随之提高。为确保食品的品质和安全，为我国食品的进出口贸易严格把关，保证我国人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，开发出准确方便的鉴定食品有效成分的方法，具有重大意义。陈文炳[22]等本研究以豆粉与豆奶粉中的大豆成分(内源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、马铃薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖体DNA(18S R-DNA)片段为研究对象，进行单一与二重PCR扩增，以扩增产物作为分子标记，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物学鉴定技术，为食品质量与安全管理提供技术支持。

参考文献

[1]张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用.中国卫生检验杂志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [2]陈师勇、莫照兰、徐永立.水产养殖病原微生物检测技术研究进展.海洋科学,2002.26(9)P31-35 [3]杨卫军,张小军,张坤朋,张光杰.PCR技术在食品微生物检测中的应用.安阳工学院学报,2004(4)p16-18 [4]张玉霞，黄鸣.食品检验中多重PCR技术的应用.中国卫生检验杂志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [5]陈师勇、莫照兰、徐永立.水产养殖病原微生物检测技术研究进展.海洋科学,2002.26(9)P31-35 [6]杨卫军,张小军,张坤朋,张光杰.PCR技术在食品微生物检测中的应用.安阳工学院学报,2004(4)p16-18

第五篇：分子生物学在医学检验中的临床应用及前景

分子生物学在医学检验中的临床应用及前景 班级：2013级科硕6班 专业：临床检验诊断学 姓名：姜世涛

学号：20*** 评分： 导师签名：

分子生物学是一门正在蓬勃发展的学科，新技术和应用条件的不断出现，为检验医学的发展提供了崭新的时代并提供新的机遇和挑战。分子生物学是以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象的学科，分子生物学技术即建立在核酸生化基础上的一类研究手段，现已广泛应用于医学检验中，同时也逐渐渗入数理科学、结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学，研究内容也从DNA鉴定、扩展到核酸及表达产物分析，技术不断进步为微生物检验、肿瘤诊断及评估、遗传病诊断、兔疫系统疾病诊断提供重要依据和创新思路。在结构基因组学、功能基因组学和环境基因组学蓬勃发展形势下，分子诊断学技术将会取得突破性进展。一．利用分子生物学技术检测样品中核酸水平

PCR[1]技术是目前应用较广泛和成熟的临床检测方法，在法医学、常见传染病、性病、寄生虫和优生优育等领域有很高的应用价值，尤其对肝炎病毒的早期诊断。1．核酸分子杂交技术和基因芯片技术

核酸分子杂交技术也称为基因探针技术，利用核酸的变性、复性和碱基互补配对的原理，用已知的探针序列检测样本中是否含有与之配对的核苷酸序列的技术，是印迹杂交、基因芯片等技术的基础。目前基因芯片技术可广泛应用在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面。另外，现已获得一些微生物的全基因序列，包括百余种病毒，多种细菌(流感嗜血杆菌、产甲烷球菌及实验室常用的大肠杆菌等)和一些酵母等。因此，将一种或多种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块基因芯片上，可快速、简便地检测出病原体，判断侵入机体引起感染性疾病的病原微生物(病毒、细菌或寄生虫等)，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。2．单核苷酸多态性分析(SNP)技术

在人群中，个体基因的核苷酸序列存在差异性，称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于人的基因组中。如果在某个家庭中，某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种”遗传标记”来判断家庭成员或胎儿是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的”身份证”，因此，基因多态性分析技术已经广泛应用于群体遗传学研究、疾病连锁分析和关联分析、疾病遗传机制研究、肿瘤易感性研究、个性化用药等诸多方面。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析技术为临床检测提供了依据。SNP是一种最常见的遗传变异，在人类DNA多态性中，SNP约占90％。SNP是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基。SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同在于：它不再以”长度”的差异作为检测手段，而是直接以序列的差异作为标记。由于SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于计算机分析结果，因此SNP检测已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。尽管SNP检测在搜寻疾病基因方面有潜在的价值，但实际应用中却比人们想象的要难得多，它需要花费大量的时间进行筛查，才能建立可靠的SNP分析图谱。3．microRNA是潜在的临床诊断工具 microRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNAs，其功能是负调控基因表达。在正常组织中，miRNA转录，加工，结合到靶mRNA的互补位点，通过抑制蛋白翻译或是改变mRNA的稳定性来抑制基因表达，维持细胞生长、增殖、分化和死亡的正常进行。不同miRNA的分布有组织特异性，因此在生理和病理条件下，miRNA的表达水平存在差异。成熟miRNA水平下降可能是由于miRNA生物合成的任何步骤的缺陷造成的，而这最终将导致不适当的miRNA的靶蛋白的表达。最后的结果可能导致过度增殖、侵入、凋亡的减少、不能正常分化或者去分化，引起肿瘤的形成。最近的证据表明，miRNA突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。目前已知的miRNA中，大约50％在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点，这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。例如，mir-125b一1，线虫lin一4的同源基因，在染色体的1lq24脆性位点，在很多乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中有缺失。若能确定多种肿瘤的miRNA表达谱特征库，可以帮助诊断和治疗肿瘤。由于miRNAs可以从福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA表达谱特征库建立成为可能。在此基础上，用特定的miRNAs表达差异图谱，还可以用于预测病人的预后。另外从治疗的角度，miRNA表达谱可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。

二、蛋白组学技术在临床检验中的应用 随着生物体全基因组序列的解析，特别是人类基因组序列草图的完成，基因组学研究重点不可避免地从结构基因组学转向功能基因组学，因此在上世纪90年代中期，蛋白质组学正研究成为基础研究的重要支柱。蛋白组学是在基因组学之后又一组学，其发展之迅速，是由于其能够较为全面的考察蛋白层面的表达情况，有利于获得各种蛋白、多肽因子等信息从而对相关机制进行更深入的研究[2]。蛋白质组学研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性，虽然可以通过PCR、基因芯片等方法显示生物体的基因水平，但mRNA水平(包括mRNA的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。由此可见，对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目在生理和病理等不同条件下，其表达也不同。若能获得与某种疾病相关的蛋白水平的差异表达信息，将为临床诊断、治疗和预后提供有力依据。1．蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法，它类似于基因芯片，是将蛋白质点到固相物质上，然后与要检测的组织或细胞等进行”杂交”，再通过自动化仪器分析得出结果。这里所指的”杂交”是指蛋白与蛋白之间如(抗体与抗原)在空间构象上能特异性的相互识别。例如免疫芯片，是一种特殊的蛋白质芯片，它在临床分子诊断学有着明显的发展潜力，如肿瘤标志的检测、不同激素的测定，自身免疫性疾病中多种自身抗体或抗原的检测和超敏反应中多种过敏原的筛查等。

2．液体芯片飞行时间质谱技术在临床检测中的应用根据探针标记和色谱分析的原理，液体芯片飞行时间质谱主要由两部分组成：磁珠部分即液体芯片部分；飞行时间质谱仪部分，用于获取磁珠捕获的蛋白质质量和含量，根据不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需时间不同，被测定的蛋白质以一系列波锋的形式出现，并由此绘制出待测蛋白的质谱图，可发现各样本间的蛋白质表达和含量的异同。

液体芯片一飞行时间质谱技术利用磁珠俘获肿瘤患者与健康对照体液中低丰度特异蛋白或多肽，经飞行时间质谱测定和软件分析，建立由两者差异表达蛋白或多肽组成的质谱图模型，用于预测未知样品的归属。液体芯片飞行时间质谱技术主要用于从复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液中发现潜在的生物标志物。一方面，该技术能够在生物液体中检测指示特异疾病的生物标志物模式或生物标志物谱，另一方面，该技术还可以鉴定单个的生物标志物候选物。在哈佛大学女子医院、纽约斯隆-凯特琳癌症研究所、麻省总医院、贝勒医学院等世界一流医院和医学研究所中，该技术已广泛应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、头颈鳞癌、膀胱癌等的早期诊断研究中。应用该技术可协助诊断多种遗传性代谢紊乱疾病，如各种氨基酸代谢失常血症，包括胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各种超甲硫氨酸血症；短链核长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、异戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其他各种有机酸代谢失常疾病等。由于液体芯片飞行时间质谱技术具有准确度高、快速、高通量、灵敏度高、重复性好、分辨率高、检测费用低等特点，是极具潜力的临床肿瘤早期诊断工具。

三．分子生物芯片技术在医学检验中的应用

随着人类基因组计划(HGP)的完成，蛋白质组计划也已经启动，基因序列数据、蛋白序列和功能数据以惊人的速度增长，而传统的生物技术已经不能满足数据倍增的要求，生命科学需要更快捷、更准确的自动化的生物技术，而生物芯片在这种情况下应运而生。生物芯片(biochip)的概念虽源于计算机芯片但不同于计算机芯片。狭义的生物芯片即微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核昔酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。分析的基本单位是在一定尺寸的基片(如硅片、玻璃、塑料等)表面以点阵方式固定的一系列可寻找的识别分子，点阵中每一个点都可视为一个传感器的探头。芯片表面固定的分子在一定的条件下与被检测物进行反应，其结果利用化学荧光法、酶标法、同位素法或电化学法显示，再用扫描仪等仪器记录，最后通过专门的计算机软件进行分析。而广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件。生物芯片技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。经过十多年发展，生物芯片技术已日臻完善，其应用前景非常广阔，因其具有技术操作简易、自动化程度高、检测目的分子数量多、高通量等特点，为“基因组计划”时期基因功能的研究及科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具。在临床检验医学方面，生物芯片技术已经被应用于病毒、细茵的检测自身兔疫性疾病的兔疫标志物的检测。遗传性疾病的检测及肿瘤免疫标志物的单一检测及其联检等方面。甘志远等[3]通过呼吸道斑点试验芯片法检测呼吸道病毒抗体具有简便快速、灵敏度和特异度高等优点，是临床呼吸道病毒感染辅助诊断的有效方法。值得推广使用生物芯片具有操作简单、信息量大、节约试剂、减少误差、诊断快速的特点。在临床诊断、科学研究和流行病学筛选中具有广泛的应用前景，它的的诞生也为人们提供了一种高通量、高效率的肿瘤学研究手段[4-6]。五．分子生物纳米技术在医学检验中的应用

1.纳米科学技术是20世纪末期刚刚诞生并正在崛起的新科技。通过直接操纵和安排原子、分子创制新物质，纳米技术与医学相结合，促进了基础医学研究技术的完善、临床诊断技术的革新及治疗水平的提高[7]。通过应用纳米技术，在DNA检测时，检测方法更加简便、快速、准确。美国NASA Ames Center for Nanote Chnology与中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室合作，将碳纳米管用于基因芯片，样本需要量低于1000个NDA分子（传统DNA检测的样本需要量超过106个DNA分子）；需要的样品量更少，可免去传统的PcR扩增步骤；结果可靠、重复性好、操作简单、易实现检测自动化[8]。免疫分析加上磁性修饰已成功地用于各种生物活性物质和异生质，如药物、致癌物等的检测。将特异性抗体或抗原固定到纳米磁球表面，并以酶、放射性同位素荧光染料或化学发光物质为基础所产生的检测与传统微量滴定板技术相比具有简单、快速和灵敏的特点。霍美俊等[9]利用抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒，同时具有可在病毒感染的细胞周围特异性富集和磁颗粒可在交变磁场下感应升温的双重功能，将其作为磁感应热疗的靶向介质，有望研制出病毒感染性疾病磁感应热疗的靶向介质。为寻求一条快速诊断EV71病毒感染的新方法，纳米细胞分离技术的出现有助于解决生物医学中快速获取细胞标本的难题。应用纳米免疫磁珠检测早期肺癌患者循环血液中的肿瘤细胞，可监测肺癌的转移情况。2.六．分子生物学技术在临床检测应用中的问题

疾病的发生是由于人体受内外因素的影响，导致机体细胞、组织或器官功能紊乱，归根到底是核酸、蛋白等分子水平表达异常，由此可见，利用分子生物学技术进行临床检测是协助临床诊断和治疗的必不可少的工具。但由于分子生物学技术不仅对临床样品的处理有较高要求，而且对检测人员的技术水平也有要求，这就涉及到从标本收集、处理、检测和分析等多个环节的系统化和规范化，为此，我国已制定了临床实验室定量测定室内质量控制指南。

利用分子生物学技术进行临床监测，在某些情况下可能存在一定困难，例如与核酸相比，蛋白和多肽作为生物标志的一个优势是它们能够很容易的在血液、尿液和其他生物体液中找到。这些类型的样品很容易获得，并代表了含有丰富的具有潜在信息的生物学信息分子。但从研究手段方面来说，蛋白质研究技术比核酸技术相对要复杂和困难，不仅氨基酸残基数量多于核甘酸残基，而且在蛋白质组研究中没有一种方法象PCR那样能迅速扩增目的片段，这样对于丰度低但功能重要的蛋白质很难进行大规模的研究。miRNA虽然是新兴的研究领域，但它们与疾病的相关性日益受到人们的重视，相信随着基础研究对miRNA不断深入的认识，miRNA必将成为临床检测中的手段之一。七．参考文献

[1] 王海英.分子生物学技术在医学检验中的应用发展［J］.当代医学2011,17（6）16.[2] 解福生，李欢.蛋白组学在心血管方面的研究进展.医学信息(中旬刊), 2011,8,3812-3813.[3] 甘志远，颜云盈，朱心智.生物芯片在婴幼儿呼吸道病原体感染诊断中的应用[J].内科,2011,6(3):215-216.[4] 王新允，袁玲，郑海燕等.肺癌中FHIT蛋白表达细胞芯片的研究[J].中国肺癌杂志,2009,12(2):131-134.[5] 朱抿，于军，周文利等.生物芯片技术在肺癌研究中的应用价值[J].中国肺癌杂志,2011,14,5:441-445.[6] 张战，朱波，林治华.生物芯片技术在肿瘤研究中的应用[J].重庆医学,2011,5(4):493-495..[7] 曲秋莲，张英鸽.纳米技术和材料在医学上应用的现状与展望[J].东南大学学报,医学版,2011,30(1):157-163.[8] 张阳德，纳米技术与外科.中华实验外科杂志[J].2004,21(10):1159.[9] 霍美俊，张长清，闰妍等.抗EV71多克隆抗体偶联的靶向磁性纳米颗粒对病毒的特异性富集[J].科技导报,2010,28(16):25-30.