03281食品微生物学(二)实验考试大纲

第一篇：03281食品微生物学(二)实验考试大纲

江苏省高等教育自学考试大纲江南大学编

食品微生物学实验

一、课程性质及其设置目的与要求

（一）课程性质和特点

微生物学实验是为专业基础课《微生物学》配套的同步实验课程，为必修课程，本教学大纲是根据食品科学专业的人才培养目标制定的。其目的是为了使学生加深理解微生物基础理论，掌握微生物学实验的基本技能，通过实验教学，培养学生观察、思考、分析和解决问题的综合能力，以及实事求是、严肃认真的科学研究态度，提高学生的综合素质，熟悉并掌握微生物学研究方法，能用微生物学方法解决一些专业实际问题。为学生今后的学习及工作实践打下宽厚的基础

（二）本课程的基本要求

1．要求学生熟悉微生物实验的基本原理，包括普通光学显微镜的工作原理，简单染色法原理，革兰氏染色法原理，测量微生物细胞大小的原理，微生物的分离、纯化的基本原理，培养基的配制原理，高压蒸汽灭菌原理、干热灭菌原理，细菌总数的测定原理，微生物生理生化反应原理，食品卫生微生物检验检测原理等。

2要求学生掌握显微技术、染色技术、消毒与灭菌技术、接种技术、培养技术，代谢产物检测技术、菌种鉴定技术与食品卫生微生物检验检测技术等，并运用这些技术从事微生物学研究、解决有关微生物专业的实际问题，为进一步学习有关专业课程与微生物学相关研究与生产基础奠定良好基础。

3.要求学生及时规范地写出实验报告：有绘图要求的实验，必须在课堂内完成显微镜下绘图，力求真实、准确；无绘图要求的实验，对实验结果要认真观察、记录、整理；实验报告写作要规范，要有简要的分析讨论。

（三）与其他课程的联系与分工

本课程侧重介绍微生物学实验原理、技术，开设时间最好略后或同步于微生物学理论课。

二、课程内容与考核目标

实验

一、普通光学显微镜的使用

【目的和要求】

1.学习普通光镜的结构、功能、使用方法。

2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。

【实验内容】

1.了解光镜各部分结构。

2.熟悉普通光学显微镜使用方法，并学习油镜的使用方法。

3.掌握利用光镜观察微生物的技能，了解细菌（球菌、杆菌）、真菌等微生物的主要特征。

【重难点】

1.油镜的使用

2.聚光器的调节

【注意事项】

1.安全取放显微镜。

2.油镜使用后要彻底清洁。

实验

二、微生物的染色

【目的和要求】

1.学习并掌握微生物的制片技术

2.学习掌握简单染色的基本技术。

3.学习革兰氏染色法的原理和方法。

【实验内容】

1.简单染色技术并观察。

2.革兰氏染色并观察鉴定。

【重难点】

1.革兰氏染色，结果鉴定。

【注意事项】

1.革兰氏染色的染色和脱色时间要恰当，否则结果不明显。

2.观察芽孢时要调节光线，否则不易观察到。

实验

三、放线菌、霉菌的形态观察

【目的和要求】

1.练习丝状微生物的制片和简单染色技术。

2.了解放线菌、霉菌的形态特征。

【实验内容】

1.观察放线菌、霉菌的自然丝状生长状态。

2.简单染色并观察细胞特征。

3.熟悉显微镜下观察丝状微生物的一般方法。

【重难点】

1.放线菌、霉菌的自然丝状生长状态的观察。

2.比较两者形态的异同点。

【注意事项】

1.注意防止菌丝污染显微镜物镜镜头。

实验

四、酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

【目的和要求】

1.学习水浸片法制作酵母菌临时装片。

2.了解酵母菌的形态特征，观察出芽繁殖的状态。

3.了解鉴别细胞死活的方法。

【实验内容】

1.水浸片法制作酵母菌临时装片。

2.观察酵母菌的形态特征，并注意芽殖的状态。

3.通过染色结果鉴别细胞的死活。

【重难点】

1． 酵母菌的芽殖特征。

2． 鉴别细胞的死活。

【注意事项】

1.美蓝染液水浸片法制作酵母菌制片注意染液的浓度和染色时间。

2.菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。

3.盖片时缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。

实验

五、微生物大小的测定

【目的和要求】

1.学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。

2.掌握对不同形态酵母菌细胞大小测定的要求，增强对微生物大小的感性认识。

【实验内容】

1.安装并校正测微尺。

2.测定并记录不同形态微生物细胞的大小。

3.处理数据，计算细胞平均实际大小。

【重难点】

1.换算目镜测微尺每格长度的代表值。

2.安全使用测微尺，保护高倍物镜镜头。

【注意事项】

1.校正目镜测微尺时光线宜弱些，以便找到镜台测微尺的刻度。

2.换高倍镜时要十分小心，防止压坏镜台测微尺和损坏镜头。

3.测量对象要有代表性，数据及单位换算要准确。

实验

六、显微镜直接计数法

【目的和要求】

1.了解血球计数板的结构和功能。

2.学习并掌握使用血球计数板测定酵母菌细胞或孢子数量的方法。

【实验内容】

1.制备菌悬液

2．检查血球计数板

3.加样并计数，计算样品的含菌量

【重难点】

1.计数板中计数室的寻找。

2.调节成合适的浓度以便计数和减小误差。

【注意事项】

1.清洗计数板时要小心，不能使用刷子等硬物，以免破坏精细度；干燥计数板不能火上烘烤。

2.取样时要摇匀菌液，且加样时不可有气泡产生。

实验

七、培养基的配制及灭菌

【目的和要求】

1.学习掌握培养基的配制原理。

2.掌握配制培养基的一般方法步骤。

3.熟悉高压灭菌锅的使用原理和方法。

4.熟悉干热灭菌箱的使用原理和方法。

【实验内容】

1.按照培养基的配方浓度要求计算各成分所需要的量。

2.准确配制培养基并灭菌。

3.各种玻璃仪器的包扎与灭菌。

【重难点】

1.规范准确量取各成分。

2.高压灭菌锅的安全使用。

3.干热灭菌箱的安全使用。

【注意事项】

1.计算要准确无误。

2.称量要精确。

3.安全使用高压灭菌锅。

4.安全使用干热灭菌箱。

实验

八、微生物的接种、分离与培养

【目的和要求】

1.学习微生物的接种、分离方法原理与培养技术。

2.学习无菌操作培养微生物的技术方法。

【实验内容】

1.学习常用的接种与分离方法，掌握无菌操作要求。

2.制备菌种混悬液，无菌操作进行划线及涂布培养。

3.学习一般微生物的培养方法。

【重难点】

1.无菌操作

【注意事项】

1.划线分离菌悬液要无菌操作，以免污染空气中杂菌。

2.划线分离时各级划线区域不要重叠。

实验

九、细菌的代谢与生化反应—细菌对含碳、氮化合物的分解和利用

【目的和要求】

通过不同细菌对不同含碳化合物的分解利用情况，了解细菌碳代谢类型的多样性 通过不同细菌对不同含氮化合物的分解利用情况，了解细菌氮代谢类型的多样性

【实验内容】

对大肠杆菌、沙门氏菌做不同生化反应试验，观察记录结果。

【重难点】

1.对实验结果有正确的判断

【注意事项】

1.无菌操作，以免污染空气中杂菌。

2.接种时标记要清楚，各菌种间切忌交叉污染

实验

十、食品卫生微生物学检验

【目的和要求】

1.学习食品卫生微生物学中菌落总数测定原理与方法

2.学习食品卫生微生物学中大肠菌群测定原理与方法

【实验内容】

1.测定饮用水中的菌落总数。

2.测定饮用水中大肠菌群的数量。

【重难点】

1.样品的量取、稀释、浇注法接种。

2.数据处理，结果的判断。

【注意事项】

1.注意无菌操作。

2.样品稀释倍数要准确，标记要清楚，接种前要摇匀。

3.培养基的温度要适宜。

4.数据处理。

三、有关说明和实施要求

（一）自学教材

本课程使用教材为：江南大学编写的微生物学实验讲义，GB/T4789.2-2008, GB/T4789.3-2008

参考书：钱存柔，微生物学实验教程，北京大学出版社，1999.7

(二)考核方式

考核方式：

1.本课程的最后成绩为各次实验成绩的平均值与实验操作考核相结合的方式。各次实

验成绩由实验报告成绩与实验操作实验成绩组成。

2.各次实验成绩的平均值占总成绩的70%，实验操作考核占总成绩的30%。实验报告评分依据：

1.实验报告撰写的完整程度以及正确性；

2.所观察结果的正确性、绘图的完整性；

3.实验结果的正确性；

4.回答问题的正确性；

5.分析和讨论中所体现的对实验过程中出现问题的认知程度。

第二篇：微生物学考试大纲

《微生物学》课程考试大纲

（适用于生物科学专业）

课程编码：

151512060

学时：

学分：3 开课学期：第5学期 课程类型：专业必修课 考试方式：笔试

额外携带的考试工具：计算器 考试持续时间：110分钟

成绩构成：平时成绩×20%+实验成绩×20%+期末考试成绩×60%

一、课程简介

微生物学是高校生物专业的主要专业基础课，是生物科学中一个活跃的分支学科。其目的与任务旨在使学生获得微生物学方面的基础理论、基本知识和基本技能，着力培养学生分析问题、解决问题的能力。

本大纲依据该课程的教学大纲编制而成，适用于生物科学专业。

二、考试内容

第一章 绪论

一、考试知识点

微生物的六大特点，生物界的分类，微生物学发展简史、特殊人物及其贡献，微生物学在生命学科中的地位及前景。

二、考核要求

1、了解微生物及其特点。

2、理解微生物在生物界的地位，微生物学在生命学科中的地位及前景。

3、掌握生物界的分类，微生物学发展简史、特殊人物及其贡献。

第二章 原核微生物

一、考试知识点

细菌的一般和特殊结构，鞭毛、芽孢特殊结构及意义，革兰氏染色的原理，芽孢、糖被、菌落等概念。

二、考核要求

1、了解放线菌、篮细菌及其他原核微生物的形态、结构与繁殖。

2、理解革兰氏染色的原理，芽孢的抗逆性机制。

3、掌握细菌的一般和特殊结构，鞭毛、芽孢特殊结构及意义，革兰氏染色的原理，芽孢、糖被、菌落等概念。

第三章 真核微生物

一、考试知识点 真核微生物与原核微生物的区别，酵母菌的繁殖方式，霉菌的形态结构与繁殖。

二、考核要求

1、了解酵母菌的繁殖方式及生活史。

2、理解芽殖与芽裂殖的区别。

3、掌握真核微生物与原核微生物的区别，霉菌的形态结构及繁殖方式。

第四章 病毒

一、考试知识点

病毒的概念、特点及繁殖过程，温和噬菌体、烈性噬菌体、前噬菌体、盲传、噬菌斑等概念，溶原性细菌的定义及特点，病毒的研究方法。

二、考核要求

1、了解病毒的研究方法。

2、理解病毒的概念及特点。

3、掌握温和噬菌体、烈性噬菌体、前噬菌体、盲传、噬菌斑等概念，病毒繁殖过程，溶原性细菌的定义及特点。

第五章 微生物的营养

一、考试知识点

营养物质的运输方式，培养基的配制原则，凝固剂的优劣。

二、考核要求

1、了解微生物的六大营养物质及功能，微生物的营养类型。

2、理解微生物对营养物质的吸收方式。

3、掌握培养基的类型及配制原则。

第七章 微生物的生长及其控制

一、考试知识点

微生物生长的测定方法，微生物纯培养的分离及生长规律，温度对微生物生长的影响，干、湿热灭菌。

二、考核要求

1、了解影响微生物生长的因素。

2、理解温度对微生物生长的影响，湿热灭菌的原理。

3、掌握微生物纯培养的生长及其测量方法，微生物生长繁殖的控制的方法，干、湿热灭菌步骤及其注意事项。

第八章 微生物的遗传变异

一、考试知识点

证明自发突变的两个典型的实验，转导、转化、接合的发现，普遍性转导与局限性转导的区别，诱变育种的定义及方法步骤，营养缺陷型菌株的筛选与分离方法，原生质体融合育种、基因工程定义，菌种保藏的一般方法。

二、考核要求

1、了解微生物的突变类型及原因，菌种保藏的一般方法。

2、理解证明自发突变的两个典型的实验，3、掌握遗传变异的物质基础的实验证明，细菌的基因转移和重组方式，普遍性转导与局限性转导的区别，诱变育种的定义及方法，营养缺陷型菌株的筛选与分离方法，营养缺陷型、转导、转化、接合、原生质体融合育种、基因工程等概念。

第九章

微生物的生态

一、考试知识点

微生物与其生态环境关系的主要类型，引起水体污染的生物因素及治理。

二、考核要求

1、了解微生物与环境保护，污水生物处理原理及措施。

2、理解生态环境中微生物与其环境的相互关系。

3、掌握拮抗、共生、水华、赤潮等概念。

第十章 传染与免疫

一、考试知识点

传染、特异性免疫概念，决定传染结局的三大因素，抗体类型，抗体产生规律及应用，免疫应答的概念及过程，生物制品及应用。

二、考核要求

1、了解免疫学技术及应用，生物制品及应用。

2、理解决定传染结局的因素，体液免疫和细胞免疫。

3、掌握传染、免疫、抗原、抗体、免疫应答、特异性免疫、单克隆抗体等概念，抗体产生规律及应用，活疫苗与死疫苗的区别。

三、基本题型及评分标准

（一）题型及分数比例

名词解释 24% 选择题 10% 填空题 26% 判断题 10% 简答题 30%

（二）试题难易及分数比例

一般50% 综合40% 较难10%

四、选用教材

《微生物学》 黄秀梨，2003.7，高等教育出版社。

五、课程主要参考书

1、《微生物学》 沈萍，2000，高等教育出版社。

2、《微生物学教程》 周德庆，2002，高等教育出版社。

执笔人：唐蕊

审核人：唐蕊

第三篇：食品微生物学实验题目

食品微生物学实验（名词解释选一题，简答题选三题）

一．名词解释

1.细菌总数

2.大肠菌群

3.高压蒸汽灭菌

4.乳酸菌

5.芽孢

二．简答题

1.简述革兰氏染色原理

2.简述培养基配置步骤

3.影响高压蒸汽灭菌效果的因素有哪些？

4.革兰氏染色分为那几步？其关键是哪一步？为什么？

5.MRS培养基中加入CaCO3的作用是什么？

6.为什么检测乳酸菌不用牛肉膏蛋白胨培养基？

7.牛肉膏蛋白胨培养基中各成分分别起什么作用？

8.细菌细胞特殊结构有哪些？分别起什么作用？

9.简述显微镜使用步骤

10.高压蒸汽锅灭菌与干热空气灭菌相比有什么优点？为什么？

11.比较平板计数法和显微镜直接计数法的优缺点

12.高压蒸汽锅灭菌开始之前为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌后为什么要待压力表指针降到0时，才能打开排气阀，开盖取物。

13.鲜乳中存在霉毒素会对乳酸菌生长起什么作用？

14.普通酸乳制作中常加入乳酸菌有哪些？比例如何？二者关系如何？

15.用作消毒剂的乙醇浓度是多少？请说明用此浓度的乙醇的原因和机理。

第四篇：微生物学实验

细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一 显微镜直接计数法

（一）目的要求

1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图15—2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。

图15—1 血细胞计数板构造

（一）图15—2 血细胞计数板构造

（二）A.正面图；B.纵切面图； 放大后的方格网，中间大方格为计数室

1.血细胞计数板；2.盖玻片；3.计数室

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则

1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）

同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母

2．仪器或其他用具 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。

（四）操作步骤

l．菌悬液制备

以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。

4．显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

5．清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（五）实验报告

l．结果

将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。

各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml

12345

第一室

第二室

2．思考题

(1)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差．力求准确?

(2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。

二平板菌落计数法

（一）目的要求

学习习近平板菌落计数的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。

（三）器材

1．菌种 大肠杆菌菌悬液。

2．培养基 牛肉膏蛋白陈培养基。

3．仪器或其他用具lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

（四）操作步骤

l．编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-

4、10-

5、10-6。(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀释

用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支lml吸管插入10?1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图15-3所示。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3，取样

用三支1mL无菌吸管分别吸取10-

4、10-5和10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

图15—3平板菌落计数操作步骤

4．倒平板．

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

5．计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-

4、10-

5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

五、实验报告

1．结果

2．将培养后菌落计数结果填入下表

稀释度10-410-510-6

Cfu数/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考题

(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?

(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果?

三 光电比浊计数法

一、目的要求

1．了解光电比浊计数法的原理。

2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

二、基本原理

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。

光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

图15—4 比浊法测定细胞浓度的原理

（三）器材

1．菌种 酿酒酵母培养液

2．仪器或其他用具 721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。

（四）操作步骤

1．标准曲线制作

（1）编号 取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。

（2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。

（3）测OD值 将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD值填入下表

管号12345678

细胞数106/ml

光密度（OD）

每管菌悬液在测定OD值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定

(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定

将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。

各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。

3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。

（五）实验报告

l．结果

每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数

2．思考题

(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点?

(2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?

(3)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?

四 大肠杆菌生长曲线的测定

(一)目的要求

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。

2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

(二)基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。

用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002换算出所测菌悬液的OD值。

图15—5 带侧臂试管的三角烧瓶

(三)器材

1．菌种 大肠杆菌

2．培养基 LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

图15—6 直接用试管测OD值

(四)操作步骤

1．标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定

用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。

本操作步骤也可用简便的方法代替：

1．用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。

(五)实验报告

1．结果

(1)将测定的OD600值填入下表：

培养时间对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)绘制大肠杆菌的生长曲线。

2．思考题

(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？

(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。

(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

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第五篇：微生物学实验技术考试要求

课程名称：微生物学实验技术（微生物专业）

一、考试的总体要求

微生物学实验技术是微生物学和工业生物技术等专业技术人才最重要的专业基础技能。通过本课程的考核，重点检查考生对微生物学基本实验技能及其原理和应用等掌握情况，主要包括微生物的染色与显微观察技术；微生物的分离纯化与培养技术；微生物生长测定与生理生化技术、微生物遗传育种技术以及分子微生物学实验技术等。要求掌握实验的设计原理、主要步骤、注意事项以及该实验技术的适用对象等。

二、试题类型及比例

1、简答题：约40%

2、问答题：约60%

三、考试形式及时间

考试形式为笔试。考试时间为3小时。

四、考试主要内容

（一）微生物染色与显微观察技术

1.显微镜的使用及维护

2.细菌简单染色、革兰氏染色、芽孢染色与细菌形态观察

3.酵母菌美兰染色与酵母细胞形态观察

4.霉菌的形态观察

（二）微生物的分离纯化与纯培养技术

1.培养基的制备与灭菌（含玻璃器皿的包扎）

2.无菌操作技术

3.平板划线、倾注平板与涂布平板分离技术

（三）微生物生长测定与生理生化技术

1.微生物大小与总数测定

2.平板菌落计数法及其它生长测定技术

3.微生物的生理生化试验

4.水的卫生细菌学检验

（四）微生物遗传育种及分子微生物学实验技术

1.从自然界中分离筛选特定类型的微生物

2.微生物诱变技术及特定突变型的筛选

3.微生物原生质体制备与融合技术

4.细菌质粒DNA的抽提与电泳检测

5.细菌质粒DNA的转化

6.DNA的PCR扩增及其产物纯化

五、主要参考书目

1.诸葛健，李华钟主编，微生物学（第二版，实验部分），科学出版社，2009

2.诸葛健，李华钟，王正祥主编，微生物遗传育种学（实验部分），化学工业出版社，2009

3.诸葛健主编，工业微生物实验与研究技术，科学出版社，2007