PCR实验室报批细节、注意事项、常见问题问答

第一篇：PCR实验室报批细节、注意事项、常见问题问答

报 批 细 节

1、技术档案：

技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件

2、仪器档案：

实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等

实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。

扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。

5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值

3、其他细节: 垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。仪器简单操作流程

标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。仪器的申请、采购、使用、验证程序

样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序 样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本

标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。

检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。

抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认

注 意 事 项

1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致.“写你所做的,做你所写的”.2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如“消毒时间一到两小时”不能这样写,多少就是多少.3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外.4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程.5、每把枪的用途要清楚,不能弄乱.比如稀释阳模的枪和处理标本的枪不可混用.6、普通离心机处理分泌物标本时应在离心后静置20分钟才能开盖.(许斌这样认为)

7、所有仪器、设备都要有档案卡.8、所有的清洁消毒要在实验结束后马上进行,尤其是仪器、设备.像扩增仪，每天都要清洁，做完的反应管决对不能留在样品槽内。

9、各区的拖把、抹布不得混用,标记清楚.10、生物防护意识要强,手套要随时更换.生物防护安全的保证要从三个方面:制度、硬件、意识。

11、爆管如何处理:立即停止实验,水浴里的水要倒掉,冲洗.所有可能污染的地方要用消毒液擦洗,紫外照射,通风排风.12、各区应有日常工作核查表,做为每天工作记录的补充.13、各区要有泡有消毒液的生物污物桶,用来处理生物垃圾.14、验收组带来的标本要按平时对待临床标本一样处理,要有接收记录,结果登记等.15、拒绝电话或代领等非正常方式发放报告单.16、存放标本的冰箱要上锁,钥匙及电脑资料的密码要由本科室人员专人保管.17、报告单上要注明试剂的检测下限,不能写成参考范围.除了有操作者,还要有核校者,且两者姓名除了电子打印还要用手签.定量结果不能有阴阳性提示,只能报数值.18、SOP文件中PE5700的温湿度要求应该为温度15－30℃、湿度为< 80％。

19、SOP中

医院申报实验室注意事项

专家组参观实验室回答的问题

1，“你们的冰箱的铁链我可以从底下抽上来，实验室能做好保密性吗？

可以的，你们能做到就行，注意保密！

2，实验室需要配置冷冻离心机，生物安全柜，如果做HCV时,注意重新添置新实验室。

3，生物防护中是否有锐器的防护注意事项？ 4，实验室的温湿度计的放置位置？ 最好放在实验室内。

5，实验室中如何做好离心管抑制物的检测？ 而非爆管、裂管的检测！

6，在做HCV时规定从抽血化验到送达实验室要几个小时要有明规定！3小时左右！

7，溶血标本有何具体的判断标准？脂血呢？

实验室末次会议的提问

1，你们单位（达安）试剂，当我们新鲜标本做HBV时，提取中40微升+40微升提取液处理，待放置过夜后，第二天加样时，有的标本特难取样，有何处理办法？ 2，实验室中垃圾你们如何处理的？

3，实验室中阴性标准检测后变成阳性你怎么办？（我们实验室一共有三管阴性阴性对照，第一个阴性检测管是试剂什么都不加，直接上机，第二个阴性检测管是试剂中加入在实验开始时打开盖的1.5离心管带有蒸馏水的，第三个阴性检测管是与实验一起提取的阴性血清。）4，实验中如果阳性质控，阳性梯度，标本呈阴性请分别解释？ 5，实验室必须配置生物安全柜，高速离心机！

临床基因扩增检验实验室技术验收现场问卷

（口试和/或笔试）

一.现有一个患者向你提出：“我在你们医院检测HBV DNA为阳性，但在另一家医院检测为阴性，你们医院是怎么做的检测？”，此时，你怎么办？

（该题主要是考实验室人员是否知道并遵守所制定的抱怨处理程序）

二．现有一个临床大夫拿着几张HBV DNA定量PCR检验报告单找到PCR实验室，说：“你们的PCR结果到底准不准，我这个病人刚开始检测，HBV DNA是57×10拷贝数/ml，用了拉米呋啶治疗后二周，再检测结果为3×107拷贝数/ml，降了不少，但再过二周检测，又变成了6×107拷贝数/ml，升高不少，这到底是怎么回事？”，如果这个大夫刚好问的是你，你怎么办？并如何解释其提出的问题？

(该题除了考实验室人员是否知道并遵守所制定的抱怨处理程序外，还要求其对特定PCR检验的批间变异有充分的认识)

回答思路：

这两题分别对应患者和临床医生提出的抱怨。考点为你是否按照所制定的程序来处理：无论是患者还是医生提出抱怨，我们都应该“按照”程序先记录抱怨人姓名、抱怨内容等，然后等问题解决后记录处理结果等，最后记录反馈意见等。

注意：一般问题中出现“此时，你怎么办？”，其考核的重点均为“形式”而非“内容”。所以题目中无论病人抱怨的是服务态度不好还是结果报告不准，医生抱怨的是检测结果和临床诊断不符还是报告发放不及时，回答的方向都应该是：“我们接待他们后，先在登记表上记录抱怨的什么什么相关信息，做相应处理，解决后记录处理结果，最后填反馈表，归档总结，跟着以后改进等等等等”。对各种具体问题的处理就按照实际情况来回答就行。

如果题目中出现要你具体“解释某某提出的问题”时，这时是具体考察某一“内容细节”了。第二题中看你对PCR检验的批间变异有否充分的认识：一般PCR检测试剂盒存在着一定的批间甚至批内差异，而且PCR检测前处理也存在着一定的误差，分析软件相关参数的选择也会使定量结果发生变动，这是方法学造成的不可避免的事实。同一操作人、同一仪器、同一批号试剂、同一份标本同时做多份平行管，得到的结果都会不尽相同。所以我们都会允许结果存在一定范围的偏差，一般为一个数量级的拷贝数。5×107、3×107和6×107均在允许的误差范围内，排除了各种影响因素后，出现这种情况很正常，这说明了该病人用药效果不佳。若定量结果有1～2个数量级甚至更大的变化才能反映用药疗效。

三．现有一人打电话到科室，说：“我孩子在你们医院做了一项丙肝的PCR检测，名字叫XXX，请你告诉我检测结果好吗？”。如果是你刚好接了这个电话，你会怎样去做？

（该题考的是实验室人员在患者要求以电子邮件、电话、传真等方式传递报告时，是否能按相应的程序去做）

回答思路： 也是考形式。“对于这种非正常的报告发放形式，我们按照程序，是这样这样处理的。”因为各个医院实际情况不同，所以无论你怎样处理，只要程序中体现了对患者结果的保密原则，具体细节不会太要求。

在程序中按以下几个方式写都是可以的：

1、我们均不以任何非正常形式发放报告。（最干脆！就是有点不近人情，不过对我们来说省事）

2、实在有特殊情况，可以电话查结果，其它发放形式不行。但必须确认身份，包括核对其所查询的患者姓名、性别、年龄、检测项目、送检医生、送检日期、病区床号等情况，并提供患者ID号。

3、可以通过电话、图文传真、电子邮件等形式传送结果，和上面一样，需要核实身份。（最宽松了，不过麻烦了很多）

要注意的是：这些情况均应明确告知查询者，这几种非正常形式发放的报告均仅为临床提供参考，实验的最终结果以正式检测报告单为准。特殊情况报告发放后需详细登记，签署报告人姓名，实验室负责人签字。

“报告的正确发放”为考核重点，一般可能还会引申出“你们是如何发放检测结果报告？”之类的问题，按照程序中写的实际情况回答就行的了。只要遵循保密原则就OK。

最简单的无非把事情都推给医院：说门诊患者报告单送至服务台门诊报告发放处，由那里的医生确认身份后发放。（具体她们是怎么确认、确不确认这已经不关我们的事了）。

若写病人到科室领报告也行，只是“我们怎么确认病人身份”要在程序中体现：询问相关信息、根据收费单或病历唯一条形码（若医院采用计算机网络系统）确认等等。

四．现有你科室同事，拿了一份血清标本给你，说：“这是我一个熟人的标本，他要做HCV RNA检测，刚好他还做生化和免疫检测，我从生化标本分了一些出来，给你做HCV RNA。”你觉得这样行吗？为什么？

（该题主要是考实验室人员对有关标本的收集程序是否清楚并遵守）

回答思路：

问到了“为什么？”表示具体考到细节了。按照我们的收集程序，做PCR尤其是RNA项目需要独立取血，不能从其它检测的标本中分出一些来做。而且对RNA标本的采集、保存、运输都有严格的要求。

一般验收组会对这类问题加以引申。问你每天标本在哪儿采集？采血的人员有否经过专门培训？采集的标本如何保存？

还可以顺便问你结果发放后的标本如何保存、保存在哪儿？保存多久？甚至要你把这多久多久前的标本拿出来给他们看。

五．某一天，你在做HBV DNA荧光定量PCR检测（方法的定量测定范围为103～107拷贝数/ml）中，发现有1份标本的测定Ct值超出方法的测定上限，此时你怎么办？对于没有特异扩增曲线的标本你又怎么报告结果？

回答思路： 此为具体问题：题目已经假设了方法的定量测定范围为103～107拷贝数/ml，我们就按照这个假设来考虑。先看是否为特异扩增的曲线（即看曲线是否为标准的S形曲线），若为标准S形曲线表示的确为阳性标本，Ct值超出检测上限，表示未知标本HBV DNA浓度过大，不在检测线性范围内，应该进行浓度梯度稀释（1/

10、1/100、1/1000„„），重做实验，看哪个梯度处于线性范围内，得到原始浓度乘以相应稀释倍数即得。

若不是特异扩增的曲线（也就是常见的那种前面翘、与阈值线有交点的阴性曲线，计算机不会具体分析，见有交点就给Ct值，而且Ct值还很小，小于测定上限的Cycle数），按阴性报。

六．在PCR检测的核酸提取离心中，如发现有一管离心管出现破裂，此时你怎么办？

（该题是考实验室人员对于其制定的实验室及仪器设备消毒清洁程序是否知道并遵守）

回答思路：

按照离心机的消毒清洁程序：必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾 桶，再用75%酒精擦拭离心室消毒，用移动紫外灯照射30～60分钟后才能开始实验。

可以引申出：离心管破裂，可能质量有问题，为防止以后同类事情的发生，按照耗材质检程序进行离心管质检实验，若不合格停止使用，重新购买并进行质检，合格的耗材才能使用。

七．有一个PCR实验室的荧光定量PCR仪如ABI 7000因某种原因搬动到了另一个实验台面，实验室只是将仪器外表面擦了擦，即用于常规扩增检测工作，你觉得该实验室做得对吗？为什么？

（该题是考实验室人员对于其制定的PCR仪校准程序是否知道并遵守）

回答思路：

考核实验室人员对于其制定的PCR仪校准程序是否知道并遵守。仪器移动应该按照程序进行校准后才能重新用于常规扩增检测工作，以保证实验结果。

7000型核酸扩增荧光检测仪为复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师 进行。实验室联系仪器厂家派技术人员来校准仪器。

平时就算不搬动仪器，实验室也应与仪器厂家达成协议，定期校准仪器。八．有一位实验室工作人员在做PCR实验中，一开始将化验单带至标本处理区，核酸提取完成后，进入了扩增区，但将化验单忘在了标本处理区，此时，他应该怎样做？

（该题是考实验室人员对于其制定的实验室单一流向工作程序是否知道并遵守）

回答思路：

很简单，按照单一流向原则，该实验员不能直接回2区拿单，要么请其他当日未进过扩增实验室的人员帮拿，要么严格按要求淋浴、换衣服后再次进入2区拿化验单。

第二篇：PCR实验室

简介

Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据

条件

1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室;实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出 由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它 有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广 泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍

2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求;荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证;

4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班，并持证上岗。PCR实验室通过验收，实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行

5、必须在无菌无尘环境下进行操作

功能

能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控，并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受，阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒，解决了乙肝病毒易变异、耐药，病毒复制模板难以治疗，人体免疫耐受状态不易打破等医学难题，能迅速消除临床症状，而且有效抑制乙肝病毒复制，明显加快e抗原、抗体的血清转换速度，杀灭血液及肝细胞内的病毒，为防止再感染提供了长期保护，有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。

建立方法

1、建立样品准备区

这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取DNA或RNA。⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产生气溶胶。⑺任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。

2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。

3、建立前PCR区。

该去专门用于准备各种反应，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

4、PCR实验室试剂的操作。

⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。⑷所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

5、在前PCR区建立PCR混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃，在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。⑵如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济，可以考虑分装保存够一天的PCR成分。⑶作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。⑷阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。⑸当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。⑹由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。

6、控制污染的方法。

已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG，这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。

7、后PCR区PCR完成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动

第三篇：PCR实验室

高端PCR实验室控制设计说明

PCR实验室即分子生物学实验室，在医疗、科研、生物技术方面得到广泛的应用。因其在不同行业的应用各有区别，在具体设计时也有不同之处，就医疗机构的应用而言，主要使用三区或四区设计，即试剂准备区、样品提取区、扩增分析区；此类三区设计时候应用于类似荧光定量型或同类PCR分析设备，及扩增与分析过程在设备内一次完成。而四区设计在三区的基础上讲扩增分析区拆分为扩增区与分析区适用于其他类型的pcr设备及手工处理。

在PCR实验的设计上，经过多年的经验累积，已经在一些关键技术上达成了共识。因为PCR实验中所产生的DNA与RNA片段过于微小，以至于可以穿透高效过滤器，所以在实验室设计上已经不在强制要求设计高效净化系统，但是为了提高实验环境水平及保护实验室内的敖贵设备方面，如果在具备条件的情况下可考虑追加高效空气净化系统；建议净化级别万级。在PCR实验中所产生的DNA与RNA片段污染是一直以来PCR实验的重点问题。此类污染主要至上次试验中所产生的基因片段对下次试验产生的污染，而且一旦试验环境中的污染形成后很难处理。因为消毒等传统方式对于基因污染没有很良好的效果。所以在PCR实验室设计中一般将整套实验室设计为全新风型实验室，这样而已通过有效的换气次数来达到净化室内污染的作用。而在控制方面也有很多不同之处，因为各单位对PCR实验的重视程度各有不同，所以在设计上也有不同，主要的控制设计有定送定排式压力控制系统、变送定排式压力控制系统变送变排式压力控制系统。在控制设备方面也有很多区分如压力无关型控制系统、压力有关型控制系统。

根据业主要求，本PCR实验室为三区设计，各区可独立使用，不设置高效过滤系统等相关要求，根据业主以上要求，我方给出的设计方案为压力无关型变送变排压力控制系统。本系统的特点是，设备启动后可根据实验室内使用节点调节送风量及排风量来控制各房间状态，系统说明见下图

 每个房间可分别控制，使用时通过房间开关输出启动信号，当设备接到启动信号时设备运行，运行中根据管道压力反馈决定变频器大小，房间内送排风量由压力无关型风量调节阀控制。 当有多个房间开启或关闭时，设备更加管道压力反馈，调节设备变频器增加或减少送排风量来稳定管道压力。各房间内压力又房间内的压力无关型定风量阀进行控制。

 当BSC（生物安全柜，B2全排）开启时BSC专用供风机组运行，BSC-供风机-排风机连锁运转。

 当BSC做变风量调节时，根据房间内压力变化，BSC专用供风机组前安装的压力无关型变风量调节阀根据压力变化增减送风量，确保房间压力执行在可控范围内。

 当房间不适用时，房间与缓冲间均关闭电动密闭阀，确保房间处在密闭状态避免布朗运动造成的可能污染风险。

 房间换气次数均按照一定净化标准设计，当室内污染发生时，通过一定时间的换气处理后，污染问题可以基本解决。 本系统如果业主需要，可在室内送风口末端加装高效过滤设备，房间可升级为净化型实验室。

 压力无关型风阀简介：压力无关型风阀的特点是不会根据管道压力的变化而影响风阀内部的送风量，在一定管道压力区间内能够自行调节阀体阻力，来稳定送风量，是高端实验室必备的关键部件，目前此类阀体技术均有国外生产厂家控制，目前国内主用使用的产品有妥思、文丘里、西门子等品牌。

第四篇：PCR实验常见问题

【实验】PCR常见问题总结

作者: gene121(站内联系TA)发布: 2005-07-04 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。1假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。2出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。3出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。二.PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因

(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。对照试验

1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

3.重复性试验

4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 防止污染的方法

(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。

(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。

(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。

第五篇：PCR实验室说明

PCR实验室设计

PCR实验室分为四个区域，进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出，四区域分别为： 1.试剂配制区n 2.样品处理区n 3.核酸扩增区n 4.产物分析区n 如使用全自动分析仪，区域可适当合并,三四区可合并为扩增产物分析。

各区的功能是： 1.1.1 试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存。1.1.2 样品处理区：样品登记、分装；核酸提取、保存和加样。1.1.3 扩增产物分析区：扩增产物的测定、结果分析、登记及报告。1.2 扩增前区与扩增后区应严格分开，须使用不同的房间，两区之间最好有一定的间隔。1.3 使用商品化试剂盒可在样品处理区进行少量试剂配制。1.4 在满足下列操作和清洁处理要求的前提下样品处理区和试剂准备区可设在同一房间内： 1.4.1 在生物安全柜内操作。1.4.2 每个实验人员、实验组分别使用各自的试剂及耗材。1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。1.4.4 用有效的方法对操作区域和共享器具在实验前后进行清洁及消毒。设计要求：

PCR实验室可以是分散形式，也可以是组合形式,现要主要是以组合形式为主流。完成一组PCR实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程，若实验工艺需要，还应增加样品粉碎过程。

一、分散形式PCR实验室 所谓分散形式PCR实验室，是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远，呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR实验室，由于各个实验之间不易相互干扰，因此无需特殊条件要求。

二、组合形式PCR实验室 所谓组合形式PCR实验室, 是指完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置，组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR实验室，由于各个实验间集中布置，容易造成相互干扰，因此，对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间，以减少室内外空气交换。

试剂配制室及样品处理室宜呈微正压，以防外界含核酸气溶胶的空气进入，造成污染,可以通过控制进风风量大于排风风量达到正压效果。

核酸扩增室及产物分析室应呈微负压，以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品，可以通过控制排风风量大于进风风量达到负压效果。

在理想情况下，PCR实验室缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。

PCR实验室进风由原有中央空调控制，要求将中央空调风口安装到指定定点，且高度为地面铺装好后2600mm处。

如果使用荧光PCR仪，扩增室和产物分析室可以合并。

若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。

如果使用荧光PCR仪，扩增室和产物分析室可以合并。

若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。主要设备试剂准备区 仪器设备主要有冰箱、超净台、加样器、混匀器、天平和离心机等，加样器、天平除了要专用外，还应有定期校准。试剂分装应在超净台中进行 扩增反应混合液应使用分子生物学级的，试剂制备好后应有质检：一是否有污染、二是检测试剂的扩增效果。标本制备区 仪器设备主要有生物安全柜、加样器、离心机、温育仪、混匀器等

扩增区 扩增区的主要仪器是核酸扩增仪、超净台、微量加样器、离心机、可移动紫外灯。扩增仪需进行校准。并配备UPS电源，以防止由于电压的波动，停电对扩增效果的影响。分析区 本区所使用的仪器设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等

洁净实验区的缓冲间部分面积不能超过主实验室的八分之一,这是有规定的.1、主体结构： 主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。

2、标准的四区分隔和气压调节： 将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增，产物分析四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区Ⅰ，缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。

3、消毒： 在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。

4、不锈钢传递窗： 试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。

5、地面 地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。

6、照明 灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。在建设的过程中应注意： ●规范的安装流程和全面的服务流程。●严格按照规范科学设计的安装流程。●安装前需要确定以下安装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空间尺寸 样本处理区

三、工作区域及设备要求

（一）试剂储存和准备区 1、2-8C和-15C冰箱

2、混匀器

3、微量加样器（覆盖1-1000ul）

4、移动紫外灯（近工作台面）

5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

6、专用工作服和工作鞋

7、专用办公用品

（二）标本制备区 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱

2、高速台式冷冻离心机

3、混允器

4、水浴箱或加热模块

5、微量加样器（覆盖1-1000ul）

6、可移动紫外灯（近工作台面）

7、生物安全柜

8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

9、专用工作服和工作鞋

10、专用办公用品 如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。

（三）扩增反应混合物配制和扩增区

1、核酸扩增仪

2、微量加样器（覆盖1-1000ul）

3、可移动紫外灯（近工作台面）

4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

5、专用工作服和工作鞋

6、专用办公用品(四)扩增产物分析区 视检验方法不同而定。基本仪器设备如下：

1、微量加样器（覆盖1-1000ul）

2、可移动紫外灯（近工作台面）

3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）

4、专用工作服和工作鞋

5、专用办公用品 5.人员和样品的安全是由生物安全柜和定向气流共同来保证。PCR实验室设计规程中规定人员和样品必须单向流动。即从 “试剂准备区到样品制备区，再从样品制备走向扩增区和产物分析区”，绝对不能反向流动，以辟免交叉污染。气流方向只规定试剂准备区为微正压或常压，样品制备区为常压或负压，扩增区和产物分析区为负压，压力梯度是从试剂准备到产物分析区，是高到低的。规程并没有规定要做成全新风系统，但是为降低交叉污染的风险，建议做成全新风系统。概述 临床基因扩增实验又称PCR实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点，因此被临床医生广为认可，已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。但是，这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视，因为它对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用。本文主要从临床基因扩增检验实验室的平面布局，空调通风系统设计、气流控制和污染的防制几个方面对 实验室设计中的主要特点进行了阐述。临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是如何避免污染。因此，实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕这个核心问题进行的。下面就对这几个方面分别进说明。2 PCR实验室平面布局 临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。PCR实验室平面布置示意图如图1所示。图1 PCR实验室平面布置示意图 3 实验室空调通风系统设计及压力控制 PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。3.1 试剂贮存和准备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。3.2 标本制备区 该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。3.3 扩增反应混合物配制和扩增区 该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。3.4 扩增产物分析区 该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。4 污染的预防与控制 PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染；天然基因组DNA的污染；试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。4.1 工作区域的严格划分（1）各个实验区域设置合理；（2）各个实验区域要有明显的标记（如醒目的门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。4.2 合理的系统设置（1）合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统；（2）严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。4.3 规范的操作（1）临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作；（2）在实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施；（3）清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外，对一些实验设备还应进行高压消毒处理。4.4 严格的管理（1）严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门；（2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域；（3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。（4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等；（5）扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。4.5 完备的实验室配套设施 完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如超净工作台、离心机、加样器等。

PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。3.1 试剂贮存和准备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。3.2 标本制备区 该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。3.3 扩增反应混合物配制和扩增区 该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。3.4 扩增产物分析区 该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。4.0传递窗口的尺寸：

普通传递窗规格: SAT500 500x500x500（工作尺寸）SAT600 600x600x600（工作尺寸）洁净传递窗规格: SAT600 600x600x600（工作尺寸）SAT1000 600x1000x600（工作尺寸）