现代生物制药技术的研究进展

第一篇：现代生物制药技术的研究进展

燕京理工学院

Yanching Institute of Technology（2016）届化工与制药专业现代制药技术论文 题目：现代生物制药技术的研究进展

学院： XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 专业：

XXXXX

学号： XXXXXXX

姓名：

Dream

指导教师：林贝

教研室主任（负责人）：林贝 2015 年 6 月 4 日

现代生物制药技术的研究进展 Dream 化工与材料工程学院化药1204班学号XXXXXXX 指导教室林贝 摘要

本文简述了近年来基因工程在生物制药技术的发展和应用。其中主要从基因操作中大分子的分离、PCR技术、基因芯片、外源基因的表达这4个方面叙述基因工程相关技术的应用和发展,以及基因工程药物的产业化现状与发展趋势。关键词：生物技术基因工程基因操作技术生物制药 1 基本概念 1.1 生物技术

广义的生物技术是指人类对生物资源(包括动物、植物、微生物)的利用、改造的相关技术。其发展经历了三个不同的阶段——以酿造为代表的传统生物技术，以微生物发酵为代表的近代生物技术，以基因工程、细胞工程、酶工程和蛋白质工程为代表的现代生物技术。

现代生物技术可以理解为是直接操纵有机体细胞和基因的一种全新技术是二十世纪70年代开始异军突起的高技术领域，在医疗、制药、农业、轻工食品及环保业发展迅速。[1]以上的生物技术成果集中应用于医药工业。1.2 现代生物技术两大核心工程 1.2.1 工程 概念：基因工程是分子遗传学和工程技术结合的产物。是现代生物技术的核心它能按人类需要把遗传物质DNA分子从生物体中分离出来，进行剪切、组合、拼装合成新的DNA分子。再将新的DNA分子植入某种生物细胞中，使遗传信息在新的宿主细胞或个体中得到表达，以达到定向改造或重建新物种的目的。1.2.2 细胞工程 概念：利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。并使之分裂生长成为杂种生物。它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段的重组等。 1.3 现代生物制药

主要指基因重组的蛋白质分子类药物的制造过程，即利用基因工程、抗体工程或细胞工程技术生产的源自生物体内的天然物质，用于体内诊断、治疗或预防药物的生产过程(也可称基因工程制药)。2 基因操作技术

基因大分子的分离主要指质粒(plasmid DNA)和基因组DNA的分离。质粒分离的常用方法有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂裂解法、质粒DNA释放法、酸酚法等。质粒在基因工程中最常用来做成各种克隆载体(cloning vector)或表达载体(expression vector)。质粒载体还可用于RNA干扰(RNA inter-ference)的研究[1](由于这一技术的研究和应用,美国科学家Andrew Z.Fire博士和Craig C.Mello博士获得了2006年度的诺贝尔生理学或医学奖)。基因组DNA的分离通常采用酚-氯仿法、基因文库(gene library)、Southern杂交以及PCR扩增技术等。其中基因文库是指含有某种生物基因组不同基因片段的一群DNA重组体克隆,包括cDNA文库(com-plementaryDNA library, cDNA library)和基因组DNA文库(genomic library)。最近又有研究者利用名为chum-RNA的小分子RNA建立非PCR扩增的单细胞cDNA文库[2]。2.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。该法由Mullis等人于1985年发明,并于1993年获得了诺贝尔化学奖。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术可分为定性PCR和定量PCR。2.2 定性PCR技术

定性PCR技术包括:反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR),是从非常少量的mRNA样品构建大容量cDNA文库的方法,还发展出实时RT-PCR用于定量实验[3];多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR反应体系中加入多对不同的引物,以扩增同一模板的不同区域;反向PCR(inverse PCR),该法可以对一个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究;锚定PCR(an-chored PCR),现称为cDNA末端快速扩增技术(rap-id amplification of cDNA ends,RACE)[4]。2.3 荧光标记分子

定量PCR技术以实时PCR(real time PCR)为代表,其基本原理是在PCR反应体系中引入荧光标记分子,对每一反应时刻的荧光信号积累进行实时监测,计算出PCR产物量,或通过标准曲线法得出初始模板量。2.4 基因芯片

基因芯片(gene chip ormicroarray),是生物芯片的一种,其基本技术包括:核酸方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测及读出。根据用途不同可分为表达谱芯片(expression profile chip)、测序芯片和诊断芯片。其中表达谱芯片的应用最为广泛,可用于基因功能分析、疾病发生机制的探讨及药物研究和筛选[5]。(1)确定药靶基因:通过比较正常细胞与异常细胞表达谱之间的差异,从而确定药靶基因。(2)监测药物治疗前后的基因表达变化:该监测可有3方面的作用。一是用于研究药物作用机制,通过监测基因表达的变化,可研究药物作用途径和对细胞信号转导的影响,从而了解该药物的作用机制;二是用于研究药物毒理,从表达谱的改变和异常表达,便可分析药物毒理;三是用于药物筛选,利用用药前后表达谱的改变,通过分析病理、生理、生化原理,能高效地筛选出新的药物或先导化合物。N A 芯片技术在药物基因组学的应用, 一方面可加速药物基因组学的发展;另一方面: D N A 芯片利用药物基因组学的研究成果, 根据基因型将人群划分为各种类型。D N A芯片可自动快速地检测哪些可影响药物效应的基因(为药物代谢酶、药物作用靶标等)例如设计一种淋巴白血病药物基因组芯片, 包括所有可能影响病人化疗反应的基因, 借助于这种芯片, 根据病人的基因型分类, 医生为每一个病人选择合适的治疗药物和剂量。2.5 外源基因

导入宿主细胞的外源基因,通过基因表达得到相应的蛋白质产物。根据宿主细胞的不同可分为原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。在外源基因表达时,通常把一个报告蛋白的基因与一个目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的检测与纯化。常用的报告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫还蛋白(thioredoxin, Trx)等。其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科学家因此获得诺贝尔化学奖:日本科学家Osamu Shimomura、美国科学家Martin Chalfie、美籍华人科学家钱永健。除了直接标记目的蛋白用于检测与纯化外,还可利用某些GFP具有荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的现象,用于蛋白质折叠[6]、蛋白质-蛋白质相互作用[7]、信号转导通路等[8]方面的研究。3 现代生物制药的现状

国际上,生物制药业主要集中在美国日本和欧洲,其中美国作为生物制药的发源地,无论是在经费投入、产品开发和研制,还是在产品生产和市场卜都居于国际领先地位,其它开发的产品和市场销售额占全球的90%以上。目前, 美国共有生物制药公司约1400家,具中形成规模生产的有Alzlgen、Seherir一g一Plougll、EliIJ1l一yMcrk、Gelexlteell等20多家公司。日本在生物技术的开发仅次美国, 目前共有生物制药公司约600家,其中麒麟啤洒、中外制药、味之素等著名厂商不仅在日本习内处与生物制药各方面的领先地位,而不断加强世界市场的开拓,进入欧洲和亚洲市场。欧洲在生物技术的开发上稍落后于日本但近两年来欧洲在生物技术的投入和新公司成众的数量上急速增长,目前欧洲的生物制药公司约有300家但还处在发展的开始阶段。

3.1 我国生物制药的现状

至2004年我国有现代生物制药企业114家，其中疫苗生产企业28家，可以生产27种基因工程药物和26种病毒的41种疫苗。按现价统计规定，生物生化制品生产企业全国409家，总产值220亿元，销售收入196亿元。“十五”前四年，平均每年大于20%的速度增长用于该领域的投资不断加大于固定资产平均增长32.5%。我国现已成为世界疫苗最大生产国年产量超过了10亿个计量单位。儿科常见病疫苗年产量达5亿人民币除满足自用外还向世界卫生组织(WHO)提供疫苗产品用于其他国家。3.2 我国生物制药存在的问题及应采取的措施

我国生物制药存在一系列问题开发水平低缺少创新产品生物制药产业下游技术薄弱重复生产严重、资源浪费过大产业化规模小、市场竞争无序。可采取的措施以仿制促进创新最终以创新实现产业飞跃，多渠道建立融资网络改革科研体制建立新的产学研一体化的机制，加强国际交流与合作积极应对国际竞争加强宏观调控强化和规范财税优惠政策。4 基因工程在生物制药中的发展趋势

目前基因工程药物的研发趋势是:(1)发展表达载体:目前最主要的用于生产的表达载体是哺乳动物细胞和大肠杆菌。大肠杆菌属于原核表达系统,没有糖基化功能,只能用于表达功能蛋白不需要糖基化的重组药物,如胰岛素等,且目的蛋白大量表达之后易形成包涵体,不易复性。而功能蛋白需要糖基化的则主要在哺乳动物细胞中表达。也有用真核化的原核表达载体[9]。目前还有“人源化”酵母表达体系和植物表达体系正在发展。(2)对现有的重组药进行基因工程改造和修饰:通过基因工程的改造和修饰使蛋白药物在临床应用上更安全更有疗效,如G-CSF和EPO等突变体药物研究与开发。目前,由于天然基因工程药物品种的研究已经相当普遍,因此采取对现有的重组药进行基因工程改造和修饰的策略,既可以避免侵犯知识产权,又可以为新药研究开辟出新途径。(3)改变给药途径:在继续改进注射用溶液和注射用无菌粉末的稳定性之外,还发展出化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。而在鼻腔、口服、直肠、口腔、肺部给药方面也已取得重大进展。5 生物制药研究新进展

5.1 计算机辅助药物设计技术发展

计算机技术的发展和向药物化学学科的渗透，促进了药物设计的发展。20世纪90年代计算机辅助药物设计取得突破性进展，现已成为药物研究和开发的重要方法和工具。

计算机辅助药物设计利用了计算机快速、全方位的逻辑推理功能、图形显示控制功能，并将量子化学、分子力学、药物化学、生物化学和信息科学结合起来，研究受体生物分子与药物结合部位的结构与性质、药物与受体复合物的构型和立体化学特征、药物与受体结合的模式和选择性、特异性、、药物分子的活性基团和药效构象关系等，从药物机理出发，改进现有生物活性物质的结构，快速发现并优化先导化合物，使其尽早进入临床前研究，减少传统的新药研究的盲目性，缩短新药研制的时间。

计算机辅助药物设计有两类方法，一类是基于机理的药物设计（MBDD），另一类是基于结构的药物设计（SBDD），基于机理的药物设计要针对药物作用机理，从靶点出发，考虑药物与受体的作用过程，并要模拟药物在体内的吸收、转运、代谢等动态过程，比基于结构的药物设计更合理，但该法还不成熟。目前的计算机辅助药物设计主要还是基于结构的药物设计，今后的计算机辅助药物设计的目标是向基于机理的药物设计方向发展。相信随着生命科学和计算机科学的发展，考虑药物不同作用机理和全部作用过程的计算机辅助药物设计技术将逐步建立并不断完善。

5.2 组合化学与高通量筛选技术发展

组合化学是近20年发展起来的一种合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一个反应器内使用相同条件同时制备出多种化合物，建立各类化合物库的策略。组合化学通常采用操作、分离简便的固相化学合成。液相化学合成技术也在快速发展和完善中。

在药物研究过程中，通过化合物活性筛选而获得具有药物活性的先导化合物是新药研究的基础。随着分子水平的药物筛选模型的建立，筛选方法和技术都发生了根本性的变化，出现了高通量筛选的新技术，大大加快了先导化合物的寻找和发现，并促进了高通量有机合成。近年来，组合化学与高通量筛选结合，使组合化学的化合物库种类、数量不断扩大，筛选的先导化合物数量和种类也在不断地增多，使新药的种类和数量也在不断地增加。组合化学实现的自动化合成仅20世纪90年代后得到的各类化合物总和已超过了人类有史以来所发现化合物的总和，故有人把组合化学与高通量筛选结合技术称为“新药发现的高速公路”，据文献记载，1992年～1998年的几年，经过组合化学化合物库与高通量筛选，确定的候选药物已有46个，并已进入人体测试阶段。[10]显然，组合化学与高质量筛选的结合技术，大大地加快了新药研制的步伐。虽然如此，组合化学建立的大型化合物库，为筛选也带来了困难，因此，利用组合化学设计，构建具有结构多样性的小型而便于筛选的组合化合物库，结合化学信息学和高通量筛选，将是组合化学与高通量筛选结合的一项重要课题。5.3 药物手性合成技术发展

化学合成技术在新药发现过程中发挥着十分重要的作用。近年来由于有机化学学科新理论、新反应、新技术不断发现，使得合成反应具有化学选择性成为现实，并促进了药物合成技术的快速发展，其中手性合成技术使新药研制的领域不断扩大。

手性是自然界的本质属性。在生物体手性环境，如酶、受体、离子通道、蛋白质、载体中，分子之间手性匹配是分子识别的基础，受体与配体的专一作用，酶与底物的高度、区域、位点和立体催化专一性，抗原与抗体的免疫识别都与手性有关，同时药物的生物应答常受到手性影响，包括药物在体内的吸收、转运、分配、位点活性的作用以及代谢和消除。所以，手性药物的开发是当前医药界重点研究的热点之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的药物中手性药物约占1/3，如2000年全球手性药物销售额达1233亿美元。手性药物的制备技术主要有拆分法、化学合成法和生物合成等三大类，发展较快的是后二类。化学合成法是在不对称催化剂存在下，利用化学反应的动力学和热力学不对称性，进行单一对映体合成。在已上市的手性药物中，其手性中间体均可通过现有的重（双）键不对称还原技术，特别是不对称氢化和不对称转移氢化来合成。至今为止在不对称催化合成中，昂贵的手性配体和贵金属的使用，以及手性催化剂的催化效率仍是制约其在手性技术上应用的关键。因而，手性催化剂的设计和合成，以及催化剂的回收循环使用是当今不对称催化合成研究的方向。

生物合成法则利用催化剂, 酶-催化反应的高度、底物、区域、位点和立体选择性来合成手性药物。生物合成法具有选择性高、产率高、反应条件温和等特点，随着科学技术的发展，生物合成法将成为手性制备的高效手段。5.4 药物生物技术发展[11] 生物技术药物是指利用DNA重组技术或单克隆抗体技术或其它生物技术研制的蛋白质、抗体或核酸类药物，它是目前生物技术研究最为活跃的领域，给生命科学的研究和生物制药工业带来了革命性变化。参考文献

[1]宋现让,柳永蕾,刘贤锡,等.质粒载体系统介导的人肿瘤细胞RNA干扰作用[J].基础医学与临床, 2005, 25:807-812.[2] Tougan T,Okuzaki D,NojimaH.Chum-RNA allows prep-aration of a high-quality cDNA library from a single-cellquantity of mRNA withoutPCR amplification [J].NucleicAcidsResearch, Online, 2008, 36: e92.[3] Haddad F, Qin AX, Giger JM,et al.Potential pitfalls inthe accuracy of analysis of natural sense-antisense RNApairs by reverse transcription-PCR [ J].BMC Biotechnolo-gy, 2007, 7: 21-35.[4]邓雪柯,殷建华,曹毅.3种5′-RACE技术的比较与优化[J].成都医学院学报, 2007, 2: 20-25.[5]江禾,王友群.基因芯片技术与药物的研究和开发[J].世界临床药, 2008, 29: 104-107.[6] HoY, LoHR, Lee TC,et al.Enhancement of correctpro-tein foldingin vivoby a non-lytic baculovirus [ J].Bio-chem, 2004, 382: 695-702.[7]CallejaV, AlcorD, LaguerreM,et al.Intramolecular andIntermolecular Interactions of Protein Kinase B Define ItsActivationin vivo[J].PLoS Bio,l 2007, 5: 780-791.[8]XU XH, Meier-Schellersheim M, Yan JS,et al.Locallycontrolled inhibitorymechanisms are involved in eukaryoticGPCR-mediated chemosensing [ J].J Cell Bio,l 2007,178: 141-153.[9]袁志刚,张进平,王缨,等.真核化的原核表达系统增强HBV preS2/s基因免疫的效果[J].中国免疫学杂志,2007, 23: 6-12.[10]赵立希, 孙晶晶, 蒋永平.基因工程技术在生物制药领域的应用和发展[J].基础医学与临床, 2009,(09)

[11]生物制药产业发展概况[J].化学试剂, 2008,(04)

第二篇：现代生物制药技术的研究进展

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（2016）届化工与制药专业现代制药技术论

文

题目： 现代生物制药技术的研究进展 学院： XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 专业： XXXXX 学号： XXXXXXX 姓名： Dream 指导教师： 林贝 教研室主任（负责人）： 林贝

2015 年 6 月 4 日

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现代生物制药技术的研究进展

Dream 化工与材料工程学院 化药1204班 学号XXXXXXX

指导教室 林贝

摘 要

本文简述了近年来基因工程在生物制药技术的发展和应用。其中主要从基因操作中大分子的分离、PCR技术、基因芯片、外源基因的表达这4个方面叙述基因工程相关技术的应用和发展,以及基因工程药物的产业化现状与发展趋势。

关键词：生物技术

基因工程

基因操作技术

生物制药 基本概念 1.1 生物技术

广义的生物技术是指人类对生物资源(包括动物、植物、微生物)的利用、改造的相关技术。其发展经历了三个不同的阶段——以酿造为代表的传统生物技术，以微生物发酵为代表的近代生物技术，以基因工程、细胞工程、酶工程和蛋白质工程为代表的现代生物技术。

是二十世纪70年代开始异军突起的高技术领域，在医疗、制药、农业、轻工食品及环保业发展迅速。[1]以上的生物技术成果集中应用于医药工业。

1.2 现代生物技术两大核心工程 1.2.1 工程

概念：基因工程是分子遗传学和工程技术结合的产物。是现代生物技术的核心它能按人类需要把遗传物质DNA分子从生物体中分离出来，进行剪切、组合、拼装合成新的DNA分子。再将新的DNA分子植入某种生物细胞中，使遗传信息在新的宿主细胞或个体中得到表达，以达到定向改造或重建新物种的目的。

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1.2.2 细胞工程

概念：利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。并使之分裂生长成为杂种生物。它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段的重组等。

1.3 现代生物制药

主要指基因重组的蛋白质分子类药物的制造过程，即利用基因工程、抗体工程或细胞工程技术生产的源自生物体内的天然物质，用于体内诊断、治疗或预防药物的生产过程(也可称基因工程制药)。基因操作技术

基因大分子的分离主要指质粒(plasmid DNA)和基因组DNA的分离。质粒分离的常用方法有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂裂解法、质粒DNA释放法、酸酚法等。质粒在基因工程中最常用来做成各种克隆载体(cloning vector)或表达载体(expression vector)。质粒载体还可用于RNA干扰(RNA inter-ference)的研究[1](由于这一技术的研究和应用,美国科学家Andrew Z.Fire博士和Craig C.Mello博士获得了2006的诺贝尔生理学或医学奖)。基因组DNA的分离通常采用酚-氯仿法、基因文库(gene library)、Southern杂交以及PCR扩增技术等。其中基因文库是指含有某种生物基因组不同基因片段的一群DNA重组体克隆,包括cDNA文库(com-plementaryDNA library, cDNA library)和基因组DNA文库(genomic library)。最近又有研究者利用名为chum-RNA的小分子RNA建立非PCR扩增的单细胞cDNA文库[2]。

2.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。该法由Mullis等人于1985年发明,并于1993年获得了诺贝尔化学奖。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引

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物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术可分为定性PCR和定量PCR。

2.2 定性PCR技术

定性PCR技术包括:反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR),是从非常少量的mRNA样品构建大容量cDNA文库的方法,还发展出实时RT-PCR用于定量实验[3];多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR反应体系中加入多对不同的引物,以扩增同一模板的不同区域;反向PCR(inverse PCR),该法可以对一个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究;锚定PCR(an-chored PCR),现称为cDNA末端快速扩增技术(rap-id amplification of cDNA ends,RACE)[4]。

2.3 荧光标记分子

定量PCR技术以实时PCR(real time PCR)为代表,其基本原理是在PCR反应体系中引入荧光标记分子,对每一反应时刻的荧光信号积累进行实时监测,计算出PCR产物量,或通过标准曲线法得出初始模板量。

2.4 基因芯片

基因芯片(gene chip ormicroarray),是生物芯片的一种,其基本技术包括:核酸方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测及读出。根据用途不同可分为表达谱芯片(expression profile chip)、测序芯片和诊断芯片。其中表达谱芯片的应用最为广泛,可用于基因功能分析、疾病发生机制的探讨及药物研究和筛选[5]。(1)确定药靶基因:通过比较正常细胞与异常细胞表达谱之间的差异,从而确定药靶基因。(2)监测药物治疗前后的基因表达变化:该监测可有3方面的作用。一是用于研究药物作用机制,通过监测基因表达的变化,可研究药物作用途径和对细胞信号转导的影响,从而了解该药物的作用机制;二是用于研究药物毒

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理,从表达谱的改变和异常表达,便可分析药物毒理;三是用于药物筛选,利用用药前后表达谱的改变,通过分析病理、生理、生化原理,能高效地筛选出新的药物或先导化合物。N A 芯片技术在药物基因组学的应用, 一方面可加速药物基因组学的发展;另一方面: D N A 芯片利用药物基因组学的研究成果, 根据基因型将人群划分为各种类型。D N A芯片可自动快速地检测哪些可影响药物效应的基因(为药物代谢酶、药物作用靶标等)例如设计一种淋巴白血病药物基因组芯片, 包括所有可能影响病人化疗反应的基因, 借助于这种芯片, 根据病人的基因型分类, 医生为每一个病人选择合适的治疗药物和剂量。

2.5 外源基因

导入宿主细胞的外源基因,通过基因表达得到相应的蛋白质产物。根据宿主细胞的不同可分为原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。在外源基因表达时,通常把一个报告蛋白的基因与一个目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的检测与纯化。常用的报告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫还蛋白(thioredoxin, Trx)等。其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科学家因此获得诺贝尔化学奖:日本科学家Osamu Shimomura、美国科学家Martin Chalfie、美籍华人科学家钱永健。除了直接标记目的蛋白用于检测与纯化外,还可利用某些GFP具有荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)的现象,用于蛋白质折叠[6]、蛋白质-蛋白质相互作用[7]、信号转导通路等[8]方面的研究。现代生物制药的现状

国际上,生物制药业主要集中在美国日本和欧洲,其中美国作为生物制药的发源地,无论是在经费投入、产品开发和研制,还是在产品生产和市场卜都居于国际领先地位,其它开发的产品和市场销售额占全球的90%以上。目前, 美国共有生物制药公司约1400家,具中形成规模生产的有Alzlgen、Seherir一g一Plougll、EliIJ1l一yMcrk、Gelexlteell等20多家公司。日本在生物技术的开发仅次美国, 目前共有生物制药公司约600家,其中麒麟啤洒、中外制药、味之素等著名厂商不仅在日本习内处与生物制药各方面的领先地位,而不断加强世界市场的开拓,进入欧洲和亚洲市场。欧洲在生物技术的开发上稍落后于日本但

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近两年来欧洲在生物技术的投入和新公司成众的数量上急速增长,目前欧洲的生物制药公司约有300家但还处在发展的开始阶段。

3.1 我国生物制药的现状

至2004年我国有现代生物制药企业114家，其中疫苗生产企业28家，可以生产27种基因工程药物和26种病毒的41种疫苗。按现价统计规定，生物生化制品生产企业全国409家，总产值220亿元，销售收入196亿元。“十五”前四年，平均每年大于20%的速度增长用于该领域的投资不断加大于固定资产平均增长32.5%。我国现已成为世界疫苗最大生产国年产量超过了10亿个计量单位。儿科常见病疫苗年产量达5亿人民币除满足自用外还向世界卫生组织(WHO)提供疫苗产品用于其他国家。

3.2 我国生物制药存在的问题及应采取的措施

我国生物制药存在一系列问题开发水平低缺少创新产品生物制药产业下游技术薄弱重复生产严重、资源浪费过大产业化规模小、市场竞争无序。可采取的措施以仿制促进创新最终以创新实现产业飞跃，多渠道建立融资网络改革科研体制建立新的产学研一体化的机制，加强国际交流与合作积极应对国际竞争加强宏观调控强化和规范财税优惠政策。基因工程在生物制药中的发展趋势

目前基因工程药物的研发趋势是:(1)发展表达载体:目前最主要的用于生产的表达载体是哺乳动物细胞和大肠杆菌。大肠杆菌属于原核表达系统,没有糖基化功能,只能用于表达功能蛋白不需要糖基化的重组药物,如胰岛素等,且目的蛋白大量表达之后易形成包涵体,不易复性。

而功能蛋白需要糖基化的则主要在哺乳动物细胞中表达。也有用真核化的原核表达载体[9]。目前还有“人源化”酵母表达体系和植物表达体系正在发展。(2)对现有的重组药进行基因工程改造和修饰:通过基因工程的改造和修饰使蛋白药物在临床应用上更安全更有疗效,如G-CSF和EPO等突变体药物研究与开发。目前,由于天然基因工程药物品种的研究已经相当普遍,因此采取对现有的重组药进行基因工程改造和修饰的策略,既可以避免侵犯知识产权,又可以为新药研究

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开辟出新途径。(3)改变给药途径:在继续改进注射用溶液和注射用无菌粉末的稳定性之外,还发展出化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。而在鼻腔、口服、直肠、口腔、肺部给药方面也已取得重大进展。生物制药研究新进展

5.1 计算机辅助药物设计技术发展

计算机技术的发展和向药物化学学科的渗透，促进了药物设计的发展。20世纪90年代计算机辅助药物设计取得突破性进展，现已成为药物研究和开发的重要方法和工具。

计算机辅助药物设计利用了计算机快速、全方位的逻辑推理功能、图形显示控制功能，并将量子化学、分子力学、药物化学、生物化学和信息科学结合起来，研究受体生物分子与药物结合部位的结构与性质、药物与受体复合物的构型和立体化学特征、药物与受体结合的模式和选择性、特异性、、药物分子的活性基团和药效构象关系等，从药物机理出发，改进现有生物活性物质的结构，快速发现并优化先导化合物，使其尽早进入临床前研究，减少传统的新药研究的盲目性，缩短新药研制的时间。

计算机辅助药物设计有两类方法，一类是基于机理的药物设计（MBDD），另一类是基于结构的药物设计（SBDD），基于机理的药物设计要针对药物作用机理，从靶点出发，考虑药物与受体的作用过程，并要模拟药物在体内的吸收、转运、代谢等动态过程，比基于结构的药物设计更合理，但该法还不成熟。目前的计算机辅助药物设计主要还是基于结构的药物设计，今后的计算机辅助药物设计的目标是向基于机理的药物设计方向发展。相信随着生命科学和计算机科学的发展，考虑药物不同作用机理和全部作用过程的计算机辅助药物设计技术将逐步建立并不断完善。

5.2 组合化学与高通量筛选技术发展

组合化学是近20年发展起来的一种合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一个反应器内使用相同条件同时制备出多种化合物，建立各类化合物库的策略。组合化学通常采用操作、分离简便的固相化学合成。液

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相化学合成技术也在快速发展和完善中。

在药物研究过程中，通过化合物活性筛选而获得具有药物活性的先导化合物是新药研究的基础。随着分子水平的药物筛选模型的建立，筛选方法和技术都发生了根本性的变化，出现了高通量筛选的新技术，大大加快了先导化合物的寻找和发现，并促进了高通量有机合成。近年来，组合化学与高通量筛选结合，使组合化学的化合物库种类、数量不断扩大，筛选的先导化合物数量和种类也在不断地增多，使新药的种类和数量也在不断地增加。组合化学实现的自动化合成仅20世纪90年代后得到的各类化合物总和已超过了人类有史以来所发现化合物的总和，故有人把组合化学与高通量筛选结合技术称为“新药发现的高速公路”，据文献记载，1992年～1998年的几年，经过组合化学化合物库与高通量筛选，确定的候选药物已有46个，并已进入人体测试阶段。[10]显然，组合化学与高质量筛选的结合技术，大大地加快了新药研制的步伐。虽然如此，组合化学建立的大型化合物库，为筛选也带来了困难，因此，利用组合化学设计，构建具有结构多样性的小型而便于筛选的组合化合物库，结合化学信息学和高通量筛选，将是组合化学与高通量筛选结合的一项重要课题。

5.3 药物手性合成技术发展

化学合成技术在新药发现过程中发挥着十分重要的作用。近年来由于有机化学学科新理论、新反应、新技术不断发现，使得合成反应具有化学选择性成为现实，并促进了药物合成技术的快速发展，其中手性合成技术使新药研制的领域不断扩大。

手性是自然界的本质属性。在生物体手性环境，如酶、受体、离子通道、蛋白质、载体中，分子之间手性匹配是分子识别的基础，受体与配体的专一作用，酶与底物的高度、区域、位点和立体催化专一性，抗原与抗体的免疫识别都与手性有关，同时药物的生物应答常受到手性影响，包括药物在体内的吸收、转运、分配、位点活性的作用以及代谢和消除。所以，手性药物的开发是当前医药界重点研究的热点之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的药物中手性药物约占1/3，如2000年全球手性药物销售额达1233亿美元。

手性药物的制备技术主要有拆分法、化学合成法和生物合成等三大类，发展较快的是后二类。化学合成法是在不对称催化剂存在下，利用化学反应的动力学

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和热力学不对称性，进行单一对映体合成。在已上市的手性药物中，其手性中间体均可通过现有的重（双）键不对称还原技术，特别是不对称氢化和不对称转移氢化来合成。至今为止在不对称催化合成中，昂贵的手性配体和贵金属的使用，以及手性催化剂的催化效率仍是制约其在手性技术上应用的关键。因而，手性催化剂的设计和合成，以及催化剂的回收循环使用是当今不对称催化合成研究的方向。

生物合成法则利用催化剂, 酶-催化反应的高度、底物、区域、位点和立体选择性来合成手性药物。生物合成法具有选择性高、产率高、反应条件温和等特点，随着科学技术的发展，生物合成法将成为手性制备的高效手段。

5.4 药物生物技术发展[11]

生物技术药物是指利用DNA重组技术或单克隆抗体技术或其它生物技术研制的蛋白质、抗体或核酸类药物，它是目前生物技术研究最为活跃的领域，给生命科学的研究和生物制药工业带来了革命性变化。

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第三篇：自考现代生物制药技术

自考现代生物制药技术

一、名词概念

二、知识点

自考现代生物制药技术

吉林大学现代生物制药技术)

一、名词概念 1.生物工程：应用生物科学17微细胞：是某些细菌的突变株在生长期间产生的一类微小的圆形的无核细胞，它具细胞壁及细胞膜、DNA上，并引入受体细胞，从而可使受体细胞获得外源基因的遗传信息，并进行正常的复制，表达和遗传。细胞大规模培养。

52半连续培养法：在反应器中投料和接种，培养一段时间后，将培养液和新鲜培的理论、方法，按照人们设计的蓝图，改良加工生物或用生物及其制备物作为加工原料，以提供所需生物制品为人类社会服力的综合性科学技术。

2.养液进行交换的掊养方法，称为半连续培养法。

53动物细胞工程：根据细胞生物学及工程学原理定向改造动物细胞遗传性、创造新物种，通过工程化为人类提供名贵药品服务的技术，称为动物细胞工程。54动物细胞培养技术：在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体动物细胞或组织生长繁殖的方法，称为动物细胞培养技术。

55细胞块培养法：将动物组织切成直径1～2mm小块，进行培养的方法，称为组织块培养法。

56细胞单层培养法：动物组织块经销化分散成单个细胞或细胞团块后，粘附于培养容器表面培养成新生细胞单层的培养法，称为细胞单层培养法。

57单细胞分离培养：动物组织分散后，将其单个细胞培养成纯系细胞集群的技术，称之为单胞分离培养。58确立细胞株：正常细胞在移植继代过程中，有些细胞增殖力突增强，在特定条件下可无限繁殖，与初代细胞相比，其形态、生理生化特性，病毒敏感生，抗原性及染色体结构均发生变化，具有致癌性，这些细胞称为确立细胞株。

59动物体细胞杂交技术：在外力作用下，令两上或两上以上异源细胞合并为一个多核细胞的过程，称为动物体细胞杂交技术。

60核体：细胞核连同其外表薄层细胞质构成的颗粒称为核体。

61胞质体：不具有细胞核的细胞称为胞质体。

62微核杂种细胞：按完整细胞之间的融合方式，将微核与另一完整细胞融合，使后者获得另一种细胞中的若干个染色体，所获融合子称为微核杂种细胞。

63抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞的方法。64营养缺陷型细胞：在一些营养物质的合成能力上出现缺陷，因此必须在基本培养基中加入相应的有机成分才能正常生长的变异细胞。

65营养互补选择法：利用两种亲本细胞营养互补作用原理筛选杂种细胞的方法称为营养互补选择法。66杂交瘤技术：骨髓瘤细胞与免疫淋巴细胞融合制自考现代生物制药技术

备杂种细胞的方法为杂交瘤技术。

67杂合瘤：骨髓瘤细胞与免疫淋巴细胞融合制备的杂种细胞称为杂合瘤。68微载体培养法：将细胞吸附于微载体表面的培养方法。

69酶工程：应用酶的特异性催化功能并通过工程化为人类生产有用产品及提供有益服备的技术为本酶工程。

70酶：生物体内具有特殊催化功能的蛋白质称为酶。85肿瘤坏死因子：是一种由巨噬细胞分泌能产生细胞素，使肿瘤细胞溶解的因子。

86干扰素：是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。

87集落刺激因子：CSF为一组糖蛋白物质，由淋巴细胞和单核细胞自然产生，有刺激红细胞系以外造血细胞增殖和分化的作用。

质粒。

11．雄性大肠杆菌表面的性纤毛是一种接合质粒形成的表面物质。12．根据质粒在细胞中拷贝数的不同，可把质粒分为松驰型质粒和严紧型质粒。13．严紧质粒大多为具有自身传递能力的大质粒。14．分子量较大，自身传递上严紧型质粒的特点。15．分子量较小，不具自身传递性是松驰型质粒的特点。16．基因工程中使用的质粒39．大肠杆菌DNA连接酶只能催化DNA双链的单链缺口和带粘性末端的双链DNA。

40．TDT即末端脱氧核苷酸转移酶。

41．DNA连接酶的最适温度

0

是37C。42．连接反应温度应介于催化反应与末端粘合之间。43．根据受体系统不同，基因工程可分为微生物基因工程、动物基因工程和植物基因工程。44．关于感受态本质的假说71固定比酶：限制或定位于特定空间位置的酶称为固定化醇。

72固定化细胞：被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。

73载体结合法：将细胞悬浮液直接与水不溶性毂体相结合的固定化方法。74包埋法：将细胞定位于凝胶网格内的技术称为包埋法。

75偶联效率：偶联固定化反应过程中载体结合蛋白质的能力称为偶联效率。QQ：806235356 76酶活力：醇类催化特定化学反应的能力称为酶活力。

77酶比活：指每毫克酶蛋白所表现的活力。

78固定化反应的酶活力回收串：固定醇所显示的活力与加入偶联液中酶总活力的比值称为固定化反应的酶活力回收率。

79酶试剂盒；将酶、反应试剂、稳定剂、激活剂，填充剂、及缓冲剂等配成检测用的混合制剂称酶试剂盒。80细胞因子：是人类或动物的各类细胞分泌的具有多样生物活性的因子，是可溶性物质，是一组不均一的蛋白质分子，能调节细胞的生长与分化。

81白细胞介素：由白细胞或其它细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的因子。

82.IL-3：即白细胞介素3，由激活的T淋巴细胞产生，能刺激多能造血干细胞和各系细胞的分化和增殖，促进和维持肥大细胞的增殖，增殖中性粒细胞、酸性粒细胞的活性，促进NX细胞杀伤实体瘤的活性。

83.IL-10：由TH2细胞产生，能抑制TH1细胞合成因子的能力，是一种糖蛋白。84.IL-12：是由B淋巴细胞分泌的一种细胞因子，分子量为75KD的糖蛋白，其主要作有得促进PHA活化的PBMC增殖以及亚适剂量IL-2协同促进作用。88超诱导：是指细胞在某都是松驰型质粒。种大分子合成抑制物的适17．松驰型质粒可被氯霉素当作用，诱生蛋白合成增加扩增。的现象。

18．细菌收获可通过离心进89生物反应调节剂：是生行。

物体体内的某些细胞和某19．细菌裂争可采用：非离些分子，它们既是机体对内子型或离子型去污剂，有机外环境刺激应答的效应机溶剂，碱处理及加热处理。制，也是机体维持内环境的20．λ噬菌体长约48.5kb。稳定因素。21．野生型λ噬菌体为双链

线形分子，具有12个碱基

二、知识点 的粘性末端，进入大肠杆菌

包括局部原生质体化假说及酶受体假说。45．大肠杆菌感受的制备方法包括Hanahan法，氯化钙法及电转化法。46．局限性转导只能转导宿主染色体上少数基因。47．普遍性转导可转导宿主染色体上任何基因。

48．β-半乳糖基因插入失活法的重组质粒产生白色菌落。

49．不带β-半糖苷酶活性蛋白的菌落中央也可出现淡蓝色斑点。50．动植物病毒也可作为外源基因的载体。51．目的基因重组克隆的筛选方法包括：根据重组体表型筛选，重组体结构分析法，检测目的基因法及检测目的基因表达产的法。52．原核生物中基因表达以操纵子形式进行。

53．原核生物细胞没有核膜，因此表达过程中的转录与翻译往往同时进行。54．原核生物的mRNA在翻译完毕之后，随即被水解掉。

55．真核生物转录成不均-RNA之后，还需加工，如

去掉内含子，修饰，加工5，末端和3，末端。56．基因工程中基因表达的研究，是指外源基因在某一种细胞中的表达活动。57．大肠杆菌，酵母与哺乳动物细胞三大基因表达体系已成为当前基因工程工业性生产的核心。58．基因表达合成功能蛋白的基本条件是依赖于基因的有效转录，mRNA正确的转译和转译后的加工。59．阅读框架是由起始密码子决定的。60．用于保证目的基因处于正确的阅读框架中的方法有：选用适当的酶切位点；用人工接头调节阅读框架；构建一组适合不同阅读框架的载体。61．基因的表达受到启动子等调控元件的控制。62．基因的高效表达必须依赖一个强的启动子。自考现代生物制药技术

63．适当的启动子，只能保证目的基因的正确转录，而并不能保证基因的完全正确表达。64．对已知功能的基因表达产物的检测，可以采用蛋白质电泳，免疫扩散和凝集，酶联免疫和放射免疫等方法。65．对未知目的基因功能的表达产物的检测方法是在18．水的主要生理功能是参与代谢反应，作为反应的价质，提供氢、氧元素；参与物质运输；传递热量，调节体温。19．培养基中的生长因素的主要功能是作为酶的重要组成成分。20．化学物质来菌只适用于局部空间或某些器械消毒。21．用于辐射灭菌的射线有性营养环境不利于放线菌

孢子形成。

43．一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导放线菌孢子形成。

44．霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麦米、麦粒等天然农产品为培养基。45．细菌的斜面基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。4．植物细胞实验室培养法是悬浮、微室、平板、看护、悬滴及单花粉等多种培养方式。

5．悬浮培养特点是培养过程中，细胞总数不断增加，一定时间后产量达最高点，生长趋于停止。

6．植物细胞接种浓度通常

4为2.5×10～5.0×10细胞/毫升。

携带有重组体分子的细胞中寻找新合成的蛋白质。66．应用大细胞系统检测基因表达时，主要是利用质粒或λ载体扩增的途径。67．微细胞不含有染色体DNA。

68.HbsAg是指乙肝表面抗原。

69．HGH是指人生长激素。70．HGH可以治疗侏儒症，促进烧伤及骨折等创伤性组织的恢复。

7．植物细胞单细胞培养技术有平板培养法，微室培养法、看护培养法等。

8．微室培养法的优点是可直接观察分裂繁殖及分化全过程，胞质环流规律及线粒体生长与分裂活动，亦可进行连续观察原生质体融合，细胞壁再生及融合后细胞分裂活动，同时可进行显微摄像。

9．看护培养法培养时间较微室培养长。10．细胞突变的主要原因是染色体缺失、重复、倒位、异位、碱基顺序转换、颠换及移码所引起。11．植物细胞培养物易发生自发突变，其突变频率在10-7～10-6

之间。12．人工诱发植物细胞突变的化学因素主要有碱基类似物、烷化剂、抗生素等。13．筛选植物突变细胞的目的在于获得某些药物高产细胞株或某些物质转化的高产酶细胞株。14．筛选细胞突变体主要依据细胞表型变化。15．自离体植物细胞培养物中筛选细胞突变体的方法有直接选择法，间接选择法及绿岛法。16．植物细胞培养物处于无组织无器官分化的分散状态时许多重要基因并不表达。17．目前已建立植物细胞种质保存法有：干燥保存法，液体石蜡覆盖法，低温保存法，低压低氧保存法及超低温深冻保存法。18．超低温深冻保存法系将

植物种质于-1960

C的液氮中保存。

19．常用的冻冻保护剂有DMSO，甘油，PEG，葡萄糖、山梨糖及蔗糖。20．为提高存活力，冻存材料应选用抗寒力强的幼龄培养细胞。

21．对于种子、花粉、球茎等高度脱水材料可以采用快速降温的冻存。22．对于不耐寒植物细胞需采用慢速冰冻法。23．对于木本植物冬芽冻存

物需于00

C慢速化冻。24．深冻细胞活力及存活率测定的方法有再培养法、二醋酸荧光素染色法及氯化自考现代生物制药技术

三笨四氮唑还原法。25．再培养法是检查细胞活力的根本方法。26．植物原生质体制备的材49．以组织块为材料的培养方法叫组织块培养法。50．细胞培养包括细胞及细胞团块单层培养及单细胞程谓之电场诱导融合作用。72．完整细胞间融合是扩大生物变异的有效手段。73．两种完整细胞融合时，95．微载体培养优点在于兼有固定化培养与悬浮培养的双重特点。

95．动物细胞生长缓慢，又料应用较多的是叶片，愈伤组织及悬浮培养细胞。27．高等植物细胞壁主要成分为纤维素，其次为半纤维素，果胶质及蛋白质。28．植物原生质体制备时的脱壁酶有纤维素酶，果胶酶，斗纤维素酶，蜗牛酶及崩溃酶。

29．纤维素酶使用时的pH值为5.4。

30．果胶酶最适pH值为5.8。31．纤维素酶及果胶酶混合使用的pH值为5.4～5.6之间。

32．脱壁酶液采用0.45μm微孔滤膜过滤除菌。33．纯化植物原生质体的方法有离心法、飘浮法、界面法及滴洗法。34．植物原生质体活力测定方法有：根据形态特征判断其活力，活体染色法及光染料活体染色法。35．大多数植物原生质培养1～3day，即再生新细胞壁。36．大多数植物原生质体通常在1～2周内发生

具有锚地依赖依。96．组织纤维溶酶原激活剂是一川丝氨酸蛋白酶。97．抗乙型肝炎表现抗原单克隆抗体是专一性识别HbsAg的单一抗体。98．体外法生产单克隆抗体是使杂交瘤细胞在人工反应器内大规模培养并表达相应抗体。99．体内法生产克隆抗体是利用生物体为细胞反应器大规模培养杂交瘤细胞生产抗体的方法。

100．检出分泌特异抗体细胞后，应即时进行克隆化筛选与鉴定，以免非必需细胞过分生长。QQ：806235356

定的是IFNa。37．干扰素的受体主要存在于细胞膜中。

38．白介素-2的生物学作用主要是刺激细胞增生。39．酵母属于真核生物，大肠肝菌，放线菌及兰细菌等属于原核生物，但它们均为单细胞生物。

40．NK细胞对射线照射最为敏感。

41．CTL细胞对射线照射最为敏感。

42．B细胞具有表面球蛋白，而T细胞、NK细胞，K细胞的表面则不具有表面球蛋白。

44．TNF对蛋白酶最为敏感。45．具有生物活性的肿瘤坏死因子为三聚体构型。46．细胞因子使用的最终效应部位在细胞的细胞核内。47．细胞因子多为单链分子，其基因多由多个外显子和内含子组成，但其基因均为单拷贝。

48．IL-5对细胞的作用包括增强B细胞的功能，促进活性B细胞分泌，并可诱导B细胞表达IL-2受体。49．IL-8可来源于单核细胞、巨噬细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞、T细胞等。

50．IFN的蛋的产物包括IFN-α，IFN-β及IFN-y。51．IFN-β在成纤维细胞中诱生。

52．IFN也可诱生IFN。53．TNF也可诱生IFN。54．IFN可抑制病素的生活周期的许多阶段，包括病毒的吸附和脱壳、早期病毒转录、病毒转译、蛋白合成及从细胞表面芽生。

55．EPO的主要来源为肾小管，肾间质细胞。56．可导致EPO生成增加的因素包括高原气候、冠心病、肺心病、溶血性贫血等。57．细胞因子研究发展前景包括细胞因子的加工改造，细胞因子的受体及其免疫调节的信息传递，细胞因子基因表达的调控，分子水平上了解在疾病治疗中的作用以及作为有效的免疫佐自考现代生物制药技术

剂。58．天然干扰素是一种糖蛋白。

59．干扰素对蛋白酶敏感。60．干扰素可导致病毒繁殖中断。61．干扰素具有广泛的抗病毒活性。62．干扰素基因在正常生理状态下不表达。

63．IFN对免疫功能的调节作用包括增强巨噬细胞活力，使补体水平下降及延长同种移植物的排斥反应。84．细胞因子很难用常规方法纯化。

86．TNF具有抗肿瘤作用。87．诱导TEF合成须经过两个阶段：起动期、促发期。88．TNF经鉴定有两类：TNFα，TNFβ。

89．TNF分子量因来源不同，制备方法不同及测定方法不同相差较大。

90．TNF与其它细胞因子，化疗药物联合作用可以降低TNF剂量及副作用，提高疗效。制，是以双链DNA库间媒介；利于体外纯化；（2）不论单链DNA还是双链复制形式DNA均能够感染大肠杆菌；（3）单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多制约，而不存在包装限制问题；（4）可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。

9．T4DNA连接酶的作用机制：（1）T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-AMP复合物；25mMTris-HCL(pH8.0),10m

M EDTA Ph8.0）中剧烈振荡；（4）加200μl亲配制液溶液II（0.2M NaOH1%SDS）,混合内容物，不要振荡，置冰上；（5）加150μl冰预冷溶液III（5M Kac60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml），温和振荡10s置

0

于阔步3-5min；（6）4C。12000rpm离心5min，转移上清；（7）上清加等量酚；

0

氯仿抽提，4C，12000rpm离心2min，收集上清；（8）64．人白细胞干扰素制剂的半成品检定包括比活性测定、无菌试验、余毒试验、安全试验及硫氰酸钾残余量检测。65．干扰素制剂大剂量使用的最佳途径是批注，皮下注射。66．干扰素制剂的局部用药多采用喷雾、贴敷、滴鼻。67．干扰素临床应用的适应症包括急性病毒性感染、慢性病毒性感、恶性肿瘤、器官移植患者、乙型脑炎等。68．T细胞的激活与增殖包括三个时期，即细胞产生白介素-2及其受体表达，细胞进入不依赖白介-2的增殖期。

69．白介素-2的临床应用包括抗病毒感染、抗细菌感染、抗肿瘤及艾滋病的治疗等。70．关于集落刺激因子的特性，目前认为四种集落刺激因子无序列同源性，均为糖蛋白分子，四种集落刺激因子各有特征的膜受体。71．红细胞生成素的临床应用包括慢性肾功能衰竭、类风湿性关节炎、癌性贫血、早产婴儿自体输血及用于外科手术的辅助治疗等。72．细胞因子大都是糖蛋白类物质。73．糖基成份对细胞因子活性影响不大。

74．IL-lα与IL-1β可识别相同的受体。

75．LPS可诱导单核细胞但不能诱导皮肤纤维母细胞产生IL-8。76．去除糖链后IL-10的抗原性不受影响。

77．TNF发挥作用有相对的细胞周期特异性。

78．TNF直接注入是很有效的。79．体内IFN通常在严格的诱导控制下产生。

80．IFN可以抑制正常细胞的生长。

81．对晚期癌症IFNy不优于IFNα。82．体外实CSF可引起肿瘤细胞增殖。83．高原居民的EPO年成增加。

（2）酶-AMP复合物再结合三、重点问题 到具有5，一磷酸基与3，羟1．重组DNA技术通常包括： 基切口的DNA上，使DNA（1）基因重组载体的选择腺苷化。（3）产生一个新的和制备；（2）目的基因的分磷酸二酯键，把缺口封起离纯化；（3）目的基因与载来。

体的重组；（4）重组克隆的10．DNA连接反应中的注意转化与感染；（5）重组克隆事项： 的筛选与鉴定；（6）目的基（1）连接及反应温度；（2）因的表达及表达产物的分防止粘末端的自身环化应离与提纯；

采取以下措施：①控制载体2．载体的基本条件： 与外源DNA分子的浓度与（1）本身是一个复制子，比例；②用碱性磷酸酶处理能自我复制；（2）分子量要载体防止自身环化；③定向小；（3）带选择标记，以便克隆；（3）用λDNA和科斯进入宿主细胞后有可辨认质粒的载体时的连接；①λ的表型特征；（4）对几种限DNA载体应考虑两个参数：制性酶有单一切点：（5）有插入分子左右臂的比例，两一定的非必要区，在这段插者的浓度；②科斯质粒常用入外源基因不影响其复制。两种方法连接，一种是用碱3．可作为载体的有： 性磷酸酶处理，另一种是多（1）质粒；（2）λ噬菌体；酶反应进行的克隆。（3）M13噬菌体；（4）科11．受体细胞一般具有的性斯质粒；（5）动、植物病毒。能：

4．选择裂解细菌的方法取（1）有接受外源DNA的能决于：

力；（2）限制系统缺陷或限（1）质粒的大小；（2）大制与修饰系统均缺陷型；肠杆菌菌株；（3）裂解后用（3）DNA重组缺陷型；（4）于纯化质粒DNA的技术； 不适于在非培养条件下生5．选择裂解细胞的一般准存。

则：

12．DNA分子转化机理：（1）大质粒（大于15Kb）（1）吸附：完整的双链DNA易受损，故应采用温和裂解分子吸附在受体菌的表面；法（SDS裂解法）从细胞中（2）转入：双链DNA分子释放出来；

解链，单链DNA进入受体（2）对于小质粒，可加入菌，另一链降解；（3）自稳：EDTA后采用溶菌酶处理，外源质粒DNA分子在细胞再通过煮沸或碱处理使之内又复制成双链环状DNA裂解。

（4）表达：供体基因随同6．λ噬菌体作为克隆载体复制子同时复制，并被转录的特点是：

和翻译。（1）λ噬菌体可在体外包13．基因表达的三个基本条装成病毒颗粒，高效地转染件：

大肠杆菌；（2）λDNA的长（1）基因的密码区不能被度只有在野生λ噬菌体的插入序列所中断；（2）基因75%-105%之间才能够包装；必须在启动子控制之下；（3）λ噬菌体适于克隆大（3）mRNA必须相当稳定并片段DNA及组建基因文库。有效转译，产生的外源蛋白7．科斯质粒的特点是： 不被宿主很快降解。

（1）具有λ噬菌体的特性，14．碱裂解法制备质粒DNA能高效地转染宿主细胞，但的方法：

它不含λ噬菌体的全部必（1）接种菌落于含抗生素要基因，不能裂解生成噬菌的LB中，370

C剧烈振荡反斑；（2）具有质粒载体的特应；（2）培养液性，带有质粒的抗性基因而40

C12000rpm30min离心；易于筛选。

（3）重悬细菌于100μl8．M13载体的优点： 冰预冷的溶液I（50mM葡萄（1）单链DNA噬菌体的复

糖，加入2倍体积乙醇，振荡混合，室温放置2min；（9）40

C，12000rpm，离心5min，弃上清；（10）倒置离心管，倾干液体；（11）1ml70%乙

醇40

C洗涤沉淀，弃上清，空气中干燥10min；（12）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮于

-200

C。15．配制工业发酵培养基的一般要求：（1）营养物质的组成比较丰富，浓度恰当，能满蹉力种发芽和生长繁殖成大量的有生理功能的菌丝体之需要；（2）在一定条件下，所采用的原料彼此之间不发生化学反应，理化性质相对稳定；

（3）粘度适中，最有适当的渗透压；（4）要考虑所采用的原材料的品种和浓度，与代谢产物生物合成过程中的调节关系；（5）生产过程中，既不影响通气与搅拌的效果，又不影响产物的分离，精制，以及废物的处理。（6）原材料尽量做到因地制宜，质优价廉，成本低。16．培养基的配制原则：1）营养成分配制原则：2）营养成分配比应恰当；（3）渗透压应合适；（34）pH值应合适；（5）氧化还原电位需符合要求。17．工业微生物筛选一般要求：（1）稳定而高产的遗传特性；（2）抗噬菌体能力强；（3）发酵过程泡沫少；（4）需氧量低；（5）底物转化率高；（6）对培养基和前体耐受力强；（7）营养特性；（8）最适温度高；（9）菌种既要高的遗传稳定性，又要有基因操作的可修饰性；（10）产物微生物常用的分离筛选途径： 18．工业微生物常用的分离筛选途径：（1）从菌种保存机构的已知菌种中分离；（2）从自然界中分离筛选；（3）从生产过程中分离筛选。

19．单孢子悬液的制备方法：（1）对于细菌，因其在固体斜面培养基上常粘在一起，故要求转接到新鲜肉自考现代生物制药技术

汤液体中进行培养，以取笪分散且生长活跃的菌体；（2）对放线菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后，用滤纸或棉花过滤。20．原生质体融合技术的特点：（1）打破物种界限，可实现远缘杂交；（2）可实现两上以上同种或不同种微生物细胞融合；（3）原生质体易于受到诱变剂的作用而成为较好的诱变对象；（4）可使重组频率大大提高。

21．微生物菌种保存方法：及基因型变异；2）森林及土地无止尽开发利用，自然种质库破坏，需建产人工种质库；（3）细胞工程中获得的中草药及农作物优良品种的特殊变异细胞及杂种细胞，常规保存法易于变异，需进行种质资源广泛收集与长期保存；（4）细胞培养建立的人工种质库可节省土地与劳务。29．植物原生质体制备的预处理方法：（1）预质壁分离；（2）预培养；（3）暗处理；（4）光处理；（5）低温处理； 38．动物细胞融合的基本过

程：取数量(10-10个/ml)的两种亲本细胞充分混合，离心除去上清液，取下层细胞悬液0.1ml，逐滴加入

0

0.4ml37C的40%PEG溶液，0

37C静置90s，缓慢加入5-10ml无血清培养液，轻摇离心管4-5次，离心去上清液，按每0.1ml融合混合液加25ml完全培养基，以每孔0.1ml分装于96孔培养板及每孔0.5ml分装于

0

24孔培养板上，于37C CO2培养箱中培养之。39．脂质体介导的细胞融合量与常规单层培养相同，通

过增加培养罐体积即可达到扩大培养规模的目的，减少厂房及设备投资，节约动力消耗及人力，又便于对反应系统进行检测控制。46．利用有限稀法筛选杂交瘤细胞的过程：于克隆前一日向96孔板中加入0。1ml

2细胞悬液，于37℃CO培养箱中温育，然后从阴性孔中吸取细胞计数，用完全培养基稀释成30个／ml加入96孔板中，每孔0.1ml，余下细胞再稀释成10／ml，再加于两块96孔板中，每孔（1）斜面低温保藏法；（2）液体石蜡封存法；（3）沙土管保存法；（4）冷冻干燥保存法；（5）超低温保藏法。22．工业微生物表面培养法的优缺点：（1）优点：①简单易行；②投资少；③适于小型生产（2）缺点：①劳动强度大；②占地面积大；③产量低；④易污染。23．工业发酵中提高发酵液的溶氧水平的措施：（1）提高通气强度；（2）增加搅拌转速；（3）增加罐压；（4）增加挡板；（5）通气中掺入纯氧；（6）控制基质培养基；（7）控制补料率；（8）调节温度；（9）添加表面活性剂；（10）中间补水；11）液化培养基。24．影响微生物原生质体制备的因素：1）菌体的预处理；（2）菌体的培养时间；3）酶浓度；（4）酶解温度；（5）酶解时间；（6）渗透压稳定剂。25．微生物工程产品主要类型：（1）微生物菌体；（2）初级代谢物；（3）次级代谢物；（4）生物活性大分子； 26．微生物工程在医药工业中的应用：（1）抗生素类；（2）氨基酸类；（3）核苷酸类；（4）维生素类；（5）甾体类激素；（6）治疗酶及酶抑制剂。

27．植物细胞培养的特性：（1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁，细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；（2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；（3）细胞生长的中期及对数期，易凝聚成团块，悬浮培养较难；（4）培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；（5）具有群体效应，无锚地依赖性及接触抑制性；（6）培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低；（7）培养过程具有结构与功能全能性。

28．种质保存意义：（1）植物组织及细胞移植继代培养过程可能导师致染色体30．植物细胞生长所需的营过程：动物细胞破碎后，经养成份：H2O、无机营养物、差分分离出线粒体及溶酶维生素、碳源、天然物、植体等细胞器，或采用生化技物激素、氨基酸类、核酸及术分离出的DNA，mRNA，逆其水解物以及其它成分。转录酶及其它生物大分子30．制备原生质常用酶：（1）并将其包装成脂质体，然后纤维素酶；（2）果胶酶；（3）按完整细胞之间的融合方崩溃酶；（4）半纤维素酶；式，将脂体与另一种细胞融（5）蜗牛酶。合，即或获得相应杂种细31．测定植物原生质体活力胞。的方法：（1）根据形态特征40．杂种动物细胞筛选系统判断其活力；（2）活体染色及方法：（1）HAT选择系统；法；（3）荧光染料活体染色（2）抗药性筛选系统；（3）法。互补选择法；（4）原位杂交32．植物细胞分化培养基与法；（5）基因探针选择法。原生质体培养基的差别：41．动物杂种细胞遗传表现（1）分化培养基中只有蔗型：（1）互补作用是指两种糖为碳源，不加渗透压稳定亲本细胞生物学特征在杂剂；（2）原生质体培养基中，种细胞中共同表达的现象；生长素浓度高于细胞分裂（2）激活作用是指一个亲素浓度，分化培养基正相本细胞的非活动基因在杂反；

种细胞中得到表达的现象。33．植物细胞融合的特点：（3）消失作用指亲本细胞（1）可以实现远缘杂交，某些遗传性状在杂种细胞获得种间杂种，克服有性杂中消失的现象；（4）激活与交配系不亲和性；（2）可获消失作用指在杂种细胞中得另一亲本非整倍性杂种原亲本非活动基因被激活，或胞质杂种，且获得的遗传而同一亲本某些遣传性状变异范围极广；（3）一次操同时消失的现象。作可实现两个以上亲本的42．MCAb的基本特性：（1）融合作用；（4）可获得呈现MCAb为高纯度单一抗性，双亲个体基因型总和的杂检测灵敏度极高；（2）可通种；（5）可形成有性生殖障过杂交瘤大规模培养进行碍植物种间杂种；（6）获得生产；（3）杂交瘤可用液氮具有不同后生遗传变化亲深冻法长期保；（4）可在分本的杂种。子水平上解析出存在于病34．筛选植物杂种细胞的方毒表面的抗原或受体；（5）法；1）遗传互补筛选法；可用不纯抗原制备纯（2）抗性互补筛选法；（3）MCAb；（6）但MCAb专一性利用物理特性筛选法；4）太强，难于检出微生物突变利用生长特性筛选法。株，有时不能产生与抗原交35．动物细胞培养包括：（1）联的功能易受PH、温度及盐组织块培养法；（2）细胞单浓度影响，又亲和力较低，层培养法；（3）单细胞分离半衰期短，又需长期持之以培养；（4）二倍体细胞株培恒的艰苦工作。

养。

43．单克隆抗体生产技术；36．二倍体细胞特征：（1）（1）体外培养法；（2）体具有两倍性染色体（2n），内培养法。组型正常；（2）培养条件下44．无血清培养基分类：（1）呈有限生命力，不能无限期基本合成培养基；（2）基本分裂繁殖；（3）无致癌性。合成培养基加生长因子；37．动物细胞融合过程的促（3）基本合成培养加组织融因素：（1）病毒诱导融合；抽提物。（2）PEG诱导融合；（3）45．微载体培养的优点：兼电场诱导融合；（4）聚乙烯有固定培养与悬浮培养双醇分离心力也能促进融合。

重特点，培养过程细胞产物

板中，每孔0.1ml。再制备3个／ml细胞悬液，加入另外两块96孔板中，将上述

各板置37℃CO

2培养箱中培养2-3周，待出现可见细胞集落后，检查培养液中抗体活性，选出阳性孔，扩大培养，如上法进行反复克隆，直至选出纯杂交瘤细胞为止。47．动物细胞培养过程中所具有的特性：（1）细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；(2）动物细胞较微生物大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；(3）培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌；(4）在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性；（5）培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵；（6）大规模培养时，不可套用微生物反应的经验；（7）原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。48．深冻植物细胞复苏后测其生命活力与存活率的三种方法：

（1）再培养法：将复苏后细胞立即接种于新鲜培养 基上再培养，同时测定细胞增殖量，愈伤组织形成情况及人化为新植株能力；（2）二醋酸光素染色法：用1滴0.1%荧光素染料溶液与一滴化冻后细胞悬浮液混合，活细胞染色，死细胞不着色，用普通显微镜观察计数得细胞总数，用紫外光显微镜观计数得活细胞数，据此可计算出冻存细胞存活率；

（3）TTC法：根据活细胞内脱氢酶可将氯化三苯四氮唑还原为for mazam,后者溶于乙醇而不溶于水，故前者与冻细胞保温反应用乙醇抽提，再用分光光度法测定吸收度，用以判断细胞存活率及生活力。49．动物细胞固定化培养的优点：（1）细胞可维持在较自考现代生物制药技术

小体积培养液中生长；（2）细胞损伤程度低；（3）易于更换培养液；4）细胞和培养液易于分离；5）培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。

50．中空纤维培养器优点：（1）细胞生长密度高；（2）营养牧质可有效分布，代谢产物可及时排除；（3）细胞培养可达数日，易于实现连续培养；（4）细胞分泌蛋白质浓度高；（5）反应器体积小并可用于培养多种细胞。液，混合均匀，再冷却凝固成型和破碎即成固定化酶；(2)微囊化包埋法是将醇定位于具有丰透性膜的微小囊内的技术，其基本制备方法有界面沉降法及界面聚合法两类。

58.固定化酶反应器：(1)搅拌罐型反应器；(2)固定床型反应器；(3)流化床型反应器；(4)膜型反应器；(5)鼓泡塔型反应器； 59．固定化酶的形状：（1）颗粒状固定化酶；（2）纤维应液，置于沸水中，加热使

酶失知；（2）立即加入适宜的酶变性剂，使酶变性失活；3）加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化应的最适pH值；（4）将取出的反应液立即置于冰，或冰盐溶液中，使反应

0

液的温度迅速低至10C以下。

63．酶与一般催化剂相比，所具有的优点：（1）催化效率高；（2）专一性强；（3）反应条件温和；（4）酶的活体酶的合成，释放增强，促

进过氧化物酶合增强；（3）可促使白血病细胞分化及抑制白血病细胞生长。74．集落刺激因子的临床应用：（1）治疗血细胞减少症；（2）治疗再生障碍性贫血、骨髓发育不良和自体骨髓移植后的恢复；（3）治疗癌症；（4）治疗AIDS。75．细胞因子受体的信息传递途径：（1）通过受体本身的酷氨酸激传递递信息；（2）通过

息。76．用于制备细胞因子的培养细胞标准十分严格，对这些细胞的要求包括：（1）细胞来源要清楚；（2）细胞建株的鉴定资料要记录清楚；（3）了解细胞系的生长特性和在培养条件下的细胞的稳定性；（4）培养细胞时所用的血清不含细菌、病菌、真菌和支原体。77．干扰素的基本特性：（1）种属特异性；（2）作用广谱性和选择性；（3）相对无害性；（4）特殊稳定性。78．真核基因在原核细胞中获得表达必须具备的三个条件：（1）要有原核细胞的启动子；（2）要有能与原核细胞16SrRNA3’端相配合的顺序；（3）表达的干扰素多肽要不被细胞酶类所迅速降解。

79．IL-2的生物学作用：（1）促T细胞增殖；（2）对自然杀伤细胞（NK）的作用；（3）诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖；（4）诱导淋巴因子活化淋巴细胞产生；（5）促B细胞增殖分化作用；（6）IL-2与其他白介素协同作用。

80．集落刺激因子的功能：（1）刺激造血细胞增殖；（2）维持细胞存活；（3）分化定型；（4）刺激终末细胞的功能活性。81．三种检测重组基因工程CSF的方法（1）生物学检测法；（2）分子生物学检测法；（3）免疫学检测法。82．TNF抗肿瘤作用的可能机制：（1）细胞的直接细胞毒及细胞生长抑制作用；（2）肿瘤内血管阴塞引起肿瘤缺血性坏死；（3）TNF的免疫调节作用可能在其抗瘤效应中起一定的作用。QQ：806235356 83．细胞因子共有特性：（1）多源性；（2）多效性；（3）高效性；（4）快速反应性；（5）理化性质：①化学本质为大分子多肽或蛋白；②多为单链分子；③多具有“分泌型激素”的特性；④基因多由数个外显子和内含子组成；⑤基因均为单拷自考现代生物制药技术

贝；⑥分子量均小于80KD。84．细胞因子的受体，根据其结构特点和功能分类：抗细菌、抗真菌作用；（8）热原质作用；（9）参与骨质重吸收。

种蛋白质的结构基因与调节基因广泛地存在于脊椎动物以上的细胞内，在一般2激活的细胞表面抗原标

志，也说明LAK杀伤肿瘤细胞效应是白介素—2激恬（1）细胞因子受体的新家族；（2）肿瘤坏死因子受体家族；（3）免疫球蛋白超级家族受体； 85．基因工程细胞因子制备的基本步骤：1）制备含特异性细胞因子基因的cDNA文库；（2）从cDNA文库中筛选目cDNA克隆；（3）构建表达性载体，制备高级表达性工程菌（细胞）。86．干扰素的生物功能本质：（1）抗细胞内侵害；①抑制病毒繁殖；②抑制胞内的其它微生物繁殖；（2）抗细胞分裂活性；（3）调节免疫功能活性；①调节免疫监视功能；②调节免疫自稳功能； 87．基因工程干扰素的制备方法：（1）干扰素工程菌的组建；①分离提取干扰素基因；②制备人工重组质粒；③转化宿主菌；（2）基因工程干扰素的制备；（3）基因工程干扰素的质量控制； 88．集落刺激因子的检测方法：（1）生物活性检测法；①骨髓细胞集落形成法；②依赖细胞株；（2）分子生物学检测法；斑点杂交法；（3）免疫学检测技术；双抗体夹心ELISA法。89．CSFs制检的一般步骤：（1）制备工程菌（或细胞）；2）工程菌（或细菌）的培养；（3）分离纯化；①工程菌的破碎，沉淀；②离心；③层析：离子交换层析、亲和层析；④超滤浓缩，分子筛层析；（4）除菌过滤，分装，冻干；（5）半成品检定，主要包括下列检定项目：①蛋白含量测定②活性测定③比活性测定；④分子量测定；⑤纯度测定；⑥核酸含量测定；⑦鼠lgG含量测定；⑧等电测定；⑨无菌试验；⑩热原质等检定项目；（6）成品检定：①外观检查；②活性测定；③水分测定；④无菌试验；⑤安全毒性试验；⑥热原质试验；⑦肽图测定等检测等检测项目；（7）分包装；（8）贮存。90．红细胞生成素的测定方法：（1）生物体内测定法；（2）生物体外测定法；（3）放射免疫测定法。91．肿瘤坏死因子生物学活性：（1）抗肿瘤活性；①TNF直接抗肿瘤细胞的作用；②TNF在体内的抗肿瘤作用；（2）抗炎症活性；（3）促凝血活性；（4）对脂肪细胞合成脂蛋白脂酶（LPL）和LPL活性的抑制作用；（5）促进细胞因子分泌；（6）免疫调节作用（7）抗病毒、92．IL-13的作用：（1）强生理状态下，细胞的干扰素烈报制外周血单核细胞分基因呈静止状态，只有在特泌IL-

6、IL-1β、TNF-α、定诱生剂的作用下，细胞的IL-8和gro-β；（2）能抑干扰素基因才活动，转录合制细胞培养分化的巨噬细成相应的mRNA，进而转译胞产生HIV，并能抑制体外出具有种属特异性的干扰HIV复制；（3）较小程度直素蛋白； ③干扰素本身并接作用于大颗粒淋巴细胞不能直接灭活病毒，干扰素（LGL）合成IEN-y，并与作用于细胞后，使后者又产适量和亚适量的IL-2的协生多种其它蛋白质(抗病毒同作用；（4）它能影响B蛋白)，从而阻断病毒的繁淋巴细胞，增强其增殖并能殖； ④干扰素必须具有广表达CD23表面抗原；（5）谱的抗病毒活性，如果某一有抗炎作用（败血性休克和种抗病毒物质仅对特定的风湿性关节炎）并刺激体液病毒有作用，就不能称为干免疫应答；（6）增强由IL-2扰素。

诱导产生的细胞因子激活96．人淋巴细胞几—2的制的杀伤细胞活性。备产物检定方法：

93．基因工程重组细胞因子(1)活性检定：采用CTLL的制备质控：(1)详细记录细胞株的3H掺人法进行活表达载体和宿主细胞，包括性测定，比活性必须在克隆基因的来源和鉴定，以106IU／mg以上；

及表达载体的构建、遗传学(2)纯度检定：①SDS—和结构等，此外还要介绍载PAGE检测，用银染色，在体引入宿主细胞的方法，和15KD处呈单一条带，后扫载体在宿主细胞中的状况； 描测得几—2条带占95％(2)应有详细的插入基因和以上；

表达载体侧翼调控区核苷 ②HPLC检测，反相柱(C4、酸序列的资料；(3)在生产C8、C18等)或正相分子筛柱中启动和控制有关基因的测得IL—2主峰占95％以表达方法要有详细记录；(4)上；

产品纯化方法要有明确详(3)氨苄青霉素测定：因为尽记载，如采用单抗法和层大肠杆菌发酵的基因工程析法，要采取适当措施，保产品均采用氨苄青霉素抗证这些单抗或其它潜在污性菌株生产，所以必须检定染物不损害终产品的质量氨苄青霉素残余量； 和安全性。(4)残余DNA检测：采用同94．细胞因子的分子生物学位素探针法，每剂残余DNA测定法：

量不得超过100pg；

目前采用的分子生物学技 还有生物制品要求的常规术有RNA印迹法、核酸酶保实验检定，如热原质测定、护分析、原位杂交和多聚酶制剂水分测定、安全试验、链式反应。均为通过检测相急性毒性实验、无菌试验等应的mRNA量、推算出几量均必须合格。的方法。多聚酶链式反应97．LAK细胞的杀肿瘤细胞(PCR)是目前检测几最敏感作用：LAK细胞杀伤肿瘤细的方法，尤其适用于极微量胞分如下三个阶段： 的标本，或仅有极少数细胞(1)识别阶段：LAK细胞对才能表达几基因，或几基因正常细胞无损伤作用，而对以低水平表达的标本，目前肿瘤细胞结合进而杀伤，而已可作半定量分析，且对多种肿瘤细胞结合而95．干扰素的定义及含义： 杀伤，说明多种肿瘤的细胞(1)干扰素的定义：干扰素表面存在着共同抗原决定是一类在同种细胞上具有簇，可被LAK细胞所识别；广谱抗病毒活性的蛋白质，正常细胞表面可能不存在其活性的发挥又受细胞基肿瘤抗原决定簇，就不能被因组的调节和控制，涉及LAK细胞所杀伤；关于LAKRNA和蛋白质的合成； 细胞对肿瘤细胞结合分子(2)目前认为，干扰素是一特性研究发现了“淋巴因子种类似多肽激素的细胞功活化细胞相关抗原”(LAA)，能的调节物质，是一种细胞而用LAA制备了单克隆抗素，这一定义的含义如下：体(KBA MoAb)可以抑制LAK①干扰素必须是一种蛋白细胞杀伤活性，提示了LAK质，它对蛋白酶类是敏感细胞杀伤肿瘤细胞的物质的，而对DNA酶或RNA酶却基础，从分子水平认识LAA有抵抗；天然干扰素是一种抗原为两条链的糖蛋白组糖蛋白，采用DNA重组技术成的二聚体，LAA只存在受由大肠杆菌表达的人干扰白介素—2激活后的细胞素多肽不带糖分子； ②这

表面，说明LAA是白介素—

的结果；

(2)杀伤阶段：LAK细胞杀伤肿瘤细胞主要是通过细胞介导的细胞毒作用对肿瘤细胞的杀伤；LAK细胞内含有溶细胞颗粒(C．C)，该颗粒中含有一种穿孔蛋白质，所谓穿孔因子(Peffoin)；LAK细胞与肿瘤细胞结合时，LAK细胞发生极化，首先高尔基体向与肿瘤细胞接触点方向移动，通过微管将颗粒分泌到两

种细胞接触面上，在Ca2+

激活下，LAK细胞也释放一种肿瘤坏死因子样毒素，对肿瘤细胞作用慢，不需Ca2+，又称之为不依赖钙离子的杀伤作用，常常使肿瘤细胞DNA变性和细胞核裂解，从而抑制肿瘤细胞生长；

(3)裂解阶段：瘤细胞受到攻击后，经上述两阶段后，完成裂解，抑制肿瘤生长。98．集落刺激因子的功能：

各种CSF的活性是以半固体培养基中CSF刺激造血细胞形成集落的能力来衡量的。其功能可分为四个方面：(1)刺激造血细胞增殖。集落形成细胞的分裂需要CSF持续存在，如从培养基中撤掉CSF，则细胞分裂停止，CSF的浓度决定细胞周期长短和产生子代细胞的总数目；(2)CSF既维系祖细胞的存活，也延长成熟细胞的寿命；(3)分化定型；(4)刺激终末细胞的功能活性。目前已知CSF能影响细胞作用、膜抗原的表达、吞噬作用、过氧化物的产生、杀伤微生物及肿瘤细胞，并产生许多重要的生物活性物质，如前列腺素E、肿瘤坏死因子、白细胞介素—

1、丫干扰素、血纤溶酶原活化因子等。

99．C—CSF和GM—CSF的异同点：

由于G—CSF和GM—CSF在许多相关的临床病例中可能有用，所以它们之间生物学特性差异，对某些疾病发病机理的认识有一定的意义；

(1)C—CSF特异性刺激中性白细胞，而GM—CSF则是所有粒细胞的总刺激因子，例如若要通过提高嗜酸性效应细胞水平来治疗寄生虫感染，则GM—CSF作用比G—CSF为好；

(2)GM—CSF是单核细胞和巨噬细胞的强激活剂，则G—CSF则不是，这种激活包括诱导产生诸如肿瘤坏死因子和IL—1类的其他自考现代生物制药技术

细胞因子，如需提高单核细胞和巨噬细胞活性，可选用CM—CSF，而不是C—CSF； 的主要部位，也是参与炎症的主要组织，内皮细胞本身也是产生细胞因子的重要

（另附：工艺流程图）

(3)CM—CSF是中性白细胞移动的强抑制剂，然而G—CSF则增强中性白细胞的移 动，例如当局部损伤时，GM—CSF可在局部产生，起弱的化学引诱剂作用，抑制炎症细胞离开炎症部位，而G—CSF则可增强炎症状细胞向炎症部位移动，这可能是两种造血生长因子共同提高宿主防御力的一种途径，在细菌性脓毒症时，接触内毒素可刺激单核细胞、巨噬细胞产生G—CSF，然后G—CSF刺激T细胞产生GM—CSF和IL—3，以增加骨髓内的骨髓细胞生成和进一步增强白细胞应答。100．CSFs三种检测方法的特点：

(1)生物活性检测法，特点是灵敏、方便，但因造血前体细胞、依赖株细胞一般都受几种因子的影响，因此，该法不能明确因子的特性； 质产物合成；

(3)免疫学检测法，特点是特异、灵敏，更高，缺点是不能证明有功能性蛋白缺点是不能证明被检CSF是否为具有(2)分子生物学检测法，特点是敏感性完整生物活性结构的蛋白质而非变性蛋白质，因此检测时最好将

自考现代生物制药技术

名词概念

1、生物工程：应用生物科学的理论、方法、按照人们设计的蓝图，改良加工生物或用生物及其制备物作为加工原料，以提供所需生物制品为人类社会服务的综合性科学技术。2、51、植物细胞大规模培养：在人工控制下高密度大朗养有益植物细胞即植物细胞大规模培养。

52、半连续培养法：在反应器中投料和接种，培养尸段时间后，将培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法，称为半连续培养法。

53、动物细胞工程：根据细胞生物学及工程学原理定向改造动物细胞遗传性、创造新物种，通过工程化为人类提供名贵药品服务的技术，称为动物细胞工程。

54、动物细胞培养技术：在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体动物细胞或组织生长繁殖的方法，称为动物细胞培养技术。

55、细胞块培养法：将动物组织切成直径1-2mm小块，进行培养的方法，称为组织块培养法。

56、细胞单层培养法：动物组织块经消化分散成单个细胞或细胞团块后，粘附于培养容器表面培养成新生细胞单层的培养法，称为细胞单层培养法。

57、单细胞分离培养：动物组织分散后，将其单个细胞培养成纯系细胞集群的技术，称之为单细胞分离培养。

58、确立细胞株：正常细胞在移植继代过程中，有些细胞增殖力突然增强，在特定条件下可无限繁殖，与初代细胞相比，其形态、生理生化特性，病毒敏感性，抗原性及染色体结构均发生变化，具有致癌性，这些细胞称为确立细胞株。

59、动物体细胞杂交技术：在外力作用下，令两个或两个以上异源细胞合并为一个多核细胞的过程，称为动物体细胞杂交技术。60、核体：细胞核连同其外表薄层细胞质构成的颗粒称为核体。61、胞质体：不具有细胞核的细胞称为胞质体。62、微核杂种细胞：按完整细胞之间的融合方式，将微核与另一完整细胞融合，使后者获得另一种细胞中的若于个染色体，所获融合子称为微核杂种细胞。63、抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞的方法。64、营养缺陷型细胞：在一些营养物质的合成能力上出现缺陷，因此必须在基本培养基中加入相应的有机成分才能正常生长的变异细胞。65、营养互补选择法：利用两种亲本细胞营养互补作用原理筛选杂种细胞的方法称为营养互补选择法。66、杂交瘤技术：骨髓瘤细胞与免疫淋巴细胞融合制备杂种细胞的方法为杂交瘤技术。67、杂合瘤：骨髓瘤细胞与免疫淋巴细胞融合制备的杂种细胞称为杂合瘤。68：微载体培养法；将细胞吸附于微载体表面的培养方法。69、酶工程：应用酶的特异性催化功能并通过工程化为人类生产有用产品及提供有益服务的技术为酶工程。70、酶：生物体内具有特殊催化功能的蛋白质称为酶。71、固定化酶：限制或定位于特定空间位置的酶称为固定化酶。

72、固定化细胞：苹限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。73、载体结合法：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合的固定化方法。74、包埋法：将细胞定位于凝胶网格内的技术称为包埋法。75、偶联效率：偶联固定化反应过程中载体结合蛋白质的能力称为偶联效率。76、酶活力：酶类催化特定化学反应的能力称为酶活力。77、酶比活：指每毫克酶蛋白所表现的活力。78、固定化反应的酶活力回收率：固定酶所显示的活力与加入偶联液中酶总活力的比值称为固定化反应的酶活力回收率。

79、酶试剂盒：将酶、反应试剂、稳定剂、激活剂、填充剂、及缓冲剂等配成检测用的混合制剂称酶试剂盒。80、细胞因子：是人类或动物的各类细胞分泌的具有多样生物活性因子，是可溶性物质，是一组不均一的蛋白质能调节细胞的生长与分化。81、白介素细胞：邮包细胞或其它体细胞产生的又在细胞间起调节作用和介导作用的因子。82、IL-3：即白细胞介素3，有激活的T淋巴细胞产生，能刺激多能造血干细胞和各系细胞的分化和增值，促进和维持肥大细胞的增值，增值中性粒细胞、酸性粒细胞的活性，促进NK细胞杀伤实体瘤的活性。

83、IL-10：由TH2细胞产生，能抑制TH1细胞合成细胞因子的能力，是一种糖蛋白。84、IL-12：是由B淋巴细胞分泌产生的一种细胞因子，分子量为75KD的糖蛋白，其主要作用是促进PHA活化的PBMC增殖自考现代生物制药技术

以及亚适剂量IL-2协同促进作用。85、肿瘤坏死因子：是一种由巨噬细胞分泌能产生细胞毒，使肿瘤细胞溶解的因子。86、干扰素：是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节与控制，涉及RNA和蛋白质的合成。

87、集落刺激因子：CSF为一组糖蛋白物质，由淋巴细胞和单核细胞自然产生，有刺激红细胞系以外造血细胞增殖和分化作用。88、超诱导：是指细胞在某种大分子合成抑制物的适当作用下，诱生蛋白合成增加的现象。89、生物反应调节剂：是生物体体内的某些细胞和某些分子，它们既是机体对内外环境刺激应答的效应机制，也是机体维持内环境的稳定因素。

第四篇：生物制药技术

08药学***3陈省委

组合生物合成药物进展

摘 要50年来抗生素在人类疾病治疗中发挥了重要作用,今后的几十年里它们也将是关键的治疗剂。尽管在过去的20年中通过靶向筛选发现了一些微生物药物,但是这种筛选方法很难发现新类型药物。组合生物合成可以弥补这种不足,通过基因工程方法改造微生物基因和酶,产生新的抗生素,发现那些在自然界中不能发现的药物。

关键词 基因工程合生物合成新抗生素

微生物种类繁多,其产物化学结构丰富多彩,生物活性十分广泛,是开发各种新产品的丰富资源,但是传统的筛选方法已远远不能满足社会发展的需要。随着分子生物学和生物技术的发展,以及基因组学、蛋白质组学、生物信息组学、代谢组学研究的深入,人们对微生物基因组的研究也有了显著进展,已经阐明了许多与微生物代谢有关的生物合成基因,为微生物组合生物合成药物的研究和开发奠定了良好的基础。

一、研究背景

自1928年弗莱明发现青霉素和1942年瓦克斯曼发现链霉素以来,微生物药物在疾病防治和拯救人类生命中起着十分重要和不可替代的作用,特别是抗生素被国外科学家誉为20世纪医学领域的皇冠宝石。微生物药物一直是临床最常用的药物,在西方发达国家,抗生素占临床处方药物的20%以上,在中国约占处方药物的30%。但自上世纪70年代后,随着脊髓灰质炎、天花、麻风等传染性疾病先后在全球范围内被消灭,国家对微生物药物研究的支持逐渐下降,抗传染病药物研究进入了困难时期。上世纪90年代后,我国在已有亿乙肝病毒携带者的基础上,又出现了100万以上人类免疫缺陷病毒(HIV)携带者。2002年末以来,重急性呼吸窘迫综合征(SARS)的出现使我国的传病控制告急,不得不重新思考微生物药物的研究策略在新的时期里,微生物药物研究再度升温,原因

①新病原微生物不断出现,如SARS、艾滋病(AIDS)疯牛病等;②生物武器的使用,如炭疽等;③各种耐菌株在世界范围的传播;④许多传染性疾病,如肺核、血吸虫病等的死灰复燃。目前国内外侧重研究的生物药物,主要有抗新病原微生物,抗耐药菌,抗病毒,抗肿瘤抗生素以及微生物来源的生理活性物质。微物药物的研究主要

包括以下内容:①抗新病原微生药物的寻找与开发;②细菌耐药机制及其抗耐药细药物研究;③微生物药物的生物合成基因研究;④组生物合成微生物药物研究。其中组合生物合成微生药物是近年发展较快的研究领域,将在创新药物研中发挥重要作用。

二、组合生物合成生物技术,尤其是基因工程技术的不断发展,为生物医药领域开辟了广阔的前景;通过基因工程技术所得到的药物也在临床治疗某些疑难疾病中发挥着越来越重要的作用。

广义,基因工程产品分为两类

①单基因直接产物。通常是指单个基因编码序列的翻译产物(蛋白质),它们一般是生物大分子如干扰素和单克隆抗体,目前生物医药领域中开发的多数产品均属于此类,其中包含有效地用于临床治疗的如重组人胰岛素、干扰素和促红细胞生成素。我国在此领域独创的药物不多,而且这类药物的一个突出缺点是它们比较容易被仿制,只要有了相应的细胞系即可利用基本设备进行生产。

②多基因间接产物。是指由多基因编码的多酶体系介导而合成的小分子化合物和多肽,包括自然界由微生物和植物产生的天然产物,如抗生素、生理活性物质或萜类化合物等结构比较复杂的化合物。它们品种繁多,性能各异,仅就目前研究得比较深入的聚酮体和萜类化合物,就包括具有抗肿瘤作用的阿霉素、紫杉醇,具有免疫抑制作用的FK506、西莫罗司,具有降血酯作用的洛伐他汀、银杏内酯,具有抗结核杆菌作用的利福霉素,抗疟药物青蒿素等。

组合生物合成(combinatorial biosynthesis)是在微生物次级代谢产物合成基因和酶学研究基础上形成的。组合生物合成的概念是结构不同但生物合成途径相似的抗生素生物合成基因之间可以进行重组、组合或互补产生新结构的化合物。尽管微生物药物的结构多样,但形成这些产物的主要生化反应机制却基本相同,它们通常是由非常简单的化学物质,如小分子羧酸和某些氨基酸作为合成起始单位和延伸单位,通过由一系列基因编码的多酶体系参与的生物化学反应(构成一个合成途径)而形成的,参与这些天然产物生物合成的多酶体系是由多个结构明显分开的功能区域所组成。研究表明,参与这类小分子生物合成的基因通常是连锁或邻接而构成一个基因簇(cluster),这为基因的克隆和操作提供了方便,同时由于参与

次级代谢生物合成酶系对底物的特异性,专一性要求不是很严格的,对结构相类似的底物均可识别,这一特点为不同基因组合产生新的化合物创造了条件。因此,有针对性地对某些基因进行操作,如替换、阻断、重组以及添加、减少组件等,均有可能改变其生物合成途径而产生新的代谢旁路(metabolic pathway),继而形成新的化合物,这就为组合生物合成提供了基础,国际上已有通过这些手段得到多个化合物的报道。

三、研究的科学意义

开展微生物基因工程组合生物合成创制新型药物研究,具有如下意义。

1、利用组合生物合成体系,完成化学方法不能完或难以完成的活性化合物的合成,如抗癌药物紫杉(taxol)等;这类活性化合物在自然界中含量少、需要大、医学价值高,而且通常化学合成困难(成本高,难大,环境污染严重),为了确保红豆杉资源的可持续用,除正在开展的苗圃栽培,并以苗圃作为紫杉醇提的原料之外,通过生物合成来使它们具最终的商业值是一个极具潜力的手段。例如,与抗癌药物紫杉醇用相似的埃波霉素(epothilone)已在链霉菌中通过合生物合成方法获得表达,现已进入开发研究阶段。、对一些现有的结构复杂的天然产物如青蒿素银杏内酯等有效组分进行定向合成,对临床用抗生品种进行有针对性的修饰和改造,如对红霉素进行造产生酮内酯型的大环内酯类抗生素,获得对临床药菌具有活性的抗生素衍生物;或者通过对现有天产物或抗生素的结构改造,获得具有全新活性的或化性能有明显改善的天然产物或新抗生素。、组合生物合成产生新化合物的潜力很大,化合数是以可操作基因的指数方式形成,如设R为可利的基因数,n是每个基因的不同等位形式(即不同天产物来源的数目),从理论上讲经过基因组合可得Rn种排列组合,即得到Rn个化合物。通过组合生合成,获得一大批新化合物,作为高通量药物筛选样库的来源之一。、由于多基因组合操作的平台是以易于大规模产的微生物体系为基础,使创制新型药物的研究便产业化。、组合生物合成的研究,必将推动我国在基因水对天然资源的利用,更好地利用植物代谢产物,挖掘前实验室条件下无法进行培养的生物体,包括海洋的生物体。随着研究和应用的发展,植物和海洋生物级代谢产物的组合生物学研究,也将蓬勃

发展起来。

四、国内外研究现状

1985年,Hopwood教授[4]在世界首次报道用遗工程的手段合成“非天然”的天然产物isochromanequinone,该工作为后来的组合生物合成奠定了础。在以后的十几年里,这一领域成为天然产物代工程研究中最活跃的领域,许多微生物次级代谢研的专家都加入这一领域的工作,因为组合生物合成潜力制造出很多先导化合物。目前的发展趋势由最初的基础研究逐步演变为基础与应用兼顾,有的地向产业化迈进。该领域的研究也同样得到工界的重视,美国加州高新技术产业公司研制的埃波素(epothilone D)已进入III期临床评价阶段。埃霉素原来由纤维堆囊黏细菌产生,其产量低,繁殖时间长,产品无法进行产业化生产。该公司利用基因组合技术使纤维堆囊黏细菌的埃波霉素生物合成基因在链霉菌中得到表达,并通过酰基转移酶域替换及羟基化酶基因的阻断,获得了主要产生埃波霉素中抗肿瘤活性最好组分的epothilone D的基因工程菌。我国自上世纪80年代初开展以多基因组合工程技术研制新药的研究,在聚酮类抗生素如大环内酯类抗生素、利福霉素、安莎霉素及抗生素产生菌分子生物学研究方面,取得一定进展。国家重大专项支持的基因工程必特螺旋霉素己进入临床研究,基因工程必特螺旋霉素的研制为组合生物合成技术应用于小分子化合物的创制中提供了良好的工作基础和经验。我国微生物代谢产品研究历史悠久,已形成多学科协调合作的体系,近年来在国家的支持下该体系已得到一定的发展,加强了微生物及代谢产物资源的开发。我们已逐步建立难培养极端微生物和未培养微生物资源及海洋微生物的挖掘工作,建立并完善从土壤或其他来源直接分离DNA技术。我国有很强的有机化学合成能力,可以合成进行组合合成的起始单元,开展前体介导的组合生物合成(precursor-directed biosynthesis)研究。我们已建立并不断完善多种生物活性筛选模型,有天然产物化学分离鉴定及药理、药效、毒理评估的配套学科。

目前基因工程技术的发展水平,在单基因操作方面已经比较成熟;在多基因操作层次上虽然技术难度相对比较大,但近年来在此研究领域已有了迅猛的发展,已积累了较好的研究基础,许多次级代谢产物生物合成基因簇已得到克隆,基因结构与功能已得到阐明,并且发展了一系列大容量载体和合适的宿主表达系统。组合生物合成已形成国际药物领域研究的热点和一个重要发展方向。

五、研究方向与前景

我国天然微生物及植物资源丰富,以微生物作为平台的药物生产历史悠久、种类繁多,利用这一宝库开展组合生物合成研究,建立新型化合物库,作为新型药物或先导化合物的重要来源之一,有重要的理论与实际意义。组合生物合成为当今世界研究热点,我国也有一定工作基础,开展这方面的研究将有利于加深对次级代谢生物合成机理的研究与应用、促进生物技术新药研制中的作用,对发展我国新药有重要意义,并推动新药研究中高通量筛选技术与方法的建立与善,筛选出有价值的新药。

我们要重点加强难培养微生物及海洋生物资源挖掘工作,建立并完善从土壤或其他来源直接分DNA技术,以丰富组合生物合成基因资源;加强微物天然化学研究,建立微量、快速、高效鉴定天然产化学结构的技术和方法;充分利用我们已经建立的种生物活性筛选模型,通过广泛地联合与协作,扩展合生物合成技术在创新药物中的应用,建立我国基工程微生物组合生物合成创制新型药物或先导化合研究的技术平台。该研究将有助于开拓和促进我国新技术在新药研究与开发中的应用,对创制具有我自主知识产权的新药将会有积极推动作用。

对本课程的意见：

1、可能是因为选课人太少的问题，上课的时候没有很好的听课气氛，不过主要

还可能是自己的原因，自己不能集中精神听讲。

2、以后只要选课的人比较多了，应该会好一些，上课的人少了，总是觉得就像

这门课不重要，老师讲的很清晰，主要是我们上课时常开小差。自从上了大学，就没太有人管了，有时听起课来就爱听不听，这倒是对每门课都差不多的。

3、课堂上可以稍微提问一下，因为提问往往可以引起同学们的注意，这样走神的情况可能会少一些。

4、课堂中还可以穿插一些与课程有关的历史、说一下那些地方比较适合做研究、考研究生去哪里比较好啊什么的，这样既可以对现在的科研大环境有所了解，课堂内容也不至于太单调。

最后谢谢老师兢兢业业地为我们把课上完，尽管上课人数少，你还是把课完整地给我们讲完，谢谢老师为我们的付出。

第五篇：生物制药技术

酶

分离纯化酶的一般程序

1粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离 3酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳）

4浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥

酶的主要纯化技术－层析技术

利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数)，使各组分以不同的比例分布在两相中，当流动相以一定的速度流经固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离的技术过程。称为层析技术（chromatography）

离子交换层析（ion exchange chromatography）

在一定的pH条件下，带电荷的蛋白质与高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团相吸附，流动相中解离的离子与被吸附的酶发生可逆的交换，而对不同吸附能力的蛋白质进行分离 离子交换剂的选择：阴离子交换剂用于处理净电荷为负的蛋白质，阳离子交换剂用于处理净电荷为正的蛋白质

样品在低离子浓度条件下上柱，逐渐增加洗脱液的离子浓度，使蛋白依次被洗脱下来 洗脱方式可以是步进式洗脱或线性梯度洗脱 洗脱液一般用 NaCl

凝胶过滤法（gel filtration）亦称分子筛层析、排阻层析，是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析分离的一种方法

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；

分离提纯 脱盐 测定高分子物质的相对分子量

疏水层析（hydrophobic chromatography）

原理：蛋白质分子中含有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等疏水性较强的氨基酸，当蛋白质溶液经过疏水层析介质的疏水配基时，蛋白的疏水性集团（疏水补丁）会与疏水配基发生亲和作用而被吸附在介质上。不同蛋白质分子中疏水基团的数量和特性有所不同。在洗脱时通过改变洗脱液的极性达到分离的目的

亲和层析（affinity chromatography）

也称功能层析、生物专一吸附或选择层析。根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的方法 酶与激活剂/抑制剂/底物/辅酶；抗原与抗体；激素/配体与受体；蛋白质与DNA/RNA上特定区域

特定的配基（激活剂/抑制剂/底物/辅酶）固定于惰性载体 目的酶与配基特异性亲和吸附，杂质被洗脱 改变洗脱条件，解除目的酶与配基的专一性结合

固定化酶（细胞）的定义

优点：

1.稳定性显著提高；

2.同一批固定化酶能重复多次地使用； 3.固定化后，很容易与反应物分开（过滤），不污 染产物，而且有利于控制生产过程，同时也省去了 热处理等使酶失活的步骤；

4.可长期使用，并可预测衰变的速度； 5.提供了研究酶动力学的良好模型。缺点：

①固定化时，酶活力往往有损失。②增加了生产的成本，初始投资大。

③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜。④非均相反应。

①注意维持酶的催化活性及专一性。在酶的固定化过程中，酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。②固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。

③固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。④酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。

⑤固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或溶剂发生化学反应。⑥固定化酶成本要低，以利于工业使用。

载体结合法

1物理吸附法2离子结合法3共价结合法 是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。1）物理吸附法 作用方式：非特异性物理吸附作用：范德华力；氢键；疏水作用；静电作用 优点：制作简单，酶分子的构象很少或基本不发生变化，固定化酶活力较高 缺点：酶与载体结合力弱，酶易从载体脱落 载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等 2)离子结合法

作用方式：离子键结合

优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较高的固定化酶。

缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应时，酶与载体易分开。载体：多糖类离子交换剂，合成高分子离子交换树脂 3)共价键结合法

作用方式：共价键结合

优点：酶分子和载体间的共价键较牢固，有良好的稳定性及重复使用性 缺点：制备过程复杂，反应条件比较剧烈，酶活性损失比较严重。

制作方法：先将载体活化，在载体上引入一个活化基团，然后该活化基团再与酶分子表面的基团（羧基/氨基/羟基）反应结合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。

交联法

利用双功能（或多功能）基团的试剂，使酶蛋白分子之间发生交联，凝集成网状结构而成为固定化酶

常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛

包埋法

1网格型2微囊型

将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。

载体：凝胶，高分子聚合物（半透膜）

优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化。

缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发生催化作用。所以用包埋法制备的酶，一般只适用与小分子底物。

包埋法分为：网格包埋法和微囊包埋法。

酶传感器（enzyme sensor）1生物传感器的概念

由生物识别物质（如酶、微生物、动植物组织、抗体等）和能量转换器相结合所构成的分析仪器，可以简便快速的测定各种特异性很强的物质 要求识别物质对被测物具有高度的敏感性和选择性

根据识别物质可分为：酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器

2、生物传感器的一般结构与工作原理 结构:有两个部分组成

生物分子识别元件（感受器）：酶、核酸、抗体、细胞等 信号转换器（换能器）：电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、表面等离子共振器件等 原理：待测物质经扩散作用进入生物传感器,通过分子识别发生特异的生物化学反应,产生的生化信号经换能器转换为可定量和可处理的电信号,进而可检测出该物质的浓度.根据反应产生的信号不同，可选择相应的换能器.抗体

多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个抗原决定簇，因此每个免疫细胞都可能产生一种针对某一抗原决定簇（antigenic determinant）的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibodies，PcAb）。

单克隆抗体：单一类型的只针对某一抗原决定簇的抗体分子，是由单一的B淋巴细胞克隆产生的结构和特异性完全相同的高纯度抗体。

抗原的制备

1.用基因工程技术制备重组蛋白抗原

2.提取纯化天然抗原

3.合成多肽半抗原

4.小分子半抗原

5.多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联

免疫

动物选择：Balb/c小鼠，品系一致

途径

体内，体外，脾内免疫

筛选阳性克隆及克隆化

克隆：由单个细胞繁殖扩增而形成性状均一的细胞集落的过程。

目的：筛选阳性克隆；确保杂交瘤细胞所分泌的抗体具有单克隆性以及从细胞群中筛选

出具有稳定表现型。

筛选阳性克隆鉴定

单克隆抗体活性检测方法：

1）酶联免疫吸附实验（ELISA）：可溶性抗原、细胞核病毒。2）放免测定（RIA）：可溶性抗原、细胞抗体。3）FAC（荧光激活细胞分选仪，流式培养仪）：针对细胞表面

抗原的抗体检测。

4）IFA（间接免疫荧光法）：用于细胞和病毒抗体的检测。

杂交瘤细胞的克隆化

（1）有限稀释技术 柏松分布（2）半固体琼脂培养法

0.5%琼脂培养基中进行克隆

1ml含不同数量的细胞悬液

1ml42度0.5%的琼脂液

单克隆抗体的大量制备

基因工程抗体（genetically engineered antibodies,gAb）

是通过基因工程技术研制的，即通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体。基因工程抗体既保持了单抗的均一性、特异性强的优点，又能克服其为鼠源性的不足，是拓展单抗广泛人体使用的重要途径。

（一）嵌合抗体（chimeric antibody）

特点：是用人抗体的C区替代鼠的C区。效果：使鼠源性单抗的免疫原性明显减弱，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学。嵌合抗体的优点：

保持了亲本鼠单抗的特异性和亲和力；

减少人源性的恒定区的HAMA现象；

能有效地介导产生补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）及免疫调理作用。缺点：

目前已有数十种嵌合抗体进入了临床试用，虽然HAMA现象较鼠单抗大为下降，但有相当比例的患者仍会出现HAMA症状，针对可变区的抗独特型抗体反应仍很明显。

（二）改型抗体（reshaped antibody，RAb）亦叫“重构抗体”，“CDR移植抗体（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR 序列。

特点：此种抗体可以使人单抗获得鼠单抗的特异性又保持人源抗体的亲和力。

动物

动物细胞分类

1、贴壁依赖性细胞 概念：anchoraged-dependent cell需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞 大多数动物细胞都属于此类。

2、非贴壁依赖性细胞

概念：anchoraged-independent cell不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞。

3、兼性贴壁细胞

概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系

转基因技术的基本原理

将体外构建的重组DNA分子(目的基因或基因组片段)通过显微注射、或转染胚胎干细胞等方法注入动物的受精卵或着床前的胚胎细胞,然后将此受精卵或胚胎再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带外源基因的转基因动物。

同源重组

双链DNA的两个区段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源区。同源的双链DNA可以通过相互交换进行重组。

外源DNA如有同源区，也可通过类似的同源重组过程整合到生物的染色体基因组上。

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多潜能细胞系，具有胚胎细胞相似的形态特征和分化特征。

新型

反义技术：根据碱基互补原理，使用与目标靶的遗传物质（DNA或mRNA）特定互补的核苷酸片段来封闭基因表达的技术方法。

反义药物：人工合成或生物合成的DNA或RNA，能与RNA互补，抑制疾病基因的表达。反义核酸（antisense nucleic acid）是一段与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点。

核酶(ribozyme)具有酶活性的RNA，可降解特异的mRNA序列。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）

由双链RNA介导的细胞内特异性mRNA降解过程，导致靶基因的表达沉默。

基因导入方式

直接体内疗法（in vivo）

是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。间接体内疗法（ex vivo）

是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。

肿瘤的基因治疗

（一）通过抑癌基因抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡。

（二）通过病毒感染杀伤肿瘤细胞

（三）通过诱导免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞

（四）肿瘤的自杀基因治疗

（五）肿瘤抗原靶向的肿瘤基因治疗

（六）细胞因子基因治疗