微生物学实验[最终定稿]

第一篇：微生物学实验

细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一 显微镜直接计数法

（一）目的要求

1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图15—2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。

图15—1 血细胞计数板构造

（一）图15—2 血细胞计数板构造

（二）A.正面图；B.纵切面图； 放大后的方格网，中间大方格为计数室

1.血细胞计数板；2.盖玻片；3.计数室

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则

1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）

同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母

2．仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。

（四）操作步骤

l．菌悬液制备

以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。

4．显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

5．清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（五）实验报告

l．结果

将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml

12345

第一室

第二室

2．思考题

(1)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差．力求准确?

(2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。

二平板菌落计数法

（一）目的要求

学习习近平板菌落计数的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。

（三）器材

1．菌种 大肠杆菌菌悬液。

2．培养基 牛肉膏蛋白陈培养基。

3．仪器或其他用具lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

（四）操作步骤

l．编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-

4、10-

5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀释

用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10?1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图15-3所示。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3，取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10-

4、10-5和10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

图15—3平板菌落计数操作步骤

4．倒平板．

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

5．计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-

4、10-

5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

五、实验报告

1．结果

2．将培养后菌落计数结果填入下表

稀释度10-410-510-6

Cfu数/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考题

(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?

(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?

三 光电比浊计数法

一、目的要求

1．了解光电比浊计数法的原理。

2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

二、基本原理

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。

光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

图15—4 比浊法测定细胞浓度的原理

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母培养液

2．仪器或其他用具 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。

（四）操作步骤

1．标准曲线制作

（1）编号 取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。

（2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。

（3）测OD值 将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表

管号12345678

细胞数106/ml

光密度（OD）

每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定

(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定

将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。

各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。

3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。

（五）实验报告

l．结果

每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数

2．思考题

(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点?

(2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?

(3)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?

四 大肠杆菌生长曲线的测定

(一)目的要求

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。

2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

(二)基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。

用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002换算出所测菌悬液的OD值。

图15—5 带侧臂试管的三角烧瓶

(三)器材

1．菌种 大肠杆菌

2．培养基 LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

图15—6 直接用试管测OD值

(四)操作步骤

1．标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定

用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

本操作步骤也可用简便的方法代替：

1．用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。

(五)实验报告

1．结果

(1)将测定的OD600值填入下表：

培养时间对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)绘制大肠杆菌的生长曲线。

2．思考题

(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？

(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。

(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

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第二篇：微生物学实验基本要求

微生物学实验基本要求及成绩评定

一、思想和态度要求

1、树立严谨认真的科学态度

2、理解与验证基本原理

3、掌握并不断提高分析和解决问题的方法

4、启迪创新思维

二、具体要求

1、实验前5-10分钟到达实验室。迟到1次扣除0.5分，无故一次不到扣除1分。

2、每次实验前预习实验的目的、原理和方法，做到心中有数。

3、实验前洗手，保持试验台清洁，保持室内安静。

4、实验过程中要严格无菌操作、防止杂菌污染。

5、实验过程中，严格按正确方法操作实验仪器。

6、实验过程中认真及时做好实验记录。

7、实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃品接近火焰。如遇火险，先关掉火源，再用湿布掩灭，必要时用灭火器。

8、每次实验完成后，清洁试验台，各种物品放回原位。

9、带菌材料的处理：含菌培养基应灭菌后再作为垃圾处理。

10、由于操作不当损坏玻璃器皿，先登记姓名，并扣分，每件1分。

11、认真按要求完成实验报告。

三、微生物学实验成绩评定

1、基础和综合实验80%

每次实验5分，其中实验操作3分，实验报告2分

2、实验考试10%

实验理论和实验操作各为5分

3、自主设计实验10%

包括实验设计、实验操作、实验结果、汇报交流，共10分

第三篇：微生物学实验考核办法

本科微生物学实验考核办法

考核方式：按学号顺序逐一进场应考。考核内容共8项，每位同学通过抽签考其中的一项内容。考核时间：每人限6分钟内完成。

考核地点：微免实验课上课的实验室

考核内容及要求如下：

1、显微镜（油镜）的使用和保护方法

（1）、提供一张细菌玻片标本，要求能正确使用油镜观察到细菌的基本形态。

（2）、掌握显微镜（油镜）保护方法

2、血清对倍稀释法

（1）、用生理盐水将血清进行对倍稀释，终浓度达到1/ 2、1/ 4、1 /8三个稀释度。

（2）、掌握血清对倍稀释的原理及方法，能正确使用刻度吸管。

3、玻片凝集试验

（1）、要求用伤寒诊断血清，采用玻片凝集试验的方法检测待检细菌是否为伤寒杆菌。

（2）、要求操作方法、步骤正确，能准确判断结果。

（3）、无菌操作正确。

4、革兰氏染色法

（1）、口试回答细菌涂片的制作方法

（2）、将一张已涂好的细菌玻片进行革兰氏染色

（3）、要求染色步骤及各项染色时间正确，操作熟练。

5、细菌的划线分离培养技术

（1）、将细菌分区划线到普通琼脂平碟上。

（2）、要求划线分区正确，接种划线手法正确、熟练。

（3）、无菌操作正确。

6、液体和半固体培养基的细菌接种方法（无菌操作）

（1）、将菌种接种到液体培养基和半固体培养基内。

（2）、要求各环节无菌操作正确。

7、细菌在培养基中生长情况及细菌特殊结构观察

（1）、正确描述固体培养基的菌落、菌苔。

（2）、正确描述液体培养基中的细菌生长情况。

（3）、正确观察出镜下细菌的特殊结构。

8、抗酸染色法

（1）、正确回答抗酸染色的各个步骤（包括用加热法或不加热法 初染的时间）。

（2）、操作技术手法正确熟练

（3）、脱色程度控制较好。

注：经一次考核不及格者，可在全班同学考核结束后，允许补考一次。补考成绩通过后只计及格。

第四篇：微生物学实验考试题

《微生物学实验》试题

1、在进行高压蒸汽灭菌时，是否只要灭菌锅压力表到达所需的值时锅内就能获得所需的灭菌温度？为什么？

2、在手提式高压灭菌锅的盖上有哪些部件？它们各起什么作用？

3、高压蒸汽灭菌锅的操作有哪几个步骤？每一步骤应注意哪些问题？

4、在微生物学实验中，常用于配制固体培养基的凝固剂是什么？它有哪些特性？如何使用？

5、环境样品梯度稀释、涂布平板法分离微生物时，如何选择不同稀释梯度样品的涂布顺序？为什么？

6、在革兰氏染色实验中，为什么会出现假阳性和假阴性？如何避免？

7、在革兰氏染色实验中，不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌？为什么？

8、为何用计数板可以计得样品中的总菌值？如何计算样品中的菌体浓度？

9、血球计数板计数时，计数室内如有气泡会对结果产生怎样的影响？如何避免产生气泡？

10、试分析血球计数板计数法的误差来源，并提出减少误差的方法和措施。

要求把题目和答案写在实验报告纸上，统一收齐后和第一次实验报告一起送到我办公室-生科楼104。

第五篇：微生物学实验教案

实验一 显微镜的构造和使用方法

一、实验目的及要求

1.了解显微镜的构造和性能 2.掌握显微镜的正确使用和维护方法

二、原 理

微生物最显著的特点是个体微小，必须借助显微镜才能观察它们的个体形态和细胞构造，熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。本实验主要介绍目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜的结构和使用方法，目的在于使同学们通过本实验，对光学显微镜有比较全面的了解，并重点掌握明视野普通光学显微镜中油镜的使用。

三、显微镜的构造和性能

1.构造（1）机械系统：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、推进器、调节螺旋。

（2）光学系统：目镜、物镜、聚光器、反光镜、滤光片。

2.性能（1）分辨力和数值孔径

分辨力用D表示，D=0.5×(λ/N.A)

N.A=n×Sin(α/2)

N.A为数值孔径；λ为入射光波长；n为介质折射率。α为镜口角。

（2）放大倍数

放大倍数 = 物镜的放大倍数×目镜的放大倍数

四、实验器材

显微镜、标本、擦镜纸、香柏油、二甲苯

五、显微镜的使用方法

1、对光：光强时用平面镜，光弱时用凹面镜，视野明亮即可。

2、镜检：低倍镜——定位；高倍镜——观察；油镜——观察

3、镜检完毕后的工作：擦拭镜头（标本）等，还原显微镜，登记，洗手，离开。

4、总流程：安装—调光源—调目镜—调聚光器—镜检—擦镜头——复原—登记。

六、作业（可选）

1、哪些方法可以提高显微镜的分辨率？

2、2、为什么有时候在低倍镜下可看到的目标，换用高倍镜则无法看到？

实验二 细菌、放线菌的形态观察

一、实验目的及要求

1.掌握细菌的制片和染色技术 2.掌握放线菌形态观察方法 3.熟练油镜的使用方法

二、细菌染色的基本原理 1.革兰氏染色

G＋与G－细胞壁结构不同，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇进行脱色时，G＋细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，乙醇脱色使肽聚糖的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在胞内，经脱色处理时，初染剂保留而呈现紫色。G－菌肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。2.简单染色

细菌细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。细菌常用碱性染料来进行简单染色，这是因为在中性，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，很容易使细菌结合使菌体着色，经染色

后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

三、实验材料

1、菌种

金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、大肠杆菌、灰色链霉菌

2、器材

显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、香柏油、碱性染料等。

四、方法和步骤 1.细菌简单染色

取菌（要求无菌操作）——涂片——干燥——固定——染色（1min）——水洗——干燥——镜检（形状、大小、排列方式）2.放线菌菌落形态观察

（1）表面形状

大小、颜色、边缘、紧密程度等。（2）区别营养菌丝、气生菌丝、孢子丝 3.气生菌丝、孢子丝的活体观察

将培养皿盖打开，选择菌丝和孢子丝生长较薄的部位，直接用低倍镜和高倍镜观察。

4．气生菌丝、孢子丝的印片观察

载玻片——滴1滴美兰染液——盖玻片印片——印片面向下置于美兰中——吸去多余染液——镜检（用油镜观察）——维护还原显微镜。

五、作业

1、绘出所观察的几种细菌和放线菌的形态并注明名称和放大倍数。

2、放线菌菌落和细菌菌落有何不同之处？

3、放细菌的菌体为何不易挑取？

实验三 酵母菌和接合菌的形态观察

一、实验目的及要求

1、掌握酵母菌和接合菌菌落及个体主要形态特征。

2、掌握观察酵母菌和接合菌个体形态的制片方法。

二、实验材料

1、菌种

啤酒酵母，黑根霉，高大毛霉

2、器材

显微镜，载玻片，盖玻片，接种钩，酒精灯，无菌水，乳酸苯酚，吸水纸等。

三、实验方法 1.酵母菌菌落的观察

菌落颜色、光泽、质地、表面特征等。2.酵母菌细胞形态观察（水浸片法）

无菌水滴加于载玻片上——取菌——涂片——盖上盖玻片——镜检（10倍定位，40倍观察芽殖）。

注:亮的区域为液泡，看不到细胞核，核须染色才可见到。3.接合菌活体观察（1）肉眼观察

（2）显微镜观察

打开培养皿盖，将盖倒置，在低倍镜下观察，注意假根和匍匐丝的结构，孢囊结构和孢囊孢子。4.接合菌制片观察：

载玻片——1滴乳酸苯酚——顺一个方向钩取少量菌丝——盖玻片剥离飘落于乳酸苯酚——加盖玻片——镜检 注意：乳酸酚不必加热，孢囊在制片时已大多被破坏。

区别孢囊与气泡在显微镜下的差别：气泡会吸附大量孢子，且中央亮，两边暗，而孢囊中间厚，整个区域都暗。

四、作业

1、画出供试菌典型结构（不是在一个视野可全部看到），并注明放大倍数和名称。

2、比较酵母菌、放线菌和细菌的菌落特征。

实验四 青霉和曲霉的形态观察

一、实验目的

1、掌握曲霉、青霉菌落和个体形态特征。

2、掌握观察曲霉、青霉的主要形态特征的制片方法。

二、实验材料

1、实验菌种

灰绿曲霉，黑曲霉，黄曲霉、青霉等。

2、器材

显微镜，载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，乳酸苯酚，吸水纸等。

三、实验方法 1.菌落的活体观察

取培养皿用肉眼观察菌落的大小形态，正反面颜色、质地、饰纹边缘、颗粒物（闭囊壳、菌核等）。2.制片观察：

(1)制片：取干净载玻片——加1滴乳酸苯酚——在菌落中心与边缘之间钩出少量菌（带培养基）置于乳酸苯酚——加盖玻片煮微沸——镜检.(2)观察：将制片放在显微镜下，用低倍镜观察菌丝的粗细、颜色、分生孢子头形态；曲霉顶囊大小、形态、可育面积、分生孢子梗粗细、颜色、表面特征，有无横隔，小梗着生情况、大小、层数，分生孢子形态，大小，表面特征。

四、作业

1、出供试菌的形态并注明各部分的名称。

2、比较青霉和曲霉属霉菌的个体形态特点。

实验五 培养基的制备和常用器皿准备

一、实验目的

1.学会培养基的制备和常用器皿的准备方法 2.学会高压蒸汽灭菌及干热灭菌方法

二、原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异。但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。另外，培养基中一般含有适宜的pH值，一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

任何一种培养基制成后应及时的灭菌，以备培养菌使用，一般培养基灭菌采用高压蒸汽灭菌。

三、实验器材

1、试剂：马铃薯、葡萄糖、琼脂，营养琼脂、淀粉等。

2、器皿：移液管（1ml）、培养皿、试管、三角瓶、搪瓷缸、量筒等。

3、仪器：高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱。

4、其他：牛皮纸、纱布、棉花、棉线绳。

四、实验方法与步骤

1.PDA培养基的制备

马铃薯削皮——切块——称量——加水煮沸——过滤——往滤液中加葡萄糖、琼脂粉等——煮沸——分装——加棉塞——包扎——灭菌（湿热）。

2、营养琼脂培养基的配制

称量45克营养琼脂，加水至1000毫升，煮沸后分装，加棉塞灭菌。

3.灭菌水的制备（稀释用）

取9ml蒸馏水于试管中，塞棉塞，包扎后灭菌。取225ml蒸馏水于500ml具塞三角瓶中，包扎后灭菌。4.常用器皿准备：

a.移液管的包装 b.培养皿的包装

五、作业

1.高压蒸汽灭菌和干热灭菌各适用于哪些物品？ 2.两种灭菌技术应注意哪些关键操作？ 3.培养皿等干热灭菌前包扎的目的？

实验六 微生物的分离培养和接种方法

一、实验目的

1、掌握稀释分离和平板划线获得微生物纯种的方法

2、学会微生物接种技术

二、原理

从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

三、实验器材

1、材料：土壤、粮食或者食品。

2、培养基：PDA培养基、营养琼脂培养基。

3、器皿：三角瓶、移液管、试管、培养皿、玻璃刮铲、酒精灯、接种环等。

4、仪器：电炉、恒温培养箱。

四、实验方法

1、微生物的纯种分离

（1）稀释涂布分离法：制平板—制菌悬液—涂布—培养—获得纯种微生物。

（2）平板划线法：制平板—制菌悬液—划线—培养—获得纯种微生物。

2、微生物的接种（1）斜面接种

五步曲：a.接种环灭菌 b.拔棉塞及试管口灭菌 c.接种 d.塞棉塞 e.接种环灭菌

（2）培养皿接种：（霉菌形态观察及鉴定用）倒平板—接种（单/三点接）—接种环灭菌

五、作业题

1、为什么用稀释法和平板划线法能获得微生物纯种？

2、霉菌平板接种为什么要使平板倒置？

3、要求根据实验结果写一篇论文，字数在2000字左右。