酵母转化问题参考

第一篇：酵母转化问题参考

Ways to Destroy Your Yeast Transformation

by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture

Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E.coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip.Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid…

1.Forgetting to add single stranded DNA

While E.coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment.If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation.2.Using old PEG

PEG(polyethylene glycol)is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer.Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly.The percentage of PEG will make or break the success of your transformation;an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off.If you can stand it, make new PEG for every transformation.Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation.3.Using cells in stationary phase

Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency.This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed – only that your successful transformation rate will be much lower.Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation.4.Using the wrong selective marker

A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit.Double check to save yourself some tears!

5.Cutting corners when heat-shocking

This is a major difference between E.coliand yeast transformations: while E.coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock.Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes.I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced.If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minutes, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.

第二篇：关于酵母类产品是否上税问题

根据相关法律来分析，酵母细胞壁多糖和酵母自溶物无论是以原料还是添加剂形式，都应该要交税，只有简单处理的饲用酵母可以享受税收优惠政策，税率会低一些，税率为13%，正常位17%。

（以下是各法律文件）

关于饲料产品免征增值税问题的通知

根据国务院关于部分饲料产品继续免征增值税的批示，现将免税饲料产品范围及国内环节饲料免征增值税的管理办法明确如下：

一、免税饲料产品范围包括：

（一）单一大宗饲料。指以一种动物、植物、微生物或矿物质为来源的产品或其副产品。其范围仅限于糠麸、酒糟、鱼粉、草饲料、饲料级磷酸氢钙及除豆粕以外的菜子粕、棉子粕、向日葵粕、花生粕等粕类产品。

（二）混合饲料。指由两种以上单一大宗饲料、粮食、粮食副产品及饲料添加剂按照一定比例配置，其中单一大宗饲料、粮食及粮食副产品的参兑比例不低于95%的饲料。

（三）配合饲料。指根据不同的饲养对象，饲养对象的不同生长发育阶段的营养需要，将多种饲料原料按饲料配方经工业生产后，形成的能满足饲养动物全部营养需要（除水分外）的饲料。

（四）复合预混料。指能够按照国家有关饲料产品的标准要求量，全面提供动物饲养相应阶段所需微量元素（4种或以上）、维生素（8种或以上），由微量元素、维生素、氨基酸和非营养性添加剂中任何两类或两类以上的组分与载体或稀释剂按一定比例配置的均匀混合物。

（五）浓缩饲料。指由蛋白质、复合预混料及矿物质等按一定比例配制的均匀混合物。

二、原有的饲料生产企业及新办的饲料生产企业，应凭省级税务机关认可的饲料质量检测机构出具的饲料产品合格证明，向所在地主管税务机关提出免税申请，经省级国家税务局审核批准后，由企业所在地主管税务机关办理免征增值税手续。饲料生产企业饲料产品需检测品种由省级税务机关根据本地区的具体情况确定。

三、本通知自2001年8月1日起执行。2001年8月1日前免税饲料范围及豆粕的征税问题，仍按照《国家税务总局关于修订“饲料”注释及加强饲料征免增值税管理问题的通知》（国税发[1999]39号）执行

饲料类初加工免征企业所得税

中华人民共和国财政部、国家税务总局联合发布财税〔2008〕149号文印发了《享受企业所得税优惠政策的农产品初加工范围（试行）》（2008年版）

（二）饲料类初加工

1.植物类饲料初加工。通过碾磨、破碎、压榨、干燥、酿制、发酵等简单加工处理，制成的糠麸、饼粕、糟渣、树叶粉。

2.动物类饲料初加工。通过破碎、烘干、制粉等简单加工处理，制成的鱼粉、虾粉、骨粉、肉粉、血粉、羽毛粉、乳清粉。

3.添加剂类初加工。通过粉碎、发酵、干燥等简单加工处理，制成的矿石粉、饲用酵母。

（三）牧草类初加工

通过对牧草、牧草种籽、农作物秸秆等，进行收割、打捆、粉碎、压块、成粒、分选、青贮、氨化、微化等简单加工处理，制成的干草、草捆、草粉、草块或草饼、草颗粒、牧草种籽以及草皮、秸秆粉（块、粒）。

根据国家税务总局《关于修订“饲料”注释及加强饲料征免增值税管理问题的通知》（国税发[1999]39号）的规定，用于动物饲养的粮食、饲料添加剂不属于免税范围。根据《财政部 国家税务总局关于若干农业生产饲料征免增值税政策的通知》（财税[2001]113号）的规定，生产销售的除尿素以外的氮肥、除磷酸二铵以外的磷肥、钾肥以及以免税化肥为主要原料的复混费免征增值税。饲料添加剂不属于免税范围，应缴纳增值税，税率为17%。

从饲料添加剂预混料生产和原料构成看，它是由五种或六种添加剂加上一种或两种载体混合而成，添加剂的价值占预混料的７０％以上。按照国家税务总局１９９３年１２月２５日印发的《均值税部分货物征税范围注释》（国税发〔１９９３〕１５１号）中“饲料”的解释范围的规定，饲料添加剂预混料难以归入上述“饲料”的解释范围，因此，不能享受规定的“饲料”免征增值税的待遇。

第三篇：转化方法和酵母质粒抽提

酵母转化（快速）

侯昕

1、挑单菌落于3ml 2XYPAD培养基中，30°C 200rpm培养至菌浓度为2X108 cell/ml。（约18h）。

2、用1.5ml离心管收集菌液两次，每次1ml，13500rpm，常温离心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA变性，100°C 5分钟，置冰上备用。在菌中依次加入

50％PEG3350

240ul

1M LiAc

34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA

50ul plasmid DNA(各1ug)

36ul 每加入一种后，要吸打混匀。5、6、42°C水浴1－3小时。

13500rpm离心1分钟，吸弃上清。沉淀中加500ul水，吸打均匀，100ul涂皿。

7、30°C培养两天

此方法可用于已知蛋白互做检测，将两个质粒共转化。

2×YPAD：Yeast Extract

16g

2mg/ml carrier DNA：

Peptone

32g

鲑鱼精DNA（Sima D1626）

Glucose

32g

溶于水，低温放置过夜，灭

Adenine hemisulfate

80mg

菌后－20°C保存。

d2 H2O

800ml 酵母转化（高效）

侯昕

1、挑酵母单菌落于100ml SC液体培养基中，30°C，200rpm摇至菌浓度为2X107 cell/ml（稀释20倍，OD545或OD600为0.1）。※或挑酵母单菌落于50ml 2XYPAD液体培养基中，30°C，200rpm摇至菌浓度为2X108cell/ml（稀释200倍，OD545或OD600为0.1）。

2、用两个50ml离心管分别收集40ml菌液，3000g，常温离心5分钟。

3、将菌分别转入两瓶150ml 2XYPAD培养基中，扩大培养至菌浓度为2X107cell/ml。

4、用500ml离心管收集300ml菌液，3000g，5分钟。用 200mlddH2O洗两次，将菌转入一个50ml离心管。

5、2mg/ml carrier DNA变性，100°C 5分钟，置冰上备用。

6、配Mixture：

50％PEG3350

14.4Mml

1M LiAc

2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA

3ml plasmid DNA＋ddH2O

2.04ml

7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均匀。

8、42°C水域热激45分钟；每5分钟摇一下，使其受热均匀。

9、3000g，离心5分钟，弃上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均匀，涂皿，100－200u/皿。

此方法可用于酵母双杂交文库筛选，建议分步转化。

酵母质粒抽提

侯昕

1、收集菌液，10000g，离心10秒。

2、菌沉淀中加200ul YLS，牙签打散。

3、加200ul 苯酚氯仿异戊醇（25：24：1），摇5分钟，13000rpm，离心5分钟。

4、将上层转入一新离心管中，重复3。

5、将上层转入一新离心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，摇匀，10000g，4°C离心10－30分钟。

6、750ul 75％乙醇洗，10000g，离心5－10分钟。

7、重复6。

8、吹干，加10－20ul 水或TE。

此方法得到的质粒可用于电转大肠杆菌

Yeast lysis solution（YLS）：

2％（v/v）

Triton X－100

1％（w/v）

SDS 100mM

NaCl 1mM

EDTA

第四篇：实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

电转法

设计方案一：

感受态制备：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；

5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min； 6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；

7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。电转化：

1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；

2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；

3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h； 4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h； 5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：

感受态制备：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；

4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；

5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。电转化：

1.向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；

2.擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；

3.立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

4.离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h； 5.离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。

设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞 具体如下：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30℃、250-300rpm 条件下培养至OD=6-10（为防止菌体老化，可将50mL培养体系提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到预定的OD:6-10）；

2.取1mL菌液分装于EP管中，于4℃，12000rpm离心30s，弃上清； 3.收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；

4.所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；

5.离心，弃上清，加入1ml 1M 预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次； 6.最终用1M 预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70℃冰箱保存； 7.电转方法同上。

8.每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。

备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4℃条件下。

醋酸锂转化法

方案一：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、200rpm培养过夜；

2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；

3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体； 4.25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样； 5.用1mL 0.1M LiAc悬浮，离心收集菌体；

6.再用0.5mL 0.1M LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用； 7.依次向上述50 ul感受态细胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、2mg/ml 单链DNA：50ul、转化DNA（5-10ug）：50ul； 8.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 9.30℃水浴孵育30min；

10.42℃水浴热休克20～25min；

11.13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1ml YEPD培养基，30℃摇床

孵育4h；

12.离心收集沉淀菌体，取除约800 ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨涂板。

方案二：

1、接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2×107cells/ml；

2、取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；

3、收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到1.5ml离心管； 4、1ml TE/LiAC（10×TE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5]；lO×LiAc[1 M LiAc pH 7.5）清洗细胞，然后用1×TE/LiAC重悬至2×109 cells/ml； 5、1.5ml离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA混合；

6、加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀； 7、30度振荡培养30min； 8、42度水浴热击15min；

9、离心5s，用1ml 1×TE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基。

附：

电转法方案二中的处量液配制方法：

1.A液成份：100 mM LiAc，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5；配制量：500mL。

1.1 称取54.654g山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中； 1.2 事先配制1 M LiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中； 1.3 事先配好1M Tris-HCl（pH 7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中； 1.4 用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4℃保存。2.B液成份（母液）：1 M DTT

配制量：20mL。2.1 称取3.09g DTT，加入到50mL小烧杯内； 2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um滤器过滤除菌； 2.3 适量分成小份后，-20℃保存。

3.在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液（A+B）。以50mL菌体为例：取A 液8mL，再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混匀，备用。

第五篇：酵母双杂交技术研究进展

酵母双杂交技术研究进展

提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统，它自建立以来经过了不断的改进与完善，不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性，而且在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。这些都将对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到促进作用。

0 引言

随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，大量关于基因结构的信息不断涌现，对这些信息进行系统研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。这不仅需要利用计算机进行生物信息学的分析和预测，而且必须结合生物学实验获取证据。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的发展趋势，已出现了很多新技术，如DNA微阵列技术（DNA micoarry）,基因表达的系列分析（SAGE）,肽质谱分析法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。酵母双杂交技术的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。酵母双杂交技术的应用现状

酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相

互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。常见问题的解决与改进

酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：

(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。

（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。

（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。

在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。

转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法。酵母双杂交技术的新发展

酵母双杂交技术在应用中发挥了巨大的作用，但人们也注意到了它有一定的局限性。为此发展了多种适应不同目的需要的改型的双杂交技术。

反向双杂交技术 在研究中检测并鉴定出那些能阻断两个蛋白间相互作用的因素有重要意义。在研究那些能使相互作用被阻断的因素(如寻找哪些结构域上发生突变可使相互作用中

断或那些分子可以阻断相互作用)时，传统的双杂交技术有较大的局限性。因此，反向双杂交系统(Reverse Two-Hybrid System)应运而生。这项技术的特点是采取了反选择筛选策略。根据反选择设计的不同，大致可以分为两类。一类是用便于反选择的URA3或CYH2基因作为报告基因。URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质，使细胞无法生长。反之，在能生长的细胞中，外界因素已使蛋白间的相互作用不能发生，而我们想知道的正是这些因素。因此，只要对存活的克隆进行检测就可以得到结果。Vidal等人用这种技术发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用必需区内的点突变。另一类是将常规报告基因(如HIS3)置于大肠杆菌转座子Tn10编码的tet-抑制因子(TetR)/操纵基因控制之下。待测蛋白之间发生相互作用后首先激活tet-R基因表达抑制因子TetR,TetR结合到tet操纵基因后就抑制了报告基因的表达，结果转化子不能生长。只有当待测蛋白之间的相互作用被某种因素所阻断而无法激活tet-R基因时，报告基因才能摆脱tet操纵基因的控制而表达，使转化子获得在选择培养基上生长的能力。Shih 等人利用这种方法鉴定出cAMP-应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位点的Ser133突变会阻断其与辅助激活因子(CREB结合蛋白)的相互作用。

三杂交技术 在许多细胞内信号传递过程中，两个蛋白间的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究这些大分子对蛋白间相互作用的影响过程中发展了一种新的技术系统——三杂交系统(Three-Hybrid System)，其本质与双杂交是相同的，只是需通过第三个分子的介导把两个杂交蛋白带到一起。例如小配体三杂交系统(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以渗透的二聚体化学诱导物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作桥梁，将AD和BD融合蛋白连接到一起，激活报道基因的表达。研究较多的是免疫抑制剂FK506。Belshaw等将FK506与环孢菌素A(Cyclosporin

A)构建成异源二聚体，它能把分别与FK506和环孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活报告基因。Licitra将FK506与地米塞松(dexamethasone)通过共价键连接成二聚体。通过实验进一步证实了FK506与蛋白FKBP-12间的特异性相互作用，表明用这种方法鉴定蛋白与小分子间的相互作用是切实可行的。RNA与蛋白之间的相互作用是许多细胞生命活动的基础，例如mRNA的翻译，早期发育以及RNA病毒的感染等。然而可用于这方面研究的简便方法却很少。RNA三杂交系统(RNA Three-Hybrid System)的建立为分析RNA与蛋白之间的相互作用提供了有效的手段。这个系统主要是由一个RNA分子和两个都能结合该RNA的蛋白质组成。此RNA的一部分与一个已知蛋白结合后就可利用它的另一部分去筛选新的RNA结合蛋白。因此这种技术既可检测由RNA介导的两个蛋白质之间的相互作用，也可筛选鉴定新的蛋白结合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突变体RevM10与Gal4 DB域融合作为诱饵蛋白，利用该RevM10蛋白能识别并结合其靶RNA中Rev蛋白反应元件(Rev responsive element,RRE)的作用去筛选同样也能与此RNA结合并已与Gal4 AD域融合的未知蛋白。根据同样的原理，如将一个已知RNA与RRE融合形成杂合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作为诱饵，便可用于筛选该RNA结合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌体衣壳蛋白能识别结合其基因组内一种21核苷酸的RNA茎环结构的特性，将RNA噬菌体衣壳蛋白与Lex DB域融合，构建成可用于寻找体内的RNA结合蛋白的酵母三杂交系统。

核外双杂交技术 在传统的酵母双杂交系统中，蛋白之间的相互作用是在细胞核内发生的。因此,它不能检测某些在核外蛋白之间的相互作用。为了克服这种局限性，近年来有人建立了核外双杂交技术。其中SRS 和USPS就是这种技术的两个代表。SRS也称Sos蛋白召集系统(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分别将待测蛋白X与哺乳动物细胞的一种鸟苷交换因子(EGF)Sos蛋白融合；将Y蛋白与锚定在酵母细胞膜上的Src肉豆寇烯化信

号蛋白融合，并使它们共表达于一个cdc25-2基因温度敏感型突变的酵母菌株内。由于该菌株中cdc25-2基因编码的EGF蛋白在36℃条件下不能激活细胞膜上的Ras蛋白，Ras途径不通。所以细胞无法在36℃条件下生存。但如果待测蛋白X与Y之间发生相互作用就能把Sos蛋白带到细胞膜上并激活附近的Ras蛋白，从而打通Ras途径，使该菌株获得在36℃条件下生存的能力。Aronheim等用此技术鉴别出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分离到了一个AP-1抑制因子JDP2。USPS也称为基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的设计是根据这样一个事实，即真核细胞中遍在蛋白与某一蛋白之间新生成的融合会被遍在蛋白特异的蛋白酶(UBPs)迅速切开，但这种切割只有当遍在蛋白正确折叠时才会发生。研究发现，遍在蛋白基因的N端和C端这两部分即使分离，只要共表达与同一个细胞内，它们仍能正确折叠。将待测蛋白X与带有点突变的遍在蛋白N端片段融合，将待测蛋白Y与下游接有报告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它们共表达与同一个细胞内。因遍在蛋白N端片段内含有点突变，它与C端片段之间不能自然形成正确的折叠。只有当蛋白X和Y之间发生相互作用时才能克服点突变的影响，使遍在蛋白的两端形成正确折叠，从而引来UBPs切除与C端片段连接的报告蛋白。此技术建立之初是通过Western blot检测有无被切下的报告蛋白来判断待测蛋白之间是否发生了相互作用的，所以操作比较繁琐，不便于推广。最近有人对它作了改进，以一种融合的转录激活因子PLV作为报告蛋白。PLV一旦被从遍在蛋白C端片段上切下，它就会进入细胞核内激活特定的报告基因，如：LacZ 和HIS3等。这样就可以根据转化细胞是否生长及显色来判断待测蛋白之间有无相互作用。因此极大地简化了操作步骤，提高了筛选效率。酵母双杂交技术发展与应用的趋势

在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图(linkage-map)。Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类(非编码序列除外)通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图。这是以往的实验所难以获得的。

为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点：

(1)来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA；

（2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡；

（3)含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。

这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。

最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。

胡文峰

2007040380106