western 内参选择 大讨论

第一篇：western 内参选择 大讨论

在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，看到很多站友对内参的选择 经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。

我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。1。为什么一定需要内参？内参的重要性。2。常用的几种内参。

3。不同的情况如何选择不同的内参。支持一下！

1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。

2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin(球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。

3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！个人一些见解，供参考！

内参的重要性，必要性：

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

我想问一下,内参和目的蛋白相差15kD能不能将膜上他门的位置(用预染)分别剪下来,孵育啊?还是必须得跑两张膜一个内参一个目的蛋白啊?洗膜的时候可以放在一起洗么?如果他们是同源的二抗可以放在一起孵育么? 回答楼上的问题：完全可以剪开分别加一抗孵育，我就是这么做的；洗膜时最好分开洗涤，放在一起的话两张膜可能重叠在一起，影响洗膜效果；如果不剪膜，你两个一抗来源相同而且特异性很好（单抗）的话，可以一起孵育，不过应该注意可能存在的交叉反应，你可以尝试一下看看结果再定。本人是新手，问一个很汗的问题，原核表达也需要做内参么？做内参的蛋白在哪里找？ 不甚感激

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：

一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我们实验室使用最多的是***工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，价格为988元人民币。虽然公司网上称稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，但我们一般按照1：5000～6000稀释，不过效果确实非常好，荧光条带非常亮，而且抗体使用3～4次也没太大改变。

我们也使用过博奥森的beta-actin，200ul 480元，稀释比1：200～500。因为稀释比不高，所以价格并不便宜。更可气的是，我PC 12细胞居然有两条条带，小鼠也是两条。我也同意剪开,但是别忘记一个问题.你 要确保你剪开的部位没有蛋白.kang chen的HRP－标记内参很好

不需要剪膜 更为直观，有说服力 我做了半年的western,就我对内参的理解如下

1.所选内参有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致.2.做内参可以:一,检验你的整套western装置是否正常run effectively.包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等.二检测你的样品蛋白含量是否相等.3.选择内参要根据你的目的蛋白的性质即你的 目的蛋白是胞内还是核内,你蛋白的 分子量是大是小,当然还有价钱以及你的目的.4.一般内参是比较容易作出来的,同时它也是帮助你摸索条件的,你把其做漂亮,你后面就很顺利了,只是转移的条件有点变化.其余照样或根据说明书操作.我想请问一下如果内参和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的内参都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分块胶来跑呢？

那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。

也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。http:// http:// https:// http://

2, 选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体。主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).相关网址如下: http:// http:// http://www.xiexiebang.comA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然我认为这种可能性出现的几率比我买彩票中大奖差不多。今晚回答这个问题对于我来说也是一个考验，很多基础知识都是通过网络和拚命的回忆来的，也算是对于actin这个内参的一个全面了解了，希望有所帮助。

补充一点选内参的原则：所选的内参与目的基因之间不能有调节关系，否则内参就不客观了，如：你是做与糖代谢相关的基因就不能选GAPDH，与细胞骨架相关的就不能选β-actin。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作 在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：

一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C－端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。我来说点不同看法

内参是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案显然是否定的.只有在需要得到可发表的结果的情况下,才有必要做一个漂亮的内参.1: western本身就是一个很粗略的定量方法,严格的说,根本不具有定量的能力,所有从werster里出来的表达量的区别(明显的“有”“没有”的区别属于定性），都是不精确的，苛刻点说，压根就是不可采信的。所以内参只是一个为了结果完整性而出现的东西，平时做western如果次次做内参，完全没有必要，也没什么太大帮助

2: 那么如何控制上样量，有很多办法，可以通过SDS-PAGE粗略判定，这个方法一点不比用内参差，那些abundant protein在胶上完全可以通过肉眼辨别条带的深浅，反倒是用western判断很困难，在western结果出来都是很黑的条带，不一定在胶上看起来就一样.而最直接的办法是在准备sample的时候就下好功夫，取多少个细胞，最终溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的时候每条lane大概有多少细胞的.内参，尤其是werstern的内参，绝大多数情况是作为“漂亮的马后炮”出现的,当你前期控制完之后，再放上一个内参告诉别人“看，的确如我所料”.werstern次次做内参,完全没有必要

要发文章还是要用内参更有说服力，前面的同志们在讨论的时候主要针对的是动物体系，不知生物公司的内参一抗对植物材料WB是否通用？我想请教一下；做水稻受病原菌处理后线粒体的蛋白的变化，采用什么内参比较好？一般病原菌处理植物后发生的PCD会不会影响action的表达差异性？选择GAPDH可以吗？希望针对植物蛋白和动物蛋白在WB过程中选择内参需要注意的事项进行交流讨论！

可供选择的内参除了前面说过的actin和tubulin，还有Ubquitin，elgf等。但是，最重要的是一定要确定试验的处理因素不会对选择的内参蛋白表达产生影响，比如常用的tubulin，可能就不太适合用来定量有丝分裂相期的蛋白表达情况。因此，如果有条件，最好在预实验中平衡比较一下多种内参再选择最优。当然，对于我们大多数人来说，只要回顾一下本研究领域的权威参考文献，大概就可以确定哪种内参在这种实验中已经得到公认了！

关于内参的应用问题，国内一直还没有形成应用的习惯，可能是有研究水平的原因，也有可能是内参的抗体大部分是国外产的，超级贵！前段时间为了一篇文章，用的内参外国人老不相信，老板一狠心买了两只chemicon内参，50ug包装，每支3000多！不过好在我们有自己做的一支很好用的内参单抗，平常的实验可以保证敞开用，国内其他大部分实验室可能就没这么好的运气了！但是老板经过此事也下决心要把这个抗体完整详细的鉴定出来，然后推出去让大家都来用提高它的可信度。目前，鉴定的工作已经差不多完成了，剩下的就是申请专利，不管最后是怎么卖出去，国产的东西应该会大大便宜于国外的，这对大家来说可能也算一个好消息吧

不太苟同 sixday1004兄对内参的某些看法.sixday1004 wrote: 我来说点不同看法

内参是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案显然是否定的.只有在需要得到可发表的结果的情况下,才有必要做一个漂亮的内参.这么肯定的将内参的作用局限在“需要得到可发表的结果的情况下”的狭小范围内，似乎有些不妥。科研过程中，有谁能未卜先知到实验结果？没有内参的作用，我们如何得知得到的结果就是“可发表的结果”？

1: western本身就是一个很粗略的定量方法,严格的说,根本不具有定量的能力,所有从werster里出来的表达量的区别(明显的“有”“没有”的区别属于定性），都是不精确的，苛刻点说，压根就是不可采信的。所以内参只是一个为了结果完整性而出现的东西，平时做western如果次次做内参，完全没有必要，也没什么太大帮助

western的确是一种半定量的方式，不是很精确，但这决不是因噎废食甚至是“破罐子破摔”的理由。内参的出现，就是为了在一定程度上弥补WB的不足而必须的一种实验设计，只有这样我们才有可能对每次的WB结果进行分析。请注意，内参不是完整性结果的“果”或“附属品”，而是“因”或“前提”，颠倒了两者的关系，可不是一种科学严谨的实验态度哦。

当然，如果是同一批样品，在保证上样体积一致的情况下，是可以不必次次做内参的。

2: 那么如何控制上样量，有很多办法，可以通过SDS-PAGE粗略判定，这个方法一点不比用内参差，那些abundant protein在胶上完全可以通过肉眼辨别条带的深浅，反倒是用western判断很困难，在western结果出来都是很黑的条带，不一定在胶上看起来就一样.而最直接的办法是在准备sample的时候就下好功夫，取多少个细胞，最终溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的时候每条lane大概有多少细胞的.WB结果出来很深的条带，那是因为曝光时间太长的缘故，可以适当减少曝光时间或通过其它有效方法来降低条带的亮度，这样之后还是能够很容易在胶片上判别的。条带的亮度与上样量并不是一直都是线形关系的，不仅WB如此，考马斯亮蓝染色也是如此。SDS-PAGE上的丰度蛋白本身就具有很多不确定性，比起已知的内参，利用其作为判定标准更在无形中增加了判断误差的风险。

比较认同您关于“准备样品时下好功夫”的观点，不仅仅是可以尽量保证总蛋白量的一致，更重要的是良好的蛋白样品会有好的电泳行为，直接影响到WB条带的质量。即便如此，每次准备样品后，内参还是要有的。

内参，尤其是werstern的内参，绝大多数情况是作为“漂亮的马后炮”出现的,当你前期控制完之后，再放上一个内参告诉别人“看，的确如我所料”.“漂亮的马后炮”，我们的确也常在茶余饭后这样调侃内参的作用。但在实验中，它的确是我们评价实验结果的“基石”，只有这样，我们才能理直气壮的指着内参告诉别人，“看，的确如我所料”。

werstern次次做内参,完全没有必要

请sixday1004兄三思，指教。

个人观点，仅对事，仅供参考。

做内参的目的是为了保证蛋白上样量相近/相等.仔细想一下到底有多少实验需要相对精确的上样量就知道了,其实并没有太多.1: 如果你是为了做kinetic assey之类的,那么蛋白量是需要相当的精确,靠WB的内参显然是远远不够的

2: 如果是为了detect到不同sample蛋白量的区分,那是需要并且如果想发表,结果中是必定要有内参的.但是,依然有精确度的问题.倘若变化范围很小,光靠内参有说服力么?还是要回到更精确的蛋白定量上去;而倘若范围变化很大,例如RNAi之类的,又需要用到内参这样相对“精确”的方法么? SDSPAGE甚至sample制备的时候做的一些控制已经绰绰有余了.3: 还有一个是顺序问题,请问有哪个人在做RNAi screening之类实验的时候,每个sample做内参的?都是挑好clone了之后想做个发表结果的图的时候才放上内参的吧.否则先不谈浪费antibody的问题,光是花掉的时间和获得的效果,有性价比么?很多人做fusion protein detection的时候甚至连SDS-PAGE都省了,直接上DOT BLOT(一般买的tag antibody质量都很好).内参用在一些“关键性”的情况下才有意义.并且这个范围还很狭小,既不能太小(内参不够精确),也不能太大(SDSPAGE可以做到同样效果).4: 至于LS某人提到的习惯问题,我只想说..国外好象也没听过WB次次用内参的,这个和科研水平高低毫无关系,因地制宜吧,不用这么死板.WB常用内参及其技术参数

内参名称 分子量大小 适用范围 beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞 GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞 Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞 VCDA1/Porin 31kDa 线粒体 COXIV 16kDa 线粒体 TBP 38kDa 细胞核

第二篇：大讨论

唐山市公共交通总公司

关于开展“解放思想、改革开放、创新驱动、科学发展”

大讨论活动的情况汇报

城管局：

根据市委“大讨论”活动的实施方案要求，唐山市公共交通总公司联系工作实际，认真开展了大讨论活动，努力实现在解放思想上有新进步、在体制上有新突破、在工作上有新作为，确保城市公交与全市发展大局同步推进。现将我单位在大讨论活动中发现的问题及改进措施汇报如下：

一、具体问题的查找情况

（一）从外部讲，公交面临的问题主要是：

1、新一轮城市发展带来的压力。随着我市城市快速扩容，城市人口以及机动车出行率的急剧增长，给公交带来了前所未有的困境。一是公交路权问题。目前，我市仅在建设路使用了一条公交专用道，致使我市公交车正常运营得不到保障，难以吸引群众愿意乘公交、更多的乘公交。二是扩容区域群众需求问题。今年，我们已收到人大、政协有关开通、延伸公交线路的建议和提案18件，但均存在很大难度。主要原因有：（1）由于现有公交车数量有限，难以抽调车辆开通新线路；（2）开通冷辟线路，会给 1

公交带来更大的政策性亏损；（3）个体班线在城市区域运营，致使公交线路开通受到阻挠。

2、综合治理带来的压力。社会车辆侵占公交车停靠站和场站的进出口不按规定停放等现象严重，而公交没有执法权，对此也是力不从心。

3、缺少履行公益性的政策保障机制。唐山公交自1996年以来，一直严格执行政府指定的低票价，较好的履行了社会公益性职责。因我市至今没有对公交政策性亏损建立保障机制，虽然自2011年开始实行了定额（非足额）补贴，2013年增加到8000万元，但仍与履行公益性带来的政策性亏损有很大差距，致使企业正常经营资金缺口较大，影响了企业良性发展。

（二）从内部看，公交面临的问题主要是：

1、公交车保有量不足。现阶段万人拥有公交车仅为10.37标台（按照2011年统计城市人口197.08万计算）。按照现有的人口总量计算，距省要求到2015年达到15台标还需净增加900余量公交车（按照10米车计算）；再有按照《河北省机动车氮氧化合物排放总量减排实施方案》以及我市据此拟定的实施方案（代拟稿）要求，我市有890车黄标车应在2015年前淘汰。现阶段，我市已高度重视了公交车的更新，但按照每年500辆更新的速度，到2015年仍达不到省要求，难以满足城市扩容需求。

22、公交场站不健全。我市公交车进场率为62%，与国家要求的90%以上标准差距甚远，场站缺口为11.9万平方米。

3、职工队伍稳定的压力。公交驾驶员工作时间长、压力大，但收入和福利待遇低，目前，驾驶员的流失现象凸显，职工队伍出现了不稳定。

二、采取的举措及解决的问题

通过大讨论对问题进行查找、剖析，我们深刻感到企业发展还面临着诸多困难和挑战，为此，我们采取了以下措施，让思想更新，让理念更新，让举措创新，将从思想、行为根源上实现崭新地突破。

（一）加大全员解放思想、更新观念的力度。

为贯彻落实市领导提出的“建设具有实力、活力、魅力的沿海强市、美丽唐山”的总体目标，我们结合大讨论活动提出了“建设美丽公交”的具体要求。美丽公交的标准是要具有“好的班子、好的素质、好的环境、好的秩序”。为此，在全公司开展了“建设美丽公交、打好四个攻坚战、优化公交发展环境”的专项整治活动。四个攻坚战分别是：劳动用工管理攻坚战、环境整治攻坚战、客运秩序整治攻坚战、安全管理达标攻坚战。我们以此为契机，形成督导检查的长效管理机制，促进各项工作不断迈向新台阶。开展了以提升基础班组的凝聚力、执行力、战斗力和民主决

3策力为目标的“基层班组建设”活动，进一步强化基层班组民主管理、规范化管理，全面提升员工的整体素质。

（二）不断延伸精细化管理工作。

挖潜增效是公益性企业做到让政府放心、百姓满意的根本所在。今年唐山公交以“务实创新年”为主题，再次推进了纵向到底、横向到边功能更深层次的精细化目标预算责任管理，系统推进了五大体系建设，即：为确保公交运营及公共安全，推进了安全管理体系建设；为确保车辆保持良好状况，推进了技术保障体系建设；为确保文明服务再上新台阶，推进了行风管理体系建设；为确保员工素质提升，推进了员工培训管理体系建设；为确保企业综治、消防安全，推进了安保管理体系建设。五大体系将实现全面闭环运行，使企业精细化管理程度进一步提升。

（三）提高干部队伍整体素质。

一是开展了中层以上干部军训活动，以军养德、以军强身、以军促智，使干部在身体和思想上得到磨砺。二是按计划系统、有序的推进干部培训工作，不断提升干部素养和能力。三是组织中层干部参观了开元集团，组织各级管理人员拓展视野、找差距。四是在全体机关干部中开展“转作风、树形象、促发展、提素质”为主题的“下基层、结对子”活动，帮助基层搞好基础建设，通过下基层活动的开展，力求达到“四个促进”，即促进

4我公司基层路队建设、促进中层干部素质提高、促进基层职工队伍稳定、促进总公司的各项工作任务的完成。

三、下一步具体措施

下一步，我们针对尚未解决的问题做具体安排如下：

（一）全面落实本重点工作安排。

（二）针对世园会，结合南湖区域规划，做好公交大客流集散规划。

（三）积极与财政、厂家配合推进，尽快落实本500部公交车更新的政府实事工程。

（四）积极探讨黄标车以外公交车辆的油改气工作。

（五）在完成OA办公系统和ERP系统基础建设的基础上，全面推广实施。

（六）推进智能调度系统的全面应用，取代人工核算。

（七）积极推进公交场站的规划和建设。

（八）进一步学习先进企业管理经验，做好走出去、引进来，提升公交现代化管理程度。

（九）进一步与同行业做好对标定位，查找不足，提升精细化程度。

（十）努力争取环保资金、数据采集及信息管理平台课题费、节水基金、信息服务系统建设资金（电子站牌建设资金）等项目资金的支持，减轻政府财政投入负担，为企业发展增强后劲。

（十一）拓展思路，积极推进与开滦、唐钢等大企业集团在班车托管运营合作，寻求新的经济增长点。

（十二）积极与市规划局沟通，本着切合实际、科学合理的原则，积极推进加气站建设，形成供气网络，保障公交加气，同时减少运行成本。

总之，针对本次活动查摆的问题及不足，唐山公交将以解放思想为先导、以改革开放为动力、以创新驱动为抓手、以科学发展为目标，在主管局指导下，以打造“美丽公交”为主题，努力为建设具有实力、活力、魅力的沿海强市、美丽唐山”做出新的更大的贡献。

第三篇：大讨论

小学语文教学中存在的问题、原因以及整改措施

语文课程改革实验已经走过了几个年头，语文阅读教学也在悄然间发生了很多可喜的变化。学生的主体地位得以体现，“以读代讲”的理念得以落实。但是，在欣喜之余我们也发现，在当前的阅读教学中仍存在着一些亟待解决的问题。

一、教师教学拔高要求，教学繁杂。

小学语文阅读教学倡简、务本、求实、有度。教材处理要简约而不简单。因此，教师要对教材进行挖掘、梳理、浓缩，从而使课堂教学内容化难为易，以简驭繁。其次，教师如果瞄准课文的重点，训练的难点，学生的疑点，语言发展的生长点，就可以在一定程度上克服“拔高要求，教学繁杂”的问题。

二、教师教学死抠教材或无度拓展。

有些教师认为，凡是教材中出现的内容，都是正确的；凡是教材中提到的知识，都是重要的。因此，从字词句段篇等角度一一出题让学生回答，把学生当作规范答题的机器，不考虑问题的难易度以及学生回答问题的角度和思路。教材是最重要的、最基本的课程资源，体现了课程目标和能力培养的要求，但教材不是给教师树立一个必须遵从的“权威”，而是搭建一个创造性劳动的“平台”。新课程倡导开发的教材观，要求教师做教材的主人，成为教材的鉴赏者和开发者，创造性的使用教材，做到“用教材而不是教教材”。创造性的使用教材是一个优秀教师必须具备的基本素养。

三、朗读指导重技巧，情感体验不深刻。

当前，很多教师都认识到了“以读代讲”的重要性，并努力在阅读教学中加以实施。但在实践过程中，更多的教师将重点放在朗读技巧的指导上，如重音、停顿、节奏等，或是笼统地提出朗读的要求，如“读得美一些”、“读出作者„„的感情”等。这样的指导，不能触及文本的深层，学生的朗读只能是飘浮在文字的表面，不能对课文有更加深入的理解，也无法表达自己的真实情感。朗读技巧的指导是必要的，但重要的是从重点的词句入手，从学生的情感体验着眼，结合文本的内容和语言文字表达的思想感情，通过教师的点拨、引导和启发，体会语句暗含的意思，学生的读才有根。在实践中可尝试以下做法。

让学生了解作者以及文本创作的相关背景资料，拉近学生与文本之间的距离，让学生与文本零距离接触；借助媒体手段和教师语言等创设情境甚至再现情境，让学生感同身受；开启学生想象的大门让学生换位体验。在学生情感体验的过程中，教师加以点拨、指导，引领学生在读中体会、读中感悟，达到以读代讲的目的。总之，只有用心灵引导心灵诵读心灵，才能读出形，读出意，读出情，读出味，读出神。

四、教师教学过分依赖教材和备课资料。

在备课时，一些教师大致看看课文，就急于读教材，甚至照着教参写教案，搞"教材搬家”。这中间缺少独立思考，没有“化”的过程，虽然把教学要求、教学步骤方法写在了自己的教案上，但由于没有消化，还是人家的，肯定不会收到好的阅读效果。

五、教师对教材把握不准、处理不当。

仔细分析一些课例，许多课的问题都出在教材的把握和处理上，有文意把握不准、教材理解有误、切入点找的不好，缺乏整体把握问题。引导学生钻研文本，教师必先钻研文本，才能帮助学生提高语文素养。

六、追求形式，浮华空泛

阅读教学时常遭遇这样的尴尬：教师神采飞扬、学生积极踊跃、教学进程顺利，课后反馈却很不理想。为什么？环节设计似乎没什么疏漏，学生的发言也都切合文本主题，那么问题出在哪里？

小组讨论、多媒体辅助„„教学方式、手段本身无错，关键在于教师运用是否妥当。有的老师过于追求形式，使语文课堂呈现浮躁之气，其间欠缺了思考——冷静的、有深度的思考。很多时候学生没有充足“读”（尤其是默读）的时间，发言顺应老师思路，而非自我生成。更直白些讲，过分形式化的课堂，使学生的视觉听觉不断受到冲击，容易产生思维疲惫。这种情况下，学生往往是根据老师的暗示，猜测老师想要什么样的答案，而不是考虑自己收获了什么。没有思考，何来感悟？浮华之下，自然只剩了空泛。

改进措施：

1、要以情感人，引起共鸣。学生情感发展容易受到老师语言、神态的感染，在课堂上教师应充分发挥语言神态等感召效应，引起学生的情感转移，最终能达到共鸣的学习效果。

2、巧设问题，启发讨论。如《六个小矮人》一文，这六个小矮人以什么来生活？他们过得幸福吗？为什么？引导学生讨论，使学生兴趣浓厚，积极思考，大胆展开想象，作出判断，让学生通过这篇课文，得到启发：懂得只有靠辛勤的劳动才能获得幸福的道理。

3、要借助情景，导情入文。即借助生活展现、实物演示、图画再现、播放音乐、扮演角色、语言描绘等情境的创设，来引发学生情感的共鸣，丰富学生的经历和经验，实现知识传承、能力发展、态度和价值观形成的统一。

4、教师要在阅读教学中，想方设法构建学生自主学习的课堂，让学生自主选择喜欢的学习方式、阅读的内容、帮助自己解决问题的伙伴；让学生自主地进行质疑问难，让学生自己去提出问题、分析问题、解决问题。这些由学生自主参与课堂的实践活动，使学生能够通过语文课的学习，有可能成为具有生活情趣的文化人。

5、少做或者不做追求形式，浮华空泛的课堂教学。不盲目进行“精彩赏析”，不顾文本特点，经常抛出类似“读喜欢的段落”的笼统要求，忽略全局，肢解课文，造成阅读的“断层”。

总而言之，学生只有具备了广泛的阅读兴趣，才会积极主动地去阅读，才会自主地选择阅读材料，不断扩大自己的阅读面，增加自己的阅读量。

公会镇中心小学2011年9月

第四篇：大讨论

关于参加“组工论坛——什么是组工干部的党性”

大讨论活动的通知

各乡（镇）党委：

为认真落实中组部提出的‚以‘一迎双争’为主题，深化‘讲党性、重品行、作表率’活动‛精神要求，结合正在开展的保持党的纯洁性学习教育活动，经县委组织部部务会议研究，决定在全县组织系统开展‚组工论坛——什么是组工干部的党性‛大讨论活动。现将有关事宜通知如下:

一、参加讨论人员：

1、县委组织部各科（室）负责人；

2、各乡镇党委确定1名副书记或组织委员。

二、讨论时间：

拟定3月13日（星期二）

三、有关要求：

1、每人登台发言时间3—5分钟，不超过5分钟；

2、3月12日（星期一）上午前将讨论稿发至whj9637@163.com，不超1000字；

3、讨论稿要紧密结合岗位或工作实际，从一个侧面或角度阐述对‚什么是组工干部的党性‛的看法，有观点，有事例，有理有据，简明扼要，不要泛泛而谈、空洞说教；

4、参加讨论时要脱稿，不要照本宣科；

5、因本次讨论要进行现场录播，参加讨论时要注意仪表和着装。望接知后迅速确定参加讨论人员，并积极做好准备工作，于3月8日（星期四）前将参加讨论人员名单上报。具体讨论时间及地点另行通知。

中共陵川县委组织部

2012年3月6日

第五篇：解放思想大讨论

中学“解放思想大讨论”活动

专题讨论稿

(2018年10月8日)按照《榆中县教育系统“解放思想大讨论”活动实施方案》的要求，自开展解放思想大讨论活动以来，按照学校的统一安排，通过集中学习和自学，对照“七破七立”要求，逐条逐项认真查摆思想观念方面存在的问题，深入剖析问题根源及原因，认真制定切实可行的整改措施。通过学习和讨论深刻地认识到这次活动，是解放思想、抢抓机遇、做好本职、奋力赶超的活动。现就结合自己的实际，对照“满、窄、庸、散”等方面进行认真反思摆查，现将个人在思想、纪律、作风和工作中存在的问题与差距，结合自身实际做以下分析：

一、查找存在的主要问题

（一）学习方面

学习上存在“懒、满”等思想。平时只知道干完自己的本职教学工作，不加强政治、思想理论学习，甘于现状、没有居安思危的意识，主动性不强，常以时间不足为由放松学习，没有抽、挤时间进行学习，比较懈怠。学习面有一定局限性，看书主要局限于专业书籍，对党的知识、社会知识涉及较少，造成知识面有一定局限性；对青少年身心健康相关的法律法规、教学案例等学习不到位。目前，虽了解了不少课堂的管理和教学方法，但认为自己主动去请求别人以及打听优秀教师从而去听课的情况不太多，以致有事在实际工作中遇到难一点的知识点和特殊情况时无从下手、运用也不熟练，造成自身素质与新形势下的教育教学工作不相适应。

（二）工作方面

由于新知识涉及面广，方法多，需要清理的思路多，时有疏忽，产生惰性；有时由于工作量大，很多工作时常同时安排下来，时有不能及时处理，不加班就无法按要求按时完成工作，但思想上有不愿经常加班的情绪。工作中思想保守，怕出乱子、怕担责任的思想还比较突出。

（三）自身建设上有差距。

虽然注重加强了自身素质建设，注重了各种场合严格要求自己、管住自己，但有时也有做不到真正的慎独，平时没有注意树立正确的人生观、世界观、权力观，全心全意为了学生意识不太牢固，平时虽然基本做到遵纪守法，没有出现违法乱纪的问题。但有时工作纪律仍不够严格，不时会出现迟到的现象，会存在人云亦云的思想。

（四）在创新教学工作中。

思想不够解放，观念陈，更新不到位，工作循规蹈矩，按部就班，不力求全面发展，缺乏主动性和创造性，满足于应付本职工作，只求完成任务，不求精益求精，没有脚踏实地的用科学发展观的理论去正确研究处理教育教学中存在的问题。

二、产生问题原因的剖析 深刻剖析自己存在的不足，虽然问题在表面，其实根子在思想。经过认真剖析，自己感到主要有以下几个原因：

（一）在更新教学方法上有点偷懒，自己学习的理论不太符合目前的教学状态以后，没有积极去寻找新方法。

在平常的教学中，上级领导机关，还是学校部门都会定期组织老师们开展各种类型的公开课及讲座，但是在这些公开课有些是别的科目，不能立马使得自己的教学水平提高，就不是很认真。对于讲座，听得时候非常的认真，但由于不是很系统，所以能力的提升上还不是全面。所以没有及时并且很好的指导自己的教学工作。

（二）对于工作的积极性有所降低。在比较熟悉了解自己的工作以后，有些时候积极性不高，不能更加积极的去探讨，研究自己所教的这门课及教学方法。

（三）工作纪律有所松懈。有时候会忘记打卡，没有很好地遵循学校的规章制度，并且对于有些材料上交推迟，工作的纪律性不是很高。

（四）“教育”工作做的不到位。借由自己不是班主任，对教育学生没有不遗余力地去付出，有时自己不去管理学生而是交给班主任，导致自己管理能力不高和与学生的距离比较远。

三、存在问题整改措施

解放思想大讨论排查问题阶段，对个人来说，要用新思想、新观念重新审视自我，反思自我，解剖自我，让自己进一步增强责任感、压力感，增加自豪感。通过学习讨论和对照检查不足，使我更加清醒地认识到自己存在的问题，我决心进一步解放思想、更新观念，用全新的思想、全新的理念，提高自身素质，为个人适应安全生产监管工作作出自己的努力。

（一）加强学习，不仅注重业务知识学习，而且加强政治理论，不断增强自身的党性修养。

通过学习，进一步增强服务意识、公仆意识，树立正确的世界观、人生观、价值观，发扬艰苦奋斗的优良作风，牢固树立社会主义荣辱观，提高业务能力，为做好优秀的教育教学者打好基础。

（二）加强服务，勇于创新。

1.善于总结工作的得与失，及时发现存在的问题和不足，不断提出改进工作效率的新办法、新思路；2.树立强烈的自觉意识和责任意识，牢记全心全意为人民服务的宗旨，大胆工作；3.始终把学生的全面发展放在第一位，发挥自己的最大效力与学生沟通，解决学生学习与生活 中遇到的问题与难题。

（三）开展批评与自我批评。

一个人有缺点毛病并不可怕，可怕的是讳疾忌医，以致“小疾”拖成“大病”，甚至病入膏肓，不可救药。“良药苦口利于病，忠言逆耳利于行。”只有经常地开展批评和自我批评，虚心地接受批评，才能不断地改造自我、提高自我、完善自我。

（四）求实效，优化工作。要创造一个好的局面不容易，在一个比较高的起点上巩固保持、甚至谋求新的发展就更难。所以要想谋取新的进步，必须时刻保持高昂的斗志和顽强的进取精神，在务求实效上下功夫，时时处处严格要求自己，时时自重、自省、自警、自制、自律，增强防腐拒变的能力，适应社会，适应安全监管工作。