PCR实验检测标准操作规范

第一篇：PCR实验检测标准操作规范

PCR检测实验室操作规范

一、PCR 实验室的设置及管理

1．目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。2．适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。3．负责人： 4．细则：

4．1流感实验室为急传所的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。4．2 本实验室采用实时荧光定量（定性）PCR 技术作为病毒基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。标本的接收则在检验科标本接收处进行。

4．3 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。4．4 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP 文件。

4．5 严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。

4．6 非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。4．7 实验完毕后做好清洁消毒工作。

二、PCR 实验室工作制度

1．目的 ：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。

2．适用范围：所有本实验室人员。3．负责人： 4．细则： 4．1 本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。4．2 各区的用品不得混用。

4．3 在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。4．4 试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP 文件）。

4．5 标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA 的合成（见相关SOP 文件）。

4．6 扩增分析区只能进行DNA 或cDNA 的扩增、实时荧光PCR 扩增产物的分析（见相关SOP 文件）。

4．7 进行实验时严格执行本实验室的各项操作规程，及时做好各种操作记录，力求准确、可靠。实验完毕，做好清洁、整理及分析统计等工作。

4．8 室内仪器由专人负责，未经许可，不得随意使用或挪用；爱护使用仪器，定期进行保养与维修。

4．9 爱护科室财产，注意安全；离开实验室前应关好门窗，检查水、电等。

三、PCR 实验室内务管理制度

1．目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。2．适用范围：实验室相关人员及相关清洁工人。3．负责人： 4．细则：

4．1 非本室工作人员未经允许不得进入实验室。4．2 各区的用品不得混用。

4．3 实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。

4．4 进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。

4．5 所有仪器（如PCR 扩增仪）须有专人负责，并有使用维护记录；实验人员必须熟悉仪器性能后方允许操作，并严格遵守操作规程。

4．6 所有试剂进购、配制、质检、使用均要有记录，未经允许不得随意带出本实验室。4．7 每天了解仪器运转情况及试剂使用情况，确保仪器整洁安全，试剂合格使用。4．8 各区的各种清洁消毒均应有记录，工作衣消毒时注意各区应分开进行处理。4．9 注意保持实验室卫生整洁，严禁在室内抽烟、吃零食，非实验操作人员应尽量少入。4.10下班前检查门、窗、水、电，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备。

四、PCR 实验室人员的配置及管理

1．目的：保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验能力的实验人员。2．适用范围：适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。3．负责人： 4．细则： 4．1 人员要求

4．1．1 本实验室工作人员应为医学检验专业或相关专业毕业，具有中级以上技术职称或专科以上学历。

4．1．2 实验室工作人员应参加卫生部或省临检中心举办的PCR 技术培训，并取得合格证。4．1．3 对于新进入本室的人员，如尚未取得PCR 技术培训合格证，应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作，实验报告由有资格人员出具，并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。4．2 人员配置

4．2．1 实验室应根据工作需要配备足够的工作人员。4．2．2 各级技术人员履行相应的工作职责。4．3 人员培训及考核

4．3．1 实验室负责人或负责人指定人员参加每年卫生部PCR 室间质评总结会。

4．3．2 实验室工作人员每1～2 年至少参加1 次PCR 技术的省级或国家级继续教育项目，参加相关学术交流会议。

4．3．3 安排未取得上岗培训合格证的工作人员在合适的时间内参加技术培训。

4．3．4 科室不定期组织实验室内部实验人员学习、更新核酸扩增方面的相关知识，提升自身的理论学习水平。特别是在标本接收区采血、接收标本的人员，需定期对其进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。一些科室的送检标本由该科室的人员送到标本接收区，对这些临床医护人员也要定期进行有关核酸扩增技术，标本采集、保存、运输等知识的培训。

4．3．5 本实验室工作人员每年进行考核一次,考核内容: a)日常工作质量 b)室内质控测评 c)室间质控测评 d)在抱怨处理中的表现

4．3．6 本实验室工作人员实行严格奖惩制度,有下列表现者可受奖: a)工作质量高, 质控测评成绩优秀者

b)有科研能力,并有一定数量和质量的论文发表 c)有独创性工作成果,经鉴定认可者 d)受到有关部门或群众嘉奖者 有下列情况者将受到惩处: a)工作质量问题较多，质控测评成绩不合格； b)不遵守规章制度并造成一定影响； c)不求上进。

4．3．7 本实验室工作人员奖惩方法分精神及物质两类,经实验室上报及有关部门批准后执行。

4．3．8 本实验室工作人员均建立业绩档案,实行能进能出制度,不断吸收高质量人员,加强培训和提高,对于不适合本室工作的人员要及时调离。4．4 人员管理

4．4．1 实验室建立所有工作人员的技术档案，包括：学历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关材料复印件。

4．4．2 技术档案分文本档案和电子档案，文本档案每年更新1 次，电子档案随时更新。

五、PCR 实验室清洁程序

1．目的：保证实验室环境的整洁，防止污染。

2．适用范围：适于实验室工作环境、实验台面、工作服、移液器等的清洁消毒工作。3．负责人： 操作人： 4．细则：

4．1 实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。

4．2 合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常用的物品要容易寻找到。

4．3 抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。4．4 实验结束后用2%戊二醛对台面进行清洁，并用移动紫外灯进行消毒。

4．5 每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。每周1 次对移液器咀进行75%酒精浸泡15 分钟左右，若使用过程中发生污染应随时浸泡处理。

4．6 实验过程中如发生标本或试剂外溅，应立即用2%戊二醛滴上，滤纸盖上半小时，然后用酒精擦洗，并用移动紫外灯消毒。

4．7 每天实验前开启各区的通风系统，各区实验结束后，分别打开传递窗紫外灯、移动紫外灯（对实验台面消毒）、天花板紫外灯消毒实验室，每次开启 30～60 分钟。4．8 待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。

4．9 依次清洁三个区的实验台面和地面，各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。4．10 处理好各区废弃物。

4．11 每周将工作服洗涤消毒，不同实验区的工作服隔开洗涤。

六、PCR 标本唯一标识编号规则

1．目的：保证标本编号的唯一性，也是准确发放报告的基础。

2．适用范围：使用核酸扩增荧光检测实验室所开展的病毒以及基因检测项目： 3．负责人： 操作人： 4．程序：

4．1 按检测日期分类标记

根据标本送检的日期，每天的标本对应标记一种唯一的代号。4．2 按检测类型分类标记

根据检测项目的不同，每种检测项目对应标记一种唯一的代号。4．3 按验单接收顺序编号

在同种检测类型的验单中，按验单顺序编号。4．4 特殊标本的编号

如有特殊情况，应在标记前面增加特异字母区别开。4．5 编号步骤 a）对当天送来的标本，根据编号的基本原则编号，每个样本的每个检测项目对应一个唯一的编号。

b）用笔在每张检验申请单和对应的样品管上作好相同的标记。

c）做好标本的接收记录，每个样本的记录都应包括以下信息：接收时间、医院、科室、送检医生、患者姓名、性别、年龄、标本类别、标本状态、送标本者、接收人、检验单号、标本唯一统编号等。

d）处理好样品、点样后，将反应管放入扩增仪上开始扩增。

f）扩增得到结果后，先在统计簿上填入结果，作好记录，再一一把实验结果填入相应申请单。

g）发放检验报告单。

七、PCR 基因扩增实验室的要求

1．目的：规定在各区内所进行的工作及其操作。2．适用范围：所有在本区内进行的工作。3．负责人： 操作人： 4．程序：

一、临床基因扩增检验实验室的设计

（一）临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。各区的功能是：

1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

2.标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。

3.扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。

4.扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。

（二）临床基因扩增检验实验室的空气流向。临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。

（三）工作区域仪器设备配置标准。

1.试剂储存和准备区。

（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。

（2）混匀器。

（3）微量加样器（覆盖0.2-1000µl）。

（4）可移动紫外灯（近工作台面）。

（5）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。

（6）专用工作服和工作鞋(套)。

（7）专用办公用品。

2.标本制备区。

（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。

（2）高速离心机。

（3）混匀器。

（4）水浴箱或加热模块。

（5）微量加样器（覆盖0.2-1000µl）。

（6）可移动紫外灯（近工作台面）。

（7）生物安全柜。

（8）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。

（9）专用工作服和工作鞋(套)。

（10）专用办公用品。

（11）如需处理大分子DNA，应当具有超声波水浴仪。

3.扩增区。

（1）核酸扩增仪。

（2）微量加样器（覆盖0.2-1000µl），（视情况定）。

（3）可移动紫外灯（近工作台面）。

（4）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。

（5）专用工作服和工作鞋。

（6）专用办公用品。

4.扩增产物分析区。

视检验方法不同而定，基本配置如下：

（1）微量加样器（覆盖0.2-1000µl）。

（2）可移动紫外灯（近工作台面）。

（3）消耗品：一次性手套、加样器吸头（带滤芯）。

（4）专用工作服和工作鞋。

（5）专用办公用品。

上述各区域仪器设备配备为基本配备，实验室应当根据自己使用的扩增检测技术或试剂的特点，对仪器设备进行必要的增减。

二、临床基因扩增检验实验室工作基本原则

(一)进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。

(二)各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。

(三)不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。

(四)实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

(五)工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。

(六)实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

三、临床基因扩增检验实验室各区域工作注意事项

(一)试剂储存和准备区。贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过扩增检测区，试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区，应当保存在标本处理区。

(二)标本制备区。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染，可通过在本区内设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。

(三)扩增区。为避免气溶胶所致的污染，应当尽量减少在本区内的走动。必须注意的是，所有经过检测的反应管不得在此区域打开。

(四)扩增产物分析区。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）、直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法、质谱分析等。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1 mol/L HCl中，并且不能在实验室内倾倒，而应当至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。

由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应当注意实验人员的安全防护。

八、PCR 废弃物的处理程序

1．目的：保证实验室、实验人员和外部环境的安全。

2．适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用化学试剂（NaOH、EDTA、乙醇、生理盐水等）、实验室废弃物的处理； 3．负责人： 操作人： 4．细则：

4.1 科室职责应对本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传播途径中的重 要性，并要求严格执行。

4.2 实验室所有垃圾，装入专用污物袋内，各区备有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾 袋（黄色）。使用过的一次性消耗品(如试管、吸头、离心管、等)，先放入10%次氯酸钠溶 液中浸泡2～4 小时后，再放入黄色垃圾袋内，使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋 内集中处理。

4.3 夹取标本的工具，如钳、镊、接种环、吸管等，用后均应消毒清洁，进行微生物检验时，应重新灭菌，金属工具可烧灼灭菌或消毒液浸泡；玻璃制品干热或压力蒸汽灭菌。4.4 一次性塑料痰盂，用2%戊二醛液浸泡2～4小时后，放入黄色垃圾袋内集中处理。4.5 废弃标本如血、尿、胸水、腹水、脑脊液、唾液、胃液、肠液、关节腔液等用10%的84 液浸泡2～4小时后，集中处理。

4.6 盛标本的容器，若为一次性使用的纸质容器及其外面包被的废纸，放入污物袋里 处理；对可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15 分钟或加入10%次氯酸钠溶液浸泡2～4 小时，消毒液每日更换，消毒后用洗涤剂及流水刷洗，沥干，用于微生物培养采样者，用压力蒸汽灭菌后备用。

4.7 废弃标本及其容器装入黄色垃圾袋内、封闭，污物处理中心处理。

九、基因扩增检测实验及结果分析

1、目的：保证扩增及结果分析的标准化、规范化。2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。3．负责人： 操作人：

4、标准程序：

4.2.8 发放报告：及时登记检测结果记录，发放临床报告。

4.3 实验结果无效的判断标准：出现下述四种情况中的任何一种或多种，当次实验结果不可 发，查找原因，重做实验。4.3.1 阴性对照出现扩增。4.3.2 阳性对照无扩增。

4.3.3 大批甚至所有的标本都扩增了。4.3.4 室内质控血清检测结果出现失控情况，实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程 序。

4.4 实验结果有效的判断标准：达到下列要求后，当次实验有效，可以发放结果。4.4.1 阴性对照没有扩增，阳性对照扩增。

4.4.2 阳性标准品梯度曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内。4.4.3 室内质控血清检测结果处于在控状态，具体标准详见

十、临床标本的保存操作程序

1．目的：临床标本正确保存，以便必要时复查。2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。3．负责人： 操作人： 4．程序：

4．1 处理前的标本保存

a）全血标本可4℃下短期（24h 内）保存，长期保存则需分离出血清（血浆），保存于-20℃下。

b）咽拭子、痰或胸腹水、脑脊液、脓液标本短保存于-70℃下。4．2 报告发出后的标本保存：

a）提取的核酸标本当天检测可置4℃保存，如当天不检测应置-20℃保存。报告发出后第二天丢弃。

b）原始血清/血浆样本在报告发出后放入低温冰箱-20℃保存1 个星期，以备复查。超过1 个星期保存期的标本由室负责人酌情处理，一般按生物传染性物品统一处理。

c）血清/血浆标本放置低温冰箱保存时须有记录，按编号顺序存放，并由专人负责管理。4．3 特殊标本的处理：

对暂不检测的项目和规定时间外收到的零散样本，要随时登记和交班，以免漏检，遗失和延误检验。对特殊样本或特殊病人的样本，实行“首接”负责制，所谓特殊样本是指难于采集的样本，以及特殊病人的样本一律实行“首接”负责制，无论那位工作人员，一旦收到样本后，均须负其责任，不得以任何借口推托，及时和正确保管和转送样本到有关实验室或有关人员，同时作交班记录和双签名。

十一、临床标本的采集、运送、接收程序

1．目的：规范临床待检标本的正确采集、送检和处理。2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。3．负责人： 操作人： 4．程序： 4．1 标本的采集

4．1．1 标本由临床各科室接受过临床基因扩增检测有关标本采集、保存、运输知识培训的医护人员采集并送至实验室。4．1．2 标本采集要求

a）血液标本：用2ml 真空采集管或1.5ml 高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2 小时内送达实验室。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml 的离心管中，编号。

b）痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送检。（对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl 水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。）标本在室温下保存不能超过24 小时。4．2 标本的运送

标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽可能快的送至检测实验室，如运送时间需2 小时以上，必须用冰盒送至实验室。4．5 接收

4．5．1 严格对各类样本的查对和双签制度，对病房各样本及时进行验收，查对，不符合要求的样本一律退回，并有书面记录。

十二、PCR 生物安全防护措施

1．目的：预防工作人员在实验过程中被感染或污染。2．适用范围：适用于本室所有工作人员。3．负责人： 操作人： 4．细则： 4．1 实验人员在实施生物防护措施时，应严格遵守各项相应的规章制度，建立起强烈的生物防护意识。

4．2 每天更换废液缸的2%戊二醛溶液，并保证2%戊二醛溶液用量为废液缸内总液量的五分之一左右。

配置消毒液时，正确量取足量的消毒剂（用量杯，保证浓度），水的用量也要正确，缸体密封性良好。

4．3 实验台面日常清洁时使用75%的酒精擦拭。

4．4 每区每次实验后紫外灯照射30～60 分钟，如有需要可延长照射时间。

4．5 所有来自病人的血液或体液标本均应视作传染源，因此在标本的采集、运输过程中，标本容器应完好无泄漏。

4．6 处理标本时应穿工作服、戴手套，以免沾上皮肤。如手或其它部位的皮肤沾上血液或体液标本以及试剂，应立即冲洗干净。有下列情况之一者，需另外消毒：手接触有传染性的微生物，水龙头、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量细菌污染。消毒剂可用“84”消毒液。4．7 在实验过程中，病人标本（血液、体液）或试剂不慎溅入眼内应立即用清水洗。4．8 实验过程中在使用针具等锐器时，尽量小心防止受伤。若被锐器刺破时，应立即脱下手套，尽量挤压伤处，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要时进行预防补救措施。4．9 在实验过程中病人标本（血液、体液）外漏时，应立即用2%戊二醛滴上，滤纸或纱布盖上半小时，然后用酒精擦洗，并用紫外灯消毒。

4．10 实验完毕离开时，应脱下所有该实验区个人防护装备。4．11 实验完毕后应对实验室进行紫外消毒。

4．12 遇有意外事故应立即报告科室负责人，当事人应立即注射相关疫苗或进行预防性治疗，并进行医学观察，严重者应报告技术负责人。

十三、PCR 实验室化学试剂配制程序

1．目的：保证实验中用到的各种溶液符合实验要求。

2．适用范围：核酸扩增荧光检测实验室常用溶液：4%NaOH 溶液、75%酒精、消毒剂（三氯异氰尿酸或 二氯异氰尿酸钠）、2%戊二醛溶液等。3．负责人： 操作人： 4．程序： 4．4 化学试剂的配制：

4．4．1 用具：干燥洁净的250ml 量桶一只，1000ml 量桶一只，1000ml 烧杯一只，三角烧瓶两只，天平一架，100ml 塑料试剂瓶、2000ml 广口瓶各一只。4．4．2 配制步骤：

4．4．2．1 配制4%NaOH 溶液: a）用天平称取4 克分析纯的NaOH 固体，置于一只三角烧瓶中。

b）用250ml 量桶准确取100ml 水，缓缓注入盛放NaOH 固体的三角烧瓶中。c）摇荡三角烧瓶使NaOH 固体充分溶解。

d）然后缓缓倾倒入100ml 塑料试剂瓶中密封保存备用。4．4．2．2 配制消毒剂: a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯达到500mg/L，即可达到消毒作用。

b）消毒剂为粉状（20 克/袋），如配制一升的消毒剂溶液，则取500g，倒入烧杯中，缓缓加入1000ml水充分溶解，备用。

c）如需加大消毒力度，则有效氯浓度加大。4．4．2．3 配制2%戊二醛溶液: a）准确量取戊二醛原液20ml 倒入1000ml 烧杯中。

b）量取980ml 水，缓缓倒入1000ml 烧杯中，混匀，加至2000ml 广口瓶中备用。注意事项：每份配制好的溶液保质期为14 天

十四、PCR 应急处理程序

1．目的：在实际工作中，仪器设备发生故障、试剂盒发生质量问题时，为保证检验结果的准确性、及时，应正确采取应急措施，最大程度上避免或减轻不利影响。

2．适用范围：适用于满足核酸扩增荧光检测实验室检测需要并可能对检验结果造成误差的仪器设备和试剂盒。3．负责人： 4．细则： 4．1 核酸扩增荧光检测实验室工作人员在职责范围内均有责任熟悉各种仪器和相关设备的性能、要求、维护和保养、常见故障的排除、尤其要严格按照操作规程操作。

4．2 工作人员在职责范围内均有责任有意识地注意以求及时发现并报告仪器设备和试剂盒的异常情况。

4．3 作为应急处理，潜在着一定的可能影响检测质量的不确定因素。室负责人负责在第一时间检查核实应急措施的有效性。4．4 仪器设备故障

4．4．1 室负责人接到异常情况报警后，立即现场确认异常情况的性质：观察有误、误操作、偶发现象或确属不能立即排除的故障。

4．4．2 用红牌故障标志标示故障仪器，以防被错误使用。

4．4．3 有满足要求的替用设备的，启用替用设备（准用仪器）。借用其他部门仪器设备时，及时联系借用并核实该设备的使用状态。替用、借用或备用设备的使用在满足质量要求的同时，必须同时满足实验室管理措施（特别是防污染）的要求。

4．4．4 不能解决的问题，应及时与供应方会同解决。根据双方合同约定，及时通知供应方。供应方技术支持人员将在规定的时间内随身携带备用设备到达现场。

4．4．5 仪器维修后，必须经验收合格并供需双方签字，调试实验通过后才能重新启用。取下红色故障标示（暂停使用），换上蓝色正常标示（正常使用）。4．4．6 科室主任须检查并随时跟踪所采取措施的有效性。

4．4．7 对未能及时排除故障时，必须及时上报科室，在科主任批准下，应积极联系附近的其他已得到卫生部临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检验，以满足病人和临床或科研需求。

4．5 试剂盒质量发生问题，经核实后，及时通知供货商迅速更换另一批次试剂，使用前需先作质量检测，合格后方可使用。

4．6 仪器设备故障或试剂质量问题不能得到解决，预期将会影响到检测报告的及时发出，可将标本送至其它已得到卫生部临检中心认证的临床基因扩增检验实验室检。4．7 影响到检测报告发出的情况，应在应急处理记录表作记录。

十五、试剂的质检标准操作程序 1．目的：保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，符合要求。2．适用范围：各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂。3．负责人： 操作人： 4．程序：

4．1 收到试剂后，目测试剂是否处在冻存状态。

4．2 核对试剂品种和数量并检查包装：外包装（厂名厂址、、批准文号、批号和有效期等）；内包装（试剂瓶完整性、试剂配备品种完整性、使用说明书有否等）。4．3 及时将试剂转入－20℃冰箱保存。将上述检测核对情况在记录本上登记。

4．4 最迟在前批次试剂存量尚可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验。

4．5 效验实验：

4．5．1 要求设置：空白对照、阴性对照、阳性对照、室内质控各一，阳性标准品梯度（104、105、106、108）。

4．5．2 出现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测： a）空白对照出现扩增。如扩增曲线CT 值大于25，需重复实验确证试剂污染。

b）阳性对照和阳性标准品均未检出，或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。

4．5．3 阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。

4．5．4 空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。

4．5．5 阳性对照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT 值偏大5 个循环以上。提示阳性标准品存在问题。更换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。

4．5．6 空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出，阳性标准品导出的标准曲线之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相关性（﹤－0.99）均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入临床使用。4．6 将实验结果归入记录。

十六、离心机操作维护程序

1．目的：保证离心机的正常使用。

2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。3．负责人： 操作人： 4.性能参数:见说明书。5．程序：

5．1 离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使仪器处于水平位置以免离心时造成仪器振荡。

5．2 打开电源开关，将预先平衡好的样品对称放置于转头的样品架上，关闭机盖。5．3 旋动定时旋钮设定离心时间，缓慢旋转转速调节旋钮使仪器转速达到预定要求。5．4 离心完毕后，将转速调节旋钮调回零位，关闭电源开关。

5．5 待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，再次关闭机盖结束离心。5．6 离心室的清洁：为了避免样本等残留物的污染，应经常对离心机外壳和离心室进行清洁处理。对离心室清洁，应先打开离心机盖，拨掉电源线，用专用设备将离心机转子旋下，再用中性去污剂（70%的异丙醇/水混合物或乙醇去污染）清洁离心室；离心室内的橡胶密封圈经去污剂处理后，用水冲洗，再用甘油润滑。

5．7 转子的清洁：转子会被样本残留物污染，也可能会被某些化学试剂腐蚀，因此应对转子每月进行清洁维护。每月用中性的清洁剂清洁转子一次，并在仪器维护记录本上作好记录，以延长转子的寿命。6.仪器维护

(1)为确保安全和离心效果,仪器必须放置在坚固水平的台面上,塑料盖门上不得放置任何物品,样品必须对称放置,并在开机前确保已拧紧螺母。

(2)应经常检查转头及试验用的离心管是否有裂纹,老化等现象,如有须及时更换.(3)试验完毕后,需将仪器擦拭干净,以防腐蚀.(4)如样品比重超过1.2g/cm3,最高转速n 按下式计算:n=nmax*√--1.2/样吕比重.(5)当电机碳刷长度小于6mm 时,必须及时更换.(6)在离心机未停稳时不得开盖.(7)仪器必须有可靠接地.(8)实验结束后,请关闭后面的电源开关,拨掉电源插头时,请不要忘了打开后面的电源开关.(9)该仪器在日常使用中请注意符合“5.6,5.7”要求。(10)严格按照仪器的开关机程序关机。7.期间核查

(1)本仪器不需要特别的周期间隔。

(2)校准物均为与ICSH 之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

十七、冰箱操作维护规程

1．目的：对冰箱进行适当的维护，以确保冰箱的正常使用。2．适用范围：本实验室使用的各种品牌、型号的冰箱。3．负责人： 操作人： 4.性能参数:见说明书。5．程序：

4．1 开、关机：冰箱按说明书要求放好后，插上电源线，冷藏室温度开关置于4℃，冷冻室温度开关置于-20℃，2 小时后用温度计确认。系统进入正常运行状态后即可使用。4．2 外冰箱应放置于水平地面并留有一定的散热空间。外接电源电压必须匹配，并要求有良好的接地线。

4．3 冰箱内禁止存放与本实验室无关的物品。

4．4 放入冰箱内的所有试剂、样品、质控品等必须密封保存。

4．5 保持冰箱出水口通畅；非自动除霜冰箱应在每月底除霜；月底清洁冰箱，清洁时切断电源，用软布蘸水擦拭冰箱内外，必要时可用中性洗涤剂。4．6 每日观察冰箱内温度并记录于冰箱的质控图上。

4．7 若温度超出规定范围，调节温控使其回到正常范围，并进行记录。

4．8 若温控调节无效，报请设备科维修，修理后须验收合格并签字后方能正常使用。6.仪器维护

(1)使用注意。该仪器在日常使用中请注意符合“4.注意事项”要求

(2)废液瓶满要及时倒掉废液，切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气，防止低真空出现。

(3)当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。(4)严格按照仪器的关机程序关机。7.期间核查

(1 冰箱不需要特别的周期间隔。

(2)校准物均为与ICSH 之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

十八、生物安全柜操作维护规程

1．目的：正确使用生物安全柜。

2．适用范围：本SOP 适用于本实验室使用的生物安全柜。3．负责人： 操作人： 4.性能参数:见说明书。5．程序：

5．1 新安装或长期未使用的生物安全柜，使用前必须用超净真空吸尘器或不产生纤维的物品认真进行清洁工作。

5．2 接通电源，使用前应提前15～30 分钟同时开启紫外灯和风机组工作。

5．3 当需要调节风机风速时，用生物安全柜操作面板上的风速调节钮进行调节。风机、照明均由指示灯指示其工作状态。

5．4 工作台面上禁止存放不必要的物品，以保持工作区的洁净气流不受干扰。

5．5 禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免作明显扰动气流的动作；禁止在预过滤进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风量减少，降低净化能力。

5．6 使用结束后，用消毒液清理工作台面后打开紫外灯，15～30 分钟后关闭紫外灯，关闭生物安全柜电源。每次使用生物安全柜后，均需对其进行清洁。

5．7 根据环境洁净程度，定期将预过滤器中的滤料拆下清洗，一般间隔时间为3～6 个月。5．8 定期（一般每半年1 次）计测工作区风速，如发现不符合技术参数要求，则可调大风机供电电压。当风机组电压调到最大时，工作区风速仍达不到0.3m/s，则必须更换高效空气过滤器（由厂家或院仪器维修人员进行）。

4．9 有相应的维护记录，长期不使用的生物安全柜拨下电源插头。6.仪器维护

(1)使用注意。该仪器在日常使用中请注意符合“4.注意事项”要求(2)废液瓶满要及时倒掉废液，切勿强行扯动红黄两根管来打开瓶盖，检查废液瓶是否漏气，防止低真空出现。

(3)当出现堵孔时，按自动冲洗键冲洗管道。(4)严格按照仪器的关机程序关机。7.期间核查

(1)PE-5700 基因扩增仪的定标不需要特别的周期间隔，本实验室PE-5700 基因扩增仪执行卫生部临床检验中心的指定校准。

(2)校准物均为与ICSH 之标准相符合的校准物，测定值偏差均不超过其规定值。

十九、移液器操作维护规程

1．目的：确保移液的精确性，正确使用移液器。2．适用范围：本实验室使用的可调式移液器。3．负责人： 操作人： 4．程序： 4．1 移液器的使用

4．1．1 转动旋钮设定移液量，设定的移液量不可超出该移液器规定的范围。4．1．2 装上配套的Tip。4．1．3 前进移液法

a）将按钮压至第一停点位置；

b）将移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深处，然后慢慢松开按钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴撤出液面，擦掉管嘴外侧的所有液滴。

c）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。约1 秒钟后，继续将操作按钮向下压至第二停点位置。待管嘴液体放干净后，将管嘴贴在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中，撤出管嘴。

d）松开按钮使之回到起点位置。需要时，可更换管嘴继续移液操作。4．1．4 倒退移液法：适用于高粘度液体及/或易起泡沫液体的移液。a）将操作按钮向下压至第二停点位置。

b）将移液管管嘴浸入试剂瓶液面下2~3mm 深处，然后慢慢松开钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴撤出液面，擦掉管嘴外侧的所有液滴。c）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。

d）遗留在管嘴时的液体或者随管嘴一起扔掉，或者放回原来的容器中。4．1．5 重复操作法：重复操作移液法可以快速、简便地重复转移同体积的同种液体。a）将操作按钮向下压至第二停点位置。

b）将移液管管嘴浸入液面下2~3mm 深处，然后慢慢松开按钮吸入液体。待移入管嘴吸满液体后，将管嘴贴在容器瓶壁上防止形成液滴滴入瓶中。

c）轻轻压下操作按钮至第一停点位置，放出液体。待放完所需体积液体后，把按钮停在第一停点位置，不包括在移液量之内的少量液体仍留在管嘴内，管嘴外的液滴则需包括在移液量之内。

d）将管嘴浸入试剂液面下不远处，然后慢慢松开按钮使管嘴重新吸入液体。(3)e）重复步序c）和d）继续移液操作，就可重复转移相同体积液体。4．2 移液器的维护

每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。每周1 次对移液器咀进行75%酒精浸泡15 分钟左右，若使用过程中发生污染应随时浸泡处理。4．3 移液器的校准

为确保移液器加样的精确性和准确性，正确使用移液器，需定期（一年）对移液器进行校准 4．3．1 校准环境和用具要求室温：20～25℃，测定中波动范围不大于±0.5℃。

电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平内的湿度（相对湿度60～90%），天平内应放置一装有10mL 蒸馏水的小烧杯。

小烧杯：5～10mL 体积。测定液体：温度为20～25℃的去气双蒸水。选定校准体积： a）拟校准体积；

b）移液器标定体积的中间体积。

c）最小可调体积（不小于拟定体积的10%）。如为固定体积移液器，则只有一种校准体积。4．3．2 校准步骤

a）将移液器调至拟校准体积，选择合适的吸头； b）调节好天平；

c）来回吸吹蒸馏水3 次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头；

d）垂直握住移液器，将吸头浸入液面2～3mm，缓慢（1～3 秒）一致地吸取蒸馏水 e）将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体；

f）将移液器以30℃角放入称量烧杯中，缓慢一致地将移液器压至第一档，等待1～3 秒，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出； g）记录称量值； h）擦干吸头外面； i）按上步骤称量10 次； j）取10 次测量值的均值作为最后移液器吸取的蒸馏水重量，按表1 所列蒸馏水Z 因子计算体积；

k）按校准结果调节移液器。4．3．3 比较校准法

利用经计量局校准并颁发校准报告之同型号移液器，在移液器量程范围的高低两个档各选择一个校准点

(4)用电子天平称量结果与已校准移液器称量结果进行比较，完成校准。

参考文件：

1.卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增管理办法》的通知 2.卫生部检验中心《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》 3.《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

4.ISO15189 质量管理体系范本文件（第六册）

第二篇：pcr检测技术

《食品安全学》综述

PCR快速检测技术综述

1．前言

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。

2.研究的目的与意义

聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。

人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。

1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。3.国内外研究现状

3.1.基础研究方面的应用

目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：

[1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变；

3.2.PCR在临床上的应用[2]

[1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。

[2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。[3]在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3．3.在法医学中的应用[3]

例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将4.相关检测技术 4.1.技术原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验中发现，DNA在高温下也能发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。4.2.工作原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 4.3.工作步骤

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度 5.研究方案

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。5.1研究方法

① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。

② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。

③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，5.2.技术路线

PCR技术

聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。5.3.所用仪器与材料

引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40-60%,浓度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。

4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究内容

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。6．1.检测对象

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。[4]乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能 6．2检测内容

PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。

PCR技术类型[5]

免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术

复合PCR技术

彩色PCR技术

抗原捕获PCR技术 增敏PCR技术

酶标PCR技术

二温式PCR技术

锚定PCR技术

定量PCR技术

毛细管PCR技术

多重PCR技术

巢式或套式PCR技术 7.预期目标PCR 技术在大肠杆菌O157: H7检测中

（1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物： 正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld。

徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR: kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7。

4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中

传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。

参考文献

[1] 葛忠源;荧光定量PCR检测DPV弱毒免疫鸭消化道和呼吸道大肠杆菌、葡萄球菌、乳酸杆菌及其数量变化规律的研究[D];四川农业大学;2006年

[2] 徐焕宾,贲昆龙,曾涛,李劲光;检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用[J];中国病毒学;2001年02期

[3] 顾鸣，韩伟.复合PCR鉴定沙门菌的方法.中国卫生检验杂志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陆.肠出血性大肠埃希菌(EHEC)流行趋势.中国食品卫生杂志[J]，1999，3:31-35 [5] 石岚;实时定量PCR检测IgH基因重排的研究[D];昆明医学院;2004年 [6] 王颖.食品安全学技能训练.2010.10

第三篇：PCR实验常见问题

【实验】PCR常见问题总结

作者: gene121(站内联系TA)发布: 2005-07-04 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。1假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。2出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。3出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。二.PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因

(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。对照试验

1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3.重复性试验

4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 防止污染的方法

(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。

(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。

(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。

第四篇：岗位标准和操作规范

办公室岗位标准和操作规范

1、办公室主任工作规范和岗位标准

（1）主持办公室的全面工作，统筹安排室内各人员的工作，做到既有分工又有合作，室内工作运转有序。

（2）建立健全各项规章制度，把好文字材料关，确保各种材料按时按质按量完成；做好信息新闻及宣传报导工作，提高两院的知名度，每年向民政局报送信息不少于12篇，县电视台宣传两院的工作不少于5次，并力争市级报刊宣传报导秭归县福利院的工作。同时完成民政局下达给两院的各项工作任务。

（3）安排司机出车，在安排车辆上坚持原则，不公车私用，在车况不好的情况下，坚决不允许出车，避免安全事故发生。

（4）为领导当好参谋助手，为领导提供准确的信息，协助做好上传下达和收发工作。

（5）协助做好来信来访、接待及清洁卫生工作。

2、办公室秘书工作规范和岗位标准

（1）负责各种文书材料的起草、打印工作，注重提高材料质量。

（2）负责各种报表工作，做到数据准确无误，前后逻辑贯通。

（3）做好来信来访及接待工作，妥善处理上访工作，接待过程中态度和蔼，表达得当，解决问题时不违背政策和原则。

（4）负责新闻信息、宣传报导工作，每月向局报送信息2篇，主动向县广播电视台、《宜昌日报》社及相关传媒单位投递稿件，努力提高两院的知名度。

（5）做好清洁卫生、收发及电话转传工作。主任外出时，主持办公室的全面工作。

3、司机岗位规范和岗位标准

（1）车辆原则上只供本单位因工作需要使用，司机不得随意出动车辆，任何单位或个人用车必须经办公室主任批准并由办公室通知。

（2）单位领导或职工个人因私事原则上不得使用单位车辆，司机不得在没有办公室通知的情况下善自出车，否则，造成的一切后果由司机本人承担。

（3）爱惜车辆，注意保修，经常检查车辆的性能及状况，在车况不好的情况下不得勉强出车。

（4）安全第一，谨慎驾驶，遵守交通规则，如果不是由不可抗拒的原因造成的交通事故，其责任司机本人承担。

（5）司机如果没有出车任务，在办公室待令，协助办公室接听电话及其它工作。

4、保管员岗位规范及工作标准

（1）负责院内所有物资及财产的保管工作。

（2）对所有的物资及财产如实地清理、登记、造册，做到账账相符、账物相符。

（3）严格执行财产进、出库登记制度、领取人签字制度，弄清财产的来源、数量、流向及经手人。丢失的财产实行追究赔偿制，对低值易耗品做好损耗记录。

（4）定期清仓，做好仓库的清洁卫生工作，防止物资腐烂、变质、虫蛀、鼠咬等。

财务室岗位标准和工作规范

1、会计岗位规范和岗位标准

（1）严格执行《会计法》和财经纪律，坚持原则，秉公办事，讲究职业道德。

（2）做好本单位预算、决算及资金争取工作，及时向领导反映财务收支状况，一月向领导报告一次资金平衡表。

（3）坚持“一支笔”审批制度，对不合理、不合法的单据坚决不予入账，确保资金使用的合法性。

（4）及时扎账报账、科学建账，做到账账相符、账物相符、账钱相符。

（5）规范整理财务档案，妥善保管会计凭证，确保财务工作清楚、明白、无误。

（6）正确建账，合理开支，财务工作经得起相关单位的检查和验收，不给单位、领导和个人带来麻烦。

（7）对局财务股以指出已经存在的问题必须予以纠正，并确保今后再不出现类似问题。

2、出纳岗位规范和岗位标准

（1）严格执行财经纪律，坚决执行“一支笔”审批制度，合法使用各种原始凭证，合理开支经费。

（2）严格资金管理，不得擅自挪用、挤占、借支单位资金，开支经费必须经院长签字认可。

（3）对收取的经费及时存入银行，办公室内不得存放现金；妥善保管各种凭证，避免现金、凭证意外丢失。

（4）及时汇总票据，单位职工因公预借经费，工作结束后及时报账，职工个人不允许长期占用公家资金。

（5）协助会计做好财务档案的整理工作。

3、财务室考核细则

（1）使用、报销不合格单据，发现一张扣1分。

（2）不经院长允许，擅自借支现金给他人，发现一次扣10分。

（3）经相关部门和单位检查，发现建账不科学、不规范，一次扣10分；对单位造成重大影响的扣50分。

（4）该到位的经费不及时到位，一次扣5分；因工作力度不够，造成有关单位取消到位资金的，一次扣50分。

（5）现金、凭证保管不当造成丢失的，除赔偿全部损失外，一次扣100分。

（6）档案资料不全或整理不规范扣10分。

接待室岗位规范和工作标准

1、接待室工作人员必须遵守作息时间、坚守接待岗位，按要求做好接待记录。

2、努力学习，熟悉掌握院内的各种情况及相关业务知识，掌握院内的床位数、收费标准、服务内容、须知事项及院民守则，牢记《自费代养合同书》中涉及的各项内容，接待过程中做到有问必答。

3、对来院考察的老人或老人亲属态度和蔼、热情大方、主动周到、使用文明用语，带领老人到生活区、住宿区、娱乐区、健身区、休闲区参观，如实地介绍各方面情况，客人来时热情恭迎，客人走时主动相送。

4、认真仔细、客观公正地对入院老人的身体状态进行评估，并确定老人的护理等级，征求老人对住房的要求，以确定收费标准。若有对护理等级确定不准的对象，及时向院领导报告，杜绝与老人或老人亲属发生争执。

5、评定护理等级时客观公正，不得无故提高或降低老人的护理等级，一经发现，将给予严厉处罚。

服务组岗位规范和岗位标准

1、服务组组长岗位规范和岗位标准

（1）在院领导的领导下开展本组工作。

（2）起草本组的工作计划、工作总结及其它文字材料并报院领导审阅。

（3）合理安排本组的值班次序，保持良好的上班秩序、工作秩序，完成本组的各项工作任务。

（4）制定老人娱乐、休闲、健身等活动方案，并要求本工作人员按方案规定引导老人活动。

（5）规范服务内容，提高服务质量，通过优质服务吸引更多的自费代养老人。

（6）定期召开组内职工会议，要求职工加强学习，努力提高自身素质；积极探索科学的服务方法，提高服务质量；对工作中存在的问题及时指出并予以纠正；解决工作中存在的其它问题。

（7）定期召开院民会议，对服务质量是否满意征求老人意见；向院民通报院内的工作情况；向院民传达本组的工作意愿及其它需要院民大会解决的问题。对院民宣传健康卫生知识及安全自卫意识。

（8）定期组织“院民委员会”的老人召开会议，与老管会的同志一道制定“院民管理工作计划”；评定老年人零花钱；汇总老人提出的意见及建议等，并将情况反馈到院领导，以便院领导掌握相关情况。

（9）规范本组的工作纪律、工作秩序、工作内容，对本组人员严格要求，工作中严格按制度和程序办事，对违反制度的同志坚决按考核细则办事，不当“好人”，不循私情，不隐瞒事实依据。

（10）规范建立本组档案资料，做好组内的各项会议记录，每周阅读一次值班记录，每月向院办公室上报组内考勤表并总结本月工作情况；规范整理院民档案，做到档案整理不漏人、不漏项。

（11）为每位新入院老人进行初期评估、入住适应计划、定期评估及程序化个案服务方案。

2、服务组服务员岗位规范和岗位标准

（1）在组长的领导下开展工作，服从安排，听众指挥，认真做好本职工作。

（2）严格按《三个基本规范》的要求做好所有老人的日常生活及起居工作，根据不同老人的不同护理等级分别为老人洗漱、洗头、洗澡、更衣、喂水喂饭、整理床铺、大小便、服药、翻身、修剪指甲、洗衣、洗被、洗窗帘等。

（3）帮助老人运动、健身、医疗，便于老人康复和保持良好的精神状态，对因病住院或长期卧床不起的老人进行24小时守护，必要时必须安排处理能力较强的院民与其同住，以防发生意外。

（4）打扫室内室外卫生，保持24小时室内明窗净几、室外干净整洁。

（5）与老人交心谈心并按要求做好谈心记录，每次交谈时间不少于15分钟，掌握每个老人的性格特点及饮食要求，做好当班记录，规范档案资料，确保各项工作有据可查。

（6）工作过程中按程序和制度规范服务，严格作息时间，遵守工作纪律。

（7）坚持“老人无过错”原则，不与老人发生争执，端正服务态度，讲究工作方法，妥善处理工作中发生的矛盾和问题。遇到确实无法解决的事情及时向组长或院领导反映。

（9）老人参加集体活动、集体就餐以及健身等，工作人员必须跟随左右，并护理介助、介护老人上下楼梯。

（10）鼓励每个老人每天坚持三个“半小时”，即早上半个小时锻炼、中午半个小时休息、晚上半个小时新闻。

3、自理老人服务程序（三级护理）

（1）每天清扫房间一次，保持室内无蝇、无蚊、无鼠、无蟑螂、无臭虫、无异味。

（2）督促老人一周洗澡一次，衣着干净得体，并勤换勤洗，冬、春、秋一周一次，夏季经常换洗，确保身体无异味。

（3）协助整理床铺及房间，被子半月清洗一次，特殊情况随脏随洗。

（4）督促老人洗头、理发、修剪指甲，经常清洗毛巾和脸盆。便器每周消毒一次

（5）服务人员24小时值班，实行程序化个案护理，视情况调整护理方案。

4、介助老人服务程序（二级护理）

（1）每天清扫房间一Ⅰ次，保持室风无蝇、无蚊、无鼠、无蟑螂、无臭虫、无异味。

（2）协助老人每周洗澡一次（夏季每周2次），提供干净得体的服装并定期换洗，冬、春、秋一周一次，夏季经常换洗，特殊情况随脏随洗，确保身体无异味。

（3）协助整理床铺及房间，被子半月清洗一次，特殊情况随脏随洗。

（4）定期为老人理发，协助老人洗头、修剪指甲，毛巾、脸盆经常清洗，便器每周消毒一次。

（5）搀扶老人大小便，Ⅰ级褥疮发生率低于5%，Ⅱ级褥疮发生率为零，入院前已经发生的离外，但应做好详细记录并尽可能提供防护措施。

（6）对患有传染病的老人及时采取特殊保护措施，并对其隔离治疗，以既不影响他人又尊重病患老人为原则。

（7）服务人员24小时值班，实行程序化个案护理，并视情况调整护理方案。

5、介护老人服务程序（一级护理）

（1）每天清扫房间一次，保持室内无蝇、无蚊、无鼠、无蟑螂、无臭虫、无异味。

（2）早晚为老人洗漱，每周为老人洗澡两次，提供干净得体的服装并经常换洗，冬、春、秋每周一次，夏季经常换洗，特殊情况随脏随洗。

（3）帮助老人起床穿衣、睡前脱衣，为老人整理床铺，被子半月清洗一次，特殊情况随脏随洗。

（4）定期为老人理发、修剪指甲、洗头，经常为老人清洗毛巾和脸盆，便器每周消毒一次。

（5）送饭到居室，喂水喂饭，帮助老人大小便，为行走不便的老人配备临时使用的拐杖、轮椅和其它辅助器具。

（6）Ⅰ级褥疮发生率低于5%，Ⅱ级褥疮发生率为零，入院前已经发生的离外。对因病情不能翻身而患褥疮的情况应有详细记录，并尽可能提供防护措施。

（7）帮助老人活动、健身，对患有传染病的老人采取特殊保护措施并对其隔离治疗，以既不影响他人又尊重病患者为原则。

（8）服务人员24小时值班，实行程序化个案护理，实情况调整护理方案。

6、残疾人服务程序

（1）每天清扫房间一次，做到室内无蝇、无蚊、无鼠、无蟑螂、无臭虫、无异味。

（2）协助残疾人洗澡，夏季每周2次，其它季节每周1次，为残疾人提供干净得体的服装并定期换洗，夏季经常换洗，其它季节1 周1次，特殊情况随脏随洗。

（3）帮助残疾人穿衣脱衣、整理床铺，被子半月清洗一次，特殊情况随脏随洗。

（4）协助残疾人理发，每月一次；协助残疾人大小便；协助残疾人洗头、修剪指甲；口腔护理清洁无异味；毛巾、脸盆经常清洗，便器每周消毒一次。

（5）为行走不便的残疾人配备临时使用的拐杖、轮椅和其它辅助器具。

（6）Ⅰ级褥疮发生率低于5%，Ⅱ级褥疮发生率为零，入院前已经发生的离外，对因病情不能翻身而患褥疮的情况应有详细记录，并尽可能提供防护措施。

（7）视天气情况每天带残疾人到户外活动1个小时或进行其它健身锻炼。

（8）特别保护女性智残人的人身权益不受侵犯，对患有传染病的残疾人及时采取特殊保护措施，并对其隔离治疗，以既不影响他人又尊重病患残疾人为原则。

（9）服务人员24小时值班，实行程序化个案护理，视情况调整护理方案。

7、正班职责、工作程序及标准

（1）24小时值班，并负责辖区范围内的老人护理工作，当班时间内不得以任何理由擅自离开工作岗位。

（2）从早上6：30分开始，为老人打开水及洗脸水。

（3）按要求打扫整理房间卫生，该消毒的消毒，该清洗的清洗，同时负责老人起床、洗漱、梳理、大小便等工作。协助需要早锻炼的老人进行早锻炼。

（4）招呼老人早餐，为介助、介护老人送饭到居室，并为需要喂饭喂水的老人喂饭喂水。早餐结束后清洗餐具。需要服药的老人根据医嘱服药。

（5）从8：30分开始，引导老人健身，根据不同老人的不同身体状况、不同的健身器材，不同的运动性能，力争每个老人都进行锻炼。这项工作11：00钟结束。

（6）11：30分招呼老人午餐，工作内容同（4）。

（7）12：30半钟以前照顾老人午休，对特殊老人查房。要求每个老人至少午睡半个小时。

（8）午休结束后给老人打送洗澡水，为不能自理的老人洗澡、洗头、修剪指甲等。

（9）下午引导老人看书、阅报、下棋、打牌、看电视等，并抽时间与个别老人谈心，做好谈心记录，与一个老人的一次谈心时间不得少于15分钟。根据老人需要，把老人送到平台上晒太阳。

（10）从5：00（夏季5：30）开始老人晚餐，工作内容同。

（11）行政工作人员及副班下班后关好大门，老人不再外出。

（12）晚上组织老人看电视，陆续招呼老人就寝。晚上10：00钟最后一次检查老人的就寝情况，白天每隔一个小时查房一次，有特殊情况做好查房记录。

（13）夜晚加强巡查发生意外情况及时、妥善处理，并向行政值班人员汇报。

8、副班职责、工作程序及标准

（1）早上8：00准时上班，并按规定在记录簿上签字。

（2）首先协助正班到每个房间查房，准确掌握每位老人的身体及生活情况。

（3）打扫健身房、活动室、走廊、楼梯、大厅及室外卫生，擦洗门窗、扶手及玻璃，24小时保持环境卫生干净整洁。

（4）协助正班组织老人健身、活动。对有康复希望的老人耐心地指导老人康复健身。

（5）协助正班给老人送饭、送水。对生活不能自理的老人帮助其吃饭喝水。

（6）对不能自理的老人协助正班给老人洗澡、洗头、换衣。

（7）若有老人生病住院，到医院护理病人，并为病人送饭送水。

（8）若园田的任务特别紧急，需要抢种抢收，在院领导的统一安排下协助到园田劳动。

（9）组织老人开展下午的活动，同样协助正班给老人送饭送水，需要喂饭喂水的帮助喂饭喂水。

（10）所有的工作结束后若没有特殊事情5：00（夏季5：30）下班。若遇特殊情况，副班不能休息或不能下班回家的，服从组长或院领导的统一安排。

9、交接班时间、程序及标准

（1）正班转副班或副班、休假接正班的从早上8：00履行交接班手续。

（2）交接班时，交班人和接班人同时到每个房间对室内卫生、室内布局及老人的身体状况仔细地进行检查，发现问题及时指出。

（3）若有卫生不到位，接班人可以拒绝接班；若有老人生病或身体的某一个部位受伤，应查明原因，划出责任界线并及时向组长或院领导反映后再履行交接班手续。

（4）及时查明问题，问题查明后是交班人的责任由交班人负责。若接班人不认真检查，是交班者的责任但接班人没有查出问题，一旦在交接班表上签了字，所有的责任由接班人负责。

（5）检查结束后，在一切正常的情况下，双方履行交接班手续，交班人、接班人都在记录簿上签字。

10、房间标准

（1）卫生到位，确保室内无蝇、无蚊、无鼠、无蟑螂、无臭虫，无异味，厕所无臭味。

（2）被子、床单、枕套卫生干净，摆放整齐。

（3）衣服、鞋子全部放到衣柜里面，床上、椅子上、柜子上不准摆放。

（4）床头柜、食品柜上面的东西干净整齐，不凌乱，窗台上不摆放任何东西。

（5）墙壁上面不乱钉乱挂，乱涂乱画，窗帘整洁，不歪歪斜斜。

（6）卫生间内的洗漱用品、毛巾、开水瓶等摆放有序。

（7）临时垃圾一律丢到垃圾篓里，垃圾袋随脏随换。

11、环境卫生标准

（1）24小时保持室内外环境卫生干净整洁，随时经得起相关部门和相关人员的检查和参观。

（2）室内玻璃每周擦洗一次，走廊、楼梯、寝室每天拖一次，健身房、活动室每三天拖一次，地面随脏随扫。地面不得有垃圾和污物。

（3）每天擦拭扶手、桌椅、及室内健身器材等一次，所有的器具上不得有灰尘。

（5）窗帘每一年清洗一次，特殊情况随脏随洗。

（6）每天打扫室外卫生，必要时用水冲洗地面。地面不得有垃圾和其它杂物。

（7）爱惜公共财产，凡属本组使用的一切用具均要干净无污渍。

12、服务组考核细则

(1)严禁院民到锅炉房打开水或提热水，发现一次扣当班人员10分；请院民提开水、送热水、扫地拖地或擦灰，造成院民摔伤、烫伤的，除全部支付院民医药费外，一次扣100分。当年考核按不合格等次计算。

（2）处理问题方法不当，与老人恶言相加，一次扣10分。造成老人上访或自费老人离院的，一次扣50分；动手伤害老人的，除给老人赔礼道歉、写出书面检讨并支付老人的全部医药费外，一次扣200分，并取消全年岗位津贴，情节严重的移交公安机关处理。造成老人意外伤亡的，只发基本生活费；其他工作人员知道情况不及时处理也不予报告的，一次扣20分，并视情节轻重扣除岗位津贴。

（3）对重症病人或突发病人，正班人员应及时向医生汇报或拿出其它紧急处理方案。必要时还要安排处理能力较强的院民与其同房居住，以防发生意外无人报告。若因安排不到位，报告不及时造成院民伤亡的，每发生一次扣当班人员5-50分，并视情节轻重给予纪律处分。

（4）给不能自理的老人送饭不及时或送错房间，造成老人到院办公室反映的一次扣4分，按服务程序应该督促、帮助老人完成的日常生活起居，凡有一项不按规范到位的扣4分。

（5）清洁卫生不到位或对老人态度不够和蔼，造成老人反映或经检查发现的，一次扣4分。

（6）经老人反映，被子或衣服该洗的不洗，一件或一床扣2分；各级领导或部门来检查，发现老人的衣服或被子特别脏，造成不良印象的一次扣20分；窗帘该洗的不洗，一幅扣4分。

（7）经院领导突击检查，发现玻璃、窗台、墙群、扶手、桌椅、健身器材等设施设备上有灰尘的，一件扣一分。若相关部门来院检查指导工作，卫生不到位，印象极差的一次扣20分。

（8）不经组长批准，发生擅自调班现象的一次扣10分；上班时间内不经请假随意外出的，一次扣10分；正班人员无紧要事情不得请人代班，自己离开岗位，每发生一次扣10分；不经允许，擅自延长休假时间的一次扣20分;旷工一天以上的，每天扣20分；旷工达一周以上的，作自动离岗处理。不严格记载考勤，上报考勤不准或有意弄虚作假的，一 13

次扣4分。当班时间内做与工作不相关的事情，发现一次扣1分。

（9）当班记录记录不全或做虚假记录的，一次扣4分；记录不做，一次扣10分；不严格履行交接班手续的，一次扣20分；晚上10：00钟不做一天中最后一次查房记录的，一次扣4分。

（10）初期评估表、入住适应计划表、个案服务方案、定期评估表等资料填写不全的，一人次扣4分。

（11）正班人员必须24小时坚守工作岗位，正班人员中午睡觉或晚上10：00钟以前就寝的一次扣4分；不论以什么理由（包括请人代班）参与打牌赌博的一次扣50分。

（12）按服务程序督促、帮助老人做好换季衣被、鞋袜的更换、清洗、存放工作，凡有一人不到位的，一人次扣4分；衣着不整洁、不干净、凌乱不堪的，一人次扣2分；因工作人员工作方法不当造成老人受伤的，一人次扣5-200分，并视情节轻重扣除全年的岗位津贴。

（13）严格执行院民离院请销假制度，凡院民离院请销假制度不严，造成院民伤亡或走失的，一次扣100-200分，并取消全年的岗位津贴，只发给基本生活费。

（14）每位工作人员应加强团结，顾全大局，全心全意为院民服务。若工作人员之间发生矛盾不能正确对待，不讲团结，不顾大局而在院内吵闹，造成不良影响的，每发生一次扣当事人20分，一年内达2次以上的作待岗处理，达3次以上的作开除处理。本组职工之间发生矛盾，组长不予解决或解决不力的，发生一次扣组长2分；院民发生矛盾，当班人员不予解决或解决不力，发生一次扣当班人员2分。

（15）凡本组工作人员一次扣分达50分以上的，组长扣10分；本组人员扣全年岗位津的，组长扣50分。

13、本制度从2010年1月1日起执行。

生产后勤组岗位规范和岗位标准

1、事务长岗位规范和岗位标准

（1）负责院民生活物资的采购工作。

（2）合理开支院民生活费，发挥资金最大的使用效率，确保院民吃好、喝好，并确保当月拨出数与实际开支额控制在±5%之内。

（3）与食堂工作人员建立相互通气制度，征求食堂所需物资方面的建议，以便合理地采购物资。

（4）负责管好后勤账目，建立后勤生活物资现金日记账，账目要求清楚，钱账相符，按月扎账。

（5）按月汇总原始凭证，建好生活档案，档案集中统一放置；按月汇总生活凭证，每月底向院领导报告当月支出明细情况。

2、生产后勤组组长岗位规范和岗位标准

（1）在院领导的领导下开展本组工作。

（2）起草本组的工作计划、工作总结及其它文字材料并报院领导审阅。

（3）合理安排本组的值班次序，确保良好的上班秩序、工作秩序，完成本组的各项工作任务。

（4）每月定期召开膳食管理委员会的老人会议，同膳食管委会的老人一道安排好自费代养老人、公费供养院民一日三餐的周谱，合理调配老人生活，膳食达到80%以上的院民人满意。

（5）定期召开组内职工会议，要求职工加强学习，努力提高自身素质；积极更新烹饪方法，提高烹饪质量，为院民提供可口的饭菜；对工作中存在的问题及时指出并予以纠正。

（6）搞好园田的规划及管理，定期召开生产劳动人员会议，合理安排生产劳动任务，确保时令蔬菜、肉类等自给自足。

（7）规范本组的工作纪律、工作秩序、工作内容，对本组人员严格要求，工作中严格按制度和程序办事，对违反制度的同志坚决按考核细则办事，不当“好人”，不循私情，不隐瞒事实依据。

（8）同事务长一起搞好物资采购及生活核算工作。

（9）规范建立本组档案资料，完善组内的各项会议记录及进餐记录，每月向院办公室上报本组的考勤表并总结本月的工作情况。

3、生产后勤组组员岗位规范和岗位标准

（1）在组长的领导下开展工作，服从安排、听众指挥，认真做好本职工作。

（2）严格执行《食品卫生法规》，严防食物中毒。

（3）合理调配全院老人一日三餐的生活，膳食口味达到80%以上的老人满意。

（4）早餐要求多样化，并视情况调整早餐种类；午餐、晚餐每餐不少于三个熟菜（不含淹菜）；饭菜的软硬、口味符合大多数老年人的要求；为需要流食、半流食及软食的老人制作流食、半流食及软食。

（5）制做各种咸菜、淹菜及其它食品，增加花样和品种，尽量满足老人口味。

（6）做好后勤组辖区范围内的清洁卫生工作，食堂用具干净卫生，摆设整齐有序；室内无蚊、无蝇、无鼠、无蟑螂、无灰尘、无有毒有害物体。

（7）妥善保管生产后勤组的所有物资、财产及各种用具，爱惜公共财产，正确使用各种用具，注意特殊用具的操作程序（如锅炉等）。

（8）按季节种好园田蔬菜，确保时令蔬菜自给自足；养好牲猪，尽量满足猪肉自给自足。

（9）搞好各种物资的进出库记录，做好进餐记录，建立健全生产后勤组各种档案资料及记录资料，做到每项工作有据可查。

4、正班工作程序及工作职责

（1）工作时间内坚守工作岗位，努力完成当班工作。

（2）安排全院老人一日三餐的生活，并负责主厨。

（3）起早为老人准备早餐，并注意早餐多样化，按时开饭，按时提供开水和热水。供应开水及热水时注意锅炉的安全使用方法。

（4）早餐7：30——8：00准时供应；中餐11：30分；晚餐冬季5：00分，夏季5：30分。

（5）按一周菜谱为老人准备中餐及晚餐,饭菜口味达到80%以上的老人满意。根据服务人员的申报，负责安排好供养人员的整生生日餐、病号营养饭以及需要流食、半流食、软食的食物供应。根据院领导的安排，做好客餐供应。

（6）打扫辖区内卫生，定期进行餐具消毒处理，防止病菌感染；清理食堂物资，各类食物分类存放，生熟不混放，防止食物变质变味和食物中毒；做好各种账目和记录。

（7）根据季节和蔬菜品种制作各种淹菜、咸菜，该自己班上完成的工作不得拖到下一个班次。

（8）事务长不在时，主动安排当日饭菜品种；食堂需要的其它物资均可代购。

5、副班工作程序及工作标准

（1）早上8：00钟以前进岗到位。

（2）打扫辖区范围内的室内外卫生，协助正班准备中餐和晚餐。和正班一起为老人打饭。

（3）和正班人员一起做好各种淹菜、咸菜及其它工作。

（4）农忙季节如果组长需要与组长一起到园田劳动，无事时在食活动，上班时间内不得随意到其它岗位串岗。

（5）下午开饭结束后可以回家休息，遇到中心工作或其它特殊情况服从统一安排。

6、交班时间、程序及标准

（1）正班转副班或休假和副班或休假转正班的时间为中午12：00钟。

（2）交接班时必须履行签字手续，交班人与接班人需同时对所有的物资进行检查核对，若有霉烂变质的食物需立即报告并进行处理，一旦发现其它问题要立即指出，此时发现 17 的问题接班人没有责任，一切责任由交班人负责。交接班时没有发现问题，交接结束后发现的问题一律由接班人负责。(3)双方若不履行交接手续，在交接期间发现问题，一律视同交班人的责任。

7、生产后勤组考核细则

（1）不严格履行交接手续，发现一次扣2分。

（2）不按规定时间开饭和提供开热水，提前或推迟达20分钟以上者，一次扣4分。

（3）饭菜生熟不均，一次扣2分；淹菜、咸菜因方法不当做不成功，造成原材料大量浪费，一次扣4分。

（4）各种用具使用不当，造成用具损坏的，一件扣4分；炊具洗涤不净，消毒不到位，一件扣1分；卫生不到位，食堂有蝇、蚊、鼠、蟑螂、蛆等，不及时采取措施处理的，一次扣10分；各类用具使用后不认真收检，到处乱扔，尤其是室外用具丢在室外，任其风吹雨洒，日晒夜露，发现一次扣4分。

（5）不按程序使用锅炉，造成严重事故的，一次扣100分；指使院民或其他人员操作锅炉，发现一次扣10分；请院民到锅炉房上开水或热水，发现一次扣10分；请院民上开水或热水被烫伤的，除支付全部医药费外，一次扣100分。

（6）请院民到食堂帮助做事，造成院民受伤的，除支付全部医药费外，一次扣50分。杜绝患传染病者到食堂做事，发现一次扣20分。

（7）园田规划不合理，季节上该种的蔬菜没有种上，造成园田空闲，一次扣10分；种植的蔬菜管理不善，造成蔬菜不能自给的，一次扣5分；家禽家畜管理不善，造成家禽家畜死亡的，一次扣10分（人力不可抗拒的原因除外）。

（8）蔬菜收回食堂后，不及时处理，造成蔬菜大量浪费甚至倒掉的，一次扣10分；事务长不在，当天生活安排不到位，造成院民为生活上访告状的，一次扣当班人员10分。

（9）采购人员低值高价或数量不足，损失部分由采购人员赔偿；验收人员不坚持原则，随意验收的，一次扣2分。

（10）食物保管不力，造成霉烂变质的，一次扣10分；明知食物已经不能食用而继续食用的，一次扣10分；造成食物中毒的，只发基本生活费并重新安排岗位，当年考核按不合格计算；食物中毒造成人员伤亡的，移送公安机关处理。

（11）不经组长批准，发生擅自调班现象的一次扣10分；上班时间内不经请假随意外出的，一次扣10分；不经请假，擅自延长休假时间的，一次扣20分；旷工达一天以上的，每天扣20分；旷工达一周以上的，作自动离岗处理。

（12）不严格记载考勤，上报考勤不准或有意弄虚作假的，一次扣4分。

（13）当班记录记录不全或做虚假记录的，一次扣4分；记录不做，一次扣10分。

（14）每位工作人员应加强团结，顾全大局，全心全意为院民服务。若工作人员之间发生矛盾不能正确对待，不讲团结，不顾大局而在院内吵闹，造成不良影响的，每发生一次扣当事人20分；全年达2次以上的作待岗处理，达3次以上作开除处理。组内职工发生矛盾，组长不予解决或解决不力，发生一次扣组长2分；在生产后勤组参加劳动的院民发生纠纷，组长或当班人员不予解决或解决不力，发生一次扣组长或当班人员2分。

（15）处理问题方法不当，与老人恶言相加，一次扣10分；造成老人上访或自费老人离院的，一次扣50分；动手伤害老人的，除给老人赔礼道歉、写出书面检讨并支付老人的全部医药费外，一次扣100分，情节严重的移交公安机关处理。造成老人伤亡的，只发基本生活费；其他工作人员知道情况不及时处理也不予报告的，一次扣20分，并视情节轻重只发基本生活费。

8、本制度从2010年1月1日起执行。

医务室岗位规范和岗位标准

1、医务室主任岗位规范和岗位标准

（1）在院领导的领导下开展工作。

（2）负责组内工作计划、工作总结及各项规章制度的起草工作，经领导批准后组织实施；不断完善岗位规范及标准、职责、制度并经常督促检查，按时总结汇报；

（3）具体组织、实施全院的医疗、康复、预防、保健工作。

（4）带头执行院内的各项规章制度和操作规范，了解和掌握组内工作状况，做好本组与其它组之间的协调工作。

（5）经常性地学习新技术、新疗法，在工作中对有价值的病案进行总结研究。

（6）负责院民的救治工作及请外院医生会诊，利用外院的医疗器械和技术开展医疗协作工作。

2、临床医师职责

（1）负责全院老人的医疗、预防保健及康复工作，担任门诊值班工作。

（2）对病员进行检查、诊断、治疗、开写医嘱并检查执行情况，同时还要做一些必要的其它检查。

（3）书写各项记录，对新入院者及时体检，及时写出初期评估报告；做好查房记录，做到处方规范、用药合理、诊断明确。

（4）在治疗疾病的同时，侧重预防保健工作，防止流行性疾病及传染病的发生和流行；对重大疾病及时报告并果断采取措施。

（5）认真执行各项规章制度和技术操作常规，亲自操作或指导服务人员进行各种检查和治疗，严防差错事故。

（6）加强学习，不断掌握新技术、新疗法。

（7）随时了解病人的思想、生活情况，征求病人对医疗护理工作的意见，做好病人的思想工作；控制好老人药费。

（8）坚持每天查房，并做好查房记录。

3、护士职责

（1）认真执行各项护理制度和技术操作规程，正确执行医嘱，准确及时完成各项护理工作，严格执行查对制度，严防差错事故的发生。

（2）做好基础护理和精神护理，经常巡视院民住房，发现异常及时报告。

（3）认真做好危重病人的抢救与护理。

（4）协助医生做好各种诊疗工作。

（5）定期组织病人学习，宣传健康保健知识，征求老人和家属意见，改进护理工作。

（6）做好消毒隔离、物资以及药品材料的保管工作。

4、药品管理及发放制度

为切实做好药品的管理及发放工作，保障患者用药安全，结合本院的实际情况，特制定以下制度：

（1）进药与验收：a、购药应以质量为前提，从合法的医药公司进货，医生进药采取谁进药谁负责的原则，对自己所购的药品器械质量负责。b、购药应有合法票据，并按规定建立购进记录，做到票、账、货相符。c、验收人员对购进的药品应根据原始凭证严格验明药品的合格证、药品的通用名称、规格、生产厂家、生产批号、有效期等。

（2）发药与喂药：a、调配处方必须核对患者姓名、药品的名称、数量、用法、用量、禁忌等。b、严格依据医师的处方所列的药品调配、发药，不得擅自对处方所记载的药品以及用法、用量作任何的增减、替代或变动。c、发现有配伍禁忌或超剂量的处方，药剂人员首先应当拒绝调配并与处方医师取得联系，必要时由处方师签字更正。若处方师坚持原处方，药剂人员应要求处方师重新签字后方可调配。d、对生活能够自理老人的药品按处方核对后发至病人保管，并告知其用法、用量；对生活不能自理的老人或智商有问题的老人，其药品放到值班室里，由当班人员按医嘱按给服。

（3）登记、划价与保管：a、每天登记好处方上的药品，填写好每天的处方数，并做好相关记录。b、药品价格略低于市场价，不得以任何形势擅自提高或降低药品价格。c、药品保管账目清楚，进出账目与实物相符；每月一扎账，报

表到财务室。d、药品一经发至患者手中确认无误后，禁止退还和更换，禁止在药房借、还、换药品；e、药品的储存与存放必须分类。

（4）器械的管理：a、购进的器械应根据原始凭证严格验明其合格证、生产日期、名称、规格、生产企业、生产批号等。b、一次性使用的医疗器械不得重复使用，使用过的应按国家有关规定销毁，并作记录。

5、预防保健工作制度

（1）掌握全院老人的身体状况，认真做好传染病的预防工作。

（2）每月开展一次健康知识讲座活动，做好全院健身保健及卫生宣教工作。

（3）负责做好老人入院及定期体检工作，掌握每个老人的健康状况，提出保健防护措施。

（4）做好季节性的疾病预防工作。

（5）做好院民饮食保健及指导工作，参与讨论制定食谱。

6、本制度从2010年1月1日起执行。

第五篇：荧光PCR检测原理

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。其特点有：

(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。

(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。实时荧光定量PCR技术的基本原理

在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。

方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR技术的应用 1.基因工程研究领域

① 基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。

② 转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。③ 单核苷酸多态性（SNP）及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基于两条探针和基因组的不稳定性。基因突变基于两条探针，一条探针横跨突变点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体得稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。2.医学研究领域

① 病原体检测：由于实时荧光定量PCR方法可靠性和重复性好，并且操作简便、快速、结果判断客观，目前，人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。

② 药物疗效考核：利用实时荧光定量PCR技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。结果证明，实时荧光定量PCR系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法，应用这种技术可以预测化疗将引起的反应。

③ 肿瘤基因检测：肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。

目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因、肿瘤MDRI基因、白血病WTI基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现。荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。3.其他领域

用实时荧光定量PCR方法对免疫组分进行分析是其应用的重要方面。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。检测方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。服务流程

1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；

3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；

5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。收费标准

优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）

（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数

（如图1所示）。

1.荧光阈值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1.TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2.SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。3.分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。1．传统定量PCR方法简介

1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。2．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．内标对定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。