高效液相色谱系统中气泡对检测的影响及其解决方法

第一篇：高效液相色谱系统中气泡对检测的影响及其解决方法

高效液相色谱系统中气泡对检测的影响及其解决方法

在我们进行液相色谱分析时，有时会遇到这样一个问题：系统的流路中存在气泡。

由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。

造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。

为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。常用的脱气方法有以下几种：

1.吹氦脱气法 使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在0.1Mpa压力下，以约60ml/min流速通入流动相10-15min以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂，脱气效果较好，但在国内因氦气价格较贵，本法使用较少；

2.加热回流法 此法的脱气效果较好；

3.抽真空脱气法 此时可使用微型真空泵，降压至0.05-0.07MPa即可除区溶解的气体。显然使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。

4.超声波脱气法 它是目前实验室使用最广泛的脱气方法，将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气10-20min即可。该方法操作简便，基本能满足日常分析的要求。

5.在线真空脱气法 把真空脱气装置串联到储液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。

其二，在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净。

其三，在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。

第二篇：高效液相色谱基本概念和术语

高压液相色谱HPLC培训教程(一)I．概论

一、液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。

二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点：

高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速-流速为0.1~10.0 ml/min。

高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

三、色谱法分类

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临

为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3．离子交换色谱法

固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4．离子对色谱法

又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。5．排阻色谱法

固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

第三篇：GB_T 23217-2008_水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测法

GB/T 23217-2008 水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测

法

基本信息

【英文名称】Determination of tetrodotoxin in aquatic products―HPLC-fluorescence detection method 【标准状态】被代替 【全文语种】中文简体 【发布日期】2008/12/31 【实施日期】2009/5/1 【修订日期】2008/12/31 【中国标准分类号】X04 【国际标准分类号】67.050

关联标准

【代替标准】暂无

【被代替标准】GB 5009.206-2016

【引用标准】GB/T 6379.1,GB/T 6379.2,GB/T 6682

适用范围&文摘

本标准规定了水产品中河豚毒素测定的液相色谱测定方法与液相色谱串联质谱确证方法。本标准适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤、鱿鱼中河豚毒素的测定与确证。本标准方法的检出限为0.05 mg/kg。

第四篇：高效液相色谱技术在食品安全领域中的应用

高效液相色谱技术在食品安全领域中的应用 摘要：本文综述高效液相色谱在食品安全检测中的应用。详述食品添加剂、非食品添加剂、农药残留量、抗生素药物残留量、毒素的检测等的检测技术。对于保证食品质量、维护人民健康安全有着重要意义。关键词：高效液相色谱技术；食品安全；食品添加剂；非添加剂；农药残留量；药物残留量；毒素

Research on the food safety of High Performance Liquid

Chromatography

LIU Wen-duo

(Zhongkai University of Agriculture and EngineeringCollege of light industry and food science, Guangdong

Guangzhou 510225)

Abstract: High Performance Liquid Chromatography was applied in food safety monitoring,Mainly on food additives, no allowed additives, pesticide residues, antibiotic residues, toxin and so on.It has important significance to ensure food quality and people's health.Key words: HPLC;food safey;food additives;non additivies;pesticide residues;antibiotic residue;toxin

高效液相色谱(HPLC)是 60年代后期发展起来的分离分析技术，是现代分离测定的重要手段[1]。问世以来，因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析[2]。近年来，随着色谱技术的不断发展，各种工作站软件的开发，以及与质谱等仪器的联用，大大拓宽了 HPLC的应用范围。目前很多新型专用的 HPLC仪不断出现，如氨基酸分析仪、糖分析仪、离子色谱仪等相继出现[3]。

近年来常有食品安全事故发生，例如食品添加剂超标；一些食品农药残留和有害物质超标，苏丹红事件、三鹿奶粉事件就是先例。这些产品不合格，严重影响我国的声誉和人民的安全。此时，精密的高效液相色谱仪器就发挥重要作用。本文仅就高效液相色谱质谱在食品检测中的应用进行综述，以供参考。食品添加剂的分析

1.1 甜味剂

天然甜味剂有蔗糖、葡萄糖、甘草酸钠盐等，人工甜味剂有糖精及其钠盐，环已基氨基磺酸钠和甘精。甘精毒性大 , 各国都禁止使用, 我国准许使用糖精钠、环已基氨基磺酸钠、天门冬酰丙氨酸甲脂、麦芽糖酸、D-山梨糖酸、甘草和甜味菊等。糖精钠是使用历史最长的人工合成甜味剂之一，WHO制订的ADI为 0～2.5 mg/ kg。单独测定食物中的糖精钠方法较简单，使用反相色谱柱，以甲酸： 0.02 mol / L乙酸铵（5：95）为流动相，紫外检测器，波长选择 230 nm，可以很容易地获得结果，这是国家标准检验方法[4]。

甘草苷系天然甜味剂，溶于水、乙醇中，不溶于乙醚、氯仿。采用反相离子对分配型 HPLC法可同时测定食品中甘草苷和糖精钠，操作简便、迅速。其条件为Chrosorb RP-18(5μm)柱，流动相为乙醇：0.05 M磷酸二氢钠（2 ：3）溶液中含 0.02MCTA，用磷酸调pH为 3，紫外检测器，波长选择 245 nm[5]。

1.2 着色剂

为了改善食品的感官性状，允许在食品中添加一定限量的食用色素。食用色素可分为食用天然色素和合成色素，天然色素来源于植物色素和动物色素，一般较为安全。合成色素常以苯、甲苯、萘等化工产品为原料合成。由于合成色素大都有慢性毒性或致癌性，必须严格

控制使用种类及含量。我国允许使用的 8种合成色素,都是水溶酸性色素。采用径向加压柱 u Bondapak C18反相柱，以甲醇：0.02 M乙酸铵为流动相，可将除新红外的 7种合成色素同时分离定量。用液体阴离子交换树脂 Amberlite LA乙晴（50：50），流速为 1.5mL/mL，检测波长 243nm，结果三聚氰胺的保留时间为6.9 min，空白无干扰。检出限为1.0ug（行标为2.0μg），有实用意义。

李延志等[10]采用 HPLC-DAD 法快速筛查蛋白质食品非法添加三聚氰胺。其方法是样品以 1% 三氯乙酸提取，用 2% 乙酸铅沉淀蛋白，离心后，上清液荆 0.45µm 滤膜过滤，直接上机进行HPLC分析。本法检出限为 0.28mg/kg，线性范围： 0.05~1.6mg/L，该法灵敏、准确，可推广使用。

张俊燕等[11]报道饲料中三聚氰胺的检测方法。采用 Agilent 1100 HPLC-DAD 检测器，波长 240 nm 和北京Agela 离子交换固相萃取柱。样品经0.1%三氯乙酸提取，离心，上清液过 PCX 小柱，净化后做 HPLC 分析或衍生后做 HPLC-MS 分析。结果按照2007 年美国 FDA的 HPLC-UV 方法测定三聚氰胺，用国产 AgelaANB 亲水色谱柱，分离效果良好。最低检出限：HPLC-UV 法为 2µg、HPLC-MS法为 0.5µg，大大提高灵敏度，而 FDA 原法由于流动相中加入离子对试剂而不能直接用 HPLC-MS分析。

WC Andersen 等[12]采用超高效液相色谱串联四级杆质谱法测定鮎鱼组织中的三聚氰胺，结果满意。陈晓东等[13]亦曾建立乳及乳制品中三聚氰胺的HPLC-MS-MS测定方法。样品用三氯乙酸和乙晴提取，经阳离子交换固相萃取柱（SPE）净化后，HPLC-MS-MS 法确证和测定。外标法定量。结果在 0.01~0.5µg/mL 范围内呈线性关系。r=0.9999，检出限（LOQ）为 0.01µg/kg，本法加样回收率为80.4%~107.4%。RSD=9.4%。可满足检测要求。

此外，由于大量使用的三聚氰胺大部分以原形直接或是随着粪便排入海洋中，对海洋生物造成潜在威胁，对生态环境造成破坏，已成为新的重要污染物。XU Ying-jiang等[14]建立固相萃取-超高效液相色谱串联质谱测定海水及沉积物中的三聚氰胺的方法。检出量为

0.5µg /kg，适合海水及沉积物中痕量三聚氰胺的测定。

2.2食品中苏丹红的检测

苏丹红属偶氮染料，系化工合成染色剂。主要用于蜡染、油彩等产品。苏丹红进入人体后分解还原成致癌芳香胺，对健康造成很大危害。

温忆敏等[15]参照欧盟和我国国家标准方法经研究和改进，建立食品中苏丹红系列化合物和对位红的 HPLC 测定法。样品经有机溶剂提取、氧化钼吸附、梯度洗脱等进行测定，并采用光谱-色谱法，重点对洗脱剂强度与萃取活性关系、色谱优化条件等进行研究。该方法可同时测定食品中苏丹红 1、2、3、4 及红 7B、黑 B、对位红等。最低检出限均可达到 0.01mg/g，符合有关法规的要求。

刘志权等[16]应用超高效液相色谱质谱联用（UPLC-ESI-MS-MS）法建立快速测定苏丹红 1~4的含量。实验采用UPLC-ESI-MS-MS 串联四级杆质谱仪，多粒子反应监测（MRM）定量法。通过对样品预处理、色谱条件和质谱参数的优化选择，建立的同步测定食品苏丹红 1~4 含量方法，重复性好、灵敏度高、准确可靠。本法苏丹红 1~4 的最低检出限分别为0.1µg/kg、0.1µg/kg、0.2µg/kg、1.0µg/kg，线性范围在 1.0~100ng/mL，r=0.9900，加样回收率为 87.0%~109%，可用于样平的实际检测。

宁肃骏等[17]建立食品中对位红、苏丹红 1~4的 UPLC-ESI-MS-MS 测定方法，以氘代苏丹红为内标进行定量。试样经提取，再经液液萃取和固相萃取（Waters Oasis MAX）净化，上机进样测定。本法线性范围在 0~100µg/kg，r=0.9900，定性定量检出限均为 1.0µg/kg，加样回收率为 78%~112.4%。经辣椒酱等 7 种食品检测，结果满意。本法灵敏度高，特别适合于低含量复杂样品中苏丹红的分析。食品中农药物残留量的检测

3.1 食品中农药残留量的检测

为防治病虫害，农业上广泛使用各种农药，其残留量超标将严重影响人们的健康。林子掩等[18]采用自制硅藻土固相萃取柱，建立固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）法，同时测定蔬菜中甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯等农药的残留方法。4 中蔬菜样品测定的回收率分别为卷心菜 80.7%~106.2%、花菜80.5%~102.6%、红萝卜63.0%~109.3%、青椒 74.9%~109.0%。RSD 均为 14.5。对于控制蔬菜质量有实用意义。

WEN Yuyun 等[19]应用高效液相荧光检测器（HPLC-FL）测定茶叶中甲氰菊酯等 5 种菊酯类农药的残留量。实验以乙晴-水(74：26)为流动相，流速为 1.2mL/min，梯度洗脱，柱后衍生化，FLD 检测，激发波长：221 nm，发射波长：320 nm，本法线性范围在 0.04~8.0μg/g，RSD为3.4%~6.4%，检出限为0.012~ 0.048μg/g（重）。结果完全符合欧盟标准的要求，为出口茶叶质量提供保证。

徐远金等[20]应用 SPE-HPLC-ESI-MS法同时测定疏菜中痕量甲胺磷、敌百虫、马拉硫磷、对硫磷等7种有机磷农药残留量。并根据测得的二级质谱离子碎片，研究7种有机磷农药的裂解规律。样品提取液经固相萃取后，采用用C18 柱分离。以0.1%甲酸乙酯-0.1% 甲酸水溶液为流定量动相，线性梯度洗脱，以保留时间和质荷比对分离出的组分予以定性确证，以峰面积进行定量。结果表明7种农药的浓度与其峰面积在一定范围内呈良好的线性关系。检出限为0.002~0.090µg/kg，RSD=3.1%~5.2%。此法简便、快速、灵敏，适于蔬菜中 7 种有机磷农药残留量的测定。

3.2 食品中药物残留量的检测

我国一些水产养殖地区由于放养密度高、环境污染严重等原因，致使水生动植物发病率增加，有的渔民为追求经济效益最大化，常在饲料中添加四环素类抗生素药物，致使水产品中这些抗生素残留增加，目前其残留危害已引起世界范围内的广泛关注。

程雪梅等[21]采用 HPLC-MS-MS 法分析海产品中的四环素类药物残留。由于浓度很低，样品经 2% 高氯酸提取，固相柱萃取，以乙晴-水-三氯乙酸体系为流动相，采用电喷雾离子检测器进行质谱分析。结果金霉素、四环素、土霉素、强力霉素的检出限分别为 0.008 mg/kg 和 0.062mg/kg。可以满足海产中四环素类抗生素残留测定的要求。

周艳明等[22]指出，有些抗生素如赤霉素，目前我国尚无标准测定方法，出于实际需要，并为国标提供方法，建立草莓中赤霉素残留量的 HPLC 测定方法。样品采用 80% 甲醇提取，经液液萃取，净化，以紫外检测器测定。结果表明，本法最低检出限为0.017 mg/kg，加样回收率为 82.8%~106.6%，RSD为3.2%~4.1%。方法准确可靠、简便可行。亦可用于其它水果中赤霉素的检测。

孙志刚等[23]应用 HPLC-SEI-MS 法测定水产品中甲羟孕酮残留量。实验样品先用乙酸乙酯提取，氮气吹干，乙晴溶解，正己烷除脂，中性氧化铝小柱净化，流动相为乙晴 c-0.1% 甲酸（70：30），RP18 柱分离，通过MS-MS测定。本法检出限为0.03µg/kg，定量检出限为 0.1µg/kg，可满足我国出口检测要求。

XIAX X 等[24]采用液相色谱质谱联用测定家禽和猪肉、鸡蛋中甲硝唑、替硝唑、洛硝唑和异丙硝唑的含量；DAESELEIRE E 等[25]应用液相色谱质谱联用法，快速同时鉴定和测定鸡蛋中洛硝唑、甲硝唑和地美硝唑的含量，结果满意。YINJu-can等[26]采用固相萃取柱净化处理后进行液相色谱-大气压化学电离源串联四级杆质谱，在正离子模式下(HPLC-APCI(+)-MS/MS)对动物源性食品鸡肉、猪肉、牛肉中甲硝唑等 9 种硝基咪唑类药物及其代谢物残留量进行分析。最低检测量为 0.5μg /kg。上述方法简便快速、灵敏可靠、专属性好，为质量控制提供可靠的方法。

杜振霞等[27]应用超高效液相色谱-串联四级杆质谱（UPLC-MS/MS）同时测定牛肉组织中环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星等 3 种氟喹诺酮类兽药残留。样品经萃取后测定，检出限均为0.05μg/L，定量限为0.1μg/L。

ZHANGJian-li 等[28,29]采用 LC-MS/MS 法同时检测保健品中非法添加的阿卡波糖、二甲双胍等10种降糖药和安定、硝基安定等 8 种镇静催眠药。前者检出限为 20mg/kg，后者检出限为 1mg/kg。方法简便快速、准确可靠，适于保健品中非法添加的化学类降糖类药的常规检测。

3.3 食品中毒素的检测

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，其基本结构都有二呋喃环和氧杂萘邻酮,如毒素B1、G1和 M1等。日常 HPLC检测这些物质时采用 C18柱，流动相为甲醇：0.01M KH2PO4(1：1),荧光检测器，λEx360 nm，λEm245 nm。柳洁等[30]采用ODS Hy 2persil 5μm，125 mm×4 mm柱，流动相为甲醇：乙腈：水 = 15 ：13 ：72，荧光检测器λEx 360 nm，λEm 440 nm，检测出黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和 M1，检测限达到 0.02 μg。

海产品贝毒大田软海绵酸（OA）是一种小分子海洋聚醚类腹泻性贝毒素。多由海洋甲藻产生。常蓄积于贝、螺等海洋生物体内，食用后易引起腹泻性为主的食物中毒，且 OA 为强烈的致癌因子，对人类健康构成严重威胁。卢士英等[31]建立 ELSIA和HPLC-MS/MS同时测定花蛤和扇贝等 OA 的 2 种方法。前者检测线性范围在0.4~2.5μg /L，后者为10~800μg /L。前者灵敏度为 0.18μg /L，后者为μg /L。经 10 种海产品样品检验，结果 ELISA 法检出蛤蜊样品的含量为3.82μg/100g，扇贝的含量为 2.32μg /100g； HPLC-MS/MS 法检出蛤蜊样品的含量为 3.42μg /100g。所建立的 2 种方法皆可用于海产品腹泻性贝毒 OA限量标准检测。小结

HPLC作为一种十分有效的分析分离手段，已广泛地用于食品安全等领域，其技术也在不断改进与发展，发展具有专家系统的智能多模式多柱的色谱系统是当今色谱发展的重点，即色谱专家系统将是一个必然趋势。

HPLC另一个发展趋势是联用技术的发展。目前人们所面临的问题, 往往很难再用单相分析分离方法解决, 而常需用色谱、质谱、光谱、核磁等多种方法综合加以解决。随着计算机技术的发展。多仪器联用形式已成为现实，如 GC-LC、MS串联质谱法分析海产品中四环素类药物残留

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第五篇：变性高效液相色谱技术及其在植物检疫工作中的应用前景

变性高效液相色谱技术及其在植物检疫工作中的应用前景 摘要：本文介绍了变性高效液相色谱(DHPLC)技术的基本原理及影响因素，并结合植物病原鉴定技术的特点，分析了DHPLC技术在植物检疫工作中的应用前景，证明了DHPLC技术将成为一种快速、准确、高效的新型植物病原检测技术。

关键词： DHPLC 植物检疫 核酸分析技术

DHPLC是变性高效液相色谱(denaturing higperformance liquid chromatography)的英文缩写，是近几年才逐渐发展成熟的核酸分析技术，目前在生命科学领域中已得到广泛的应用。是一种基于异源双链分析(heteroduplex analysis)的基因突变、单核苷酸多态性(SNP)、DNA片段长度多态性的高精度、高通量的新型检测技术。

植物检疫工作中，由于植物病原特殊的生物学特点，而具有原理、步骤程序各不相同、种类繁多的鉴定技术。大多数病原如病原细菌、病毒、类病毒在传统的目测法、培养基筛选、免疫电镜、血清学鉴定等步骤后，还需进行指示植物鉴别及致病力检测。其步骤繁杂，时间冗长甚至超出苗木存活容许的时间范畴等缺陷给检验检疫工作的顺利实施造成了一定的困难。变性高效液相色谱技术(DHPLC)的出现为解决以上问题提供了极大的可能，这种技术利用基因的物理化学性质，将先进的高精度大型仪器分析技术与核酸提取、体外扩增等经典分子生物学技术相结合，实现了生物学、物理学、分析化学等多学科交汇互融，既发挥了化学仪器的高精密度的优势，又体现了物理学和生物技术的成果，是当今学科交叉领域又一杰出科研硕果，可为未来植物检疫技术发展提供了新的前进方向。

一、DHPLC的基本原理及影响因素长度多态性分析原理

DNA分子带负电荷，通过一种充当‘桥梁’作用的分子一使TEAA(三乙钱醋酸盐)的阳性按离子与DNA相互作用，与柱子固相填料表面分子结合，DNA分子本身得以吸附到柱子上。这样DNA分子结合的TEAA越多，与固相结合得越牢固。经基链与固相结合的强度会随着流动相中乙睛浓度的增加而减，DNA片段越长，结合的TEAA越多，越不易被洗脱。因此DNA片段大小分析是长度依赖性分离，而非序列依赖性分离。变性温度是影响DNA片段分析的一个重要因素。而在不变性温度条件下，可分离长度不同的双链DNA分子。基因型多态性分析原理

DHPLC的基本原理是异源双链分析(heteroduplex analysis)。异源双链(heteroduplex)指由不完全互补的两条DNA单链形成的双链DNA，同源双链(homoduplex)指由完全互补的两条DNA单链形成的双链DNA简略来说，异源双链和同源双链对介质有不同的亲和力，因此，它们从介质中被洗脱下来的条件有差别。如果PCR产物源自纯合子或者发生了纯合突变的个体，那么只有在与另外一种纯合野生型序列的PCR产物混合，再变性复性，才能够形成上述杂合和纯合双链。杂合双链存在错配碱基，其变性温度低于纯合双链，当温度升高到一定程度，先于纯合双链在错配碱基周围解链变性，导致双链减少和单链增

多。由于单链比双链所带的负电荷少，杂合双链比纯合双链更容易形成单链，其保留时间短于纯合双链，在图谱上先于未解链的纯合双链出现。随着变性温度升高，纯合双链也会部分变性，A=T含有2个氢键，C=G含有3个氢键，前者变性程度比后者低，因此先出现的峰为含有AT的双链，后出现的为含CG的双链。利用这种杂合和纯合双链在保留时间上的差异，可以快速分析单个核苷酸的突变，从而进行基因型的判定。DHPLC的影响因素

（1）PCR产物的影响

PCR扩增为高通量基因型检测提供了标本源。DHPLC对PCR中的引物、试剂虽无特殊要求，而且也不必对PCR产物进行预处理，但是要尽量保证PCR扩增产物的忠实性，避免人为引入错配碱基。

（2）洗脱温度

温度是影响DHPLC检测基因型成功与否的至关重要因素。如将检测温度提高2℃后，就可在RET基因中发现两个漏检的突变基因型。有些基因突变对温度不敏感，在较宽的温度范围内(悬殊8℃左右)都可对其进行有效筛检；但有的突变对温度要求严格一些，如BRCA1基因的56134C/T与 2640C/T，只有分别在59℃与57℃下，才能被检测到。

（3）固定相

目前，有几种不同的分离介质被用于突变分析中。如美国Transgenomic公司应用大小为2 m的无孔聚苯乙烯颗粒作为分离柱的材料，惠普公司则使用孔径为3.5 m的硅胶作为分离柱介质。这两种柱的分辨率似乎相似，但寿命却大不相同，前者通常可分析6000个左右的样品，而后者仅可分析1000~2000个样品。最近，瓦里安公司(WalnutCreek,CA)开发出多聚物包被的碱性化硅胶柱。也有尝试将无孔聚苯乙烯与有孔硅胶结合，制成单片集成毛细管柱，可使柱效提高40%。

（4）流动相

流动相中离子配对剂的TEAA浓度对DHPLC分析的温度有显著影响。如果TEAA的浓度从lommol/L升高至200mmol/L，那么对应的最佳检测温度就要提高4-4.5℃。流动相的pH值(6-9)对检测效果几乎没有任何影响，但pH值太高，将会使双链DNA完全变性，达不到检测目的；pH值太低，又会干扰DNA与TEAA的相互作用，影响检测

效果。．

二、DHPLC在植物检疫工作中的应用前景DHPLC在有害生物鉴定中的应用

（1）DHPLC在原核有害生物鉴定中的应用

植物检疫工作中，检疫性原核有害生物主要包括细菌、植原体、病毒、类病毒等。关于原核有害生物相关的DHPLC检测技术报道主要集中在医学领域。2004年Bode E等以保守基因ITS(16S～23Sintergenic spacer region)和功能基因gyrA为鉴定依据，在42种待测细菌中准确地检测出Bacillus cereus菌和Bacillus thuringiensis菌。Hurtle W等利用DHPLC对较广范围的细菌种类

进行基因鉴定，几个属的39种细菌用来检验DHPLC的准确性和可靠性。大多数(36/39)种的细菌拥有可作为分子指纹图谱的特异表达曲线图，而且在70余种细菌样品中，Yersinia pestis(10/70)和Bacillus anthracis(12/74)样品都被准确地鉴定出来。实验结果表明，DHPLC的检测特异性为100％，敏感度为97.7％，predictive值为96.9％，这些数据证明DHPLC可以用于细菌鉴定。Domann E等进行了以16S rRNA基因的V6至V8区序列为靶序列，通过DHPLC区分致病菌多样性的研究。罗阳等对用变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查了SARS冠状病毒(SARS.CoV)S蛋白的受体的正常无关个体中氨基肽酶N编码基因ANPEP的全部外显子及其两侧部分内含子序列，发现SARS-CoV感染和SARS发病的易感基因或抗病基因。

(2)DHPLC在真核有害生物鉴定中的应用

真核有害生物结构较原核生物更为复杂，基因组构成和基因功能分化更为精细，更多的致病基因和保守基因可作为生物基因型鉴定的依据，这些特点促成了DHPLC在真核生物的研究领域拥有更加宽广的用武之地，并发挥了更为强大的功能。Kota等通过DHPLC进行了大麦(Hordeum vulgare L.)的基因结构及基因分型的研究工作。陈瑶生等用DHPLC对猪肌肉组织差异表达EST的进行鉴定。Wulfert M、蒋琼橙等认为人类线粒体DNA(mtDNA)的16024~16365nt，73-340nt及438—574nt 3个区域为多态性高发区，这3个区域的高度多态性使得个体间具有高度的差异性，因而可以用来作个人识别。他们通过DHPLC和PCR对人类线粒体的异质性进行技术检测。沈靖等采用DHPLC直接测序和PCR．RFLP方法发现与初步证实了中国人的iNOs基因TsP多态性。以上例子有力地证明了DHPLC在真核生物生命科学领域的实用性和通用性，昭示了这种检测技术在真核有害生物鉴定工作中的广泛应用前景。

检疫性植物病原以其危害性大、破坏力强、症状复杂多变而成为一类重要的检疫对象。植物病原生物在分类学中跨度很大，现发现有真菌、细菌、植原体、病毒、类病毒和线虫等。这些病原生物从致病性这一点讲是相同的，但致病机理及基因结构、调节、控制等特点却大相径庭。总体来说，植物病原不仅种类多，而且近似种多，表现为检疫性病原之间易混淆、检疫性与非检疫性病原之间难区分、同种病原在不同寄主上表现的症状不同、不同种病原在相同寄主上却可能表现相似的症状等具体形式。目前，DHPLC技术在医学、保健学、环保、生态学领域已得到广泛的应用，检测范围几乎涵盖从原核生物到真核生物、从微生物到植物、动物、从低等生物到高等生物的各种生命形式。DHPLC是一套经过反复摸索、改进、总结所得到的较为成熟稳定、准确快速的基因型检测分类鉴定技术，是一种能够满足植物检疫-工作需要、解决上述难题的行之有效的新型检测方法。DHPLC在杂交作物品系鉴定方面的应用

从标准的角度而言，我国现行的GB/T3543.3-1995《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》及其实施指南中列入的对杂交水稻品种的鉴定方法，应是当前世界上较全面的方法，而且也完全与国际接轨。同时，世界上近20多年来，对杂交水稻品种鉴定技术的研究，在理论方面、技术方面都取得了很大的成就，特别是近年将DNA分子检测技术用于品种鉴定的研究取得了可喜的进展。DNA指纹图谱技术主要包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、扩增酶切片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列或微卫星重复序列(SSR)DNA指纹技术具有多态性丰富、灵敏度高、区分鉴别效果好等优点，但是，主要存在重演性差、技术难度大、成本高、费时等缺陷，目前用于品种真实性和纯度鉴定的方法还很不成熟。DHPLC的基本原理是异源双链分析，其技术特点正适用于杂交水稻的鉴定，纯和体基因组可作为(野生型)同源双链模板，而杂交体则视为突变型(异源双链)。利用异源双链和同源双链洗脱顺序、时间上的差异，可准确地进行杂交水稻的鉴定。Kota等通过DHPLC成功地绘制了大麦(Hordettm vulgare L.)的SNP图谱，Rupe MA等利用nrp基因通过DHPLC对杂交玉米品系及基因表达等进行了研究。DHPLC在转基因植物鉴定方面的应用

转基因技术是将外源基因转入生物体或细胞内使之表达的技术。在人们构建的外源转基因载体中，人们设计裟入了基因表达所需的启动子、终止子序列。为了方便转基因植物的筛选，人们还整合了报告基因和抗性基因。因此针对这个特点，当我们对转入的目的基因并不了解的情况下，通过检测这些基因序列就可对转基因作物进行鉴定。转基因作物DHPLC检测方法可以以目前通用的报告基因(Gus和Gfp基因)、抗性基因(Kan和Lif抗性基因)、启动子(CaMV35S)和终止子(CaMV35S和Nos等)等具有代表性的特异片段为扩增靶序列(或杂交探针)，将从待检样品中提取的DNA，利用特异性引物扩增，与以上基因的标准品混合，利用变性高效液相色谱仪进行温度变性，复性形成异源双链或同源双链，并先后从色谱柱洗脱，收集信号形成不同吸收峰后再经计算机软件进行分析判断。目前利用常规PCR、核酸杂交、荧光PCR、基因芯片检测转基因生物的技术日臻成熟，但关于DHPLC检测转基凶成分国内外都尚无相关文献报道，可作为一个全新的研究方向去探索。DHPLC与传统分子生物学方法

经典分子生物学方法的引人，在缩短植物检疫鉴定工作的检测周期、提高检测灵敏度、提升检测效率的同时，极大地丰富了植物病原检测鉴定的技术手段，为实验室具体的检测T作提供了更为广阔的选择。但其自身的缺陷也逐渐暴露出来，常规PCR检测步骤简单，操作方便，假阳性结果m现频率过高的问题却无法避免。荧光PCR及基因芯片技术灵敏度高、结果可靠，但荧光定量PCR仪及基因芯片装置价值昂贵，大多数部门无力购置。Southern、Northern等由于杂交技术耗时长、步骤多，对于检测人员技术能力要求较高等缺点不适合在检验检疫部门推广应用。许多研究表明与传统分子生物学方法相比，DHPLC作为植物病原的新型检测鉴定技术在准确度和节约成本、高通量、简捷快速等各个方面都具有天然的优势。施锦绣等比较DHPLC与直接测序法在单核苷酸多态性检测中的应用，发现在41个样本的SERT-E9A/G基因检测中，DHPLC的检出率达到了100％。在大规模样本的杂合子筛检中，检测的错误率几乎为0。结论是DHPLC技术是一项可用于未知序列的检测、尤其是在人群中大规模筛查已知序列的有效手段。Arnold等在BRCA1基因中，DHPLC检出了所有直接测序找到的变异体，但DHPLC比直接测序的成本至少降低了10倍左右。与基于荧光PCR、DNA芯片的再测序相比，DHPLC不仅成本低，而且灵敏度与特异性也比较高。Kwok等认为，对于频率高于20％ 的变异，DHPLC的检出率为100％，而直接测序的检出率为80％。Choy等通过比较构象敏感凝胶电泳(PCRCSGE)、PCR．SSCA和DHPLC检测结节性硬化症基因 C2突变的能力，发现对于TSC2单核苷酸变异的检出率PCR—CSGE和PCR-SSCA分别为69％和54％，而DHPLC为100％，提示DHPLC优于CSGE和SSCA，特别是在检出单核苷酸变异方面。这些研究表明，DHPLC是检测基因组DNA更为敏感而且准确的手段。

DHPLC技术操作步骤简单，具有自动化程度高、检测快速、灵敏度高的特点，并可以对样品进行自动化回收。该技术允许在完全变性、部分变性或非变性条件下分析核苷酸片段，已被广泛用于核酸片段分离、突变检测、基因型分析、PCR引物纯度分析和纯化、SNP分析等方法，单核苷酸突变检测准确率稳定在96％以上。在最佳条件下，该技术甚至可以对有些杂和体的两个等位基因进行分离。又由于整个过程无需对DNA产物进行后期无害化处理，可以有效地解决溴化乙锭的环境污染问题。

由于工作和职责的特殊性质，检验检疫的工作对象包含了各类产品，涉及到农业工业等方方面面，实验仪器的配置、资料种类有较高较宽的要求。高效液相色谱仪作为分析化学常规仪器，被广泛使用于各地方局的常规检验工作中，具有良好的普及率。DHPLC利用交叉科学的优势，跨领域的发挥高精度化学分析仪器的潜能，挖掘高效液相色谱仪潜在价值，不仪节省了二次购买仪器的昂贵费用，也无形提高了其自身价值。同时，植物病原新型尖端高效液相色谱检测技术(DHPLC)的研制与检验检疫系统一贯实施科技创新、保持与国际接轨战略相符，将有助于加速植物病原检疫技术的革新，确立我国在国际相关研究领域的领先和权威地位。

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