痕迹检验在交通肇事中的应用

第一篇：痕迹检验在交通肇事中的应用

痕迹检验在交通肇事中的应用

近几年，随着社会经济的不断发展，各种机动车保有量快速增长，再加上车辆驾驶人员培训时间短，不能完全适应道路交通环境的要求，道路交通事故与日俱增，交通肇事逃逸案件不断上升，这不仅给国家、集体和人民生命财产造成重大损失，更给受害人及其家属在精神上造成了极大的痛苦，在生活上带来了许多困难。作为公安交通管理机关，如何通过对交通事故现场痕迹物证进行分析、提取，迅速、及时侦破案件，严厉打击交通肇事犯罪嫌疑人，是摆在我们面前的一项艰巨任务。

一、概述

（一）痕迹检验与痕迹检验技术

痕迹检验是运用科学的理论和方法检验刑事案件中的痕迹，确定痕迹与案件的事实、痕迹与一定的人或物的关系的一种技术手段与司法鉴定工作。

痕迹检验技术是指运用痕迹检验学的理论、方法检验案件中的各种痕迹物证，确定痕迹与案件、痕迹与一定人或物之间关系的一种刑事技术。

（二）交通事故痕迹及鉴定依据

所谓交通事故的痕迹是指交通事故形成的一切痕迹，具体指在交通事故和逃逸案件的发生过程中，车辆与其他车辆或物体相接触和相互作用时，在彼此间的作用面上形成的形象痕迹、整体分离痕迹和表面附着痕迹。

交通事故鉴定的主要依据是指事故发生后遗留在现场路面、车辆、人体及有关物体表面能够证明事故事实的各种印痕和破损的状态。

利用痕迹检验技术对交通事故进行有针对性的现场勘察工作可以确定案件性质，主要依据以下几个方面出发: 1.现场是否有轮胎印

对于现场中的轮胎印，关键是要分析此轮胎与被撞车辆或行人是否有关。我 们主要通过轮胎印痕反映出的行驶方向、轨迹、通行及变异情况还有现场被撞车辆或行人的倒地位置、痕迹等来综合分析现场遗留的轮胎印痕是否是由事故形成的。

2.现场是否有汽车零部件、玻璃碎屑及其他散落物

我们要分析现场的散落物属于肇事车辆的哪个部位并尽量收集；检验被撞车辆或者行人有无油漆、玻璃碎片或其他附着物粘附；还要检验受伤者的受伤部位、程度和形态，来推断肇事车辆的碰撞部位及行人致伤的情节。

3.钝器伤的特点

交通事故中的身上多为钝器伤，应根据受伤者损伤部位、形态、受力方向来分析肇事车辆上是否有形成此伤口的部位。

4.现场痕迹、物证是否有反常表现

在现场勘查中，运用痕迹技术发现现场的疑点，并通过进一步检验找到证实案件性质的依据。如果现场痕迹与事故发生过程存在本质上的差异，案件非交通事故的可能性就较大。

5.勘查外围现场是否有可疑迹象

有些案件现场完全符合交通事故的特点，可通过调查走访外围现场，观察外围现场是否有可疑现象，结合多方面的调查作出客观全面的原因分析。

近几年运用痕迹检验技术查处交通事故和肇事逃逸案件越来越得到公安部门的认可，根据痕迹检验技术作出的鉴定结论在许多重要环节中起到直接的关键性的作用，痕迹检验技术在交通肇事案件中发挥着重要的作用。

（三）痕迹检验在交通肇事案件中的作用 1.痕迹检验在判断交通事故类型的作用

准确的判明事故类型是处理交通事故案件的基础，不仅可以提供排查方向，还可以避免不必要的纠纷。交通事故类型一般分为三种：即车车相撞、车人相撞和车辆单独事故。在这几种类型中，有是会因为事故现场混乱或没有证人而发生混淆。比如有的车辆单独事故现场和车车相撞很相似，如果没有目击证人或者证人陈述不清楚，往往会引发受害人家属上访等事件。这类案件可以通过对事故现场的勘察及人员损伤情况的检验和车辆痕迹的检验、确定痕迹尤其是车辆的痕迹(包括行驶痕迹、刹车痕迹、损坏痕迹和擦伤部位等)，准确的判明痕迹的形成过程，为妥善的解决这类案件提供客观、准确、科学的依据。

如某地仇某某与女友骑一辆二轮摩托车外出，正遇派出所设卡检查过往车辆。因仇某某所骑摩托车的车型、颜色等特征与几天前被盗窃的车相似，民警便令其停车接收检查。仇某某见状驾车仓皇逃走，并与大树相撞，二人当场死亡。受害人家属听信一些“目击者”谗言聚众闹事。为了妥善解决此事，派出所将案件上报上级公安局请示出具现场车辆检验报告。经过检验发现，该车损毁严重，多处痕迹符合撞击树木摩擦地面形成的特征。从而排除了一些别有用心者的谗言。

2.在侦破交通肇事逃逸案件中的作用

交通案件发案率时有上升的趋势，这类案件会因为现场情况和证人情况而侦破起来比较困难，通过痕迹检验技术检验却常常可以取得意想不到的作用。具体体现在如下几个方面:(1)检验鉴定轮胎花纹痕迹。车辆肇事时留在现场地面上的印记是车辆运动过程的真实记录，是交通事故再现中不可缺少的物证。这些轮胎印在现场中除了留在地面上外，有时还留在被撞人或被轧过人的衣裤上。只要认真勘验就可以发现和提取，为破案提供重要物证。

(2)检验鉴定整体分离痕迹。整体分离痕迹是交通肇事现场常出现而且又不易被破坏和改变的物证之一。由于机动车具有体积大、重量大、速度快的特点，所以在车辆与车辆之间的碰撞中，在地面常常会有脱落或在车体上遗留的一些涂料，这为认定肇事车辆提供了线索和依据。

(3)检验鉴定微量痕迹物证。在许多交通肇事案件中，微量痕迹物证常常能发挥很好的证据作用。碰撞的车辆、车人、车物之间互相附着的涂料、纤维、介质物质等都能反映出互相的关系、形态、高低、位置，从而印证两者的作用关系，为破案提供很好的线索与证据。

痕迹检验与鉴定技术在重大交通肇事逃逸案件中的应用十分广泛。上述几方面只是常见的痕迹检验技术在交通肇事逃逸案件中的应用。总的来说，只要我们认真细致地进行现场勘验，就能够很好地发挥痕迹检验与鉴定技术在交通肇事逃逸案件中的作用。

二、痕迹检验在交通肇事案件中的具体应用

（一）轮胎花纹痕迹检验鉴定的应用 1.轮胎印压痕迹

在交通事故中，人与车、车与车之间发生接触，不可避免的会产生物质与痕迹形态的相互交换，在双方客体上会同时留下痕迹物证和微量物证。印压痕迹的形成必须有三个要素，即造型客体、承受客体和作用力。造型客体、承受客体的作用方式不同时，所形成痕迹的种类、特点和形态是不相同的，造型客体的轮廓形态特征会直接反映在承受客体上。

案例：2002年6月2日，某路口，石某驾驶大货车由南向东右转弯时，大货车右前角与李某驾驶的两轮摩托车(后乘其子)相撞，造成二人当场死亡。经勘察，死者李某后腰部、后背肩部印压花纹痕迹清晰，由两种不同轮胎胎面花纹印压形成，经与大货车轮胎胎面花纹样本比对检验，死者腰部车印压花纹图案与大货右前轮轮胎花纹样本图案相同(图略)，后背肩部花纹图案与大货车右中轮轮胎胎面的样本花纹图案相同。

由此可见，肇事大货车右前轮首先由死者腰部碾轧，随即右中轮由后背肩部碾轧。当碾压在人体上后，人体软组织在轮胎胎面人字形的间隙中形成挤压造成淤血，使轮胎胎面花纹较完整地显现在人体皮肤上而形成轮胎印压痕迹。

2.轮胎滚印

滚印是指车辆轮胎在路面作纯滚动运动时，在路面上遗留的印迹，这种印迹可以显示出胎面花纹结构。

路面上的轮胎滚印的宽度决定于轮胎的负荷、气压和规格。对同一种轮胎而言，车辆重载和轮胎气压低时，胎面与路面接触面积增加，滚印较宽。车辆轻载和轮胎气压高时，胎面与路面接触面积减小，滚印较窄。

3.轮胎压印

车辆轮胎受制动力的作用，沿行驶方向在路面作滚动和滑移的复合运动时，在路面遗留的印迹。这种印迹的胎面花纹在车辆行驶方向有所延长。车辆制动时，随着制动力的增加，轮胎与路面间的摩擦力由小变大，车轮由滚动过渡到抱死。由于车轮运动方式的改变，路面上出现由轻到重，向行驶方向延伸的轮胎纹痕迹和拖印。

4.轮胎拖印

拖印是指车轮被制动抱死后，轮胎滑行在路面上遗留的印迹，这种印迹呈带状，不显示胎面花纹。拖印是指由于轮胎与路面接触部位强力摩擦，使胎面物质呈细小颗粒脱落，在路面上形成的平面夹层痕迹。

5.轮胎侧滑印

由于车辆制动性能、速度、装载、轮胎和路面等诸多因素的影响，使车轮偏离原行驶方向作斜向滑移运动，遗留在地面的印迹。侧滑印迹宽度一般大于车轮胎面宽度，不显示胎面花纹。

（二）爆胎痕迹检验鉴定的应用

在交通事故中，车辆轮胎出现爆裂现象并不少见。车胎痕迹在交通事故痕迹中属于车辆行驶痕迹，爆胎后还会产生其它痕迹。爆胎容易导致交通事故的发生，发生交通事故时也会造成爆胎。但对于驾驶员来讲，这两种爆胎现象在交通事故案件中有着本质的区别。爆胎所引发的交通事故属于意外事故，而交通事故中造成的爆胎，其前提是已经发生了交通事故，往往是驾驶员违反交通法规等原因而酿成的交通事故，是要负法律责任的。

案例：今年二月份，我市境内发生一起特大交通事故。一辆“猎豹”牌吉普车，由东向西行至S312线39km + 840m处超车时，与前方同向行驶的一辆“一汽佳宝”牌小型客车相擦刮，后吉普车驶向公路的左侧，与对面沿路边停放的“飞彩”牌农用三轮车及路边6个行人相撞，造成3车受损，4人死亡，8人受伤的特大交通事故。经现场勘查和事故调查，事故处理部门下达了《交通事故责任认定书》：驾驶吉普车的驾驶员，在没有与被超车保持充足的安全距离的情况下实施强行超车，是造成此事故发生的直接原因，根据《中华人民共和国道路交通安全法》等有关法律规定，吉普车驾驶员负事故的全部责任。吉普车驾驶员接到交通事故认定书后，立即提出了异议，并称这是一起由于吉普车左前轮突然爆胎后，方向突然失控导致的意外事故。而最初调查时，吉普车驾驶员未曾提及爆胎之事，车上的4名伤者也均未听到爆胎声。为了查清该起交通事故的真实情况，事故处理部门对吉普车左前轮车胎进行检验以确定该车胎爆裂是在事故发生前还是在事故发生时。

经检验，该轮胎为真空轮胎，轮胎与轮毂已脱离。轮胎面上有大量撕裂状痕 迹，轮胎外侧有一处3cm ×4cm缺失，其他无异常。根据痕迹特征反映，可判定轮胎面上的大量撕裂状裂纹痕迹应为轮胎在爆裂过程中所形成的爆胎痕迹；轮胎外侧面的缺失，因形态规整，痕迹内壁的细微痕迹方向性一致，判定为撞击过程中所形成的切割痕迹。由于被检轮胎同时存在爆胎痕迹和撞击痕迹，要确定两种痕迹所形成的先后顺序，就必须根据痕迹形成的过程和机理加以综合分析。在检验过程中我们首先假定该车是先爆胎后撞击，则爆胎后轮毂将直接承受汽车的部分重量，没有气体的瘪胎必然地面之间形成碾压过程，且轮胎与轮毂由相对静止变成相互摩擦，应该在轮胎上形成轮毂的碾压和摩擦痕迹。根据上述汽车在行使过程中爆胎所形成痕迹的机理，我们在被检轮胎没有发现轮毂与轮胎在碾压过程中所应反映出的痕迹。若撞击后形成爆胎，则由于该轮胎与被撞三轮车某部件形成挤压，造成该轮胎内压瞬间增加可以形成爆裂，并在高速运动的过程中同时可以形成切割痕迹。根据轮胎上痕迹的种类，以及痕迹形成的过程、机理综合分析，可认定这起交通事故中爆胎的形成过程应为：肇事车辆与前方同向行驶的“一汽佳宝”牌小型客车相擦刮后，吉普车变向驶向公路的左侧，与对面沿路边停放的“飞彩”牌农用三轮车及路边6个行人相撞。此鉴定结果进一步支持了事故处理部门下达了《交通事故责任认定书》所认定的结论。

（三）整体分离痕迹检验鉴定的应用 1.同质断裂整体分离痕迹

断裂形态由物体形状所决定，断裂面可能凹凸不平或带有毛刺，或呈其他特征形态，断离面相互对应，界面上的痕迹、附着物及形态也是相互对应的。通常在现场提取到的遗留物，仅仅反映了该残片本身的特征，只能认为是与案件有关的物证，只有当获得了与遗留残片相关的另一分离体客体，而且经过对分离客体的检验，其断裂特征与遗留残片特征相对应时，才能初步确定是否可作为同一认定的依据。因此，不仅要对形态特征进行检验，还要对其进行物理、化学的检验，进一步分析它们的材质、种属，综合起来判断是否原为一体，准确作出同一认定的结论。

案例：2000年7月22日，在某高速路，一辆旅行车由西向东行驶中因爆胎停车，乘车人阎某下车行至超车道内时，被一辆同方向由后驶来的小客车撞出，造成阎某死亡，事故发生后肇事小客车逃逸。经勘验，对现场遗留残损物与嫌疑 车右后视镜基座支架残损件进行了整体吻合复原，其嫌疑车右后视镜基座支架残损件的断面呈凸起弧线，宽度为0.2cm，长度为1.7cm，工字型断裂面宽度为0.2cm，对角线长度为0.8cm，凹陷面弧线宽度为0.3cm，长度为1.1cm；各形态特征均与现场遗留残损物断口形态的弧线宽度、长度相对应，各断面痕迹特征吻合良好，经X射线能谱仪/扫描电子显微镜对其材质进行分析均为同种金属材质，为同一物体断裂分离所形成，可作为同一认定的依据。

2.异质脱离整体分离痕迹

无论是同种材质的组合体，还是不同材质的组合体，各部件之间会有相应的接触面，相邻两部件的接触面上会留下相应的接触印痕和附着物，脱离后，在脱离部位上的印痕形态也是相互对应的。因此，通过异质材质印痕及附着物进行形态特征与分析检验，判断是否原为异体、异质分离同一认定的依据。

案例:2002年10月18日，在某环路发生一起重大交通肇事逃逸案，造成骑三轮车人死亡。经查，车号为晋×××的斯太尔牌大货车有肇事嫌疑。对现场提取的车体部件与大货车左侧脚踏板支架部件经过初步重叠复位后两部件吻合良好。现场遗留物简称A件，车体上部件简称B件，对于这类组合部件在同类大货车上通常属于通用部件，但在这起案件中，它的反映特征在于：(1)擦划痕的贯穿特征。当A、B两个部件拼接在一起时，A件与B件表面的擦划痕由A件表面贯穿至B件表面，划痕连续完整，而且数条划痕均为一次形成。(2)形态特征的完整性。当A、B两个部件拼接在一起时，在其表面的中心部位，有一个由中心跨越两部件边缘而形成的一个孔洞，移开其中任何一个部件，其形状会失去完整性。(3)固有的接触痕迹。A件圆柱体(与B体接触)的外表面与B件半圆形(与A件接触)壳体的内表面上，有形态相对应的磨损痕迹。(4)物理化学特征。A件与B件表面的黑色油漆涂层，经FTIR、SEM/EDS检验，均为同种油漆；两部件对应的磨损面上，均检出对方的不同金属成分。在这一案件中，采用了一物多证、同痕多检、理化分析相结合的方法，依据上述特征，对涉案物证进行全面、细致的分析检验，作出了整体异质分离的鉴定结论，在强有力的证据面前，肇事嫌疑人认罪伏法。

（四）微量物证检验鉴定的应用

交通肇事逃逸案具有现场开放的特点，微量物证的分布复杂，交通事故中常见的微量物证有油漆物证、塑料和合成树脂物证、纤维物证等。由于微量物证种 类、发生作用方式以及遗留部位的不同，交通肇事逃逸案件中微量物证具有不同的存在与分布形式。

1.油漆物证

当车辆与车辆发生碰撞和刮擦，被碰撞和刮擦部位的漆层会发生脱落或相互间的油漆物质转移；机动车辆若与自行车或行人相碰撞和刮擦，有时会在自行车某部位，被害人的衣服、身体上留下肇事车辆的油漆。现场油漆物证的形态与车辆涂层油漆的老化程度及事故本身作用力的大小、方向有关。有的是车辆表面油漆脱落，有的则是多层油漆甚至是底部的腻子层也同时脱落。一般来讲，只有那些旧车因表层油漆严重老化，附着力差，会呈现较大的片状散落，其他则多呈细小颗粒状和小片。如果在事故现场收集到的漆层较厚且厚薄不均匀，可判断此漆片为修补喷涂过油漆的车辆上掉下来的；反之如漆片厚度较均匀，则此漆片为从厂家喷涂油漆的原车上脱落。

(1)油漆物证的提取。现场油漆物证的提取在交通事故现场发现较完整的油漆碎片，可利用竹质镊子轻轻地夹取，放入检材收集瓶中。对于微小的油漆颗粒，则应使用检材收取勺或手术刀刮取后收入检材收集瓶中。对于擦刮痕迹部位的油漆附着物，最好是做完痕迹鉴定和拍照之后，小心地将漆状附着物连同载体一起妥善固定好，直接送检，由检验技术人员进行微量漆状物的提取。

(2)嫌疑肇事车辆上油漆物证的提取。当通过侦查找到嫌疑车后，不要急于提取油漆检材，而应认真、全面地检验该车各部位，重点观察该车涂层是否有划痕、擦痕、脱落及重新喷涂等现象。然后对其形状、离地距离进行测量、记录，同时对照对方车辆或受害人身上接触点的位置、距地高度是否吻合，如不吻合即可排除；如果双方在擦划方向上吻合，相应距地面高度一致，应必须注意两者油漆的颜色是否一致，以便提取到准确的检材。

2.塑料和合成树脂物证

根据塑料零部件成分、性能及事故作用力方向和大小不同，脱落的塑料物质形态不同。可塑性差、质地坚硬的塑料零部件，受到撞击后容易破碎，呈块状脱落。如机动车转向灯灯罩、非机动车尾灯标志等；可塑性较强、质地柔软而有一定韧性的塑料零部件经强力撞击或擦刮，局部产生高温，被撕裂或拉伸，呈胶状或薄膜状，粘附在车辆或物体表面。如非机动车把套，常因被机动车擦刮而呈薄 膜状粘附在车辆表面。

塑料和合成树脂物证的提取。散落在事故现场地面上的塑料碎片，可以用不锈钢镊子夹取。若塑料碎片体积较大或数量较多时，用干净的足够大的纸袋盛放； 若塑料碎片很少，则应用检材收集瓶或硫酸纸制作的盛物袋来收集。对于粘附在痕迹部位的非本身形成的物质，往往是因刮擦作用形成的附着物，提取和保存一定要小心。可借助放大镜观察，用具柄手术刀片轻轻刮取附着物。若附着物较多或具有一定硬度，可用不锈钢镊子提取，然后放入盛物容器中。如果提取连肉眼也难以观察到的附着物，可以使用酒精棉球或用一小块酒精纱布沾擦有附着物处(注意不能来回多次擦)，然后将棉球或纱布连同附着物质一起放入专用玻璃收集瓶中保存。

3.纤维物证

纤维物证的出现率相对于其他微量物证出现率较低，它的形成是有一定条件的，并非车辆与人体接触的事故现场必有纤维物证存在。而且交通事故现场的纤维物证一般都是微量的，有时有数根毛发，有时只有单根毛发或纤维，往往不易发现并且因其颜色特征不明显，除个别差异较大者外，用肉眼难以区分，必须仔细观察和寻找，有时需要使用科学仪器进行观察和鉴别。纤维物证粘附于肇事车辆的事故接触部位与被撞人体纤维的脱落部位具有方位的对应关系。

纤维物证的提取。机动车辆与人、动物的毛发接触，往往会将受害一方的部分毛发转移并附着在肇事车辆上，或掉落在事故现场的地面上，机动车辆与人的织物接触也会造成织物纤维的掉落与转移。由于毛发、纤维掉落或附着的数量较少，而且毛发和纤维本身又很细，因此要用手柄放大镜仔细勘查事故现场，必要时应使用光源照射寻找纤维物证。在提取附着物之前，最好用照相机拍下纤维的原始依附状态，作为重要物证形态资料。然后用干净的不锈钢镊子进行提取，最后将提取到的纤维物证连同所提取的受害一方(人或动物)被刮擦痕迹处的毛发或织物纤维三至五根一同送检。需要注意的是，应在立体显微镜观察到两者的颜色和外观形态近似或一致的基础上才能提取比对检材。若微量纤维的种类较多，在事故现场的散落面积较大，难以在肉眼观察下用镊子一根一根地提取，此时可使用交通事故物证提取箱中配备的静电取迹器进行提取。

三、总结 通过以上交通事故的痕迹检验，我们深刻体会到在交通事故处理中痕迹检验工作的重要性和必要性。随着法律、法规的健全和公民法律意识的增强，在交通事故的处理过程中，车辆痕迹的检验工作将逐步走向规范化、正规化。这就要求公安交通事故处理部门的民警要进一步增强在处理交通事故的过程中的证据意识。要加强对交通事故现场勘查知识的学习和交通事故中的痕迹检验知识的储备。对特大、复杂的交通事故案件以及可能造成矛盾纠纷的案件要有保全证据的意识，以减少不必要的纠纷。

参考文献

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第二篇：浅谈交通肇事案件中的痕迹检验-修改稿

浅谈交通肇事案件中的痕迹检验

（呼伦贝尔市公安局交通警察支队李国峰特古斯）

摘要：在经济全速发展的背景下，交通事故出现的频率也是越来越高，在形成资料分析的取证过程中，需要采用现代化的技术手段，尤其是对交通肇事案件中的痕迹检验技术，对于整个交通案件的处理以及证据的收集等方面有很大作用，因此，通过采用多种技术手段来增强交通肇事案件的痕迹检查，有着很大的现实意义。本文主要从当前交通肇事案件中痕迹检查的重要性进行分析，在起到关键性的作用中，加强对整个痕迹检验技术的探讨，从而更加有效的对交通肇事案件形成全速、有效的侦破。

关键词：交通肇事；案件处理；痕迹检验；技术运用

在机动车辆增加的情况下，交通事故发生的频率也是越来越高，在交通肇事案件处理中，更加注重证据的使用，因此，要在综合管理的基础上，交通公安部门要形成对交通肇事案件的侦破，其中，对于痕迹的检验是一个重要的因素，通过采用痕迹检验的方式，可以明确的形成具体部位的肇事情况，对于整个案件的侦破，能提供最直接、最客观、最基础的证据，是侦破案件的突破口。因此，要积极探索在交通肇事案件中痕迹检验的技术运用，为案件侦破做出更大的贡献。

一、简述痕迹检验在交通肇事案件中的关键性作用

1、物证分析的关键因素

通过采用痕迹检验的方式，对于交通肇事案件形成全面的分析，尤其是能提供详实的线索。在整个交通肇事中，再高明的犯罪手段也会留下一定的痕迹，这就说明，通过细致的痕迹检验，能从中发现一些线索，可以还原整个交通事故的原型。在肇事案件的处理中，融合痕迹检验的分析，就能形成相关的案件技术模式，对于一些基本的要素，如车轮、刮痕处等一些线索，能为整个侦破案件提供有力的证据。在这些因素的形成中，一个不起眼的痕迹，可能成为侦破交通肇事案件的关键点，对于一些主体的因素，能提供对比分析等，这样，更加有利于形 1

成整体分析，所以，在痕迹检验中，对于提升整个物证的有效性，有着很大帮助。

2、侦破案件的主要突破口

在交通肇事案件的痕迹检验中，通过详实而且具体的痕迹分析，对于每一个细节都不放过，能为交通肇事案件提供最为关键的突破口。这样，能形成对整个证据链的全面分析，尤其是在综合证据的分析中，对于痕迹检验的结果，可以成为案件侦破的关键要素。譬如，在一起高速公路交通肇事案件中，一辆车子由西向东行驶过程中，由于车轮爆胎停车，驾驶员在停车进行检查的过程中，被一辆同方向的小客车撞出，这位驾驶员当场死亡。在针对痕迹进行检验的过程，由于小客车肇事逃逸，要形成相应的证据，才能更好为侦破案件提供依据。于是，对残余的残损物进行痕迹检验，其中有一个关键的因素，在现场遗留中，嫌疑车辆右后视镜支架残损物呈现出一定的碎片，通过缺口形态的弧线跨度分析，对于整个横断面的材质与现场遗留的材质完全相吻合，这一个线索，成为了破案的关键因素，也为整个肇事案件的侦破立下了一定的功劳。

二、探讨交通肇事案件中痕迹检验的物证利用

1、车轮痕迹检验的物证利用

在交通肇事案件的痕迹检验中，对于车轮的利用是一个不容忽视的因素，因为，从车轮的痕迹乐意反映出更多的因素，其中包括车轮的花纹种类以及轮距与车辆在行驶中的状态等。对于车子在运行中的一些状态，尤其是在起步、刹车、转弯等一些综合情况，通过对车轮痕迹的检验，从而可以有效的判断出车辆行驶的方向、速度等，在这些综合因素的形成中，包括对车轮更加细致的检查，其中，包括车轮的磨损、裂缝、嵌物等现象，在这样的检验中可以形成同一认定。因此，通过这些具体的车轮检验，能更加科学细致的形成对肇事案件的证据服务，形成侦破的有效性。譬如，在2006年发生在307国道上的一起交通事故，其中，一位骑着摩托车的人被火车碾伤造成腿部骨折的事件，在摩托车倒地之后，火车车轮碾压摩托车上的人，但是，货车司机不承认对摩托车主的碾压，于是，在获取证据的过程中，对货车的车轮进行了痕迹检验，结果发现，货车司机的裤脚上有轮胎痕迹，与货车的轮胎相对比，正好是完全吻合，并且伤者的裤脚上的轮胎痕迹与货车的轮胎是一样的，在证据确凿的基础上，货车司机只能承认碾压事实。因此，通过对车轮痕迹的检验，能为整个案件的侦破提供鲜明的依据，并且为下

一步的侦破提供详实的数据与车轮形状、数据的对比，有很大的实际作用。

2、现场遗留整体分离物的痕迹检验

在现场的控制过程中，对于现场收集与提取遗留物或者整体分离物，有着很大的现实意义。通过对现场遗留的整体分离物如轮胎花纹、挡风玻璃、车灯以及其余的分离物，在整个交通肇事案件处理中也有着很大的作用。通过对这些东西的检验，可以成为对交通肇事车辆的界定。譬如，在2009年307国道上发生的一起交通肇事案件，在发生事故之后，肇事者逃逸。在赶赴现场的过程中，对现场进行细致的勘察，在整个事件中，残留有肇事车辆的玻璃灯罩碎片，除此之外没有其余的任何线索。在针对现场残留的玻璃灯罩进行检验的基础上，在进行交通及时堵截的同时，通过大量的走访调查，发现有一辆车辆的后转向灯灯罩破损，有重大肇事嫌疑，通过这一条线索的侦破，将这一辆车辆的玻璃灯罩与现场残留的玻璃灯罩进行对比，正好是吻合的，在型号、痕迹对比上完全吻合，因此，可以认定为这一辆车辆是逃逸车辆。通过这种痕迹检验的方式，正好可以与整个残留物进行有机的对比，这样，完全符合对交通肇事案件的证据获取，从而为侦破交通肇事案件提供强有力的帮助。

3、车辆刮痕检验的技术运用

在交通肇事案件中，对于车辆刮痕的资料运用是一个重要的环节。因为在整个交通肇事过程中，要形成车辆的碰撞才能出现事故，因此就会有刮痕、磨损等现象，在对一些接触部位形成全方位检验的基础上，形成数据与痕迹对比，观察证明肇事过程的事件真相。在整个检验过程中，从刮痕的高度、宽度、深度以及附着物的痕迹起止线等，从而能确认出车辆的行驶方向，对于交通肇事案件的责任划分有很大帮助。譬如，在2010年在广州某地区发生一起交通事件中，原因是一辆农用三轮车与农用四轮车发生侧翻并由于刮一下引起侧翻。在对侧翻车辆痕迹检验的过程中，针对一些刮痕进行全面的分析，其中发现，三轮车的左马槽与四轮车的左马槽形成同一高度的刮痕，这就可以得出结论，这两辆车经过一定的碰刮，并在另一辆车上发现有油漆被刮的附着物，通过对整个刮痕留下的证据分析，对其中四轮车对三轮车的刮倒承担一定的责任，由此可以得出，这种刮痕检验的过程能为交通肇事案件的侦破提供有力的证据，正好是形成了细致的综合管理模式，为整个交通事故肇事案件的侦破率提供了有力的证据支持。

三、案件实例分析

1、案件1：布纹印压痕迹

这个事故主要是采用对印迹的检验，由于在整个运动的过程中，车辆之间形成一定力量的碰触，会产生更大的摩擦力，速度较快的情况下，交通事故中的痕迹就会残留的更多。在整个物理迁移的过程中，会产生更多的印迹，通过对这些印迹的整体分析，能形成痕迹检验的整体效果。在2012年2月发生的一起交通事故中，在一个车站前，一辆小面包车由西向东行驶，在发生车辆侧滑的过程中，挤压在路旁的行人身上，造成路人的死亡。在整个勘察的过程中，可以看出这一辆小型面包车的左侧后门处有一个软物体，在撞击之后形成了15cm左右的凹陷痕迹，并有布纹印压的痕迹，通过对这一痕迹的减压，可以形成准确的结论。从这一个案件的分析来看，在发生事故的过程中，行人身体处于标志杆与车身之间，在挤压过程中行人衣服布纹清晰的显示在车辆车轮的油漆表面，只要通过对布纹印压的痕迹提取，就能获取更加准确的数据痕迹，在进行对比检验的基础上，可以确认整个肇事案件的真相。从而形成鲜明的导向过程，这些证据的获取，能为整个案件的侦破提供更加有力的帮助，能起到很好的效果。

2、案件2：物证检验技术运用

物证检验技术就是对痕迹的检验，也是一个证据收集的过程，通过对证据的获取，形成仔细的分析，将有很大的作用，尤其是能为交通肇事案件中责任划分、追求刑事责任等提供有力的证据。发生交通事故时，人、车都会产生相应的摩擦，有摩擦就会有线索，比如毛发、玻璃、血迹等这些不易被人作为线索的物证，对于案件的侦破却有着重大作用。无论是什么案件，只要是认真寻找、仔细勘察，都会找到其有价值的地方，最终有助于破案。如2012年6月25日牡丹江农垦区八五四农场场部至建虎高速公路“春迎加油站”西南侧200米处的树林中发现一具无名尸。通过现场勘查、尸体检验、科学推断及汇总所有外围调查情况后，最终牡丹江农垦公安局刑事技术大队确定案件性质为自杀。用科学的论证、有力的证据勇敢地面对现实，推翻了初步检验时所给出的他杀结论。细致的现场勘查所得出死亡结论与外围调查结果互相印证。为刑事侦察部门的侦察工作指明正确的侦察方向，这就是痕迹的意义所在。

四、结语

在对交通肇事案件的综合处理中，要充分发挥出痕迹检验的利用与作用，对于整个物证的获取以及为事故的侦破提供有力的帮助，能为整个案件侦破提供更加快速的材料取证。尤其是在近年来车辆增加、马路杀手增多的情况下，对于痕迹检验技术与分析措施的要求更高，因此，要在交通肇事案件中全面形成痕迹检验的综合模式，形成与整个交通管理相联系，服务于交通管理，充分运用痕迹检验技术对痕迹进行科学的鉴定，并形成科学对比分析等，为整个案件的侦破提供全面的证据支撑。从目前的痕迹检验来看，关键是对车轮、残留物、异质脱离整体分离痕迹等进行综合检验，能为整个侦破水平的提升与办案质量的提高做出更大的贡献，并为构建和谐社会提供更大、更多、更详实、更加有力的帮助。参考文献：

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[3]雷平;扫描电子显微镜及X射线能谱仪在物证鉴定中的应用[J];理化检验.物理分册;2000年11期

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[6]吴剑锋;司法鉴定若干理论问题研究[J];法律与医学杂志;2002年01期

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第三篇：“xxxx”在侦破道路交通肇事逃逸案中的应用

“xxxx”在侦破道路交通肇事逃逸案中的应用

近年来，人肉搜索无疑是公众瞩目的焦点话题，其强大搜索引擎所迸发出的威力是任何网站与信息平台望尘莫及的，便捷、快速、海量、精准的信息流，在经过整合，分析，碰撞，研判后，往往使得被搜索对象无处遁形。如将此收集信息的高效手段合法、合理、科学地应用到侦破交通肇事逃逸案件工作中，对大大提升侦破效能不无裨益。

一、人肉搜索的概念：

“人肉搜索”是社会信息化与网络化相结合的产物，现代信息网络的运用是其得以高效运行的重要保证。它是依托一个纵向贯通、横向集成、互联互通、高度共享的信息网络平台，整合和盘活信息资源并形成有效情报，变传统的单一查询过程为一人提问、多人响应的人性化搜索方式，发起人与参与者之间互通有无，高度共享，最终实现某种意愿的达成。

在交通肇事逃逸案件侦破中“人肉搜索”的主要目的是用来确定人员身份、扩大线索来源及确定物品来源目。运作的基本形式是在论坛发帖，以被查找人或物品的静态图片或动态影像为素材，加贴告知搜索意愿，一旦有认识或者掌握相关信息的网民浏览该帖，出于正义的力量，他就可利用在网上跟帖的形式，将搜索目标的基本情况或活动信息公布于网上。网民的数量巨大，跨越省界乃至国界，通过人肉搜索，通常能收获大量信息。

二、当今交通肇事逃逸侦查中出现的问题：

众所周知专群结合、信息导侦、深入研判、定向制导是侦破交通肇事逃逸案件工作取得成效的基础。但是由于信息来源渠道闭塞，导致信息流不准、不畅、不及时，使得侦破工作陷入进退两难的境地。

交通肇事逃逸侦破难的客观因素：

一是当今社会正处于转型时期，各类矛盾多发的情况下，解决专群结合紧密程度问题具有长期性、复杂性和艰巨性，并不是一朝一夕所能解决的，对侦查中群众基础工作提出了严峻的考验。而构建整个侦查工作情报信息主体的缺乏，没有强大的信息作为支撑，导致侦查工作“上层建筑”中的信息导侦、深入研判、定向制导都无从谈起。

二是交通肇事逃逸案件往往发生在路边无灯、路无监控、现场无人的三无地点，造成侦破逃逸案件信息匮乏，使得侦破工作陷入尴尬局面。传统的警务处理方式是利用现场仅存的碰撞残片，大致确定肇事车辆车型，根据行车轨迹，明确逃逸方向，划定可能藏匿范围，运用“人海战术”，进行地毯式排查，此方案不仅耗时耗力，收获的效果有时也不尽如人意，加上如果肇事车辆是异地号牌，穿越省际、市际边界时，必定绕过收费站，逃避监控录像的捕捉，使得在本市的排查围堵行动形同虚设，侦破方向毫无头绪，工作进展处于停滞状态，以致案件久拖不决，引起当事人不满，引发不安定因素，甚至造成群众上访，影响社会稳定。

交通肇事逃逸侦破难的主观因素：

一是目前，由于受到社会各种不良风气的影响，有些群众抱着多一事不如少一事的心态，不愿意为我们公安机关提供有价值的线索；有些群众对我们公安机关，还缺少必要的信任，也不愿意说。即便有群众向我们反映，大都是零乱或散碎的。以上这些情况将会给我们侦破工作带来很大的难度。

二是个别事故侦查人员专业素质不高，勘查事故现场缺乏科学性、系统性、关联性，态度不认真、不仔细、不谨慎。一些事故现场所遗留的物证有时是很少的，也许是几个残缺的漆片，或玻璃、塑料碎片；也许就一二道制动痕迹。面对这样的肇事现场，就要求我们要认真地对待现场所遗留的每一个物证，力争从有限的物证中，结合现场周围的环境，准确地分析出肇事车辆的车型、颜色、行驶方向、接触部位、损坏部位等重要的破案信息，这样就为快速破获逃逸案，奠定了扎实的基础。

三是少数侦查民警信息碰撞、研判分析能力不强。即使在肇事现场发现、整合出一定的线索，但是这些线索如同汪洋大海中的信息孤岛，彼此之间缺乏架设联系的桥梁，形成信息壁垒，造成线索杂乱无章，穿引主线拎不起，无用支线放不下，侦破方向说不清，侦破手段讲不明，侦查主导思想一笔糊涂账，分析研判一篇流水账，无关痛痒旁敲侧击，废话、牢骚、挖空心思强调客观因素啰嗦一大堆，而对于侦查方向、突破口等中心工作，只字未提，分析报告毫无建树。

三、当前人肉搜索存在的争议：

对于“人肉搜索”这一个挺形象说法，当前社会上对此非常关注，这个问题很复杂，涉及到方方面面。“人肉搜索”的概念涉及到它的界限如何确定，这些都还是研究和讨论过程中的问题。

（一）在承担刑事责任上观点不一。

1.应承担刑事责任。“人肉搜索”刚开始时确实找到了一些应该找到的人，可是随着人们的滥用，越来越多无辜的人受尽了折磨，“网上通缉已经超出了道德谴责的范畴，严重侵害了公民的基本权益。” 全国人大常委会委员朱志刚提出，“网上通缉”、“人肉搜索”泄露公民姓名、家庭住址、个人电话等基本信息，同样是严重侵犯公民基本权益的行为，其造成的危害甚至比出售公民个人信息更为严重，因此建议将“人肉搜索”行为在刑法中予以规范。

2.不应承担刑事责任。人肉搜索行为只是发动网友搜集某一个人的个人信息而已，这种行为并没有触犯法律。人大代表、华南师范大学法学院副院长陈雪明确表示，“如果我想了解一个人的信息资料，我通过我的朋友亲戚去打听，了解到了，这种行为难道也犯法了吗？这和人肉搜索的性质是一样的，只是大家的手段途径不一样而已。”

（二）可能构成其他的侵权行为。

针对“人肉搜索”涉及的种种法律问题，中国人民大学民法硕士、广东民生康田律师所王智柱律师指出，涉及公众人物的信息披露，一般不构成侵权。但由于“人肉搜索”多数针对普通百姓，即使没有明确法律规定，也很可能构成侵犯公民名誉权等民事侵权。

（三）用于协助公安机关办案不涉及侵权。

2008年11月9日，一名网民在天涯论坛发布了一则题为“两个无耻的小偷，我决不放过你们”的帖子，贴出的火锅店的监控录像清晰地看到两名男子：一名男子用衣服做掩护进行盗窃后两人立刻离开。号召网友人肉搜索找到小偷，“让他们在痛苦中东躲西藏，惶惶不可终日”。对于这个行为是否侵权，陕西王炳森律师事务所律师蒋虎军认为，公民有将犯罪分子扭送到公安部门的权利，也有配合警方调查的义务。“人肉搜索小偷”的行为不触及法律底线，这种做法等于协助公安部门工作。

四、关于交通肇事逃逸侦破工作应用“人肉搜索”的思考

一是合法化。

（一）谨防“善良网民”演变成“网络暴民”。网民是“人肉搜索”的基础，情报信息的来源，其善意的跟帖是“人肉搜索”得以高效运转的前提。但是个别网民在获知犯罪嫌疑人及其家人的信息后，“义愤填膺”过了头，往往会“亲临”当事人住所，做出过激行为，严重影响了当事人及其家属的正常生活，原本善意的举动演变成违法行径，“善良网民”悄然过渡为“网络暴民”。如2007年的“铁军打人事件”，在人肉搜索几个小时后，当事人及其妻子的电话号码、身份证号码、家庭住址、工作单位、孩子上学的学校全部曝光，个别“愤怒”的网民来到其住所喷油漆、写大字报，对其家属进行恐吓骚扰，导致与此案毫无牵连人正常的工作、学习秩序被打破。笔者以为，解决此类事件发生方法其实很简单，只需在论坛中添加浏览权限这一技术手段，让网民只能看见搜索意愿，能够跟帖，但是看不见其他人的发帖内容，待到案件侦破后，再以版主的身份发帖将处理情况给与公示，以表示广大网民的善意的辛苦没有白费。这样一来，网民之间彼此相对独立，信息流横向不能贯通，只能在纵向公安机关与网民的树状结构中互联互动，演变“网络暴民”的信息基础就不攻自破了。

（二）严审发起“人肉搜索”的必要性。“人肉搜索”是有限的资源，同时也是把“双刃剑”，只应在确有必要发起的时候采用，发起前必须慎重考虑案件的敏感程度是否会引起负面炒作和被一些别有用心的人拿来造谣滋事，所以在“人肉搜索”前履行严格的审批手续是必需的。

二是科学化

（一）发起“人肉搜索”的准备工作。在需要发起人肉搜索前，事故处理科应主动向市局网监处通报案情，根据实际需要，了解适合的网站和稳妥的发帖形式，寻求技术操作等方面专业支持。

（二）发起人的角色扮演。人肉搜索中的发起人角色很关键。应选择与网民身份平等，并与案件有联系的角色，如受害人、目击者等。避免直接以征询破案线索的公安机关身份出现。在现今，网络中的网民的素质参差不齐，对协助公安机关开展工作持有抵触情绪的不乏其人，以国家公权力代表的身份出现在人肉搜索中，往往不如一个无关人员唤起正义感或共鸣的效果更佳。

（三）群策群力，提高人气。网络里人气相当重要，“人肉搜索”成功案例都是建立在高人气的基础上。一个帖子，一个搜索，冷冷清清的数百人的浏览量或十几条的回复量，是不足以吸引大量网友参与其中的。所以，在发起“人肉搜索”时，可考虑动员或安排部分警力对发起人肉搜索的帖子进行浏览和回复，相信很短时间内便可为发起的搜索积累大量人气。

尽管“人肉搜索”无论在社会上还是网络上争议颇多，但是不容忽视的是，网民巨大的人力资源确实值得公安机关重视和挖掘，在互联网上“走网民路线”争取网民的支持，扩大线索来源，拓宽破案途径，不就是公安工作走群众路线的延伸吗？ 总之，调动一切积极因素，使侦破交通肇事逃逸工作变被动为主动，变办法少为多途径，变单打独斗为整体联动，切实提高公安交通管理部门驾驭交通肇事逃逸案件的能力。

由“清网行动”谈异地车辆“惹祸”多的原因及对策探讨 作者：罗庄大队 来源： 访问量：13 时间：2011-7-28 15:45:47 从“清网行动”中发现的一些问题来看，异地车辆造成的交通事故特别是逃逸事故占有较大的比例，造成不可估量的损失。因此，狠有必要探究其原因，根据异地车辆异地行车存在的问题和产生事故的各方面原因，采取有效对策措施，预防和减少异地车辆造成的道路交通事故。

一、异地车辆“惹祸”多的原因

一是驾驶人对异地路况不熟悉。驾驶人异地行车，对异地的线路走向、坡道、桥梁、弯道、公路边的河流、水库等情况均不熟悉。对公路交通流量情况，规律及气候等自然地理环境又不太适应，因而对不同的道路状况，在控制车速、转向、会车和应急等处理方面，往往不容易做得很恰当，而埋下安全隐患。

二是疲劳驾驶。一般而言，异地车辆大多是长途车，因而，也往往造成驾驶人的疲劳行车。驾驶人异地行车，对当地的道路和交通环境状况不熟悉，加上长途驾驶，因而要付出比别的驾驶人更多的注意力，形成更紧张状态，加之远离亲友，长距离，长时间或夜间行车，很容易造成驾驶人生理、心理上的不适和心力疲惫，往往出现精神不集中和疲劳开车等情况。因此驾驶人从头到脚，从感知思维到情绪变化，都处于一定的紧张状态，长时间驾车更要消耗很大的精力与体力，这就难免踏入疲劳驾驶的雷区。由于疲劳驾驶不容易被人引起重视的特点，往往会使驾驶人对此产生麻痹心理，而一旦发生危害后果就不堪设想。

三是气候因素。中国地大物博，广袤无垠，不同地方的道路、交通、天气等状况千差万别，一些驾驶人在异地行车时，对公路上突然出现的飞沙走石、大雨、大雾、大雪、路面变化等情况，没有太多应变经验，往往措手不及或应对措施不当，从而引发事故。

二、预防和减少异地车辆“惹祸”的对策 一是提高道路安全运行条件，完善交通标志、标线等道路安全设施，确保行车安全。公路、公安交通管理部门要积极而努力地完善辖区公路和城市街道各种标志、标线、标牌等交通安全设施。这是安全行车的基本保障。强化危险道路和事故多发点段的排查、整治工作，切实提高道路安全行车条件。做到交通标志标线设臵明显齐全，科学合理，醒目得体，使异地驾驶人循着标志、标线安全经过各地辖区顺利到达目的地。

二是加强路面巡逻监控，增强科学的可防性能力。要加大路面巡逻监控力度，切实做好辖区主干道，重要公路以及危险路段、事故多发路段的排查、整治。切实让警力下沉保畅通，有效管控和纠正路面动态交通违法行为，确保行车安全。此外，还要加大对道路交通安全设施的投入，增强科学预防客运交通事故的能力。

三是加大宣传力度，营造良好舆论氛围。要在国道、省道主干线沿途加强交通安全丰富多彩的社会化宣传，开展形式多样的专题宣传活动，调动社会各方面力量，让交通参与者在参与各类专题活动中进行社会宣传教育和自我教育。要加强对交通设施作用与意义的宣传。在实际行车中，有少数交通标志、标线仍不为所有驾驶人所重视、接受，如对警告标志注意不够，禁令标志中禁止或限制的部分内容遵守不够，辅助标志的内容不注意观察，还没有完全明白交通标线的含义等。

四是增加指示诱导行人和非机动车通行的设施，进一步强化非机动车和行人的管理。当前，行人违反交通安全法律、法规的问题较为突出，因行人违法而造成的交通事故明显上升。费县大队针对这种现象，在完善行人交通设施的同时，强化勤务管理模式，采取点、线、面相结合的模式做到高峰定点，低峰巡线。严格按照责任段分段分片，包干到人，明确管理目标，对影响城区道路交通秩序的突出交通违法行为加大整治力度，从严查纠行人乱穿马路、过街闯信号、不走人行横道或天桥、翻越隔离护栏等违法现象，并在城区主要路段轮流进行整治，规范了城区主要干道的交通秩序，有效净化了城区道路交通环境。

第四篇：PCR技术在临床检验中的应用

PCR技术在临床检验中的应用

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医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。PCR法检测乙肝的优势表现在：①早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。②对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。梅毒是由梅毒螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，梅毒螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺体其取样方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型民时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找共同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。

我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及生物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞中观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种，1969年Hubner根据Rous(1911)的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后来又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的细胞基因表达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称之为原癌基因（Proto Oncogene）。为了与病毒癌基因区分，分别用V-Onc及C-Onc基因来代表。目前了解较多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理有：①点突变，受到射线、化学因素、生物因素的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很大的区别。②获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。③基因易位，内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化。④原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因子受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤相关的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因较复杂，作用机理不太清楚。癌基因检测中常用的分子生物学技术有：杂交、DNA分子克隆、PCR扩增及序列分析。PCR扩增简便、快捷有较强的实用性，甚至可从病人体液样本中检测活化的癌基因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。Ras基因是1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分离出来取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性称C-H-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，从神经母细胞中又发现了N-ras基因。Ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤时点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用PCR扩增样本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。P53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53KD分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年Cane发现了P53蛋白Eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。P53突变后其产物突变蛋白稳定性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。PCR-RELP、PCR-SSCP则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在SSCP分析中，单链DNA因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改变，从布将变异的DNA与正常DNA区分开，统计表明100-300bp分子大小的ssDNA突变检出率可达97％，300-450bp标出率可达69％，因此大于400bp的片段多态性应采用其它方法检测。

遗传病是由于遗传基础异常而引起的疾病，人类遗传病约有3000多种，患者占总人口数的10％。遗传病大概可分为单基因、多基因及染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查（特别是显带法）、生物化分析等。随分子生物学发展，基因诊断愈来愈表现出其优越性，PCR技术是基因诊断的主要技术之一，为快速、准确地检测人类遗传病开辟了一个新的途径，预计与遗传相关的疾病的检测有80％将在3-5年内被PCR法所取代。PCR在遗传病诊断应用中，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的有PCR法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性X综合症及性别鉴定等。地中海贫血（Thalassmia）是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地中海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短臂上，a珠蛋白基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66％，贵州、四川等地高发可达2.2％。应用PCR技术可以直接检测突变的基因诊断此病。苯丙酮尿症（Phenylketouria,PKU）是一种常染色体隐性遗传病。病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化为酷氨酸血症，出现脑组织损伤，智力障碍。此病患者出生时正常，出生后一经确诊立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食治疗8-10年不致影响患者智力，但低苯丙氨酸饮食代价之昂贵是一般家庭所不能承受的，关键在于避免患儿出生。因此本病的早期诊断有极其重要的意义。PCR结合斑点杂交能有效诊断PKU。遗传性疾病的基因变化很复杂，单基因固定位点变异布致病的情况很少，因此基因诊断过程中往往需要PCR技术与限制性内切酶、斑点杂交、聚丙烯酰胺胶电泳图谱分析及扩增产物序列分析结合，作综合判断。

优生学包括基础优生学、社会优生学、临床优生学及环境优生学。孕期检查及产前诊断是临床优生学的最重要内容之一。孕期检查除一般项目外还能及时了解孕妇是患有某些对胎儿发育有严重影响的疾病如风疹病毒感染、沙眼衣原体、解脲支原体、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、弓体感染等，及时发现及时治疗并采取有效措施预防发展成为宫内感染。PCR技术对这些病原体的检测简便而确实，另外利用PCR技术可以对地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症、脆性X综合症等遗传性疾病进行宫内诊断。可见PCR在优生优育方面有很高的应用价值。

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。由于VNTR在等位基因中的多态性便构成了遗传标记。使用PCR技术对其进行扩增结合对扩增产物凝胶电泳图谱分析即可进行个人识别及亲子鉴定。由2-6核苷组成的重复串联序列称为微卫星。在人类基因组中，微卫星更加丰富。微卫星的重复序列比VNTR短，扩增分型简便，易于自动化，在VNTR或微卫星不仅重复片段的数量不同而且重复片段的核苷酸也具有多态性。在VNTR或微卫星多态性分析时，如再结合碱基配对分析可以藜得更大量的信息，这一种更有希望的标志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理论上其对嫌疑人的排除率为99.999％。PCR技术可以完成替代早期的Southern印迹法进行多态性分析而且操作简便，敏感性及准确性都有大幅度的提高。当然PCR技术在法医中的应用仍在起步阶段有许多技术问题等待解决，如样本中的抑制剂、检村中DNA的损报告伤、PCR扩增污染等。想念随着PCR技术的不断完善它将在法医学领域中有更加广泛的应用。

第五篇：分子生物学在微生物检验中的应用(精)

分子生物学在微生物检验中的应用

南京军区福州总医院全军临床检验研究所

兰小鹏 世纪是以分子生物学为代表的生命科学的时代，近年来,随着现代生物技术的快速发展,人类基因组计划的完成,尤其是生物化学、免疫学、生物仪器及计算机理论与技术的进步，分子生物学技术在医学、遗传学、法医学、生物学等各个领域广泛应用, 新的诊断技术和方法不断涌现并被广泛应用于微生物检测，为传染病的流行病学调查、基因的多样性、微生物的生物学特性、微生物的致病性和药物的耐受性、微生物的生物降解能力等各个方面提供了重要的信息。一．核酸杂交法

最初应用于微生物检测的分子生物学技术是基因探针方法,它是用带有同位素标记或非同位素标记的DNA 或RNA 片段来检测样本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸杂交有原位杂交、打点杂交、斑点杂交、Sorthern杂交、Northern杂交等,核酸分子探针又可根据它们的来源和性质分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等。其原理是通过标记根据病原体核酸片段制备的探针与病原体核酸片段杂交,观察是否产生特异的杂交信号。核酸探针技术具有特异性好、敏感性高、诊断速度快、操作较为简便等特点。目前,已建立了多种病原体的核酸杂交检测方法,尤其是近年来发展起来的荧光原位杂交技术(FISH)更为常用。二．质粒DNA图谱分型技术

细菌质粒分析是较早被使用的对病原微生物流行病学进行调查的分子分型技术。这种技术包括萃取质粒DNA ,通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA。由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同,通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也将不同,因此,与流行病相关的分离株能够被分类分型。质粒图谱分析的再现性和分辨力可通过限制性内切酶消化质粒而提高。虽然2个不相关质粒有相同的分子量, 但性内切酶位点的位置和频率是不同的。但质粒是可移动的非染色体遗传物质,细菌能自发的失去或很容易的获得,结果流行病相关的菌株可以展示不同质粒指纹图谱。许多质粒带有抗性决定因子的基因,存在于转位子上,而转位子很容易丢失或获得,这同样可以迅速改变质粒DNA组成。产生图谱的再现性也会由于质粒空间存在的不一致性(超螺旋的、断口的和线形的)而被影响,而凝胶电泳时具有不同迁移速度。大多数病原微生物有质粒,但没有质粒的就不能用此技术分型。此外,由于有些分离株中含有1个或2个质粒,会使菌株间的分辨力降低。三染色体DNA 限制性内切酶分析技术

染色体DNA经限制性核酸内切酶消化,消化后的片段再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。用限制性内切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因组DNA可以产生大量短的片段。电泳后,将获得一系列被分离的DNA图谱。通过比较图谱,就可以进行菌相似性研究。几乎所有的病原微生物分离株都可以通过这种方法分型,但由于基因组DNA巨大,酶切后产生的片段众多,且含有大量的重叠片段,这将导致菌株间图谱一致性分析产生困难。但若细菌只含一个或少量核糖体操纵子, 则只产生1～ 2条带, 这限制区分密切相关菌株的能力。RFLP分析分辨力低于脉冲场凝胶电泳分型技术（PFGE）, 且比较复杂图谱(数百条带)的难度较大。四．DNA 的脉冲场凝胶电泳分型技术

脉冲场凝胶电泳分型技术（PFGE）是使用对染色体有很少酶切位点的限制性核酸内切酶消化细菌DNA ,产生大的DNA片段(10～800 kb),这些大片段不能通过常规电泳方法进行有效分离。在电场方向周期改变(脉冲)的凝胶电泳条件下,DNA片段根据大小有效分离。PFGE产生的染色体DNA图谱比用那些高频率切割的限制性内切酶产生的图谱更为简单清晰。理论上,所有的细菌都能使用PFGE 进行分型分类,结果具有极高的再现性和分辨率, 常作为分子生物学分型方法的“金标准”使用。PFGE 也有一些局限,例如所需时间长,使用的试剂非常昂贵,要求专门的仪器等。另外,很小的电泳条件的不同就可以改变每条光谱带间距离,使用不同凝胶进行电泳得到的结果也比较复杂,这为不同实验室间的结果比较带来一定麻烦。五．聚合酶链反应技术

聚合酶链反应(PCR)技术自1985年发明以来,因其高度灵敏性和良好的特异性受到了人们的高度重视,各种各样以PCR 为基础的DNA序列的扩增和检测方法得到了迅猛发展,几乎已应用于基础研究的各个领域。各种衍生技术如反转录PCR(RTR)、多重PCR、巢式PCR、PCR单链构象多态性(PCRSSCP)、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增的多态性DNA 技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep-PCR)、荧光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于临床感染性疾病的诊断,又可用于监测其疗效，PCR及其衍生的技术近年来在病原微生物分型研究上得到了广泛应用。

1.随机扩增的多态性DNA 技术

随机扩增的多态性DNA 技术（RAPD）是一种典型PCR衍生技术, 在低复性温度下用短任意序列引物(10～15m ers)扩增有密切同源性的基因组DNA序列, 模板上任意引物杂交点的数目和位置因种的不同株而异, 理论上特定株形成特定图谱。基因组在这些杂交区段如发生了DNA片段缺失、插入或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化。通过电泳对扩增产物DNA片段的多态性进行检测、分析就可以反应出不同菌株基因组的DNA特点,从而对他们进行分型，RAPD是目前最简单的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于Rep－PCR，RAPD技术的使用范围也非常广,分辨结果也有较好的实验室再现性。虽然RAPD技术简单、快速, 但由于其对引物和DNA浓度、DNA模板质量、凝胶电泳和DNA聚合酶类型的变化高度敏感, 故RAPD的重复性不够理想。虽然RAPD的分型结果在不同实验室间变化较大,分辨力不如PFGE技术,但在疾病暴发流行时,PAPD仍是一种分析相关菌株和排除不相关菌株的良好技术。2.重复序列PCR技术

重复序列PCR技术（Rep－PCR是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物靶序列,进行PCR扩增,通过对PCR产物电泳结果的比较,分析菌株间基因组存在的差异。这些重复序列在原核生物界广泛存在,在一些细菌属和种中是保守的。在这种方式获得的图谱中,光谱带的大小和数量的不同代表着不同菌株重复序列间的距离和重复序列的数量。已成功地用于分型的细菌重复DNA序列有肠道菌重复基因间共有(ERIC)序列、重复基因外回纹序列(REP)和BOX序列的分析，与其他分类技术相比,这种技术有更高的分辨力。研究表明,虽然有时Rep-PCR分辨力稍低,但与PFGE获得的结果却有很好的相关性。3.免疫PCR 免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR)是1992 年Sano 等建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合在一起,它的基本原理是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应, 用PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子,电泳定性,根据特异性PCR产物的有无,来判断待测抗原是否存在。目前,国内外报道的免疫PCR的敏感性一般比现行的ELISA 法高102 ～105 倍。由于PCR产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比,因此免疫PCR 还可用于抗原的半定量试验。

PCR－ELISA是PCR与ELISA技术结合的检测方法，其综合了PCR、分子杂交和ELISA三种技术的优点，主要用于检测样品中的特定基因。它引入地高辛(或生物素)标记的dNTP或引物进行PCR扩增,利用酶标抗地高辛抗体(或酶标记亲和素)进行ELISA检测,代替了用于常规PCR产物检测的电泳方法,方便快捷,易于处理大量样品,且其灵敏度比使用琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍,当有适当的标准品时,还可进行定量测定。六．DNA 序列测定

与检测全染色体的PFGE、Rep－PCR和RAPD分析相比,DNA测序只检测细菌或真菌株间潜在变化序列的很小一部分。用于辨别菌株的被测序DNA区域必须满足以下条件:DNA区的结构必须是可变序列，两侧为高度保守区;DNA序列的可变性必须能足以区分特定种的不同株;DNA序列不能水平转移到其它株。对细菌和真菌, 极少序列满足这些条件。相反,DNA测序被认为是病毒分型的 “金标准”。DNA测序费用高、需要很高的技术条件, 而且自动化DNA 测序仪十分昂贵。

七．基于16SrRNA的检测技术

自Woese 等于1987年首次运用rRNA分析以来,rRNA数据库快速扩大起来,成为研究细菌多样性、进化、系统发育中被广泛采用的序列。16SrRNA存在于所有原核生物细胞中,它们相对稳定且有较高的拷贝数(每个细胞几千个拷贝),其序列中含可变区及高度保守区,因此可设计群、属、种特异性的探针。现阶段各种常见细菌的16SrRNA基因几乎全部测序完成,16S rRNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列,逐渐成为细菌鉴定、分类的“金标准”。目前, 16SrRNA 检测技术已在医学界得到广泛应用,可以用现有病原菌标准菌株制作DGGE(变性梯度凝胶电泳)标准marker , 然后对疑似“病原菌”扩增16SrRNA进行DGGE分析,这样可以做到快速检测。八．生物芯片

生物芯片技术是将生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵,当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后,利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析。微生物检测基因芯片是指用来检测样品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的特点,微生物检测基因芯片在微生物病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用。目前,许多细菌、病毒等病原体的基因组测序已经完成,将许多代表各种微生物的特殊基因制成1张芯片,经反转录就可检测样本中有无病原体基因的表达及表达水平,由此判断病人感染病原、感染进程以及宿主反应等。这样就大大提高了检测效率。基因芯片诊断病原菌的原理基于细菌的16SrRNA基因的高度保守性,由于RNA易于降解,因此多采用检测16SrRNA 所对应染色体上的16SrDNA序列。对16SrDNA而言,如果出现3 个碱基以上的差异就可以断定细菌不属于同一种属,因此可用于细菌的分类和鉴别。对病毒和耐药性病原菌的检测是通过将待测的特定基因(病毒特异性基因和耐药基因)经体外转录、PCR、逆转录、末端标记等处理成标记有荧光分子的核酸分子,然后与芯片上的探针进行杂交,用计算机对杂交信号进行处理,依信号和强度即可得出核酸含量。

液态芯片（Suspension Array Technology，SAT），又称微球蛋白芯片（Protein Bead arrays，PBA），是近年来出现的一种新的芯片技术，也是唯一被美国食品和药品监督管理局（FDA）批准的用于临床诊断的生物芯片。其原理是用两种荧光染料按照不同比例将直径为5.6um的微球（beads/microfluorospheres）染成100种染色，每种颜色的微球共价结合一种生物探针，可以是抗原、抗体、配体，也可以是核酸或酶，分别针对一种待检物。混合载有100种不同颜色的微球，就可以在一个反应孔里同时完成100种不同的生物反应。随后微球成单列通过两束激光照射的管道，计算机采集并处理每种颜色微球的荧光强度变化就可以分别对每个待测物进行定性或定量的检测，该系统可用于多种微生物抗原、抗体和特定基因的联合检测，与固态芯片相比，液态芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优越性，因此不少学者看好液态芯片的应用前景。九．生物传感器

生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断技术相结合而成的一种新技术,是现代临床检验诊断发展的一个新方向。由于生物传感器检测准确、操作简便等特点,近年来已经在许多领域取得了很大的进展,在生物分子相互作用、药物筛选、临床诊断、食物检测等领域获得了广泛的应用，其中临床中用于病原体检测的以DNA生物传感器最为常见。尽管生物传感器作为一种新的传感元件近年来得到了很大的发展,许多光化学、电化学以及压电晶体都相继在生物传感器中得到应用。与常规的核酸和蛋白质检测相比,具有检测准确、操作简单等特点,但由于它存在灵敏度不够、容易受杂质干扰等缺点,随着研究的进一步深化和技术方法的改进,这些问题将会得到解决。

十.蛋白质指纹图谱技术 蛋白质指纹图谱技术是随着蛋白质组学兴起的一种新技术，其中表面增强激光解吸电离飞行时间质谱蛋白芯片技术(SELDI-TOF-MS，下称SELDI-TOF-MS)是由T.William Hutchens 和 Tai-Tung Yip等科学家在上世纪90年代早期所创立的一种蛋白指纹图谱分析技术，并获得了2002年诺贝尔化学奖，为研究蛋白质的结构、属性、功能提供了高效而可靠的技术平台。其原理是利用各种方法（共价键、电荷等）将蛋白“富集”到芯片表面，在激光的轰击下，蛋白解吸附并电离成带电粒子，并在电场作用下飞行，其飞行单位距离的时间取决于其所带电荷数量和其分子量之比（质荷比），从而达到分离和分析蛋白质的目的。该技术是目前最有前途的比较蛋白质组分析方法，为蛋白质组学研究提供了一个利器，具有独特的优势和能力：可直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析、可同时快速发现多个生物标记物、具有高通量的验证能力、能发现低丰度蛋白质（灵敏度高达fmol/ml），与“双相电泳加飞行质谱”相比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白质，可在同一系统中集发现和检测为一体，SELDI在微生物检验方面将发挥重要的作用。十一.适体技术

1990年,Tuerk和Gold[1]分别独立研制了一种新型的体外筛选技术,即指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX),用于研究小分子核酸与靶物质相结合的部位、序列及空间构像。适体（aptamer），又称适配分子或适配子，实质是运用SELEX技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。

由于适体分子可用酶、放射性核素、荧光物质及生物素等标记以作为检测分子，它协同传统的单克隆抗体在流式细胞技术、生物传感器、荧光偏振、分子灯塔和毛细管电泳等检测技术上得到了广泛的运用。

适体与抗体相比，具有针对靶分子的范围广、亲和力和特异性高、性能稳定、便于修饰等诸多优点。利用针对微生物的特定蛋白和基因的适体对微生物进行鉴定和分型以及耐药基因的检测方面，适体将具有良好的前景，有的学者认为，未来适体有可能取代抗体。

十二.结语

长期以来,人们试图找到一种既简便又快速、又有足够分辨力的技术来鉴别和区分各种病原微生物，各种新方法和新技术不断涌现，但每一种方法都有其局限性，为了弥补各自的不足，使用一种以上的技术即采用多种方法联合使用的策略,一种技术的缺点会被其他技术的优点所代替。选择检测方法应考虑到自身所拥有的条件,检测所要求达到的灵敏度,而提高灵敏度和去除假阳性是检测方法发展的趋势。近年来,随着计算机技术的不断发展,临床病原菌检测将向着简便、快速、高通量、自动化的方向发展。分子生物学技术通过自动化仪器的使用,将在病原菌诊断、鉴定和耐药基因检测方面越来越广泛地应用于临床。