实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）

第一篇：实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）

大肠杆菌总DNA的提取

实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。

实验目的：1.掌握DNA提取的原理和方法；

2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 实验材料：

1.实验菌株：大肠杆菌

2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：

溶菌酶（50mg/ml）

5M NaCl

氯仿：异戊醇（24：1 v/v）

无水乙醇

0.8%琼脂糖

TAE电泳缓冲液 仪器：离心机，电泳仪 实验步骤：

1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清； 2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；

3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min； 4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。5)加入110ul 5 M 高氯酸钠 使其终浓度为1 M，充分混匀；

6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，吸取上清于一新离心管中；

7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min； 8)弃上清，离心管在空气中自然晾干； 9)加入30-40ul TE溶解DNA；

10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。

第二篇：实验四 植物DNA的提取[定稿]

实验四

植物DNA的提取

一、实验目的

掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。

二、实验原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物，这种复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl），降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB-核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB。提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的浓度测定和纯度分析

（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、试剂和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml(2)CTAB分离缓冲液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL。(4)TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:异戊醇=24:1(6)液氮

(7)研钵，恒温水浴（37～100℃），离心机，离心管。

四、操作方法：

(1)将10mlCTAB分离缓冲液加入50ml离心管中，置于65℃水浴中预热。(2)称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

(4)样品于65℃保温30分钟，每5～10分钟混匀一次。(5)加等体积（10ml）的氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。(6)室温下4000r/min离心10分钟。

(7)用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中间白色的蛋白质层），向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA析出。（有些情况下，这一步可以产生云雾状的DNA析出，如果看不到云雾状的DNA，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云雾状的DNA析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA中轻轻转动，缠起DNA，然后将玻璃棒转移至20mL洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA沉淀从玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云雾状的DNA，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA沉淀自然干燥20分钟。(9)用玻璃棒缠出DNA，在室温下使DNA自然干燥20分钟。(10)

将自然干燥的DNA溶于1mLTE缓冲液中，—20℃保存备用。

(11)

取100uL稀释20倍，测定A260，A280，A230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

五、思考题

1、CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？

2、吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？

第三篇：DNA提取问题集

DNA提取问题集

默认分类 2009-12-31 18:59:50 阅读155 评论0字号：大中小

提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰，DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？ 参考见解：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。

3、沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物，将清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下 DNA 部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。

上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。血样4度保存了2月，现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA，有什么解决办法？ 参考见解：按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来，下面是参考方法：

1、首先洗出白细胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴过夜。

4、用等体积的（酚，氯仿，异戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min离心收集水相。

5、取水层，加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥将DNA溶于适量水中。

CTAB法提取水稻基因组DNA，TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测，点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜，鉴定时发现DNA已经被完全切烂，只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用NEB 公司产的酶，更换EP管，灭菌水之后重复几次，结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照，酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀，换了TE溶解，检测主带仍旧清晰，可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么？

参考见解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用异丙醇（因其不易挥发）而用无水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用时间太长了。

建议重提DNA，取少许用超纯水溶解（非TE），按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解；

要得到全血基因组DNA，可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗？这样做，与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异？ 参考见解：

1、觉得还是先分离细胞好，因为DNA和RNA大都是在细胞核内，有红细胞反而不太好。从血里面提RNA，用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的，效果还是不错的。

2、现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA，用密度梯度离心，只是富积淋巴细胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话，没必要。

3、如果对基因组的要求不高，可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加无菌重蒸水500μl；10 000r/分钟离心3分钟，弃净上清；加20μl 5mol/L KI，旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡30秒；10 000r/分钟离心5分钟，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加异丙醇60μl，轻轻混匀，10 000r/分钟离心5分钟，弃上清；加冷无水乙醇1000μl，10 000r/分钟离心5分钟；弃去无水乙醇，37℃烤干；50μl无菌重蒸水或TE，混匀溶解备用。

从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗？

参考见解：可以的，国外有好多相关试剂盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的吗？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以吗？每次在用酚氯仿异戊醇抽提后，上层里面都是絮状的蛋白质，离心几次都沉淀不下来，请问是哪里出了问题？

参考见解：一般来说，蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁，二者作用各异，不可替代。对于实验中的蛋白问题，建议离心后先用竹签挑出蛋白，小心吸取上层清液，再重复抽提几次试试。

一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K，这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化，不是很难除去吗？那DNA是不是不纯？可以用来酶切吗？

参考见解：蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白，而是消化细胞，在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物细胞的较易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化组蛋白，释放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建议还是加蛋白酶k为好，这样提出来的 DNA分子量会高一点，且更纯。提白粉孢子的总DNA，白粉孢子比较小，直接在研磨中加液氮研磨可以吗？

参考见解：液氮研磨的方法应该可行的，做动物组织，植物组织多采用这种方法，植物纤维一样可以用液氮研磨，要有耐心，边加液氮边研磨，研磨好后再抽提，应该是可以的。在CTAB法提取DNA时，有一些品种没有DNA析出，是什么原因？ 参考见解：

1、用预冷的异丙醇来沉淀试试，同时研磨的时候要研的非常非常的细。

2、没有看到析出物并不代表没有沉淀，可以继续下一步试验，溶解的时候少加一点儿。

3、高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌

冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，怎样更好的抑制内源核酸酶的活性？ 参考见解：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取，虽然总DNA提出来了，可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来，请有没有什么好的办法可以解决这个问题？

参考见解：环境特别是土壤的样品成分复杂，尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质，因此用一般的国内试剂盒无法提纯。应当选用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留？

参考见解：细胞裂解不充分，裂解液和样品要快速充分混匀。洗涤产物中DNA量很少或没有？ 参考见解：

1、样品中细胞或者病毒浓度低。

2、裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。

4、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。

5、在上柱前，裂解物中没有加乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇。

6、DNA没有有效洗脱，提高洗脱效率，可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min，再离心。

7、洗脱液pH不合适，低pH值会减少DNA产率，确保洗脱液pH在7.0－8.5之间。8洗脱体积太大，超过200ul洗脱体积所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

第四篇：dna粗提取和鉴定

dna粗提取和鉴定

实验用具

洋葱或其他植物、洗洁精、食盐、搅拌机或研钵(我们采用的是家用豆浆机)、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、试管(20mL两支)、天平，dna粗提取和鉴定。95%酒精、蒸馏水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂。

实验材料的选取

凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。

原理

①加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

②加入洗涤剂和食盐的作用

洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③研磨不充分，对实验结果产生的影响

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

④此步骤获得的滤液中可能含有的细胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

实验步骤

1.破碎细胞，获取含DNA的滤液

动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋

.葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

2.去除滤液中的杂质

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

注意事项

①用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

②方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

DNA的析出与鉴定

将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA，鉴定材料《dna粗提取和鉴定》。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

实验步骤

1.称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。

洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰;或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器(榨汁机)。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。

2.研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。

3.向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。

此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌(不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物;搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。

4.鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。

注意事项

1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。

2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。

4.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：

当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。

5.盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。

第五篇：实验四动物血液中DNA的提取-教案

授课教师常祖明学生人数 55

课题血液基因组DNA的提取

授课类型新授课授课方法讲授、演示 教学用具多媒体、实验室设备

教学目的掌握鸡血DNA提取的原理及方法

教学重点理解实验过程中每一步操作的目的及原理 教学难点 教学过程

一、实验目的

1.掌握鸡血DNA提取的原理；

2.掌握鸡血DNA提取的方法及操作过程。

二、实验原理

哺乳动物的成熟红细胞已经高度分化，因而当中没有细胞核，无法提取DNA。禽类的血细胞则可以。禽类代谢旺盛，血液中红细胞更多，而且红细胞中有完整的细胞核、大量的染色体。且材料易得、经济。用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

三、实验仪器 1.水浴锅：55℃

2.离心机：8000转、12000转 3.离心管：5ml（120个）

4.移液枪：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml 5.容量瓶：100ml 6.取血针及管

四、实验材料及药品

实验材料：普通家鸡：需血液4.08ml（每管136(l）1.无水乙醇

作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。

商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。

理化性质：无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。2.柠檬酸

作用：ACD抗凝血剂成分之一。在抗凝剂中，中和柠檬酸钠的碱性。商品信息：分析纯AR，白色塑料瓶/500g，理化性质：无臭，有很强的酸味，白色粉末或颗粒，易溶于水和醇。在潮湿的空气中微有潮解性。

储存：在湿空气中有轻微潮解，需阴凉密封干燥保存。

危害：柠檬酸浓溶液对黏膜有刺激作用。柠檬酸可燃。粉体与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧爆炸的危险。3.柠檬酸钠

作用：ACD抗凝血剂成分之一。能与血液中的钙离子结合成螯合物，而使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固。

商品信息：柠檬酸三钠分析纯500克/瓶。

理化性质：有机化合物，外观为白色到无色晶体。无臭, 有清凉咸辣味。常温及空气中稳定, 在湿空气中微有溶解性, 在热空气中产生风化现象。加热至150℃失去结晶水。易溶于水、可溶于甘油、难溶于醇类及其他有机溶剂，过热分解，在潮湿的环境中微有潮解，在热空气中微有风化，其溶液 pH 值约为8。储存： 常温密闭保存 危害：无毒 4.尿素

作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白质变性，尤其能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质。

商品信息：化学试剂分析纯 500克/瓶（塑料瓶装）理化性质：无色柱状结晶或白色结晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，难溶于乙醚，不溶于氯仿。储存：密封避光保存。

危害：避免与皮肤和眼睛接触。5.十二烷基硫酸钠(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白质复合体，用于从蛋白质中分离核酸。商品信息：500g/分析纯AR。

理化性质：白色或淡黄色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于热水，溶于水，溶于热乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。储存：密封阴凉干燥保存 防止受潮受热 危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。该品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。6.1M Tris-HCl(PH8.0)缓冲液

作用：禽血裂解液成分之一。提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏 商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液

理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。

储存：室温保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。7.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）

作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。

储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。

危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化组蛋白，释放出DNA；消化DNase，提高DNA产量 商品信息：（20mg/mL）1ml/支。

理化性质：一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌中纯化得到。储存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。危害：使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质。9.Tris饱和酚（共需60ml，每管2ml）作用：强蛋白质变性剂。商品信息：瓶/250ml。理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。

储存：4℃避光保存。

危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。储存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。11.异戊醇

作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。12.无水葡萄糖

作用：ACD抗凝血剂成分之一。商品信息：500g/瓶。

理化性质：无色结晶或白色结晶性粉末；无臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。储存：无水葡萄糖易吸水结块，因此应密封保存。危害：无。

五、实验试剂 1.75%的乙醇

{75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇

2.ACD抗凝剂 100ml（共需48ml，每管0.8ml）

{柠檬酸0.48g + 柠檬酸钠1.32g + 葡萄糖1.47g} →加水至100ml，灭菌后备用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）

{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0)10ml + 0.5M EDTA(PH8.0)20ml} →加水定容至100ml，备用。

【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-异戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml {氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存

5.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml {氯仿-异戊醇（24:1）40ml + Tris饱和酚40ml} = 80ml，4℃保存 6..TE缓冲液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → →定容到50ml →高压灭菌后冷却4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} →定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液

六、实验步骤

1.采用翅静脉采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振荡混匀，配成家鸡血样25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比无水乙醇效果好，血样不至于太干涩。酒精:血(4:1)混合的血样保存时间长，可达4个月。

2.取血样(酒精:血＝4:1)680(L至5mL离心管中，8000转离心1分钟，弃上清； 目的：去除血样中大部分的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。

3.加800(LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；再加800(LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；

目的：ACD抗凝剂可以螯合血液中的钙离子，防治血细胞凝集成团凝固，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。多次离心可以去除血样中的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。4.加1700(L裂解液，10(L蛋白酶K（100(g），摇匀，55℃水浴保温过夜； 目的：DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来，蛋白酶k还可以消化DNAse，提高DNA产量。55℃水浴保温过夜可以让蛋白酶K充分发挥作用。

5.加2mL饱和酚，摇匀至无块状物，12000转离心10分钟；

目的：饱和酚是强蛋白质变性剂，可以将蛋白质及降解后的产物充分变性，变性后的蛋白质溶解度减低，易沉淀。

6.吸取上层透明的DNA溶液至另一5mL离心管中，注意不要搅拌下层的酚－蛋白层；

目的：加入饱和酚后溶液分层，上层是透明的DNA溶液，再往下是变性的蛋白质，饱和酚的比重最大在最下层。

7.加2mL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），摇匀至悬浮液，12000转离心10分钟； 目的：加入酚-氯仿-异戊醇进一步去除DNA溶液中的残留蛋白质。

8.吸取上层DNA液于另一5mL离心管中，加1.8mL氯仿-异戊醇溶液，摇匀，12000转离心10分钟； 目的：由于酚与水有部分混溶，DNA水溶液中会混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-异戊醇在抽提一次可以把酚带走。

9.吸取上层DNA液900(L于另一5mL离心管中，加无水乙醇至满，颠倒混合，试管中出现白色团块，即是DNA；

目的：DNA水溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇与DNA不相溶但与水相溶，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用无水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA会部分溶于水中，降低DNA沉淀的产量。

10.吸出试管中的无水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重复2次；

目的：像前面步骤中加入的抗凝血剂中的柠檬酸钠、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，经乙醇沉淀后的DNA中会有以上杂质存在。以上杂质有个共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗涤，可以利用其中的15%的水溶解这些杂质除去。11.将DNA自然晾干后溶入1000(L TE缓冲液，-20℃保存；

目的：乙醇已挥发除去，TE缓冲液一可以抑制Dnase活性，二维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。

七、实验注意事项

1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作； 2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；

3.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔； 4.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；

5.吸出试管中的无水乙醇时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。

八、思考题

1.本实验中几次用到的不同浓度乙醇的作用是什么？

九、实验安排

全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。每组作3个离心管，共用一个研钵。

每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。