第一篇：植物细胞骨架的观察
实验六 植物细胞骨架的光学显微镜观察
一、实验目的：掌握植物细胞骨架处理及染色方法。
二、实验原理：用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮兰R250染色，可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。
三、实验试剂：
1、M-缓冲液；
2、pH6.8磷酸缓冲液； 3、1% TritonX-100，用M-缓冲液配制； 4、0.2%考马斯亮兰R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸缓冲液；
四、实验步骤：
1、撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；
2、吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20min；
3、吸去1% TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次8min；
4、3%戊二醛固定30min；
5、pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次8min；
6、0.2%考马斯亮兰R250染色20min；
7、用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺子载玻片上，加盖玻片，于显微镜下观察。
五、实验作业：
1、绘制你所观察到的植物细胞骨架图象；
2、戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么？在本实验中各起什么作用？
第二篇：实验二、植物细胞骨架的观察
实验
二、植物细胞骨架的观察
一、实验目的
观察植物细胞内网状的骨架结构。
二、实验原理
在真核细胞的细胞质中，存在着由蛋白质纤维构成的网状骨架系统。Triton X-100是非离子去垢剂，用适当浓度的Triton X-100处理细胞，可将细胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保护和维系作用，细胞内其他可溶性成分也随之流失，这样一来水不溶性的细胞骨架系统蛋白质却被保留下来，而这被保留下来的蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，便可在光学显微镜下观察它们——细胞骨架的网状结构。为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。M-缓冲液洗涤细胞,可以提高细胞骨架的稳定性。M－缓冲液和磷酸缓冲液作用都是维持细胞的渗透压
三、实验用品
显微镜、50ml烧杯、盖玻片、载玻片、滤纸、M-缓冲液、磷酸缓冲液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛、洋葱鳞茎。
四、实验方法与步骤
1、撕取洋葱鳞茎内表皮若干片，大小约1平方厘米，置于装有PH6.8的磷酸缓冲液（PBS）的50ml烧杯中，使其下沉。
2、用滤纸吸去磷酸缓冲液（PBS），用1% Triton X-100处理20-30分钟。
3、吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，每次10分钟。
4、用3%戊二醛固定10-15分钟。
5、用磷酸缓冲液（PBS）洗3次，用滤纸吸干。
6、用0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。
7、用蒸馏水洗1-2次，将洋葱细胞置于载玻片上，加上盖片。
8、在光学显微镜下镜检。
五、作业
写出你的实验结果并绘成图。
附：药品配置
1、M—缓冲液（10×原液）
咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巯基乙醇 0.78（0.7ml）蒸馏水 加至1000ml 用时稀释，取50ml（10×原液）加450ml蒸馏水。
2、磷酸缓冲液（PBS）
配方①：
NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（无水）0.10g 0.5%酚红 4ml 双蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3调PH值至6.8。也可先配成10被浓缩液，使用时再稀释。配方②：
6m mol/L PH6.5磷酸盐缓冲液
A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸馏水100ml即为工作液。加入0.5%酚红4ml。3、1% Triton X-100 用M-缓冲液配制。
取1mlTriton X-100液加M-缓冲液至100ml。4、0.2%考马斯亮蓝R250配制
考马斯亮蓝R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸馏水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制
用磷酸缓冲液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸盐缓冲液至100ml。
第三篇：植物细胞骨架的显示及光镜观察
植物细胞骨架的显示及光镜观察
———试剂配制及注意事项
1.M缓冲液：M缓冲液是使细胞骨架中的微丝保持稳定的溶液。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。
配制： 试剂
相对分子质量
所需浓度
每升加量
备注
咪唑
68.08
50mmol/L
3.40g
稳定PH值，缓冲作用。
KCl
74.55
50mmol/L
3.73g
提供离子，对骨架起聚合作用
MgCl2。6H2O 203.30 0.5mmol/L
0.1g
提供离子，对骨架起聚合作用。
EGTA
380.40 1.0mmol/L 0.38g
螯合Ca离子 Ca离子对聚合不利
EDTA。2H2O 372.24 0.1mmol/L
0.04g
螯合Ca离子 Ca离子对聚合不利。
B-巯基乙醇
78.13
1.0 mmol/L
70ul
起还原作用，稳定骨架结构。
甘油
92.09
4.0mmol/L
294.8ul
加水定容至1L，PH调至7.2 注意：B-巯基乙醇
危险品！经皮肤、吞咽吸收有致命危险；刺激眼睛、呼吸道 粘膜，引起慢性咽炎！用药品时应适当穿戴防护服，手套。取用时及时塞好瓶塞。
2.60mM磷酸缓冲液：维持细胞生理平衡使其保持正常活性。
配制：KH2PO4, 0.37g
Na2HPO4.12H2O,1.2 g
加水到500ML
注意：
3.Triton X-100(曲拉通 X-100)化学名称为聚乙二醇辛基苯基:可以处理掉一部分蛋白质，使骨架成分更清晰。
配制方法：用M缓冲液稀释已有浓度的药品。
注意：对人体有危害，皮肤粘上后用大量清水冲洗，不慎入眼时应提起眼睑，用流动清水冲洗并就医，不慎食入后，应大量饮用清水催吐并就医。4.3％戊二醛：室温下较好地保存细胞骨架成分。
配制：25％戊二醛 12ml,6mM磷酸缓冲液 88ml 注意： ①2%酸性戊二醛对金属有腐蚀性；2%中性戊二醛对手术刀片等碳钢制品有腐
蚀性，使用前应先加入0.5%亚硝酸钠防锈。②戊二醛杀菌效果受pH影响大，用酸性或强化酸性戊二醛浸泡医疗器械时，应先用0.3%碳酸氢钠调pH7.5-8.8。pH超过9.0时，戊二醛迅速聚合则失去杀菌能力。
③2%碱性戊二醛室温只可保存2周，其余剂型可保存4周。
④戊二醛对皮肤粘膜有刺激性，接触溶液时应戴手套，防止溅入眼内或吸入体内。⑤配制戊二醛要用蒸馏水，盛放戊二醛溶液的容器要干净。
⑥用戊二醛消毒或灭菌后的器械一定要用灭菌蒸馏水充分冲洗后再使用
5.考马斯亮蓝R-250
配制：考马斯亮蓝R-250 0.2g 冰醋酸7ml
甲醇46.5ml 蒸馏水46.5ml 注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。甲醇对人体有害，误食后可导致失明，肝病，甚至死亡。皮肤粘上后用大量清水冲洗，不慎入眼时应提起眼睑，用流动清水冲洗并就医，不慎食入后，应大量饮用清水催吐洗胃并就医。甲醇易燃，使用时应避免明火，做好防火处理。
冰醋酸有腐蚀性，其蒸汽对眼与鼻有刺激作用，应做好通风与防护。
所有药品使用后统一回收处理
第四篇：细胞骨架的观察
细胞生物学实验
细胞骨架的观察
姓名：邓燕玲 学号：201011202912 专业：生命科学生物科学 实验时间：20121030 指导老师：张伟 同组同学：张丽华
细胞生物学实验
实验目的
1.了解细胞骨架的组成、结构和功能。2.学习细胞骨架标记的原理和方法。3.学习用鬼笔环肽标记微丝的方法步骤。
4.观察小鼠胚胎成纤维细胞和中国仓鼠卵巢细胞的细胞微丝骨架。5.讨论细胞骨架在中学中教学的重点与难点。
实验原理
1.细胞骨架一般是指真核细胞质内的蛋白质纤维网架系统。广义大的细胞骨架包括细胞膜骨架、细胞核骨架和细胞质骨架。直至1963年，科学家用戊二醛在室温下固定成功后，人们才广泛地观察到各类细胞骨架纤维的存在。细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维。不同成分有不同的结构和功能。细胞骨架处于不断地动态平衡中，并且有极性。2.微丝的标记方法可分为在固定细胞中标记和在活体中标记。本实验采用的是固定细胞标记，主要运用带荧光探针的抗体或鬼笔环肽标记，这需要对样品进行化学固定和膜的通透。
3.荧光探针是一种标记物，其中包含的荧光物质在从外界吸收能量后变成激发态，在回到基态时以电磁波的形式释放能量，从而产生荧光。荧光物质在受到长时间的照射后会淬灭。
4.鬼笔环肽（phalloidin）是一种剧毒生物碱，能结合F-actin，而不与G-actin结合，并且在结合后可以抑制微丝的解聚，破坏微丝聚合和解聚的动态平衡。鬼笔环肽对细胞有毒害作用，因此不利于活体细胞的研究。
5.荧光显微镜是用于观察和分析样品中产生的荧光物质的成分和定位的一种光学显微镜，荧光物质在受到激发光的激发下，会发出比激发光波长更长的光，从而在显微镜下观察。
实验器材
1.材料：小鼠胚胎成纤维细胞、CHO中国仓鼠卵巢细胞
2.试剂：PEM缓冲液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM缓冲液），4%多聚甲醛（溶于PEM缓冲液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：荧光显微镜 实验步骤
1.将小培养皿中的培养液用移液枪吸掉，加入预热的1mlPEM清洗，注意不要打在盖玻片
细胞生物学实验
上，洗三次。
2.加入1ml37°C预热的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入预热的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。
6.剪下一段与载玻片宽度一样的封口膜，将封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10L的 55nM Alex –phalloidin，将载玻片有细胞的一面朝下盖片，在暗盒中静置25min。7.用37°预热的PEM洗三次，将载玻片有细胞的一面朝上转移到一个新的载玻片中，在荧光显微镜下观察并拍照。
实验结果 思考题
1.PEM缓冲液的作用是什么？
答：促进微管中肌动蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形态固定，便于观察。2.1％Triton X-100处理细胞的作用是什么？
答：能溶解膜上的脂类和蛋白质，使细胞膜穿孔，便于标记物质进入细胞。3.如何在中学教学中推进细胞骨架的教学？
第五篇：实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观察
实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观察
一、实验目的
了解细胞骨架的结构特征及其制备技术。
二、实验器具及试剂 1．器具
普通光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸。2．试剂
M-缓冲液：咪唑、KCL、MGCL2、EGTA【乙二醇双醚四乙酸】、EDTA、疏基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)；（PH6.8）磷酸缓冲液（用NaHCO3调PH值）；Triton X-100，用M-缓冲液配制；考马斯亮蓝R250,其溶剂为：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml；戍二醛、乙醇、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶等。3.实验材料 洋葱鳞茎
三、实验内容
细胞骨架事由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用。当用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可经细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，就是细胞骨架。
（一）溶液配制（1）M-缓冲液配制：
M-缓冲液(10×原液)：咪唑34.04g，氯化镁(MgCl2•6H2O)1.02g，EGTA（乙二醇双醚四乙酸）3.8g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.29g，巯基乙醇0.78g(0.7ml)蒸馏水加至1 000 ml。使用时，取100 ml(10×原液)加900 ml蒸馏水。（2）6mmol/L（PH6.5）磷酸缓冲液配制： 甲液：NaH2PO4•2H2O，0.938g 溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000ml。乙液：Na2HPO4 •12H2O，2.15g加蒸馏水溶解，最后加水至1 000ml。取甲液685ml，乙液315ml加蒸馏水1000ml即成6mmol/LPH6.5的磷酸缓冲液。
（3）1%Triton X-100，用M-缓冲液配制： 取22ml Triton X-100液加M-缓冲液至200ml。（4）0.2%考马斯亮蓝R250：
考马斯亮蓝R250为0.2g，甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml（5）3%戍二醛，用磷酸缓冲液配制。
（二）实验方法与步骤
（1）撕取洋葱鳞茎内表皮（约1cm2大小若干片）置于装有PH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。
（2）吸去磷酸缓冲液，用1% Triton X-100处理20~30min。（3）吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，每次10min。（4）3%戊二醛固定0.5~1h。
（5）PH6.5磷酸缓冲液洗三次，每次10min。（6）0.2%考马斯亮蓝R250染色20~30min。
（7）用蒸馏水洗1~2次，细胞置于载破片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。
（8）如观察效果好，可制作成永久切片。
在有样品的50ml烧杯中，顺序通过如下药物：50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1/2V95%乙醇+1/2V叔丁醇、叔丁醇（每级5-10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每级5-10min），然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，效果好的，可加一滴中性树胶，盖上盖玻片，即成永久片。
四、实验报告
1．绘出植物细胞骨架微丝结构图。
2．分析在光学显微镜下观察到的细胞骨架的形态特征。
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