酵母双杂交技术研究进展

第一篇：酵母双杂交技术研究进展

酵母双杂交技术研究进展

提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统，它自建立以来经过了不断的改进与完善，不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性，而且在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。这些都将对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到促进作用。

0 引言

随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，大量关于基因结构的信息不断涌现，对这些信息进行系统研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。这不仅需要利用计算机进行生物信息学的分析和预测，而且必须结合生物学实验获取证据。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的发展趋势，已出现了很多新技术，如DNA微阵列技术（DNA micoarry）,基因表达的系列分析（SAGE）,肽质谱分析法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。酵母双杂交技术的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。酵母双杂交技术的应用现状

酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相

互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。常见问题的解决与改进

酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：

(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。

（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。

（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。

在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。

转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法。酵母双杂交技术的新发展

酵母双杂交技术在应用中发挥了巨大的作用，但人们也注意到了它有一定的局限性。为此发展了多种适应不同目的需要的改型的双杂交技术。

反向双杂交技术 在研究中检测并鉴定出那些能阻断两个蛋白间相互作用的因素有重要意义。在研究那些能使相互作用被阻断的因素(如寻找哪些结构域上发生突变可使相互作用中

断或那些分子可以阻断相互作用)时，传统的双杂交技术有较大的局限性。因此，反向双杂交系统(Reverse Two-Hybrid System)应运而生。这项技术的特点是采取了反选择筛选策略。根据反选择设计的不同，大致可以分为两类。一类是用便于反选择的URA3或CYH2基因作为报告基因。URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质，使细胞无法生长。反之，在能生长的细胞中，外界因素已使蛋白间的相互作用不能发生，而我们想知道的正是这些因素。因此，只要对存活的克隆进行检测就可以得到结果。Vidal等人用这种技术发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用必需区内的点突变。另一类是将常规报告基因(如HIS3)置于大肠杆菌转座子Tn10编码的tet-抑制因子(TetR)/操纵基因控制之下。待测蛋白之间发生相互作用后首先激活tet-R基因表达抑制因子TetR,TetR结合到tet操纵基因后就抑制了报告基因的表达，结果转化子不能生长。只有当待测蛋白之间的相互作用被某种因素所阻断而无法激活tet-R基因时，报告基因才能摆脱tet操纵基因的控制而表达，使转化子获得在选择培养基上生长的能力。Shih 等人利用这种方法鉴定出cAMP-应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位点的Ser133突变会阻断其与辅助激活因子(CREB结合蛋白)的相互作用。

三杂交技术 在许多细胞内信号传递过程中，两个蛋白间的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究这些大分子对蛋白间相互作用的影响过程中发展了一种新的技术系统——三杂交系统(Three-Hybrid System)，其本质与双杂交是相同的，只是需通过第三个分子的介导把两个杂交蛋白带到一起。例如小配体三杂交系统(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以渗透的二聚体化学诱导物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作桥梁，将AD和BD融合蛋白连接到一起，激活报道基因的表达。研究较多的是免疫抑制剂FK506。Belshaw等将FK506与环孢菌素A(Cyclosporin

A)构建成异源二聚体，它能把分别与FK506和环孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活报告基因。Licitra将FK506与地米塞松(dexamethasone)通过共价键连接成二聚体。通过实验进一步证实了FK506与蛋白FKBP-12间的特异性相互作用，表明用这种方法鉴定蛋白与小分子间的相互作用是切实可行的。RNA与蛋白之间的相互作用是许多细胞生命活动的基础，例如mRNA的翻译，早期发育以及RNA病毒的感染等。然而可用于这方面研究的简便方法却很少。RNA三杂交系统(RNA Three-Hybrid System)的建立为分析RNA与蛋白之间的相互作用提供了有效的手段。这个系统主要是由一个RNA分子和两个都能结合该RNA的蛋白质组成。此RNA的一部分与一个已知蛋白结合后就可利用它的另一部分去筛选新的RNA结合蛋白。因此这种技术既可检测由RNA介导的两个蛋白质之间的相互作用，也可筛选鉴定新的蛋白结合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突变体RevM10与Gal4 DB域融合作为诱饵蛋白，利用该RevM10蛋白能识别并结合其靶RNA中Rev蛋白反应元件(Rev responsive element,RRE)的作用去筛选同样也能与此RNA结合并已与Gal4 AD域融合的未知蛋白。根据同样的原理，如将一个已知RNA与RRE融合形成杂合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作为诱饵，便可用于筛选该RNA结合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌体衣壳蛋白能识别结合其基因组内一种21核苷酸的RNA茎环结构的特性，将RNA噬菌体衣壳蛋白与Lex DB域融合，构建成可用于寻找体内的RNA结合蛋白的酵母三杂交系统。

核外双杂交技术 在传统的酵母双杂交系统中，蛋白之间的相互作用是在细胞核内发生的。因此,它不能检测某些在核外蛋白之间的相互作用。为了克服这种局限性，近年来有人建立了核外双杂交技术。其中SRS 和USPS就是这种技术的两个代表。SRS也称Sos蛋白召集系统(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分别将待测蛋白X与哺乳动物细胞的一种鸟苷交换因子(EGF)Sos蛋白融合；将Y蛋白与锚定在酵母细胞膜上的Src肉豆寇烯化信

号蛋白融合，并使它们共表达于一个cdc25-2基因温度敏感型突变的酵母菌株内。由于该菌株中cdc25-2基因编码的EGF蛋白在36℃条件下不能激活细胞膜上的Ras蛋白，Ras途径不通。所以细胞无法在36℃条件下生存。但如果待测蛋白X与Y之间发生相互作用就能把Sos蛋白带到细胞膜上并激活附近的Ras蛋白，从而打通Ras途径，使该菌株获得在36℃条件下生存的能力。Aronheim等用此技术鉴别出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分离到了一个AP-1抑制因子JDP2。USPS也称为基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的设计是根据这样一个事实，即真核细胞中遍在蛋白与某一蛋白之间新生成的融合会被遍在蛋白特异的蛋白酶(UBPs)迅速切开，但这种切割只有当遍在蛋白正确折叠时才会发生。研究发现，遍在蛋白基因的N端和C端这两部分即使分离，只要共表达与同一个细胞内，它们仍能正确折叠。将待测蛋白X与带有点突变的遍在蛋白N端片段融合，将待测蛋白Y与下游接有报告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它们共表达与同一个细胞内。因遍在蛋白N端片段内含有点突变，它与C端片段之间不能自然形成正确的折叠。只有当蛋白X和Y之间发生相互作用时才能克服点突变的影响，使遍在蛋白的两端形成正确折叠，从而引来UBPs切除与C端片段连接的报告蛋白。此技术建立之初是通过Western blot检测有无被切下的报告蛋白来判断待测蛋白之间是否发生了相互作用的，所以操作比较繁琐，不便于推广。最近有人对它作了改进，以一种融合的转录激活因子PLV作为报告蛋白。PLV一旦被从遍在蛋白C端片段上切下，它就会进入细胞核内激活特定的报告基因，如：LacZ 和HIS3等。这样就可以根据转化细胞是否生长及显色来判断待测蛋白之间有无相互作用。因此极大地简化了操作步骤，提高了筛选效率。酵母双杂交技术发展与应用的趋势

在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图(linkage-map)。Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类(非编码序列除外)通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图。这是以往的实验所难以获得的。

为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点：

(1)来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA；

（2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡；

（3)含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。

这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。

最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。

胡文峰

2007040380106

第二篇：酵母表达系统概述及相关研究进展

酵母表达系统的研究进展和前景

(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院)

摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。

关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物

引言

酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。其中毕赤酵母（P.pastoris）是继S.cerevisiae 之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。

酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点

[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率

（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。

基因工程与酵母表达系统

即使酵母表达系统具有一些优势，但在用于生产蛋白质等药物时，还需要选择合适的载体并对宿主菌的某些代谢途径进行改造，使之利于目标产物的表达，要用于工业生产，还需根据实际情况优化培养条件，比如pH，温度，溶氧量，培养基营养，特殊添加剂等。

酿酒酵母的表达载体有自主复制型和整合型，自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘露糖，致使产物的抗原性明显增强。

毕赤酵母的表达载体多采用整合型载体，即将异源基因通过载体整合进酵母基因组中，这是由于没有适合毕赤酵母的游离型表达载体。所有巴斯德氏毕赤酵母的表达载体都是一个表达组件，它由一个启动子序列（大多是AOX1启动子），一个来自AOX1的转录终止序列用以指导3’终止过程和mRNA的多聚腺苷酸化，在它们之间有一个或多个克隆位点用以插入外源基因。这样的设计保证了产物(cap-AOX1 5′UTR-ORF-3′UTR-polyA)是一个成熟的mRNA以适应毕赤酵母的细胞体系，确保了信息的稳定性和有效性。检测表达所用的标记基因一般是HIS4（组氨醇脱氢酶基因），有时也用kan（卡那霉素抗性基因）或Sh ble.此外，有时为了防止酵母自身蛋白酶对所要表达的异源蛋白的降解，会使用蛋白酶缺陷突变型或降低发酵温度，保证目的蛋白的产量和得率。发酵过程一般分两个阶段，第一阶段是细胞以甘油为碳源生长，甘油耗尽后进入第二阶段，加入甲醇诱导AOX1启动子的转录翻译，从而使异源基因表达，生产目标蛋白。

酵母表达系统研究进展

1． 利用酿酒酵母生产青蒿素前体——青蒿酸

青蒿素（Artemisinin）是目前治疗疟疾的高效药物，这主要是由于疟原虫（Plasmodium falciparum）逐渐对其它药物产生了抗药性。现在青蒿素的产量远达不到需求量，所以Jay D.Keasling 等人通过酿酒酵母生产它的前体——artemisinic acid，成本低，环保，可作为高质[2]R

量和可靠的青蒿素来源。这个实验通过改造甲羟戊酸途径，引入两个来自青蒿（Artemisia annua）的外源酶amorphadiene synthase(ADS)和cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)使酿酒酵母获得将amorpha-4,11-diene氧化为artemisinic acid的三步途径。同时，还导入了CYP71AV1的天然氧化还原配体CPR(cytochrome P450 oxidoreductase)，在这之前，还需将法尼基焦磷酸即FPP（farnesyl pyrophosphate）的合成途径修饰，减少它用于固醇的合成，使之更多的用于合成amorphadiene。然后，利用改造的酿酒酵母EPY224生产artemisinic acid，不仅纯度较高，易于提取分离，而且不受气候影响。

2．利用毕赤巴斯德氏酵母生产人源抗菌肽——LL-37

抗菌肽是生物体抵御外源性病原体的防御反应中所产生的一类小分子多肽。许多传统的抗生素具有毒副作用且能够诱导耐药菌株的产生，发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越来越重要。抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广和作用机制独特等特点，还有研究表明，hCAP（Human cathelicidin antimicrobial peptide）是人皮肤在受伤或炎症刺激下，嗜碱性粒细胞分泌的一种防御或抗微生物的肽，在人类中只有LL-37一种。固相化学合成技术可以生产像肽这样较短的氨基酸序列，不过成本太高。Yong-Seok Kim等人[3]利用pGAPZ-E（pGAPZB载体的游离形式）将编码成熟LL-37的111bp的基因片段采用电穿孔方法转化到P.pastoris X-33中，进行细胞内表达，表达的重组LL-37通过LC-ESI-MS/MS检测确定，发现有5kDa的LL-37条带。酵母的表达出来的LL-37的粗提取物对Micrococcus luteus具有抑制活性。表达载体采用GAP强启动子，另外还进行了有a-MF外分泌信号的载体pGAPZaA，结果采用这个载体的X-33培养物中没有发现胞外分泌的LL-37.另外还利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168H进行了转化，LL-37在其中的表达水平与在X-33中的没有显著差异。这个实验说明了利用游离型表达载体在P.pastoris X-33中可以成功表达LL-37，并且具有生物活性，可以用于生产这类抗菌肽药物。

3．人源化的毕赤酵母生产糖蛋白类药物

人体内，除了抗体外的大多数糖蛋白的半衰期和治疗潜力依赖于末端的唾液酸化，这是由于一个糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖等会被体内的糖特异性受体或凝集素识别并被清除，也就失去疗效了。酵母和丝状真菌在表达这类糖蛋白方面具有一定前景。用酵母表达在人体内具有活性的糖蛋白需要进行很多基因删除或修饰，Tillman U.Gerngross等人[4]利用毕赤酵母构建出能表达重组红细胞生成素（EPO）的菌株P.pastoris YSH597。这个菌株是在以前的菌株RDP762基础上利用pSH926载体引入了5个新的外源基因构建成的，为的是使这个酵母能完成人源的末端唾液酸化。对天然酵母的改造设计到四个酵

母特异性糖酰化基因的敲除和14个异源基因的导入。利用SDS-PAGE和HPLC提纯分离的重组EPO具有与剂量相关的生物学活性。EPO是一种高度糖基化的蛋白质，利用酵母表达需要在N-乙酰葡糖胺或甘露糖等修饰后再加上人源的唾液酸化过程，才能产生有活性的EPO（已经进行动物试验）。这项研究表明利用酵母生产EPO等同类糖蛋白具有可行性，不仅能节省时间，而且节约成本，大量生产以缓解对这类医疗药物的需求。

酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白，而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。杨晓鹏等人[5]在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化，获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基础上，构建了PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI载体，通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白，并通过DSA-FACE(基于DNA 测序仪的荧光辅助糖电泳)分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基结构，发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时，毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2 哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。

4．在巴斯德氏毕赤酵母中高水平表达一种合成酶——植酸酶

植酸（Phytate）,即肌醇六磷酸（IP6），是植物种子中磷元素的主要储存形式, 普遍存在于植物性食品和饲料。人和单胃动物畜禽和鱼类等缺乏内源性植酸酶不能利用有机植酸磷。饲料中常添加无机磷酸盐以满足单胃动物的磷营养需求，随之产生了诸多问题，最主要的是植酸作为一种抗营养因子，在体内络合多种矿质元素和蛋白质等，常引起人和单胃动物各种营养不良症，而且未被利用的植酸磷被微生物降解释放无机磷易引发水体磷污染。植酸酶（Phytase）是一类特殊的正磷酸单酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，在动物营养、资源环境保护和人类健康等领域愈来愈显示出巨大的应用潜力和研究价值。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和细菌，其中微生物植酸酶因活性高、生产比较容易等诸多优点，对其研究和开发最为广泛和深入。Ai-Sheng Xiong等人利用一种担子菌隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶[6]（一种6’-植酸酶）基因，优化出适合P.pastoris的密码子的基因序列——phy-pl-sh，连接上信号肽MF4I的基因，采用含有AOX1启动子的pPIC9K载体，转化并使毕赤酵母GS115合成并分泌了植酸酶，产量为12.2g/L.控制的培养条件是：30°C，pH5.5，溶氧量30%，高密度培养。酶蛋白检测和酶活测试发现，酶的糖基化较严重，用水解酶Endo Hf在37°C下处理提纯的酶蛋白4h，得到的片段较均一，且在pH4.5下具有最大

酶活力。对基因稳定性和酶的热稳定性检测发现效果良好，此外他们还利用DNA Shuffling获得了几种热稳定的酶的候选基因，这项研究表明利用毕赤巴斯德氏酵母生产6’-植酸酶具有很大潜力，可以用于工业生产。

5．毕赤酵母表达大分子类药物

在毕赤酵母表达系统表达具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，显著地提高了SOD 保护HeLa 细胞免受氧化损伤的能力。细胞质转导肽(CTP，一种能够携带外源大分子穿过细胞膜，定位于细胞质的短肽)运输人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)跨过细胞膜进入细胞质，可以提高其生物利用度。李沛志等[7]利用P.pastoris GS115(his4-)及其整合型分泌表达质粒pPIC9K转化表达了融合蛋白CTD-SOD。首先，设计含有CTD转导肽基因序列的融合基因，连接至pPIC9K 质粒并用它转化E.coli Top10并进行菌落PCR筛选，抽提出重组质粒并电击转化巴斯德毕赤酵母，将转化成功的酵母接种到YPD 培养基中，通过加入甲醇至终浓度0.5％诱导表达。培养结束后分析发酵液中诱导蛋白的表达量，纯化后并进行对细胞的保护作用测试。本研究成功地在毕赤酵母表达系统中高效表达了具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，发酵上清中重组蛋白的含量为156.5 mg/L。纯化得到的CTP-SOD 分子量约为22.5 kDa。CTP-SOD 预处理Hela 细胞可显著地提高了邻苯三酚(Progallol)诱导氧化胁迫下HeLa 细胞的存活率，较野生型SOD 相比具有较强的保护作用。但是，CTP 和其他种类的PTD（蛋白转导域，Protein transduction domain）相比是否更有利于SOD或其他在细胞质中起作用的药物发挥功能都有待进一步深入的研究来证明，具有跨膜转导能力的新一代药物运输载体PTD 将会促进多肽、核酸等大分子药物的快速发展，为生物大分子药物的应用带来更广阔的前景。

在哺乳动物中, 三叶型家族(trefoil factorfamily, TFFs)蛋白通过增强细胞迁移，促进细胞增殖，对抗细胞凋亡等过程参与黏膜的修复并维持其完整性。Bm-TFF2, 一种从大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的两栖类三叶因子, 具有比人三叶因子更强的生物学活性。余果宇等人

[8]以Bm-TFF2 的cDNA 为模板, 利用PCR 方法扩增Bm-TFF2 基因, 然后插到含有AOX1 启动子和α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9K 中, 采用毕赤酵母表达系统进行分泌表达, 并用G418 筛选高拷贝整合转化子。SDS-PAGE 和Western blotting 都检测到Bm-TFF2 被分泌性表达于酵母上清。在1%的甲醇诱导表达不同时间后, 重组蛋白在72 h 的表达量最大, 可达50 mg/ L;而不同浓度的饱和硫酸铵沉淀菌液上清时, 80%的饱和硫酸铵沉淀量最大。这些结果表明, 重组质粒Bm-TFF2-pPIC9K 成功构建并在真核细胞中高效表达, 这为进一步研究Bm-TFF2 的生物学活性及其结构与功能关系奠定了基础。

6．毕赤酵母在表达病毒蛋白用于疫苗和诊断方面的应用

人轮状病毒的VP7 基因目前已有用大肠埃希氏菌、乳酸杆菌，植物和哺乳动物细胞等表达系统的报道，而酵母表达尚未见报道。利用巴斯德毕赤酵母表达轮状病毒的保护性抗原VP7，以制备轮状病毒基因工程疫苗，可为预防轮状病毒感染提供一条有效途径。卢颖等人

[9]将已构建的重组质粒VP7-pPICZαA 经SacⅠ线性化后，通过电转化法转入毕赤酵母GS115中，然后Zeocin平板筛选并进行PCR鉴定及Mut 表型筛选，成功构建VP7 基因的重组酵母表达系统，为进一步表达VP7 基因提供理论依据和实验基础。

为了分析真核体系中表达的乙型脑炎病毒E蛋白的生物学特性，张健等人[10]以乙脑病毒SA-14 株为代表，构建了E 蛋白基因的毕赤酵母表达系统。首先，应用RT-PCR 法扩增乙型脑炎病毒E蛋白表达基因，定向克隆入载体pPICZαA，然后将重组质粒以PmeⅠ线性化并电转化入毕赤酵母GS115 感受态细胞，最后用Zeocin筛选转化子进行鉴定。PCR 扩增产物约为1 350 bp，定向克隆获得pPICZαA-E 表达载体，经测序结果与Genbank 相应序列比较，核苷酸序列同源性为100%，电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株GS115-E，提取其基因组DNA 经PCR鉴定与预期相符。本研究构建的乙型脑炎病毒E 基因毕赤酵母表达系统为进一步进行E蛋白真核表达研究奠定了基础。

酵母表达系统表达病毒蛋白抗原还在血清学诊断方面有所进展。于天飞等人[11]在多酵母表达系统（GS115/pPIC9-TY，GS115/pPIC9K-ts（Mut+），KM71/pPIC9-ts）中表达了含有猪传染性胃肠炎病毒S 基因B 和C 抗原位点片段。经检测表明，不同类型酵母表达系统蛋白表达量和抗原性差异不大，研究中获得的重组蛋白为建立TGE血清学检测方法提供了必要的物质基础．本试验所获得蛋白为PRCV S蛋白缺失部分，以此重组蛋白作为诊断抗原建立的血清学诊断方法可望避免潜在的PRCV感染对检测TGE的干扰，得出筛选生长速度较快的GS115/pPIC9-TY适合作为今后进一步应用的候选重组菌．

总结

由于酵母表达外源蛋白，特别是药用蛋白质的种种优势，促使研究人员不断改进酵母的遗传特性和生理特性。这些突破更加提高了酵母在生产药用蛋白中的应用。在工作中对不同来源、不同作用特点外源蛋白的研究和开发应用，毕赤酵母表达体系是一个很好的选择，我们需要综合考虑这一表达体系的上述特点，对目的外源蛋白基因进行相应的改造，设计合理的构建策略，使重组外源蛋白按我们的要求进行表达，有助于获得大量有活性的表达产物。相信这一表达体系的采用和不断深入研究势必为基因工程药物的发展提供加速度。

参考文献

1．V.Renugopalakrishnan, et al.Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris.Appl

Biochem Biotechnol 2007;142:105-124.2．Dae-Kyun Ro, et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature 2006;440:940-943.3．In Pyo Hong, Sung Jae Lee, Yong Seok Kim, Shin Geon Choi.Recombinant expression of human cathelicidin(h CAP18/LL-37)in Pichia pastoris.Biotechnol Lett 2007;29:73-78.4．Tillman U.Gerngross, et al.Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins.Science 2006;313:1441-1443.5．Xiaopeng Yang, et al.Construction of yeast Pichia pastoris to produce Man5GlcNAc2 mammalian mannose-type glycoprotein.Chin J Biotech 2011;27:108-117.6．Aisheng Xiong, Quanhong Yao, et al.High level expression of a synthetic gene encoding Peniophora lycii phytase in methylotrophic yeast Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol 2006;72:1039-1047.7．李沛志，任军乐，安婷，刘堰.融合蛋白CTP-SOD 在毕赤酵母中的表达、纯化及抗氧 化能力.生物工程学报 2010;26:324-329.8．余果宇，张红芸，张勇，江萍，李文辉，张云.Bm-TFF2 在毕赤酵母中的表达及鉴定.动物学研究 2010;31:565-569.9．卢颖，佟伟，单颖，张轶博，吴囡，董颖，李华，吴学敏.人轮状病毒外衣壳糖蛋白VP7 基因毕赤酵母重组表达系统的构建.现代预防医学 2010;37:3523-3528.10．张健，李一卿.乙型脑炎病毒E 蛋白毕赤酵母表达系统的构建.天津医科大学学报 2009;15:40-43.11．于天飞，黎明，吕建伟等人.TGEV 截短S 基因片段在多酵母表达系统中的表达.高师理科学刊 2011;31:73-75.

第三篇：狂犬病病毒培养技术研究进展

狂犬病病毒培养技术的研究进展

狂犬病作为一种几乎100%致死的人兽共患传染病，对人类的危害已经存在了4000多年，至今仍无有效的治疗药物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后预防。其中暴露前免疫主要是针对动物而言，因为人的狂犬病来源于动物，只要动物的狂犬病免疫预防有效，可完全控制人狂犬病的发生；而暴露后预防主要用于人，因为人一旦被带毒动物咬伤，必须及时进行全程的暴露后预防才能防止感染狂犬病病毒。

不论是暴露前免疫，还是暴露后预防，都离不开安全、有效、廉价的疫苗。人和兽用狂犬病疫苗的发展，都依赖于病毒培养技术的不断进步，尤其是微载体、发酵技术和无血清培养基的广泛应用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一个新的水平，同时降低了生产成本，从而使高质量的细胞纯化疫苗逐渐占领市场。

无论是传统的体内培养技术，还是现在的细胞培养技术，以及新型的细胞发酵和生物反应器，目前都广泛应用于狂犬病病毒的实验室研究或疫苗生产。本文主要就狂犬病病毒培养技术的发展和新技术的应用现状综述如下。体内培养技术

体内培养技术利用了狂犬病病毒的嗜神经特性，具有敏感性好的优点，可以提高病毒检测的阳性率，而且易于操作，适用于不具备组织培养条件的实验室。其中，小鼠脑内接种是实验室最常用的狂犬病诊断和病毒培养技术之一，其他动物如大鼠、羊、兔等，过去主要用于狂犬病神经组织疫苗的生产。

禽胚胎培养技术主要是利用鸭胚和鸡胚进行狂犬病病毒培养，如鸡胚传代致弱的Flury-HEP、Flury-LEP和Kelev毒株。

1.1 脑内培养技术

小鼠脑内接种是最常用的狂犬病病毒脑内培养技术，最早用于狂犬病野毒株的分离培养是在1925年[5]。1955年，该技术开始用于疫苗生产，Fuenjalida和Palacios用新生鼠脑制备出人用组织疫苗（SMBV），该疫苗曾在南美洲使用了40多年，最终因使用后会引起严重的神经综合症而被迫停产[1]，但是小鼠脑内接种技术却一直延用至今。目前，该技术已成为病毒分离、毒力测定及中和试验等的常用方法，所用动物一般为小鼠，乳鼠对狂犬病病毒脑内接种的敏感性高于幼鼠和成年鼠[6]。小鼠中，以瑞士白化鼠（Swiss albino）为首先品种，该品种小鼠在实验室饲养容易，对狂犬病病毒高度敏感，但迄今尚未发现任何对狂犬病病毒具有遗传抗性的小鼠品系，因此也可使用其他品种的小鼠。实验室一般不采用野生灰鼠或家鼠，因为其野性较大，人工饲养困难。狂犬病脑内接种试验周期长，通常需观察21天，且成本较高，操作技术性强，鉴于此，有的实验室已改用细胞（如小鼠成神经瘤细胞和BHK细胞等）代替小鼠进行试验。

其他脑内培养技术（大鼠、羊、兔等动物的脑内培养技术）在20世纪80年代以前曾广泛应用于人狂犬病脑组织灭活疫苗的生产，如Semple、Fermi和Hempt疫苗等。但是，随着细胞疫苗的发展和神经组织疫苗的使用安全问题，该技术已不再常用。

1.2 禽胚胎培养技术7－10

鸭胚培养技术过去主要用于人用狂犬病疫苗的生产，目前在实验室使用较少。1955年，Peck等开始研制狂犬病鸭胚疫苗，该疫苗于1957年在美国上市，到1973年已成为美国主要的狂犬病疫苗，但是进入80年代后，在疫苗生产中人二倍体细胞（HDC）培养取代了鸭胚培养技术。

在狂犬病病毒适应鸡胚培养的研究发现，连续传40～50代时，获得的低胚传代株（Flury-LEP）对小鼠、大鼠和仓鼠进行脑内或肌肉接种时仍具有致病性，豚鼠脑内接种也可感染，但肌肉接种时则无致病力；家兔脑内和肌肉注射均不发病；犬肌肉接种也不发病。但是，病毒在传代176至182代时（Flury-HEP）大部分毒力会丧失，此时将病毒脑内接种成年鼠、兔、犬时，均无致病性。因此，一般高代次的Flury-HEP推荐在牛和猫中使用，Flury-LEP仅用于犬。Kelev株鸡胚疫苗系经鸡胚传代60～70次的病毒，该病毒对仓鼠、豚鼠和兔的脑内和肌肉的接种均不产生感染症状；以高浓度的病毒对犬进行肌肉接种，也不出现感染症状。Flury和Kelev株均适于在鸡胚中生长，过去一直用于犬狂犬病疫苗的生产，其中Flury株在世界范围内广泛使用。

鸭胚和鸡胚的接种基本一致，选取培养7天的健康胚，将狂犬病病毒毒液接种到卵黄囊内，鸭胚培养10～14d，鸡胚培养9～10d。

2.体外培养技术

1913年，Noguchi和Levaditi首次将组织培养技术用于狂犬病病毒的研究。1930年，Stoel将狂犬病病毒在移植于兔血浆凝块中的鸡胚脑和心脏内培养了5代，病毒感染力没有丧失。Atanasieu等利用小鼠食管膜瘤细胞系（一种非神经细胞）培养了狂犬病病毒街毒株和固定毒株，首次在细胞培养系统中报道了类似于Negri小体的胞浆内包涵体。

人用狂犬病细胞培养灭活疫苗的研究始于1964年,该项研究表明，人二倍体细胞株WI-38株可以作为狂犬病固定毒PM株的适应细胞，用于疫苗生产。1967年，Merieux研究所开始利用人二倍体体细胞进行疫苗研发。1974年，人二倍体细胞培养灭活疫苗在法国批准使用，1978年开始商业化生产。

2.1 原代细胞培养技术

前苏联以狂犬病病毒Vnukovo-32株感染原代地鼠肾细胞（PHKC），经紫外灭活后制备狂犬病疫苗，我国则以原代地鼠肾细胞（PHKC）培养狂犬病固定毒北京株，经甲醛灭活制备狂犬疫苗，主要用于暴露后治疗，其年需求量也相当大。

还有一些类似的疫苗是在原代胎牛肾细胞和犬肾细胞上培养并制备的。其中原代胎牛

肾细胞（FBKC）培养疫苗的适应毒株是巴斯德固定株PV-31，于1984年在法国批准用于暴露后治疗，1987年以后不再生产。有报道显示，FBKC疫苗有很好的耐受性和免疫原性，抗体反应类似于HDC疫苗。原代犬肾细胞疫苗的适应株是狂犬病固定毒PM株，PM株对人二倍体细胞也适应。

不同动物（小鼠、仓鼠、猪、犬和猴）源性的原代肾细胞培养物和禽类胚胎成纤维细胞对狂犬病病毒的易感性，证实了这些细胞具有用于狂犬病疫苗生产的潜力。如1960年Fennie报道了第一个用原代仓鼠肾细胞制备狂犬病疫苗，经过修饰后，结合狂犬病病毒北京株，我国已经将其用于人狂犬病疫苗的生产。Vnukovo-32株也是以类似的方式在前苏联用于狂犬病疫苗生产的。此外，人用疫苗也有以牛肾细胞、犬肾细胞和鸡胚成纤维细胞生产的，后者采用的病毒株为Flury LEP C25。

人用狂犬病原代仓鼠肾细胞成品疫苗有冻干和液体2种剂形，由原代仓鼠肾细胞培养的狂犬病病毒固定毒株经甲醛灭活后制备，是我国此前主要的人用狂犬病疫苗品种。狂犬病固定毒北京株在适应原代仓鼠肾细胞（PHKC）培养后，用于疫苗生产。该毒株是1931年从中国北京1条死于狂犬病的犬脑内分离得到的。通过在兔脑内连续传代后得到固定毒株，到1980年为止主要用于Semple神经组织疫苗的生产。

狂犬病病毒Vnukovo-32株是SAD株的衍生株，该毒株源于1935年从美国阿拉巴马州的一条犬中分离出的野毒（SAD），经鼠脑和PHKC交替传代传代35代，再在37℃下经PHKC连续传10代，达到第32代，完成该毒株在原代仓鼠肾细胞（PHKC）中的适应，即称为Vnukovo-32。适应的毒株，在32℃，PHKC上培养，以第33代～178代毒建立基础种子库和工作种子库，－60℃或冻干保存。

2.2 传代细胞培养技术

人二倍体细胞（Human diploid cell, HDC）疫苗是最早商品化的细胞培养疫苗，目前已在世界范围内得到广泛应用，并成为其他狂犬病细胞培养疫苗的参照标准。法国Marcy l´Etoile的Merieux研究所和德国Marburg的 Behring研究所研制的人二倍体细胞疫苗均以人二倍体细胞MRC-5培养，经β-丙内酯（BPL）灭活后制得。两者不同的是，Behring研究所生产的疫苗经梯度超速离心进行浓缩和纯化，而Merieux研究所系通过超滤实现疫苗的浓缩。

人用纯化鸡胚细胞疫苗(PCEC)是以原代SPF鸡胚细胞培养制备的，该疫苗为冻干品，其制备过程主要包括β-丙内酯灭活后狂犬病病毒抗原的纯化和浓缩等。

早期对组织培养的研究发现，经鸡胚细胞培养的低代狂犬病病毒Flury株(low egg passage Flury strain, Flury-LEP)更适于作为疫苗株使用。在此基础上，1973年以Flury-LEP株研制出兽用灭活疫苗。以此系统进行人用鸡胚细胞疫苗的生产，首先须将收获的狂犬病病毒经蔗糖密度梯度离心，达到浓缩、纯化的目的。改良后的抗体结合试验可以用于灭活后狂犬病病毒抗原成分的定量。20世纪80年代，建立了多种适用于纯化鸡胚细胞疫苗的实验室检

测方法，并开始了在人的临床试验。

恒河猴胎猴肺二倍体细胞（FRhMDC）疫苗是由美国的公共卫生部的密歇根州生物制品研究所在20世纪70年代开发的。1979年开始在志愿者中进行临床试验，1988由美国食品与药物管理局（FDA）批准用于暴露前后狂犬病防治。

人用狂犬病犬肾细胞疫苗是利用犬肾细胞在微载体上培养的。疫苗的冻干品包括经ß-丙内酯灭活的狂犬病病毒固定毒株和用以吸附病毒的磷酸铝佐剂。

建立了敏感的细胞系和细胞株以后，可以系统研究狂犬病病毒及病毒与宿主细胞的相互作用。迄今已有很多传代细胞系用于动物狂犬病疫苗的制备，如BHK-

21、仓鼠肾成纤维细胞（Nil-2）和鸡胚相关细胞（CER）。但由于某些细胞系的异源特性和潜在致瘤性，目前只有猴肾细胞Vero用于人狂犬病疫苗的制备。

人二倍体细胞（WI-38）在1964年首次报道用于人狂犬病疫苗生产，此后，其他二倍体细胞如人胚肺细胞（HEL）、人肺细胞（MRC-5）和恒河猴二倍体细胞系也用于人狂犬病疫苗生产。

除了上面提到的细胞以外，狂犬病病毒还可在胚胎鸡肌管、鼠的巨噬细胞、大鼠感觉神经系统、大鼠垂体肿瘤细胞、黑山羊和豚鼠肾细胞、胎儿蝙蝠细胞、人滑液（McCoy）细胞、日本鹌鹑胚胎细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中复制。病毒接种昆虫细胞也能检测到病毒特异性抗原，但其水平明显低于其他细胞。

人和小鼠源的成神经细胞瘤细胞已广泛用于狂犬病病毒研究，尤其是鼠成神经细胞瘤细胞（NA-C1300，为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷细胞株），显微镜下观察，该细胞与人的神经元大致相同，细微结构都有神经元样形态，在微管蛋白、神经递质合成酶和可兴奋细胞膜上也有很多共同特征。

狂犬病病毒固定毒株HEP Flury和LEP Flury可以在原代鸡胚细胞中培养，经β-丙内酯（BPL）灭活后制备疫苗。20世纪60年代，Kondo等研制出了纯化的鸡胚细胞培养疫苗（PCEC），1980年批准使用。此后，很多国家引入了纯化鸡胚细胞培养疫苗用于暴露后治疗，特别是一些东南亚国家。德国Behring研究所也研制了一种类似的疫苗。一项935名受试者接种4247剂纯化鸡胚细胞疫苗的临床试验表明，与人二倍体细胞苗相比，纯化鸡胚细胞培养疫苗可诱导产生更高的抗体滴度。在欧洲，印度次大陆以及东南亚地区（泰国）均有大量此种疫苗生产并应用于暴露后治疗。

接种病毒的组织培养细胞可用常规的单层或旋转培养法培养，悬浮培养也已成功。培养液的最适pH为7.4～7.6，适宜温度范围为30～40℃，但低温培养(32℃)尤为适宜。

3.细胞发酵和生物反应器技术

前一节介绍了狂犬病人二倍体细胞培养疫苗(HDC)的制备。尽管人用二倍体细胞疫苗安全性良好、免疫原性也高，但人二倍体细胞培养的病毒滴度相对较低，必有经过浓缩才能获

满足质量要求的疫苗，致使本疫苗的大规模生产受到了限制。脊髓灰质炎灭活疫苗是最早使用人二倍体细胞生产的疫苗，因为产毒滴度不高，WHO生物标准化专家委员会为此还对该疫苗的质量标准进行了修正。

微载体细胞培养技术（由Van Wezel发明）的出现，使细胞得以大规模培养并应用到人用疫苗的制备中。随着脊髓灰质炎病毒Vero细胞灭活疫苗的成功研制，人们开始转向以Vero细胞培养狂犬病病毒并制备灭活疫苗。因为该疫苗要求有纯化过程，以除去残留的细胞DNA成分，因此该疫苗称为狂犬病Vero细胞纯化疫苗（purified Vero cell rabies vaccine, PVRV）。

考虑到HDC的生产成本，开发商们开始寻找适应狂犬病病毒增殖的新的细胞系、细胞培养体系、病毒株和相关的生产技术，希望能够在保持疫苗高效力的同时，降低生产成本。最早用于狂犬病疫苗生产的传代细胞系是用微载体系统进行培养的Vero细胞，是来源于非洲绿猴的肾细胞系。

1984年11月，WHO和RF合作，采用微载体技术高密度灌流Vero细胞，工业化生产狂犬病疫苗，历时15年，取得成功。目前，Vero细胞疫苗已经在世界上许多国家取得了安全有效的使用经验。

参考文献：

[1] Meslin FX ,Kaplan MM ,Koprowski H.Laboratory techniques in rabies[M].Fourth edition ,WHO,Geneva ,1996.80-87.Woldehiwet Z, 2005.Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus.Clin Chim Acta, 351(1-2): 49-63

[5] Webster LT，Dawson JR.Early diagnosis of rabies by mouse inoculation: measurement of host immunity to rabies by mouse protection test．Proc Soc ExP BioI Med.1935, 32: 570-573.[6] WHO Expert Committee on Rabies.VIII Report 1992;Technological Report Series 824, WHO.Geneva．

[7] Dietzschold B, Wiktor TJ, Wunner WH, et al.1983.Virology, 124: 330-337

[8] Gluck R, Matthieu JM, Wegmann A, et al.1986.Absence of myelin basic protein in an improved purified duck-embryo rabies vaccine.Neurochem Pathol, 4: 69-75

[9] Gluck R, Wegmann A, Germanier R, et al.1984.A new highly immunogenic duck-embryo rabies vaccine.Lancet, 1: 844-845

[10] Koprowski H, Cox HR.1948.Studies on chick-embryo-adapted rabies virus;culture characteristics and pathogenicity.Journal of Immunology, 60: 533-544

[11]

第四篇：辅助生殖技术的研究进展

辅助生殖技术的研究进展

摘要：辅助生殖技术(assisted reproductive technologies，ART)是为生殖功能障碍的夫妇提供的各种非自然辅助他们生殖的技术。试管婴儿就是使用该技术的体外受精———胚胎移植方法生育的婴儿。本文就对目前常用的辅助生殖技术人工授精、体外受精与胚胎移植(IVF．ET)、卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）、植入前遗传学诊断(PGD)、赠卵IVF-ET和精子的保存等方法的发展来综述辅助生殖技术的研究进展。

据世界卫生组织（WHO）评估，每7对夫妇中约有1对夫妇存在生殖障碍。我国近期调查，国内不孕症者占已婚夫妇人数的10%，比1984年调查的4.8%增加一倍多，发病率呈上升趋势。我国更受传宗接代观念影响，多数家庭盼子心切，使不育夫妇承受着极大的心理压力，甚至引发离异、婚外恋之类家庭乃至社会的问题。ART的直接效应是使不育夫妇实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题自然会随之得到解决。临床统计，不育患者中约20%的夫妇，不借助ART就根本无法生儿育女。

生殖的中心环节是受精，因此受精方法的研究和进步是辅助生殖技术发展的一条主线。人工授精是用非性交方法，将精子置入女性生殖道内，使精子和卵子在体内结合、受精、妊娠的方法。人工授精具有悠久的历史，是最早应用的助孕技术。公元二世纪Talmud已提出人工授精的可能性，1761年，Spallanzi成功地为母马人工授精，1790年．John Hunter为严重尿道下裂患者的妻子行配偶间人工授精(artificial insemination withhusband’s sperm，AIH)获得成功，1844年William Pancoast首次施行非配偶间人工授精(arti．ficial insemination bv donor，AID)获得成功，1954．年Bunge首次成功地用冷冻精子作AID获得成功，1986年Forrler报告腹腔人工授精(direct in．traperitoneal insemination，DIPI)获得成功。

人工授精只是在体内的精子、卵子结合受精，临床应用有它的局限性，而且难以对受精的过程进行人为的影响。体外受精方法的成功才使得辅助生殖技术根本性地进步和发展。

对哺乳动物体外受精与胚胎移植研究，为人类体外受精与胚胎移植的成功打下了良好的基础。华裔生物学家张明觉在1945年开始做家兔体外受精试验[4]，1950年提出了精子获能问题，Austin在20世纪50年代初发展完善了精子获能的理论，这一理论为体外受精试验成功起到了促进作用。1959年张明觉的家兔体外受精试验成功，并把受精卵移植到别的家兔的输卵管，借腹怀孕，最后生出正常的幼兔。为人类IVF-ET的建立奠定了基础。

英国的生物学家Edwards和妇产科大夫Steptoe共同合作，从20世纪60年代开始就做人类的体外受精研究，1969年他们已经能在体外完成人工受精和培养，在1977年成功地把体外受精的胚胎移植回因为输卵管堵塞不孕的Lesley子宫内，并继续正常发育到足月，终于在1978年7月25日第一个通过体外受精．胚胎移植方法孕育的婴儿louiseBrown诞生。至此人类IVF-ET技术正式建立

IVF-ET技术的AIH治疗性交障碍;精子在女性生殖道内运行障碍;少、弱症。AID治疗无精症;男方有遗传疾病;夫妻间特殊性血型或免疫不相容。实施AID治疗时，供精者须选择身体健康，智力发育好，无遗传病家族史的青壮年。还须排除染色体变异、乙肝、丙肝、淋病、梅毒，尤其是艾滋病（HIV）。血型要与受者丈夫相同。供精精子应冷冻6个月，复查HIV阴性方可使用。因HIV的感染有6个月左右的潜伏期，此时诊断不易确定，所以供精精子一般应从精子库获取[3]。按自然周期取卵，将取到的卵泡液注入培养皿，肉眼快速辨认含卵细胞及其外周的透明带、放射冠的卵冠丘复合物。在解剖镜下确认有卵细胞存在后，置入CO 2 培养箱培养4～8h，再根据复合物的形态变化判断选择成熟卵细胞，按每卵配10～20万个精子的比例，投入经过洗涤优选已诱导获能的精子，授精后16～18h观察情况，将受精卵移入培养试管/皿内培养。于取卵后48h，胚胎发育成2～8个细胞阶段或在取卵后72h胚胎发育至8～16个细胞时植入子宫。后者较符合自然受精胚胎进入子宫的时间，且在传统体外培养条件下，只有最健康的胚胎才能活到3天，故移植成功率高。有报道，应用共培养术，可使胚胎培养至囊胚期再移植，妊娠率高达50%。一次移植的胚胎数以2～3枚为宜。因为增加胚胎移植数，妊娠率虽呈不按比例的增加，但多胎率也会随之增加，经对几组移植1～6胎资料的比较，其中以移植3个胚胎的妊娠率相对较高，而多胎率相对较低，最后妊娠。

Iouise Brown被人们称为试管婴儿，试管婴儿的诞生被认为是继心脏移植成功后20世纪医学发展的又一伟大奇迹。随之到来的是全球在发达国家及部分发展中国家的研究试管婴儿热潮，研究人员把这一方法进行了推广、改进和发展。

1984年Asch建立了配子输卵管移植方法(GIFT)，1986年Ranoux建立了体外受精．阴道培养方法。人们并没有对这些成就所满足，继续更进一步地深入研究，又开辟了显微镜下授精助孕的研究.1988年Gordongn和Talansky首次报道利用生化方法在透明带打孑L使精子进入卵膜受精，后来Cohen在显微镜下采用部分透明带切除(partial zona dissection，PZD)方法解决有些病人精子无法受精的问题。AlanTrounson和Jaeques。Testart两个实验室最先开展PZD，s．CNg进行了透明带下授精(Sulzonal insemination，SUZI)取得了成功。

1992年比利时人Palerl'no在进行ZUZI时不小心把一个精子注入了卵浆内，后来受精了，卵裂正常，他们因此得到了启发，建立了卵浆内单精子注射(intracytoplasmic spermection，ICSI)方法，这一方法是辅助生殖技术的又一重大的进展，特别是在男性不育治疗上更是一个突破性进展，目前在助孕技术中占有突出地位，国外主要的生殖中心ICSI与常规IVF比例大约为1：2或2：3，甚至有更高的比例[7]。

该技术又称第二代试管婴儿，其操作方法是，不用进行精子的诱导获能处理，只须选择一个形态正常，缓慢运动的精子先予以制动。方法用注射针挤压精子尾部，稍微擦破细胞质膜，诱导精子从擦破点释放精子细胞质体因子激活卵细胞，卵细胞的激活对ICSI的正常受精至关重要，接着按尾先头后的顺序吸精子放入注射针，再通过显微操作，将精子注入卵胞浆内，即完成受精。其他技术环节同于常规IVF-ET。对精道不通的患者可进行附睾穿刺，如吸出物中无精子，则从睾丸取活组织分离精子，或取精细胞激活后使用。适应证为:严重少、弱畸精症、输精管阻塞、先天性双侧输精管缺如以及输精管结扎后子女伤亡，吻合输精管失败或无法吻合者。

尽管临床上对很大部分病人不育的原因仍难以确切了解，用ICSI治疗效果仍很好。经过近十年的临床应用及研究发现，在IvF治疗中，体外受精率低下及受精失败大部分与精子功能方面缺陷有关，常见的是精子形态、活动力不好、精子与透明带不结合或精子不能穿透等。生精功能低下或障碍的男性不育症，用常规IvF没有较好的治疗效果，由于这些方面的原因促进了ICSI的发展。因而ICSI可以说是转为解决上述男性不育症而发明的治疗方法。：ICSI的发明不仅解决了男性不育治疗难的问题，也为整个临床生育辅助疗法开拓了新的一页。

受精发生是由精子和卵子相互作用自然发生的，ICSI则完全不需要精子有完全正常的功能，男性精子数量的要求也大大降低，从睾丸或附睾内通过手术取得的极少量的精子，甚至单个精子由技术人员挑选后直接注入卵子里也可受精。由于ICSI是人工方法直接刺穿卵细胞膜注入精子授精，因此在注射精子到卵子时有可能把外来的基因物质，如细菌、病毒等同时带入受精卵。对ICSI可能存在的问题目前已引起部分学者的注意。

随着分子生物学的发展，近年来，在人工助孕与显微操作的基础上，胚胎着床前遗传病诊断（PGD）开始发展并用于临床，使不孕不育夫妇不仅能喜得贵子，而且能优生优育。

此法也称第三代试管婴儿，指在IVF-ET的胚胎移植前，取胚胎的遗传物质进行分析，诊断是否有异常，筛选健康胚胎移植，防止遗传病传递的方法人类基因组计划研究的进展、DNA诊断分析技术以及其他技术的不断发展促进了PGD技术迅猛发展。PGD婴儿与ICSI的婴儿相比，新生儿问题或畸形发生率都不高。与常规ICSI分娩的1987个婴儿的情况非常相似，PGD分娩的162个婴儿中单胎占54%、双胎41%、三胎5%。其他指标，如出生体重、身长、头围两组也很相似，主要的异常发生率(2.3%)亦与ICSI组2.9%非常接近。

Trounson等人于1983年报道了利用赠卵IVF-ET技术首例妊娠成功的例子。与常规IVF-ET相比，技术上供卵IVF-ET要增加两个重要环节，（1）须将受者和供者的月经周期调整同步。方法是，对无卵巢功能的患者，于供者预计月经来潮前3～5天先进行类固醇激素替代治疗（HRT），促进患者子宫内膜产生周期变化，具备接受胚胎着床能力，并诱导内源性LH峰和子宫内膜雌激素受体的产生、改善机体内分泌环境。对有卵巢功能的患者，先用促性腺激素释放激素类似物或增强剂GnRH-A降调节后再用HRT治疗。在HRT治疗周期中，须进行血清激素测定、子宫内膜活检、B超多普勒监测、了解子宫内膜容受性 ［10］，以调整给药量，使子宫内膜具有良好容受性。（2）维持妊娠。赠卵与患者丈夫的精子进行体外授精发育和胚胎移植后患者后，须渐增HRT给药。以维持妊娠，直至受者自身胎盘功能建立为止。赠卵IVF-ET妊娠率较高，有的资料报道达44.9% 人类在针对男性不育的辅助生殖技术上取得的另一大进步是精子的保存技术。

1962年Sherman发明了液氮蒸气法(1iquid nitrogen vapor)冷冻精子，该方法简化了降温冷冻方法，提高了冻贮的效果。1964年Sherman报道在甘油的保护剂中再加入卵黄冻贮的精子有更高的怀孕率。1974年Sherman用冻贮了123个月的精子作人工授精诞生出健康的婴儿，这证明了长期冻贮精子的可能性，建立人类精子库在技术上已经比较成熟。

无法生育夫妇渴望生育，当有条件生育后，就希望能生育一个健康聪明的后代，在优生优育方面从受精前采取措施是一种很好的途径和发展方向，因此辅助生殖技术进一步发展，会在优生优育方面给以更多的关注。一方面是研究各种辅助生殖技术在优生优育方面能有所作为，另一方面是研究对各种辅助生殖技术对优生优育的影响。也就是说辅助生殖技术不仅仅是为患者助孕，还可对有生育能力的夫妇为了生育一个健康的后代而采用辅助生殖技术，目前在这方面已经开展工作。国内首例运用植入前遗传诊断技术(PGD)的试管婴儿于2000年4月23日在广州中山医科大学诞生，该例的母亲为血友病携带者，运用PGD技术从7个受精发育的胚胎中选择了两个健康的胚胎植入，最后她终于生出一个健康的婴儿。人类对于辅助生殖技术的研究正在紧张的进行中

参考文献：

[1]罗丽兰.不孕与不育.北京:人民卫生出版社,1998.217-227.[2]张以文 周灿权 等.生殖调控研究及辅助生育技术的进展与方向.中华妇产科杂志

[3]杨青梅.辅助生育技术进展.青海医药杂志,2003,33(2):60-62.[4]吕军 唐智柳 等.我国人类辅助生殖技术评估概述.中华医院管理杂志,2002,18(10):577-579.[5]方洁 叶盛.辅助生育技术发展对社会伦理的影响.中国医学伦理学,2003,16(1):26-27.[6]叶蓉华 张丽珠.体外受精—胚胎移植后妊娠妇女的产科结局.中华妇产科杂志,:.[7]王磊光 胥玉梅.应用试管婴儿技术引起的多胎妊娠的危害及预防措施[J].中国妇幼保健,:.[8]陈元方 邱仁宗.生物医学研究伦理学.北京:中国协和医科大学出版社,2003.180.[9]寇金矛.辅助生殖技术安全吗.国外科技动态,2003,408(7):24-26.

第五篇：人工湿地污水处理技术研究进展

人工湿地污水处理技术研究进展

［摘要］文章对人工湿地污水处理技术国内外研究现状进行了概述，阐述了人工湿地污水处

理技术主要研究内容及进展，包括人工湿地对污染物的去除机理、去除效率研究，影响人工湿地处理效率的因素研究。根据人工湿地在污水处理中的研究和应用现状，指出了今后的研究 方向。

［关键词］人工湿地；污水处理；研究进展

［中图分类号］X52 ［文献标识码］C ［文章编号］1002－0624（2011）06－0052－03 湿地是地球上水陆生态系统中独特的、重要的生物生存环境和最富生物多样性的自然生态景观之一。它在抵御洪水、调节径流、改善气候、控制污染、美化环境和维护区域生态平衡等方面具有非常重要的作用，被誉为“自然之肾”。国内外研究现状概述

1953 年，德国Max Planck 研究所的Dr.Kathe Seidel 博士在研究中发现芦苇能够去除污水中大量的有机和无机物质，随后开发出Max—Planck Institute Process 系统。1977 年由 Kickuth 提出了“根区法”(采用栽种芦苇的水平潜流湿地使有机物降解，硝化反硝化去除N，沉淀去除P)，标志着人工湿地污水处理机理的初步萌芽。与此同时，美国的国家空间技术实验室研究开发了“厌氧微生物和芦苇处理污水”复合系统。此后，人工湿地处理污水技术不断完善，并于20 世纪80，90 年代在欧洲、美国、加拿大、日本等地得到了广泛的应用。

按照工程设计和水体流态的差异，人工湿地污水处理系统可以分为表面流湿地、水平潜流湿地和垂直流湿地3 种主要类型，各类型在运行、控制等方面的诸多特征存在着一定的差异。其中，表面流湿地不需要砂砾等物质作填料，造价较低，但水力负荷较低，该类型在美国、加拿大、新西兰、瑞典等国有较多分布。水平潜流湿地的保湿性较好，对有机物和重金属等去除效果好，受季节影响小，目前在欧洲、日本应用较多。垂直流湿地综合了前两者的特点，但其建造要求较高，至今尚未广泛使用。早期的人工湿地主要用于处理城市生活污水或二级污水处理厂出水，目前已被国内外许多学者或工程技术人员，经过工艺改进或者与其他系统进行组合后用于农业面源污染、城市或公路径流等非点源污染的治理[2]。此外，最近发达国家已经将重点转移到利用人工湿地处理特殊工业废水方面。将人工湿地用于处理特殊工业废水，这是人工湿地未来发展的一个新特点和趋向[3]。

我国进行湿地处理系统研究较晚，在“七五”期间才开始了人工湿地研究工作，仍处于起步阶段。目前人工湿地的研究和应用正方兴未艾。继天津市环保所建成的我国第一个芦苇湿地工程之后，1989 年于北京昌平区、1990 年于深圳白泥坑等地建成了湿地处理系统示范工程，效果良好（BOD去除率90%，COD去除率80.47%，SS去除率93%）[4]。1990 年，国家环保局华南环保所与深圳东深供水局建立了人工湿地示范工程，处理规模为3 100m3/d，其出水达到了二级处

理水平。1999 年，漳州市天宝造纸厂因地制宜，利用荒废的低洼地建造小型水葫芦—水草人工湿地，进行厂外废水治理，处理后出水灌溉香蕉园，实现了废水不外排，具有农业生态特征的废水治理模式，为我国乡镇造纸企业废水治理提供了有益的参考。2002 年，日处理污水50 000 m3 的人工湿地污水处理厂在江苏泅洪县竣工,深圳市、沈阳市、上海市也在开展积极的设计、规划工作。研究内容

2.1 人工湿地污染物的去除机理

人工湿地污染物的去除机理研究仍处于起步阶段，人工湿地污水处理普遍认同的机理是硝化反硝化去除N，沉淀去除P 的概括性描述，进一步研究难度很大，因为涉及到生物、物理、化学等多个学科，而且难以从微观角度定量化。

去除机理主要包括微生物、植物、土壤对污染物的去除机理。人工湿地有机物降解的基础机制是微生物的硝化和反硝化活动，丰富的微生物资源为湿地污水处理系统提供了足够的分解者。湿地植物对氮的去除主要通过以下途径：氨的挥发作用、NH4+的阳离子交换作用、吸收、硝化和反硝化作用等。湿地植物对磷化物的处理除作为营养成分吸收外，还可以通过在苗床基质中的吸附、络合和沉淀反应来去除。湿地土壤对有毒物质的“净化”机理，主要是通过沉淀作用、吸附与吸收作用、离子交换作用、氧化还原作用和代谢分解作用等途径实现的。

2.2 人工湿地处理污水的效率

1）对有机物的去除效率。综合国内外有关学者对人工湿地净化城市污水的研究数据，在进水浓度较低的情况下，人工湿地对BOD5 的去除率可达85%～95%，对COD 的去除率可达80%，处理出水BOD5 的浓度在10 mg/L 左右，SS 小于20mg/L[5]。

2）对氮的去除效率。废水中的氮以无机氮和有机氮两种形式存在，无机氮可以被人工湿地中的植物吸收，合成植物蛋白质，植物的收割对湿地系统除氮有直接贡献，但这一部分氮仅占总氮量的8%～16%。微生物的硝化和反硝化作用在氮的去除中起着重要作用。目前人工湿地系统TN 去除率不高的主要原因是硝化-反硝化途径不畅通，提高氮的去除率最重要的是提高湿地系统中的硝化作用强度。还有研究发现，人为提高湿地中BOD与NO3-N 之比（如添加秸秆或甲醇），氮的去除率会大幅度提高，能从30%左右上升至80%～90%，原因是BOD∶NO3-N 的比值太低时不利于反硝化作用的进行，当比值上升到2.3 时，反硝化率达到最大值。

3)对磷的去除效率。在人工湿地中磷主要是通过基质的吸附、络合及与Ca，Al，Fe 和土壤颗粒的沉淀反应及泥炭累积，植物的吸收，微生物去除等作用而去除。据资料显示，人工湿地对各种类型污水中的TP 的去除率为47.0%～97.2%[6]。

2.3 影响人工湿地处理效率的因素

1）人工湿地的类型。人工湿地的类型不同对不同污染物的去除效率也有差异。水平潜流湿地对BOD，COD 等有机物和重金属的去除效果较好，垂直流湿地对氮、磷的去除效果较好，表面流型湿地的处理效果一般。但如果将表面流型与潜流型、表面流型与垂直流型结合起来的复合湿地，去污效率会进一步提高[7]。

2）湿地植物种类。一般来说，植物的生物量较大、根系比较发达、根系的输氧能力比较强的话，其净化能力就比较强[7]。其次，不同的植物对污染物的去除速率也不相同，日本学者对不同的植物去除氮和磷的速率进行了研究。

3）基质类型。一般来说，含有机质丰富的基质有助于吸附各种污染物；土壤基质的去污能力不如砾石基质[3]；含CaCO3较多的石灰石基质可以有效地去除磷，沸石-石灰石组合的基质可以有效地去除TN，TP [6]；煤渣-草炭基质对磷具有较强的吸附能力，在不种植湿地植物的情况下对TP 的去除率可达到77.6%～85.0%，可以作为垂直流人工湿地系统的特殊基质；花岗岩-粘性土壤基质能高效地去除污水中的磷，对TP 的去除能力可达90%[5]。

4）湿地中微生物种类和数量。废水中各类污染物的去除与湿地系统中生长的微生物种类和数量有关，相关系数的大小可以反映某一类微生物对某一类污染物的去除能力。不同微生物与BOD和COD 的去除率之间均有明显的相关性，说明人工湿地微生物系统对BOD 和COD 去除率的贡献；废水中NH4-N 的去除与硝化细菌和反硝化细菌都有明显的相关性，说明硝化和反硝化作用是人工湿地系统去除氮的主要方式；废水中磷的去除与湿地中的各类微生物均不具有明显的相关性，这说明微生物不是人工湿地系统中去除的磷主要因素；废水中总大肠杆菌的去除与放线菌和原生动物的数量有明显的相关性，这说明人工湿地系统中的放线菌和原生动物是去除大肠杆菌的主要作用者[6]。

5）环境因子的影响与管理措施。温度、水力停留时间、水力负荷、湿地的运行管理等均会对人工湿地的去污效果产生影响。水温在20～25 ℃时生物去污的效果最好，低于10 ℃时，处理效果会明显下降。因此，夏天的处理效果会好于冬天[9]。有研究表明，细菌的反硝化作用受温度影响，在10～30℃范围内，高温有利于反硝化。但温度高于30 ℃，则会对硝化反硝化过程产生抑制作用[7]。也有研究发现，当湿地运作一段时间（如3 年）后，去污效果基本不再受环境因子（如温度、污水流量等）影响。人工湿地污水处理技术研究展望

1）进一步加强人工湿地处理污水机理的研究。人工湿地处理污水的机理非常复杂，设计的范围也很广。目前，虽然有些机理研究已经得到初步的认可，但仍然存在很多问题需要进一步研究，如污水中的有机污染物、无机污染物、金属污染物的去除过程与机理；根际微生态系统的综合作用；有机物、无机化合物和金属离子在湿地系统内的相互作用及其对植物、微生物和土壤的影响等[9]。

2）人工湿地处理农村污水示范研究。人工湿地在解决我国农业面源污染和农村生活污水方面具有独特的优势，应加大人工湿地处理农村污水示范研究，探讨适合我国国情的农村污水处理方式，并通过集成示范，查找技术中存在的问题，为进一步大范围推广打下良好的基础，3）湿地系统优化运用研究。①加强湿地植物的筛选工作，选择一些耐污能力强，去污效果好的湿地植物，同时加强多种植物的合理搭配的研究。

②重点研究在提高人工湿地氧化硝化能力的同时如何提高其反硝化能力，解决硝态氮的高效去除问题。③填料的类型直接影响湿地系统的净化能力，尤其是对磷的去除。加强填料的筛选

和如何防止填料堵塞，是今后应该优先考虑的工作。结语

人工湿地系统是一个完整的人造生态系统，它形成了良好的生态循环，不仅具有较好的污水净化效果，而且具有较好的生态和经济效益。目前发达国家已用人工湿地处理各种类型的废水，发展中国家发展也应大力发展人工湿地技术，在我国该项技术将会得到越来越广的应用。

［参考文献］

［1］Hammer D A.Construsted wetlands for wastewater treatment ［M］.Michigan:Lewis Publishers inc.1989，05.［2］Li S R，Ding T，Wang S.Reed beds treatment form unicipalan dindustrial wastewater in Beijing［J］.Journal Institution Water Environ Manage，1995，9（6）：581-588.［3］Davies T H，Cottingham P D,Bavor H J，Mitchell D S.The use of constructed wetlands for treating industrial effluent［J］.Water Science and Technology，1994，29（4）：227-232.［4］GreenMB，Martin J R.Constructed reed beds clean up storm over flows on small waste water treatment works［J］.Water environed.1996，68（6）：1054-1060.［5］姜翠玲，崔广柏.湿地对农业非点源污染的去除效应［J］.农业环境保护，2004，21

（5）：471-473.［6］Batty LC，Atkin L，ManningDA.Assessment of the ecological potential of mine-water treatment wetlands using a baseline survey of macroinvertebrate communities［J］.Environmental Pollution，2005，138：412-419.［7］白晓慧，王宝贞，余敏.等.人工湿地污水处理技术及其发展利用［J］.哈尔滨建筑大学学报，1999，32（6）：88-92.［8］彭超英，朱国洪，尹国.等.人工湿地处理污水的研究［J］.重庆环境科学，2000，22（6）：43-45.［9］徐丽花，周琪.不同填料人工湿地处理系统的净化能力研究［J］.上海环境科学，2002，21（10）：603-605.