细胞骨架观察实验设计[5篇范文]

第一篇：细胞骨架观察实验设计

细胞骨架观察实验设计

I、实验内容

一、正常细胞

二、秋水仙素处理 三、VP16处理 四、低温处理 II、实验流程

一、细胞传代

二、细胞爬片

1~2d

三、细胞处理

6h

四、细胞固定、免染、观察

1d III、实验过程

一、细胞传代

1、实验材料

VEC

2、实验器材

超净台、CO2培养箱、普通冰箱、倒置显微镜、离心机、离心管、微量加液器、吸管、细胞培养瓶（皿）、镊子、酒精灯、消毒酒精、废液缸

3、试剂

胰酶、PBS、培养液（牛血清、双抗）

二、细胞爬片

已处理盖片

三、细胞处理

细胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱

四、细胞固定、免染、观察

1、实验材料

已处理的爬片

2、实验器材

离心机、离心管、玻璃培养皿、载玻片、滤纸、封口膜、温箱、荧光显微镜、微量加液器、镊子

3、试剂

PBS、BSA封闭液、一抗、二抗、蒸馏水、DAPI

4、步骤

固定

爬片置于玻璃培养皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min 吸弃PBS，加-20℃预冷甲醇，固定5min 吸弃甲醇，PBS洗3次，每次2min 免染

吸弃PBS，加100uL 2﹪BSA封闭液，盖上培养皿盖，室温固定15min 滤纸吸去片子上封闭液，加30uL（1:500）稀释一抗，盖上封口膜（勿大于盖片），37℃孵育30min ,边上滴一滴PBS PBS洗3次，每次5min 在边缘吸弃PBS（滤纸），滴加30uL（1:200）稀释二抗，避光，盖封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min 吸弃PBS，蒸馏水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干

干净载玻片上，滴加3uLDAPI，将爬片镊子夹上，反盖于防淬灭剂上 荧光镜观察

IV、注意事项

1、区分盖片正反面

2、保持样品湿润

3、一抗二抗孵育后，封口膜轻轻冲起

4、二抗孵育后，避光操作，以免荧光淬灭

5、标本染色后立即观察，不看时4℃保存

第二篇：细胞骨架的观察

细胞生物学实验

细胞骨架的观察

姓名：邓燕玲 学号：201011202912 专业：生命科学生物科学 实验时间：20121030 指导老师：张伟 同组同学：张丽华

细胞生物学实验

实验目的

1.了解细胞骨架的组成、结构和功能。2.学习细胞骨架标记的原理和方法。3.学习用鬼笔环肽标记微丝的方法步骤。

4.观察小鼠胚胎成纤维细胞和中国仓鼠卵巢细胞的细胞微丝骨架。5.讨论细胞骨架在中学中教学的重点与难点。

实验原理

1.细胞骨架一般是指真核细胞质内的蛋白质纤维网架系统。广义大的细胞骨架包括细胞膜骨架、细胞核骨架和细胞质骨架。直至1963年，科学家用戊二醛在室温下固定成功后，人们才广泛地观察到各类细胞骨架纤维的存在。细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维。不同成分有不同的结构和功能。细胞骨架处于不断地动态平衡中，并且有极性。2.微丝的标记方法可分为在固定细胞中标记和在活体中标记。本实验采用的是固定细胞标记，主要运用带荧光探针的抗体或鬼笔环肽标记，这需要对样品进行化学固定和膜的通透。

3.荧光探针是一种标记物，其中包含的荧光物质在从外界吸收能量后变成激发态，在回到基态时以电磁波的形式释放能量，从而产生荧光。荧光物质在受到长时间的照射后会淬灭。

4.鬼笔环肽（phalloidin）是一种剧毒生物碱，能结合F-actin，而不与G-actin结合，并且在结合后可以抑制微丝的解聚，破坏微丝聚合和解聚的动态平衡。鬼笔环肽对细胞有毒害作用，因此不利于活体细胞的研究。

5.荧光显微镜是用于观察和分析样品中产生的荧光物质的成分和定位的一种光学显微镜，荧光物质在受到激发光的激发下，会发出比激发光波长更长的光，从而在显微镜下观察。

实验器材

1.材料：小鼠胚胎成纤维细胞、CHO中国仓鼠卵巢细胞

2.试剂：PEM缓冲液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM缓冲液），4%多聚甲醛（溶于PEM缓冲液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：荧光显微镜 实验步骤

1.将小培养皿中的培养液用移液枪吸掉，加入预热的1mlPEM清洗，注意不要打在盖玻片

细胞生物学实验

上，洗三次。

2.加入1ml37°C预热的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入预热的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段与载玻片宽度一样的封口膜，将封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10L的 55nM Alex –phalloidin，将载玻片有细胞的一面朝下盖片，在暗盒中静置25min。7.用37°预热的PEM洗三次，将载玻片有细胞的一面朝上转移到一个新的载玻片中，在荧光显微镜下观察并拍照。

实验结果 思考题

1.PEM缓冲液的作用是什么？

答：促进微管中肌动蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形态固定，便于观察。2.1％Triton X-100处理细胞的作用是什么？

答：能溶解膜上的脂类和蛋白质，使细胞膜穿孔，便于标记物质进入细胞。3.如何在中学教学中推进细胞骨架的教学？

第三篇：植物细胞骨架的观察

实验六 植物细胞骨架的光学显微镜观察

一、实验目的：掌握植物细胞骨架处理及染色方法。

二、实验原理：用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，后者用考马斯亮兰R250染色，可在光学显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。

三、实验试剂：

1、M-缓冲液；

2、pH6.8磷酸缓冲液； 3、1% TritonX-100，用M-缓冲液配制； 4、0.2%考马斯亮兰R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸缓冲液；

四、实验步骤：

1、撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；

2、吸去pH6.8磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20min；

3、吸去1% TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次8min；

4、3%戊二醛固定30min；

5、pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次8min；

6、0.2%考马斯亮兰R250染色20min；

7、用蒸馏水洗1-2次，将内表皮细胞平铺子载玻片上，加盖玻片，于显微镜下观察。

五、实验作业：

1、绘制你所观察到的植物细胞骨架图象；

2、戊二醛、考马斯亮兰R250、TritonX-100是什么？在本实验中各起什么作用？

第四篇：实验二、植物细胞骨架的观察

实验

二、植物细胞骨架的观察

一、实验目的

观察植物细胞内网状的骨架结构。

二、实验原理

在真核细胞的细胞质中，存在着由蛋白质纤维构成的网状骨架系统。Triton X-100是非离子去垢剂，用适当浓度的Triton X-100处理细胞，可将细胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保护和维系作用，细胞内其他可溶性成分也随之流失，这样一来水不溶性的细胞骨架系统蛋白质却被保留下来，而这被保留下来的蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，便可在光学显微镜下观察它们——细胞骨架的网状结构。为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。M-缓冲液洗涤细胞,可以提高细胞骨架的稳定性。M－缓冲液和磷酸缓冲液作用都是维持细胞的渗透压

三、实验用品

显微镜、50ml烧杯、盖玻片、载玻片、滤纸、M-缓冲液、磷酸缓冲液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛、洋葱鳞茎。

四、实验方法与步骤

1、撕取洋葱鳞茎内表皮若干片，大小约1平方厘米，置于装有PH6.8的磷酸缓冲液（PBS）的50ml烧杯中，使其下沉。

2、用滤纸吸去磷酸缓冲液（PBS），用1% Triton X-100处理20-30分钟。

3、吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，每次10分钟。

4、用3%戊二醛固定10-15分钟。

5、用磷酸缓冲液（PBS）洗3次，用滤纸吸干。

6、用0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。

7、用蒸馏水洗1-2次，将洋葱细胞置于载玻片上，加上盖片。

8、在光学显微镜下镜检。

五、作业

写出你的实验结果并绘成图。

附：药品配置

1、M—缓冲液（10×原液）

咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巯基乙醇 0.78（0.7ml）蒸馏水 加至1000ml 用时稀释，取50ml（10×原液）加450ml蒸馏水。

2、磷酸缓冲液（PBS）

配方①：

NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（无水）0.10g 0.5%酚红 4ml 双蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3调PH值至6.8。也可先配成10被浓缩液，使用时再稀释。配方②：

6m mol/L PH6.5磷酸盐缓冲液

A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸馏水100ml即为工作液。加入0.5%酚红4ml。3、1% Triton X-100 用M-缓冲液配制。

取1mlTriton X-100液加M-缓冲液至100ml。4、0.2%考马斯亮蓝R250配制

考马斯亮蓝R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸馏水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制

用磷酸缓冲液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸盐缓冲液至100ml。

第五篇：细胞骨架组分的荧光染色观察

细胞生物学实验报告

细胞骨架组分的荧光染色观察

姓名：

学号：

班级：

专业：

同组成员：

一、实验原理

鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。

由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用。因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。

二、实验目的

1．掌握细胞骨架的显示方法 2.掌握荧光显微镜的使用方法

3.了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构

三、实验器材 1.材料：

CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 2.试剂：

PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液。4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液。3.仪 器

超净工作台、CO2培养箱、荧光显微镜 4.其它用品：

盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。

四、方法与步骤

由于上节课鸡胚成纤维细胞被污染，本次实验所用细胞为CHO细胞（1）准备好实验器材。（本次实验无需在超净台中进行）

（2）将上节课进行细胞爬片的培养皿从培养箱中取出，取出盖片，于小平皿中。（3）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100处理约10min(1mL)（5）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)（7）37℃预温 PEM洗3次

（8）55nM Alex-phalloidin 10µL湿盒中室温染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。（10）37℃预温 PEM洗数3次，滴加10µL Ho.33342复染色。（11）荧光显微镜下观察并拍照。

五、注意事项

1.盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻。2.注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 3.各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 4.荧光观察注意避光操作，防止荧光淬灭。5.节约试剂。

六、实验结果

本次实验我们对CHO细胞爬片结果进行了荧光染色，在荧光显镜下用不同波长的激发光对细胞骨架微丝结构及细胞核进行了观察、拍摄照片并将结果叠加。得到以下的实验现象：

图1.CHO细胞微丝荧光染色图

图2.CHO细胞核荧光染色图

图3.CHO细胞微丝及细胞核荧光染色合成图

从拍摄的照片可以较为清晰的看到CHO细胞骨架的微丝被染成了绿色，细胞核被染成蓝色；微丝的形状为长条的纺锤状细丝，遍布整个细胞，在细胞中起到了类似骨架般的支撑作用；细胞核为椭圆形，之后再将两图合成，可观察到细胞核被遍布的微丝结构包围。实验较为成功。在实验时要注意荧光染料均存在淬灭问题，所以要尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。

【参考文献】

[1] 桑建利, 谭信.细胞生物学实验指导.北京:科学出版社, 2010.[2] 北京师范大学生命科学学院.细胞生物学实验.北京:北京师范大学生命科学学院,2015.9.