第一篇：《分子生物学与基因工程》课程论文
植物基因工程研究进展
摘要：自1983年美国人首先成功地获得抗卡那霉素的烟草再生植株开始，人类就开始了植物基因工程的研究。至今已在逾200种植物中成功地获得了转基因植株,并有近1000例转基因植物获准进行田间试验,更有十余种转基因植物(如转基因棉花.大豆)已进入商业化种植.转基因产品已进入人们日常生活。植物基因工程的应用已进入蓬勃发展阶段。下面是我从植物基因工程改善生物质能利用的研究进展做一说明。
关键词：木质纤维素 细胞壁 水解酶
近几年来全世界对能源的需求量急剧增加加速了对有限的不可再生矿物质 能源的消耗资源的利用也增加了CO2及粉尘的排放,造成环境破坏和全球气候变 化[1]可再生的清洁的生物质能成为人们关注的热点。其中的燃料乙醇工业,近年来在世界范围内得到了广泛的发展,我国也大力支持发酵乙醇用作能源[2]。目前,绝大部分乙醇来源于玉米淀粉发酵生产。但是由于淀粉本身又作为食品和饲料,产量有限,成本较高,阻碍了乙醇工业的发展。于是,人们把注意力转移到谷物秸秆等廉价 的含有大量 的木质 纤维素 的生物质 材料上希望 能够被 充分利用 [3]。但由于木质纤维素本身难以分解,许多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生产生的多糖资源更利于降解,用于发酵产乙醇。1.木质纤维素发酵生产乙醇发展现状
在中国,大约每年会产生10t亿农林业废弃物这些资源用于造纸、纺织或者直接作为燃料这些占到很少一部分。绝大部分被废弃了木质纤维素是光合作用的基本产物 , 也是生物圈产生的最充足的可再 生生物资源被认为是地球上最丰富的生物高分子聚合[4]。
大部分的高等植物细胞壁由胶联多糖、糖蛋白和木质素组成双 子 叶植物 , 如拟南芥等,细胞壁多糖主要有三种:纤维素半、纤维素和果胶质,包埋在非 纤 维多糖基质(半纤维素和果胶)中的纤维素网络,与木质素和结构蛋白共同构成植物细胞壁的聚合液晶结构[5]天然状态下由于木质素的保护作用,阻碍了水解 纤维素酶与纤维素的接触并发挥作用,成为影响纤维素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人发酵降解实验证明,虽然半纤维素对纤维素。也有一定保护作用 , 但木质素的去除对于纤维素有效降解是最关键的[6]。一般对木质纤维素材料 的利用,首先要进行粉碎,然后预处理(酸碱处理等),最后 添 加 微 生物 来源 的纤维素复合水解酶类,使之与处理过的木质纤维充分接触,将其降解为单糖 , 从而用于乙醇发酵。现在虽然前期的粉碎和预处理工艺研究取得了很大进展但成本仍然较高，而且后期发酵分解处理。要添加来源于微生物的纤维素水解复合酶,价格仍十分昂贵[7]。这些因素导致目前用木质纤维素作为这些因素 导致 目前用木质纤维素作为原料发酵产乙醇,成本较高发展缓慢因此,现在对木质纤维素进行高效降解使用,仍然是个很大的难题。2.植物基因工程与植物木质纤维素利用
近年来随着生物技术的不断进步,人们开始尝试利用植物基因工程方法来 解决植物木质纤维素有效利用问题研究主要集中在改善植物细胞壁木质纤维素结构和含量比例等方面,使植物多糖资源利于降解使用，或者利用植物作为生物反应器,在植物内表达微生物来源的强活性纤维素降解酶,使植物自身表达高活性纤维素水解 酶类等研究。2.1 改善植物细胞壁的结构与组成
过去几十年的研究,改善木质素含量及细胞壁已成为可能。利用基 因工程方法,控制植物内木质素合成相关基因的表达,可以改变木质素结构和含量木质素对纤维素形成的保护作用是导致 纤维素资源利用 的主要障碍,降低木质素含量或改变其结构,将利于纤维素 的分解[8]。虽然植物体木质素的合成过程还不是十分清楚,但近几年的研究,已使大量降低木质素含量成为可能。
在玉米和苜蓿的研究中发现,木质素合成单体之一的芥子醇, 其前体的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表达,芥子单体含量会明显减少,可导致木质素含量降低 [9, 10]但是在杨树中抑制这种酶的表达却不能够改善材质,木质素含量反而增加[11]。Li L等人在杨树中研究发现,通过反义表达4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)时,木质素含量了减少了约40%,并且导致10%的纤维素含量的增加，如果正义表达控制木质素组成单体紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈疮木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可导致紫丁香基丙烷的量明显增 高,但木质素含量没有变化[12]。当两基因同时转化时,木质素含量减少可达53%,紫丁香基丙烷含量进一步增加,而纤维素含量能够增加30%。Cano-Delgado A等人研究拟南芥CESA3突变体发现,纤维素合成酶受损时,导致了木质素大量合成[13]这表明在植物木质部细胞中可能存在一种调控机制,当木质素含量减少时,为了维持支撑作用,纤维素含量会相应增加。Chabannes M等人在烟草中研究发现,同时抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表达,可大量减少木质素含量,但非预期 的还引起了细胞壁多糖酚类物质及可溶性酚类物质含量的变化[14]等人在番茄中抑制表达木质素合成相关的CCR基因,导致木质素含量降低,同时与木质素形成具有共同前体的酚类复合物增加[15]。Boudet AM等人通过抑制杨树木质素合成酶基因CCR,可导致植物细胞壁纤维 素成分更容易被纤维素分解菌Clostridium产糖量达到原来的2倍[16]这表明,降低木质素等物质含量后,非常利于纤维资源的利用。Li Y等人研究发现,过氧化酶影响了木质化过程[17]。Blee KA等人在烟草中反义抑制过氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表达,在不影响植物生长发育的情况下,使木质素含量降低了40%~50% [18]。通过基因工程方法,改变木质素结构与含量的方法改善植物细胞壁结构,利于作为能源植物,具有重要的研究价值。
2.2 植物体内表达木质纤维素水解酶
过去几十年的发展,植物已成功的作为重组蛋白表达的生物反应器,它相对于微生物和动物表达的优势是具有较低的成本已在多种植物里面进行了异源重组蛋白的表达研究(如疫苗和工业用酶等),蛋白表达量高且保持了很好的生物学活性[19]。近几年,人们开始在植物体内进行微生物来源的研究,希望这些植物作为生物反应器,大量表达并在细胞内积累纤维素酶。收获的植物,经过粉碎和预处理(酸碱处理等)后,在分解过程中能利用自身表达的酶,不添加加来源于微生物的酶,就可以将纤维素充分分解为单糖, 进一步用于生产乙醇,降低生产成本(Sticklen M,2006)[20]。考虑到细胞质表达对植物生长影响较大,一般采用定向胞外或细胞器积累表达（如定向质外体叶绿体溶酶体等）Ziegler MT等人在拟南芥中,定向质外体,积累表达了来源于Acidothermus cellulolyticus的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表达量约达到叶子总可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同样是在拟南芥中,Hyunjong B等人定向叶绿体和过氧化酶体,积累表达来源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),达到了总可溶性蛋白的4.6%,明显 高于细胞质表达和单一细胞器定向表达[22]在烟草中Dai Z等人定向叶绿体,积累表达了A.cellulolyticu 的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到总可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同样的酶,比较了定向不同细胞器积累表达的差异,发现定向质外体表达蛋 白量最高,且保持了较好的活性[24]。在其它的植物中,也进行了相关的研究, Xue GP等人在大麦的胚乳中,特异表达来源于Neocallimastix patriciarum 的内切-β-1,4-葡聚糖酶,约达到了总种子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向质外体积累表达了A.cellulolyticu耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到了叶子总可溶性蛋白的 4.9%。
目前的研究集中于将植物作为生物反应器,尽可能多的表达并积累纤维素酶,用于后期的处理。在发酵分解过程可以利用植物自身表达的异源纤维素水解酶,节省了额外添加酶的量。表达 的大都是内切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,为了预处理后还 能保持较好活性,多采用稳定性强的耐高温酶。由于纤维素有效降解需要复合水解酶,并且木质素对其具有很强的保护作用,这些植物不会发生自身降解。3.前景与展望
利用不断发展的植物基因工程技术,在能源植物研究方面已经取得了不错的研究进展。但是,目前要实现廉价充分的利用纤维资源,还有一定的困难。通过对植物细胞壁合成 代谢研究的不断深入,应该能够获得对自身生长发育不影响的低木质素植物细胞壁木质素结构及含量改善纤维素含量增加,利于降解发酵产乙醇。还希望最终能够获得一种能源植物,这种植物通过自身表达异源的高活性木质纤维水解复合酶,酶的表达受到诱导调控,收获前诱导表达,收获后送往生物能源发酵工厂。这期间,木质纤维素多糖在植物体内也可进行持续降解,在发酵工厂只需添加一些简单的辅助分解酶就可以彻底降解掉,使木质纤维资源产乙醇变得十分简单 参 考 文 献: 1.Dorian JP, Franssen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.
第二篇：分子生物学与基因工程结课论文
《分子生物学与基因工程》
结课论文
Real-Time PCR在分子生物学中的应用
姓
名：XXX 学
号：AXXXXXXX 院
系：生命科学学院 班
级：生科XXX班 任课教师：XXX
二零一二年十二月 Real-Time PCR在分子生物学中的应用
XXX XXX大学生命科学学院 黑龙江哈尔滨 150xxx
摘 要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于分子生物学领域中获取特定基因或基因片段。定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，且与常规PCR相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，成为了分子生物学研究中的重要工具。关键词：实时定量PCR；基因扩增；分子生物学
1971年Khorana等最早提出PCR理论：―DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA 基因‖。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶 ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。
自从PCR技术问世便很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，上述问题才得到较好的解决[1]。实时荧光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，FQ-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。
1.实时荧光定量PCR技术概述
1.1 实时荧光定量PCR原理
1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。在探针5’端标记一个报告基团（R），在3’端标记一个淬灭基团（quencher，Q），两者距离很近时（7-10nm），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收，并依赖其较高的S/N比值（信-噪比, signal-to-noise ratio）和良好的辨别能力进行定量检测。
荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[4][3]1.2 常用实时荧光定量PCR分类
1.2.1 实时荧光定量PCR荧光染料法
实时荧光定量PCR荧光染料法包括非饱和染料SYBR Green法和饱和染料LC Green法[5]。非饱和染料SYBR Green染料法定量成本低，方法简便，不需要设计探针，但是特异性低。荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。饱和染料LC Green法与SYBR染料法工作原理是一样的，但与传统的荧光染料SYBR Green相比有如下优点：LC Green染料在进行PCR 时可以以饱和的浓度加入，不会抑制PCR反应，而Sybr Green 染料浓度过高会抑制PCR反应。从而，利用LC Green染料可以进行高分辨率熔解曲线分析。在进行HRM分析时，由于饱和染料占据了DNA双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。除LC Green染料外，常用的染料还有Reso Light、Ever Green等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。
1.2.1 实时荧光定量PCR探针法
实时荧光定量PCR寡核苷酸探针法包括TaqMan探针法和TaqMan-MGB探针法。TaqMan 探针法技术原理是利用Taq酶的5’—3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。探针的5’端标以荧光报告基团，3’端标以荧光淬灭基团。在PCR退火复性期，探针与DNA模板特异性结合。在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’—3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。因此，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。荧光信号强度与PCR产物量相对应。
MGB探针与传统的TaqMan探针比较，有很大的优势。它可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列的 MGB探针的设计有很大的帮助；同时可以提高配对与非配对模板间的Tm值差异； 由于在探针的3’端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高，可 以进行SNP分析。MGB探针实验步骤简单，使杂交的重复性大大提高。
1.3 实时荧光定量PCR定量方法
在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。由于每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA浓度的标准品可做出标准曲线。
1.3.1 绝对定量法
该方法是利用标准品作一条标准曲线，通过标准曲线对样本进行定量。绝对定量标准品一般是用质粒DNA或是PCR扩增产物等制备的。标准品的量根据260nm的吸光度值计算得出。由于样本的浓度完全是通过标准曲线来确定，所以合适的标准品是定量准确的关键。一方面标准品与未知样本应具有一致的扩增效率，另一方面标准品的定量必须准确。这就要求标准品的扩增序列与样本完全一致，制备的标准品纯度要高，不应含有影响定量的因素如Dnase、标准品与未知样本各自反应体系内的干扰因素要一致等。该方法的优点就是测定范围很广（10～1010拷贝），结果可直接通过软件得出，不需额外计算。1.3.2 相对定量法
相相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常选用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA。使用的β-actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样品的量来自于标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基因是1×的样本，其他的样本为参照基因的n倍。由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用管家基因的量来作为标准，以比较来源不同的样本，目的基因表达量的差异，此即相对定量。这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致；此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PCR反应，存在两种模板相互的干扰和竞争[7]。
1.3.3 相对定量反应循环值（Ct）比较法
[6]即ΔCT值法，该方法是同时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的基因片段，一般是一个内源性管家基因片段。这两个扩增反应可在2管中分别进行，也可在同一反应管中进行，测得两者的CT值之差，即ΔCT。该方法不需要标准曲线。它是根据PCR扩增反应的原理，假设每个循环增加倍的产物数量PCR反应的指数期得到扩增产物的值来反映起始模板的量通过数学公式来计算相对量。比较Ct法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。比较不同待测标本DNA的ΔCT值与正常标本DNA的ΔCT值的变化，即可对未知标本靶基因的原始拷贝数作出判断，从而对病理状态进行判断或诊断。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计[8]。最终结果也是靶序列和参考品的相对比值。该方法需确定靶序列和参考品的扩增效率是否一致；如不一致，则会影响结果的准确性。
2.实时荧光定量PCR技术的应用
实时定量PCR的应用非常广泛。在科研方面，可定量分析各种基因的表达[ 9 ]、分析基因变和多态性[ 10 ]、分析细胞因子的表达
[ 11 ]、单核苷酸多态性（SNP）
[ 12 ]
测定及易位基因的检测
[ 15 ]
[ 13 ]
等；在医疗方面，可用于免疫组分分析
[ 14 ]、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析
[ 16 ]、肿瘤研究[ 17 ]和微小残留病变（MRD）[ 18 ]检测等。
以下就其在基因工程研究、病原体的检测和肿瘤分子诊断等方面的应用及其新进展作一简述。2.1 基因工程研究领域
实时荧光定量技术的出现不仅加强了有关对基因的量的研究方法，而且也加强了对基因的质所发生变化的研究。它可以检测基因突变和基因组的不稳定性，已经被广泛应用于遗传分析[19]。
2.1.1
基因表达研究
由不同的荧光报告基团标记的探针分别与野生型和突变基因杂交，探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种，说明它是一个纯合子，如果荧光信号都增加则表明是一个杂合子。从使用范围来看，它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变和缺失及表达量的异常，从灵敏度方面看，它能从单细胞进行特异基因扩增，实现植入前基因诊断。PCR技术还可用于端粒酶的检测。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症（β地贫）患者β与γ球蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地贫的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴出生[20]
。因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和产前基因诊断。
2.1.2
单核苷酸多态性（SNP）及突变分析
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性[21]。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。
2.1.3
转基因研究
Tesson等确定了实时定量PCR的技术条件，利用两种发光探针及适当的循环域值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因鼠的接合性[22]。同型结合的和异质接合的动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律，通过实时定量PCR检测，该方法为转基因动物的同型结合及异质接合提供了明确的鉴定结果。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大用途。
2.2 肿瘤的分子诊断
肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认[23]。癌基因的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据[24]。目前，肿瘤患者的生存期已有所延长，但是缓解期的患者仍存在复发的危险，因此，微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案至关重要。实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具[25]。Eckert等提出采用实时荧光PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治疗有重要指导意义。
2.3 病原体的分子检测
目前，用此方法还进行了对人类结核杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒等病原体的检测[26]。同样在国内，2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得荧光定量PCR技术得以应用和发展。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。目前, 实时荧光PCR技术已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒（HIV）等各种病原体的临床诊断，为实现快速准确诊断提供了有效的检测方法。
3.小结
时荧光定量PCR与其他一些技术的结合应用，是今后发展的方向，如与高级微型解剖技术结合后，能提高形态学损伤所至低水平扩增的检测能力[ 27 ]、可定量分析石蜡包埋储存样本中的核酸[ 28]及少量细胞中的全部转录产物[ 29 ]等。此外，微阵列实验中所选基因表达水平的测定仍需使用实时PCR技术[ 30 ,31 ]，利用该技术还可使等位基因特异表达分析以及生化武器证据甄别成为可能。
通过设计针对目的基因的特异性引物和探针，并优化反应体系和反应循环参数，已成功地建立了快速、灵敏、特异的Q-PCR检测方法。可实现大量样本同时检测，并节省大量试验时间和反应成本，为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供了有效的技术手段；同时实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型，以及对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断[32]。因此Q-PCR技术将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具，在临床上将有更加广阔的应用前景。
参考文献：
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第三篇：基因工程课程论文
基因治疗在传染病防治中的应用研究进展
姓名（学号）（学校 邮编）
[摘要] 传染病是目前人类所面临的一类重大疾病，在某些疾病状态下，人类还未寻找到理想的治疗方法，如病毒感染等。现代基因治疗是一种应用基因工程技术和分子遗传学原理，对人类疾病进行治疗的新疗法。主要是指对致病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因、核酶、基因药物进行疾病治疗的方法。经过几十多年的发展，技术逐步走向成熟，在传染性疾病的防治中显示了重大的临床应用前景。传染性疾病的基因治疗包括：基因疫苗、RNA干扰、胞内抗体、淋巴基因表达等。
[关键词] 基因疫苗 RNA干扰 胞内抗体 淋巴基因表达 1.现状
1.1 我国传染病现状 21世纪人类依然面临着传染病的挑战首先，是新发传染病的挑战。就全球而言，艾滋病是当前首恶，因其主要通过血液、吸毒、性行为传播，潜伏期长、隐袭性强、控制难度大；特别是妇女感染率高且可以垂直传播，严重危害儿童的身体健康。由于其病毒极易发生变异，所以到目前为止疫苗仍在试验阶段，缺乏理想的特效药物，免疫损伤治疗难度大，以致非洲个别国家感染人数达其全国人口的一半。我国2003年比2002年发病率上升44．39％，人类免疫缺陷病毒检出率提高了55％。2004新年伊始在东北亚韩国、日本及东南亚越南、泰国、柬埔寨以及中国和美国部分地区禽流感暴发，导致大量家禽死亡，同时H5N1病毒在人群感染使20多人丧命，又一 次引起全球震惊。更有严重者，引起疯牛病(在人类称为克雅克病)的朊毒蛋白对煮沸等常用消毒方法不起作用，疾病潜伏期长，病死率高达100％。这两种传染病不但对人类健康造成了威胁，而且给人的两种主要食物—— 牛肉、禽肉的供应造成困难。由于人与动物关系的密切，气候的变化，以及化学物质的广泛应用，微生物发生变异导致新的传染病，甚至恐怖主义制作生物武器，人类势必将面临更多的新的挑战。其次，老的传染病对人类健康的影响同样不容忽视。以2002年为例，WHO统计全球发生各类传染病共计356 824 000例次，占各病种总发病数的23．9％，位居第一，死亡共11 122 000例，占19．5％，仅次于心血管病⋯。这说明就全球而言，特别是发展中国家，传染病不可忽视。据中国疾病预防控制中心报道，我国传染病同年发病2 320 764例，死亡4520例，病死率0．0195％，均远低于全球平均水平。但近年除新发传染病外，传统性传染病一些情况值得我们注意：(1)发病数和发病率：我国2002年全国传染病报告发病数2 440 588例次，发病率比2001年下降了5．74％，而2003年发病数2 591 512例次，发病率比2002年上升5．45％。(2)死亡例数和病死率：从死亡人数看，2002年死亡4520例，比前一年死亡3576例增加了26．4％，且2003年比2002年同期又上升了17．43％，增加了1280例。2003年死亡人数中死于SARS者349例，狂犬病1980例，且后者比2002年增加821例，高于SARS。(3)病种分布：2002年和2003年发病数居前3位的均是病毒性肝炎、结核与细菌性痢疾，死亡人数居前3位的是狂犬病、肺结核及病毒性肝炎，其中乙型病毒性肝炎及结核无论发病率及死亡数均居前3位。乙型肝炎疗效有限，加上慢性化、肝硬化及部分发生肝癌呈链式发展，危害人民健康。同样，最老的传染病结核主要由于耐药增加近年全球复燃，我国亦面临结核的严重挑战。2003年其余死亡数位居前 10位的其他传染病还有新生儿破伤风、艾滋病、乙型脑炎、SARS、细菌性痢疾、出血热、流行性脑脊髓膜炎。其中除SARS及艾滋病外，均是老的传染病控制不力出现反复。儿童传染病死亡原因以破伤风、中毒性菌痢、麻疹与流行性脑膜脊髓炎为主，说明传染病主要危害儿童的特点，影响了国家优生优育的大计。
1.2 基因治疗研究现状
1.2.1 多种疾病的基因治疗 目前，基因治疗的范围已从过去罕见的单基因疾病扩大至常见的单基因疾病和多基因疾病。遗传性疾病的基因治疗多数属于单基因缺陷所引起的疾病的基因治疗。Fang等以腺病毒为载体，靶向肝细胞对苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺陷症小鼠模型进行了研究，结果表明小鼠的伤寒表型症状得到明显改善。而un等则通过反转录状病童T淋巴细胞中苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性的改变状况。恶性肿瘤的基因治疗已进行了大量的预备性实验，美国科学家构建了重组的TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)，能表达100倍于正常水平的TNF并应用于黑色素瘤的临床治疗。另外，用表达IL-
2、IFN．2和IL广1的TIL治疗神经母细胞瘤及白等的研究工作也已见报道；还有应用反转录病毒将毒素基因(蓖麻毒素和脊髓灰质炎病毒素中所含的一种蛋白酶的基因)导人癌细胞内，只在靶细胞内表达毒素并发挥杀伤作用，但对其他细胞毒性较低。对于艾滋病等传染类基因疾病，有研究将HIV LTR3’、5’寡腺苷酸合成酶杂合基因转染HeLa．T4+细胞。结果表明：经修饰的带有CD4受体的细胞具有抗HIV感染的作用。还有将编码可使艾滋病毒HIV RNA降解的核酶基因转染人淋巴细胞，从而抑制HIV的传播。
1.2.2 多种药物的基因治疗随着对基因治疗机制本身的不断深人探讨，用于基因治疗的药物形式也不断创新。基于三链DNA形成脱氧寡核苷酸('rro)[3]的反基因技术能够通过阻止基因转录和DNA复制而达到治疗目的。Cohen等曾用此技术抑制淋巴瘤的bc1．2基因，而Noonberg等以此对乳腺癌的HER2基因进行了相应的探索。基因治疗从传统意义上的DNA治疗扩展至RNA水平。有治疗作用的目的基因的mRNA已用作体内、体外基因治疗的研究。Nair等Is J从肿瘤细胞或活组织分离出mRNA，以其对自身提呈抗原的树突细胞进行转染，最终表达出了初始癌抗原(CEA)一T淋巴细胞特异性细胞毒素。Thierry等采用体外转录的方式，以GFP为报告基因，研究了mRNA在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、鼠黑色素瘤细胞B16．F10、人海拉细胞(子宫颈癌组织细胞株HeLa)、鼠成纤维细胞Ratl等不同细胞系中的表达状况，同时还探讨了不同转染试剂对转染效果的影响，并以蜂毒素肽介导并提高了mRNA的转染效率。1.2.3 多种途径的基因治疗在探讨不同疾病的发病机制、尝试不同基因药物，进行基因治疗的同时，有研究者对基因治疗的新方法新途径进行了大胆的探索。斯坦福大学研究组采用转座子作为基因载体，在患有血友病的小鼠模型上，将来自鱼的一种编码转座酶的基因与宿主染色体上的凝血因子Ⅸ 基因相连接，使小鼠的血液凝结状况大大改善。基因枪法被证明能够介导外源基因快速进人靶器官。Takuji等利用基因枪将成骨蛋白．1基因转入椎间盘细胞中并使其获得有效表达。Weiss等利用基因枪将包裹的细菌疏螺旋体OspC蛋白基因打人Balb／c小鼠体内，介导了Th2反应，并与注射方式进行比较，发现基因枪只介导Th2反应而非Thl反应的原因并非是由于相比注射方式其所输送的DNA数量太少，于CpG的临界浓度所致。利用消化道大量的黏膜表面以及其中所含有丰富的免疫介导组织，以口服的方式将具有治疗或免疫作用的目的基因1199运送到靶器官已成为基因治疗领域研究的热点。在以腺病毒为载体对肠上皮细胞进行转导的研究中，During等Luj将带有lacZ基因的 腺伴随病毒口服给乳糖不耐症的小鼠模型，在祖干细胞、肠道细胞、固有膜细胞中，外源基因的表达可持续六个月。MacLaughlin等用壳聚糖作为运送报告基因(编码氯霉素乙酰转移酶基因)的载体，经消化道后在体内得到表达。另外，Sizemore等发现当减毒的志贺氏菌进人细胞传递质粒后，质粒编码的B半乳糖苷酶引起黏膜免疫。Ayub等用减毒的沙门氏菌为载体，携带李斯特病菌的单细胞基因毒力因子，对小鼠管饲后发现明显的细胞毒性及辅助T细胞反应，同时也检测到特异性抗体的产生[4]。
2.基因治疗的方法
2.1 基因疫苗
基因疫苗及DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的第3代疫苗。其原理是将编码病原体抗原的基因分离纯化，克隆至真核细胞表达质粒载体，经皮下、肌肉注射或口服等方式进入机体，基因在体内表达相对应抗原并刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而使机体获得针对病原微生物、病毒的特异性抵抗能力，达到预防和治疗传染病的目的。与传统的第1代疫苗一减毒、脱毒病原微生物成分及第2代疫苗一基因工程蛋白多肽相比，基因疫苗具有能把抗原以自然状态形式提供给机体、保护力强、无毒力回复并对不同亚型病原体产生交叉抵抗、易于制备和联合接种、生产成本低、易于保存和运输等优点，已成为具有广泛应用前景的新型生物技术。它不仅可用来预防和治疗细菌、病毒、寄生虫等传染性疾病，而且在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗中具有重要的价值。DNA疫苗是利用分子生物学技术，根据编码抗原碱基序列，设计并合成特异性引物，用RT—PCR方法从病原微生物RNA分离纯化抗原基因，再通过限制性内切酶方法将DNA克隆至真核细胞表达质粒载体。通过特定的方法将质粒载体制备成注射制剂或口服制剂。当这 种制剂进入机体后通过载体的作用，DNA可进入机体细胞，在细胞内表达。病原抗原滞留于细胞内或分泌到细胞外，滞留于细胞内的抗原可特异性活化CD8+ Tc细胞，分泌到细胞外的抗原可活化CD4+ Th细胞或刺激B细胞产生抗体。因此，DNA疫苗不仅可诱导体液免疫，还可诱导细胞免疫，比传统疫苗只诱导体液免疫具有显著的优越性。
2.2 RNA干扰 RNA干扰主要是利用双链RNA在mRNA水平关闭特异序列基因表达或使其沉默的过程，又称转录后基因沉默(post—transcriptional gene silencing．PT—GS)，能特异性使外源性入侵基因沉默。RNA干扰最早在植物和线虫细胞中发现，被认为是它们抵抗病毒感染的一种天然免疫防御机制。目前普遍认为其机制是核糖核酸酶首先将双链RNA切割成21～23个核苷酸的片段，然后酶又与片段结合，由这些片段将酶引导至特异的mRNA上，从而降解mRNA，使特异基因沉默，抑制基因表达[1]。
2.3 胞内抗体
胞内抗体是一种基因工程抗体。其方法是采用分子生物学手段，从免疫脾细胞或杂交瘤细胞分离纯化抗体VH和VL基因片段。再通过特定的连接肽将VH和VL连接起来，构建单链抗体(ScFv)基因，并在基因上加上细胞滞留信号序列，将该基因克隆至真核细胞表达质粒载体，通过特定的方法将质粒载体制备成注射制剂或口服制剂。当这种制剂进入机体后通过载体的作用，DNA可进入机体细胞，表达单链抗体定向分布于细胞的核、胞浆或特定细胞器中与病毒蛋白结合，干扰病毒蛋白的分泌、加工和活性，从而阻止病毒复制和病毒颗粒组装释放[1]。
2.4淋巴因子转基因表达
淋巴因子在传染病治疗中具有十分重要的作用和广泛的应用前景。其中的干扰素（IFN）已成为目前抗肝炎病毒治疗唯一公认有效的基因工程药物。利用淋巴基因表达进行传染病的基因治疗研
[1]究，是基因治疗在传染病中的一个重要应用和重要的研究方向[2]。2.5 反义RNA 彭国平[5]综述中谈到HBV、HCV是引起慢性肝炎以及肝硬化、肝细胞肝癌等相关疾病的重要病原体，而有效防治此类肝病的关键在于抗病毒，反义核酸技术最早是人工合成或生物合成特定互补的DNA或RNA 序列导入靶细胞，形成mRNA—DNA 或mRNA—RNA杂交双链，从而抑制或封闭靶基因表达，达到基因控制和治疗的目的[5]。
3.基因治疗在传染病防治中的应用
3.1 DNA疫苗
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因疫苗在国外已进入I期临床实验，其结果显示：该疫苗可在体内有效表达HBsAg，并可诱导强烈的免疫反应，产生高效价抗体，同时，志愿者对疫苗具有良好的耐受性。我国科学家将S抗原基因与IL一
2、INF基因连接在同一载体上，构建融合基因给健康小鼠、HBV转基因小鼠使用后，发现CTL活性显著升高，HBsAg特异T细胞增殖能力显著高于对照组，血清抗HBs抗体显著升高。HIV一1基因疫苗在动物体内可产生有效的免疫应答，减少病毒颗粒释放和对T细胞的损害，在人体内的实验证明它可有效诱导抗HIV抗体产生。沙眼衣原体MOMP—DNA疫苗给小鼠免疫后可有效诱导抗体产生，其效价高达1: 1250，脾细胞对衣原体的刺激指数显著高于对照组，说明该基因疫苗不仅诱导了体液免疫，同时还诱导了细胞免疫[1]。
3.2 RNA干扰(RNAi)近年来随着对RNA干扰研究的深入，一种能在哺乳动物细胞中抑制特异基因表达、只有21个核苷酸的小干扰双链RNA(small interfering RNA，siRNA)被发现。将特异的siRNA通过阳离子脂质体转入Hela细胞和人胚肾293细胞等不同哺乳动物细胞中，获得了可重复的序列 特异的RNA干扰，而将长序列的双链RNA转入则出现了非特异抑制。这些研究成果为RNA干扰的研制提供了前提。Randall等人发现HCV特异的siRNA可抑制AC和Huh一7肝细胞株中HCV复制，清除细胞内HCV病毒[1]。3.3 胞内抗体
在传染性疾病，尤其是病毒感染中的应用越来越受到人们的关注。抗HIV结构和功能蛋白scFv基因导入HIV感染的淋巴细胞后能干扰HIV病毒转录和复制，而对细胞生长和CD4表达无影响，将其导入表达有CD4和CCR的人骨肉瘤细胞，可抵抗HIV的感染。抗HIV逆转录酶和抗整合酶的胞内抗体可抑制酶活性，减少病毒复制。抗CCR5和CD4的胞内抗体可抑制CCR5和CD4的表达并防止HIV感染。抗HCV外膜蛋白E2的胞内抗体能抑制病毒与靶细胞结合，发挥治疗作用。抗HCV核心抗原的ScFv能抑制核心蛋白功能和HCV的装配。我国研究者成军等人报道：将抗HBV核心抗原SeFv基因克隆至逆转录病毒载体，构建的重组逆转录病毒感染2 215细胞后能有效抑制Ⅶ 和HBsAg的表达。
3.4 干扰素的基因转移与表达
Seif等将小鼠的干扰素β（IFNβ）的基因置于主要组织相容性复合体（MHC）的启动子序列的控制之下，构建重组表达载体，转染Babl/c小鼠的成纤维细胞系NIH3T3，得到了持续的IFNβ的表达。表达IFNβ的细胞系，对滤泡口炎病毒（VSV），脑心肌炎病毒（EMCV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus）的复制和表达均有明显的抑制作用。并发现持续低水平的IFNβ的分泌表达，就可以使这一细胞系产生明显的抗病毒状态。然而，用等量的外源重组的IFNβ则无此效果。而且，加入相应的IFNβ的单克隆抗体并不能阻断这种转导的细胞系对上述三种病毒的抑制效应。因此认为，此细胞系的抗病毒状态的产生，除了和分泌型IFNβ的表达有关以外，还有可能存在其它的作用方式。另外，Bednarik
[1]等将人的α2干扰素（IFNα2）的基因重组到人免疫缺陷病毒（HIV）的长未端重复序列（LTR）中的启动子下游，转入非洲绿肾细胞系中，IFNα2的分泌表达水平持续在50~150u/ml之间。这一低水平的IFNα2的表达完全可以抑制HIV的复制和转录。同样地也发现就用相应水平的外源重组的IFNα2也无此效果。而且IFNα2的单抗也不能阻断IFNα2的抗病毒作用。这一差别的原因，作者认为体内产生的IFNα2与体外重组的IFNα2的抗病毒机理不同。外源重组的IFNα2的抗病毒机理，是抑制HIV的成熟和装配过程，而内源表达的IFNα2的抗病毒作用，似乎是主要作用在转录水平以及HIV mRNA的稳定性等方面[2]。问题与展望
基因治疗在染性疾病的体内外实验生物治疗中均显示了疗效。尤其是基因疫苗对机体的保护作用已得到了公认，但其真正进入临床广泛应用尚有一段距离。还有许多问题须要进一步的验证： 4.1 基因疫苗编码抗原的表达问题。基因疫苗使用时进入机体的是一段DNA片段，其作用的发挥须要DNA在细胞内有效转录和翻译成相应的蛋白，如何能使DNA高效率进入机体细胞并得到高效转录和翻译；
4.2 DNA疫苗目前的动物实验显示其免疫效果存在较大的个体差异，总的来看其免疫原性不高
4.3 RNA干扰目前虽然是一个研究热点，但其研究工作才起步，其导人体内的方法、稳定性等问题还需要解决；
4.4 基因治疗的安全性问题，尤其是选用的载体对机体的影响还须要进一步证实，这一问题在短时间内无法解决。4.5 伦理道德方面的争论也是影响因素之一。4.6 基因转移中的副作用和抗体形成问题。
虽然基因治疗还存在如此诸多问题，但它的理论基础和强大生命力是显而易见的。经过几年来的发展，基因治疗的研究已逐步从理论走向了临床的实验，人们已获得了不少宝贵的知识与经验，随着分子生物学、免疫学的发展，人类及细菌、病毒等基因组测序的完成，为进一步发展和完善基因治疗奠定了良好的基础，相信不久的将来，基因治疗将在传染性疾病的预防和治疗中发挥重要作用。
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第四篇：动物基因工程课程论文
青岛农业大学 动物基因工程课程论文
题 目：
核酸分子杂交技术
姓 名：
学 院： 动物科技学院 专 业： 班 级： 学 号：
任课教师： 闵令江
二〇一二年四月二十日
…1…
核酸分子杂交技术
闵令江
闵令江
摘要：核酸分子杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术，其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA(RNA)片段按碱基互补关系形成杂交双链分子。杂交双链可以在DNA链和DNA链之间，也可以在RNA链和DNA链之间形成。杂交的实质就是在一定条件下使互补的核酸链实现复性，使双螺旋解开成为单链。变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链的无规则线团，使核酸的某些光学性质和流体力学性质发生改变，有时部分或全部生物活性丧失，并不涉及共价键的断裂。复性指变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构的过程。核酸分子杂交具有灵敏度高、特异性强等优点，主要用于DNA或RAN的定性、定量检测。该技术已取得巨大突破，在医学诊断中应用广泛，而且DNA芯片技术已取得显著成就。
关键词：核酸分子
杂交
变性
复性
应用+
…2…
Nucleic acid member hybrid technology
majoring in Animal Medicine
Name GaoZhiCan
MiLingJiang
MiLingJiang Abstract: Nucleic acid hybridization in nucleic acids research is one of the most basic experimental technique, its basic principle is the application of nucleic acid denaturation and refolding of the nature, sources of DNA(RNA)fragment bases complementary relationship forming hybrid double-stranded molecules.Hybrids between double-stranded DNA DNA chain and chain, can also be formed between the DNA and RNA chains chains.Nature of the hybrid is the complementary nucleic acid chain under certain conditions of realization of complex, make double helix solved a single chain.Modified double helix of nucleic acids hydrogen bonds break, into a single chain of random coil so changed for some optical properties and fluid mechanics properties of nucleic acid, sometimes partial or total loss of biological activity, does not involve the breaking of covalent bond.Refolding of denatured DNA under appropriate conditions, two separate chains of association become the double-helix structure of process again.Nucleic acid hybridization with high sensitivity, specificity, and other advantages, mainly for qualitative and quantitative detection of DNA or RAN.The technology have made great breakthrough, widely used in medical diagnosis and DNA Microarray Technology has made remarkable achievements.Key words: Nucleic acid molecules Hybrid Degeneration Renaturation Application
…3…
引言
1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆技术的出现、质粒和噬菌体DNA的构建成功、核酸自动合成仪的诞生，大大核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体支持物的支持物上，另一条参加反应的核酸链则游离在溶液中。
常用的固相杂交类型有菌落原位杂交、斑点杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和组织原位杂交。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。液相杂交是一种研究最早且技术较复杂的杂交类型，不如固相杂交那样应用普遍，主要是因为杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。因此在此主要介绍固相分子杂交类型及其应用。
一、斑点杂交
1、概述
斑点杂交首先由Kafatos等发展起来，用于在同一固相支持物上固定几种核酸样品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发射出的信号的强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，确定待测样品中靶序列的量。
斑点杂交的原理是将DNA或RNA变性后直接点样吸附于固相支持滤膜上，即印迹之后，膜作变性和中和处理，用UV照射尼龙膜或用烘烤法处理纤维素膜，将DNA固定。然后用标记探针与之杂交，洗涤去除未反应的探针，采用放射自显影或显色反应检测显示杂交信号，分析结果。将核酸样品点种于固相支持滤膜上，可采用手工直接点样或采用真空抽滤加样器。后者点样准确方便。
2、杂交方法【1】（1）、材料
20×SSC,甲醛，去离子甲酰胺。10%SDS,20×Denhardt液，1mol/L磷酸一氢 …4…
钠（PH7.0）,底物缓冲液，亲和素-碱性磷酸酶，5-溴-4-氢-3-吲哚乙酸，淡蓝四唑等。其他还有恒温水浴锅、同位素探测仪、自动光密度扫描仪、真空抽滤加样器、恒温摇床、移液器、印迹等。（2）、操作步骤和方法
①样膜的制备
a.核酸样品的预变性 所取DNA及RNA样品的量视情况而定，一般可加10～20ug.b.尼龙膜的预处理 c.点样 d.固定
②预杂交
③杂交 a.配制杂交液 b.探针变性 c.杂交
④洗膜
⑤放射自显影
⑥结果观察
根据曝光点的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及用量的多少。利用自动灰度扫描仪扫描曝光点，计算光密度值，可以进行半定量分析。对光敏生物素标记DNA探针的斑点杂交，出现蓝紫色斑点者为阳性，未着色者为隐性。根据着色的深浅可以判定目的基因的多少。（3）、注意事项
①DNA的变性 斑点印迹的关键是DNA在转录后要完全变性，至少所有样品的变性程度要一致。
②DNA样品的纯度 用Southern转移时，电泳步骤有利于把杂质分出去，剩下要转移的DNA就比较干净。
③固相支持膜的选择 理想的膜应符合以下要求：a.具有较强的结合核酸分子的能力；b.与核酸分子的结合稳定牢固；c.与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；d.非特异性吸附少；d.具有良好的机械性能。（4）、斑点杂交的应用 【2】
…5…
现在已有众多学者应用该方法进行分支杆菌及其他病原菌的检测和种属鉴定，均取得了较敏感的检测结果。同时应用该方法检测序列变异时，若靶序列内存在突变，则其扩增产物在严格的条件下无法与探针杂交，无杂交信号就表示目的基因存在突变。近年来研究应用于单个碱基突变基因的诊断方法，其最大的特点就是简便、快速而分辨率高。其最突出的优点是进行一个标本的基因分型只需1次杂交即可完成配合快速的DNA提取方法及电脑分析软件得出，可以在一个工作日内完成所需的分型工作。
二、Southern印迹杂交
1、Southern印迹杂交的基本原理【3】
Southern印迹杂交指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上，再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。其基本过程包括：样品DNA的限制性内切酶水解，水解片段的琼脂糖凝胶电泳分离，分离后水解片段的转移，特异性的DNA片段的分子杂交，探针在杂交前用放射性标记或酶学标记，最后采用放射自显影或化学发光法进行检测。
2、Southern印迹法的基本过程【4】（1）、DNA样品的酶切和电泳
a.用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品；b.琼脂糖凝胶电泳（2）、准备用于转移的凝胶
（3）、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物
a.缓冲液的配制；b.准备转移用膜；c.固定DNA于膜上
（4）、探针标记（5）、杂交
a.缓冲液及溶液
磷酸-SDS洗液Ⅰ
SDS洗液Ⅱ
预杂交/杂交液；b.预杂交；c.杂交（6）、洗膜
取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：
2×SSC/0.1%SDS,42摄氏度，10min
1×SSC/0.1%SDS,42摄氏度，10min
0.5×SSC/0.1%SDS,42摄氏度，10min
0.2×SSC/0.1%SDS,56摄氏度，10min …6…
0.1×SSC/0.1%SDS,56摄氏度，10min 实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1～2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程中无论哪一步到达终点。都必须停止洗膜。（7）、杂交结果的检测
a.放射性核酸标记探针的检测
洗膜结束后，将洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。将膜正面向上，放入暗箱中，经磷钨酸钙增感屏前屏置于滤膜下，光面向上。在暗室的红光下，将两张X射线胶片压在杂交膜上，再压上增感屏后屏，光面向X射线胶片。合上暗盒，置-70摄氏度低温冰箱中曝光。根据放射性的强度曝光一定时间后，在暗箱中去除X射线胶片，显影、定影，一般用1～3天时间。洗片时，先洗一张X射线胶片，若感光偏弱，则多加两天曝光时间，再洗第二张片子。b.非放射性核酸标记探针的检测（8）、杂交膜的重复使用
将结合有探针的杂交膜浸入大量的洗脱液中，75摄氏度下温育2h或在含有50%的甲酰胺与2×SSPE的溶液中于65摄氏度下保温1h.然后取出杂交膜，在室温下用0.1%×SSPE短暂漂洗，再将杂交膜置于纸巾上。除去大部分液体。用保鲜膜包裹。置暗箱中进行放射自显影，以检查是否所有探针已被除去，如果没有杂交信号，说明探针已被洗脱干净，可以用于第二轮杂交或干燥后保存备用。（9）、注意事项
a.杂交膜只能用干净的平头镊子接触，不可接触手指，否则将造成背景问题。b.电泳结束后，应该确定酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、DNA样品有无降解等。
c.硝酸纤维素膜只能通过彻底干燥来进行固定，干燥后核酸与硝酸纤维素膜通过疏水相互作用力结合在一起，相互之间的结合力较弱。d.杂交体系的体积越小，效果越好。
e.杂交膜上出现斑点可能是由于封闭液中封闭剂浓度过低或封闭缓冲液配制时间过长，不能封闭杂交膜上的非特异性位点。
f.采用毛细管转移法进行核酸转移时，用prarfilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，依次作为屏障，阻止液体自流池直接流至凝胶上方的纸巾层中，纸巾对方不整齐容易从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中核酸转 …7…
移效率下降的主要原因。
3、Southern杂交的应用进展【5】
不同个体在DNA结构上存在着差异，在不编码蛋白质的区域及没有重要调节功能的区域，DNA结构的个体差异更为明显。基因组中一个特定的基因座位若存在两种或两种以上的状态，而且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于10%，这一现象称为多态性。DNA多态性本质上是染色体DNA中核苷酸数目或排列顺序的个体差异。
（1）、限制性片段长度多态性（RELP）
这种在同种生物不同个体间出现不同长度限制性片段的类型，称为限制性片段长度多态性（RELP）。RELP具有极广泛的用途，利用广泛分布的RELP作为遗传标记可以称为对人类基因组制图的基础。当多态性顺序与人类遗传病基因位点相连锁时，可以作为遗传缺陷的产前诊断或鉴别杂合子携带者的标记，以及用于亲子鉴定和群体研究等。主要方面包括：①生物体基因分型、分亚型；②癌基因分析；③遗传病的诊断④HLA分型及遗传结构分析。（2）、可变串联重复多态性（VNTR）
人类基因组含有一些DNA重复序列家族，有些重复序列分散在基因组中，有些是以一系列短的串联重复序列组成高变区，其串联；串联重复序列拷贝数可以相差很多，即出现可变数的串联重复，因而高变区的长度变化很大，使高变区两侧限制性内切酶识别位点的固定位置随高变区的大小变化而发生相对位移，造成RELP,称为VNTR多态性。
迄今为止，VNTR的研究方法主要有四种：DNA指纹图谱法、VNTR-RELP分析法、模板PCR扩增后的RELP或寡核苷酸探针（ASO）检测法以及PCR扩增片段长度多态性分析法。（3）、扩增片段长度多态性(AELP)该法的分辨率、灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳、放射性自显影的方法，并且操作时间短，一般2h即可完成。他几乎克服了Southern印迹杂交技术中的所有缺点，使VNTR在琼脂糖电泳中连续分布的等为基因片段变成单独分离的片段，使原来无法用Hardy-weinberg公式进行计算的基因频率估计称为可能。因此，该技术在遗传病诊断、基因定位，尤其是法医学上的应用日益广泛。
三、Northern印迹杂交
…8…
1、Northern印迹杂交的基本原理【6】
与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物上，再用放射性标记的DNA探针或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影。以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的含量。
2、杂交方法【7】
Northern杂交方法是单一基因表达分析的首先方法。经过二十多年的发展，Northern杂交方法比以前有了较大改进，其操作方法变得更加简单，时间也比以前缩短了，其基本操作过程分以下几大步骤： ①RNA的变性和分离 ②RNA转移至固相支持物中 ③固相RNA与探针分子杂交
④对特异结合的探针分子进行检测和分析。
3、northern杂交的应用与进展【8】
RNA凝胶印迹分析即Northern杂交分析，是分子生物学最常用的研究基因表达的方法。它可以将恒定的mRNA水平量化，同时给出相关的RNA是否存在、分子大小以及离散的RNA种类间的整体性等信息。近年又出现了一些可以定量检测RNA的更灵敏的技术，如核酸酶保护分析、RT-PCR等方法，但这些技术只是Northern杂交方法的补充而并非取代。Northern杂交仍被看作是mRNA研究的标准操作，以为它相对简单并且可获得关于mRNA的多种信息。
（1）、反向Northern杂交和Northern杂交筛选mRNA表达（2）、高通量反向Northern印迹杂交和Northern杂交
四、原味杂交
1、基本原理【9】
原位核酸分子杂交技术简称原味杂交（ISH）,是应用序列已知并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基互补配对原则特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜下进行观察，从而对组织细胞中的待测核酸进行定性、定位和相对性定量的一种研究方法。原味杂交属于固 …9…
相核酸分子杂交的范涛，但它区别于固相核酸分子杂交中其他任何一种核酸分子杂交技术。原味杂交可检测形态保存完整的染色体、细胞或组织切片中的特异核酸序列，与免疫细胞化学结合时，原位杂交还可将显微拓扑学信息与DNA、mRNA及蛋白质水平的基因活动联系起来，为从分子水平研究细胞内基因表达及基因调控提供了有效的工具，是组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。
2、原味杂交技术的基本方法【10】
原位杂交技术主要涉及四个方面：①杂交前准备，包括玻片准备、组织的固定及预处理、预杂交；②杂交；③杂交后处理，涉及杂交后的清洗；④显示及结果观察，显示包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。（1）、破片准备和组织固定
玻片包括盖玻片和载玻片，应用热肥皂水清洗，用自来水清洗干净后，置于清洁液浸泡24H，清水洗净烘干，95%乙醇中浸泡24H后用蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150摄氏度或以上，过夜以除去任何RNA酶。
为保持细胞形态结构的完整及其DNA或RNA含量及位置尽可能的稳定，被测的生物样品必须固定。DNA比较稳定而RNA很容易降解，对于DNA的固定来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。（2）、样品的预处理
①内源性酶的灭活；②RNA酶的处理；③盐酸处理；④去污剂处理；⑤蛋白酶处理
（3）、预杂交
为防止背景污染，有时要进行预杂交。预杂交液和杂交液比较起来只是不含探针和硫酸葡萄糖，其他成分相同。如果检测染色体DNA，预杂交及杂交中的DNA必须先变性，但变性处理可能破坏染色体的形态，实际操作时，必须找到适当的方法在杂交信号与形态间取得平衡。（4）、杂交
杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片以防止孵育过程中杂交液的蒸发，然后将玻片放在湿盒中进行孵育。（5）、杂交后的清洗
杂交后的清洗是为了除去非特异性的杂交，即探针与部分同源序列的结合、这种非特性杂交会干扰特异的杂交信号。由于这种杂交体的稳定性不及完全互补配 …10…
对的杂交体，控制杂交后洗脱液的严谨度就可以除去非特异的杂交，即采用系列不同浓度、不同温度的盐溶液逐步漂洗。（6）、免疫学检测
根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。
3、原位杂交的应用方向
原位杂交区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。其他杂交方法正能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排列；与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。
五、菌落原位杂交【11】
菌落原味杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释放出的DNA。将DNA烘干固定于膜上与磷32标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。实验步骤如下：
①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平血琼脂培养基上，用无菌牙签挑去单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。②培养细菌至产生1~2mm大小的菌落。
③在一块平血中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面朝上，注意防止在滤膜底面存有气泡。④5min后，将滤膜转至用变性溶液，（0.5mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-NaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。
⑤将滤膜转至中和溶（0.5mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-HCL，Ph8.0）浸湿的滤纸上，…11…
放置10min。重复中和一次。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE配成20×贮备液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(Ph7.4),20mmol/L EDTA(Ph7.4)。⑦将滤膜将滤纸吸干，80摄氏度真空烘干2h。
致谢:
化学工业出版社及生物-医药出版社联合出版的《核酸分子杂交技术》 参考文献：
[1] 疯作化，皇甫永穆主编，医学分子生物学。第2版，武汉：武汉出版社，2000 [2] 黄培堂等译，分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002
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第五篇：基因工程论文
学号：13054107
基因工程结课论文
靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体构建
院（系）名
称： 理学院 专业
名
称： 生物科学 学
生
姓名： 姜己玉 所
在班
级： 13-1
目录
摘要............................................................................................................................................2 第一章 绪论..............................................................3 1..1RNAi的研究进展....................................................3 1.1.1RNAi的分子作用机制...........................................3 1.1.2 RNAi 的特点..................................................3 1.1.3 siRNA简介.........................................................3 1.1.4 s iRNA 的设计原则..........................................3 1.2 用于 RNA i 的载体....................................................4 1.2.1 载体的选择..................................................4 1.2.2 质粒人工构建的目的.................................................4 1.3 MRP1 的研究进展......................................................4 第二章 实验材料与方法.....................................................5 2.1 实验材料.............................................................5 2.1.1 宿主菌.............................................................5 2.1.3 载体通用引物................................................5 2.1.5 主要仪器..........................................................5 2.2 试验方法.........................................................5 2.2.1 shRNA 的设计与退火..................................................5 2.2.2 合成干涉片段的退火..........................................6 2.2.3 重组载体的构建..............................................6 2.2.4 菌落PCR初步筛选阳性重组子..................................7 2.2.5 测序鉴定重组载体...............................................7 第三章 结果与分析.........................................................8 3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果...........................8 3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果.............................8 3.1.2 目的片段的回收................................................8 3.2 重组质粒的菌落PCR...................................................8 3.3 重组质粒大量提取......................................................8 3.4 重组质粒测序结果.................................................8 参考文献..................................................................9
摘 要
癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。
目的：本课题选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表达穿梭载体。构建针对mrp1 mRNA的RNA干扰表达载体。
方法：将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1 siRNA重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α后大量提取重组质粒，经菌落 PCR和 DNA测序分析检测重组载体构建结果。
结果：成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。
关键词：RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒；穿梭载体
第1章 绪 论
1.1 RNAi的研究进展
RNA干扰(RNA interference , RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。
1.1.1 RNAi的分子作用机制
RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。
1.1.2 RNAi的特点
RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，RNAi也具有高特异性，小干扰RNA由dsRNA降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3′端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。
1.1.3 siRNA简介
RNA干扰作用是通过siRNA（small interfering RNA，siRNA）这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明，双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合，进而降解mRNA。
1.1.4 siRNA的设计原则
RNAi 作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构，不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大，2001年，Elbashir S M等[应用化学合成法合成了siRNA，并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi，他们进而据此提出了siRNA 设计方法：1)从起始密码下游50~100nt开始搜索siRNA以避免出现于5′或3′端的UTRs 的蛋白结合位点，；
2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果没有相应序列，可以选择5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之间[16]； 4)要确定siRNA对靶基因的特异性，可以利用Blast软件在基因组中进行比对，；5)设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。但是，Elbashir S M等的设计方法siRNA 筛选效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。
1.2 用于RNAi的载体
基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。是指能够运载外源DNA片段进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体具有以下的功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞；（2）为外源基因提供复制能力或整合能力；（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
1.2.1载体的选择
质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。
1.2.2 质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建
1.3 MRP1的研究进展
MRP1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，MRP1的组织分布 MRP1在体内的表达可以说是无所不在。
第2章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 宿主菌
E.coli DH5α：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。
2.1.2 质粒载体
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒特性如下：pRNAT-H1.1/shuttle 是一种腺病毒siRNA穿梭质粒，shRNA的表达由人的转录启动子H1 Promoter启动，H1启动子属于PolⅢ启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成RNA，转录过程遇到4~5个连续的U即终止，非常精确；同时CMV Promoter为真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白的表达；MCS为多克隆位点。
2.1.3 载体通用引物
正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′
2.1.4 主要试剂、具酶及仪器
质粒快速提取试剂盒，Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒，10×PCR buffer，dNTP，Marker(1kb,100bp)，Goldview DNA染料，EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶，LiCl Amresco RNase Sigma bacto-typtone Bio Basic Inc bacto-yeast extract Bio Basic Inc PEG8000，HindⅢ NEB，BamHI NEB，T4DNA连接酶 NEB，Taq酶，微量振荡器（MM-2型），微量振荡器（MM-2型），恒温空气摇床，电子天平，紫外分析仪（ZF型），低温离心机（SK18），低温离心机（SK18），PCR仪（9600型），ABI 恒温磁力搅拌器（2003-16），恒温水浴锅，自动双重纯水仪
2.2 实验方法
2.2.1 shRNA的设计与退火
根据siRNA设计原则[34]，根据MRP1靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔9nt茎环序列(TTCAAGAGA)，5′端带有BamHⅠ酶切位点，3′端带有HindⅢ酶切位点，用BLAST进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。shRNA的 5
DNA模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。根据2个靶序列设计的2对DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2。
2.2.2 合成干涉片段的退火
合成片段的退火体系：各管混匀后90℃保温3分钟，37℃保温1h，再取5μL退火溶液加45μL 灭菌双蒸水混匀，使干涉片段终浓度为8ng/μL。
2.2.3 重组载体的构建
（1）将含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大肠杆菌接种入盛有200mL LB培养基（含2μg/mL氨苄青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振荡培养过夜（置摇床中160r/min）。（2）实验前预先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。预冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌悬液，观察菌体生长状况，将菌悬液分装于两个250ml离心桶中，调平。预冷离心机至4℃，4℃下8000r/min离心5min，弃上清，得菌体。（3）加预冷的溶液Ⅰ50ml于每离心桶，混匀，洗涤沉淀。8000r/min离心5min，弃上清，得沉淀。此步骤的目的为出去培养基，以获得更纯的细菌沉淀物。（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重悬细菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，温和混匀，室温放置10min，裂解大肠杆菌。（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌体破碎，释放质粒DNA等内容物。缓慢颠倒数次，防止破坏基因组DNA，室温放置3min。（6）加30ml预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒数次，防止SDS破坏基因组DNA，冰浴放置15min。4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液全部倒入新离心桶中。（7）将上清液在4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液经8层纱布过滤至新离心桶中。（8）加0.6倍体积（约54ml）的异丙醇，充分混匀，室温放置15min，以沉淀核酸。8000r/min离心15min，小心倒掉上清，敞开瓶口倒置于纸巾上，使残余上清液流尽，晾干。（9）加15ml水再加15ml LiCl（预冷）混匀，静置沉淀15min，4℃下10000r/min离心15min，以出去蛋白质和RNA。（10）倒上清于新的离心桶中，加30ml异丙醇，剧烈震荡，静置沉淀15min，在4℃下以10000r/min离心15min。再次沉淀核酸。（11）弃上清，得到沉淀的核酸。敞开瓶口倒置于纸巾上使残余上清液流尽。（12）用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下以10000r/min离心5min，弃去乙醇，离心桶敞口倒置于纸巾上，使乙醇挥发殆尽。此步骤可以沉淀DNA。（13）加2ml无菌水溶解沉淀，将液体吸到10ml离心管中，再吸2ml ddH2O冲洗瓶壁，随后将洗液加到同一10ml离心管中，随后加100µl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA彻底分解。（14）加等体积含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于4℃以12000转/分，离心15分钟，以回收质粒DNA。（15）沉淀用3ml70%乙醇重悬清洗，以除去PEG，12000r/min离心8min。（16）重复上步操作，将离心管倒扣于纸巾上10min，加1ml H2O溶解，用等体积酚/氯仿/异戊醇再抽提一次蛋白质，室温下8000r/miin离心10min。（17）小心吸上清与另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，再加0.1体积的NaAC（3mol，pH5.2），冰上沉淀20min，4℃下10000r/min离心15min，使DNA沉淀出来。（18）去上清加入3ml 70%乙醇重悬清洗，10000r/min 离心15min，晾干，用500µl无菌水溶解沉淀。
2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子
灭菌牙签挑取LB筛选平板上圆滑单菌落，先在预先分隔并标记的另一LB平皿上划板，然后点入制备好的PCR反应混合液，开始扩增。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环；72℃ 延伸1分钟，4℃保存，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。划板的平皿于37℃培养12-16h。
2.2.5 测序鉴定重组载体
将小提鉴定结果正确的质粒送交上海生工生物工程技术服务有限司，以载体反向引物为测序引物。将经鉴定后未发生突变的H1.1-
1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重组质粒的宿主菌摇瓶扩大培养后，进行质粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。
第3章 结果与分析
3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果
3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒经HindⅢ和BamHI双酶切，结果显示单酶切产物大小约为6200bp，双酶切产物略小于单酶切产物，与预期结果相符。
3.1.2 目的片段的回收
目的片段回收 ,结果显示回收产物大小约为6Kb，与预期结果相符。
3.2 重组载体的菌落PCR 重组载体菌落 PCR电泳，结果显示PCR扩增产物,电泳分析发现阳性产物可以扩增出560bp大小的条带，假阳性产物不能扩增出560bp大小的条带,与预期结果相符，可以初步筛选出阳性产物。
3.3 重组质粒大量提取
重组质粒大量提取后的电泳，结果显示pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重组质粒大小约为6.2kb，与预期结果相符。
重组质粒大提并稀释50倍以后在紫外分光光度仪Genespec上测其OD值。
3.4 重组质粒测序结果
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒测序鉴定，结果显示重组质粒的碱基序列与预期结果一致，未发生碱基突变，说明pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒构建成功。
参考文献
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