第一篇：狂犬病病毒培养技术研究进展
狂犬病病毒培养技术的研究进展
狂犬病作为一种几乎100%致死的人兽共患传染病，对人类的危害已经存在了4000多年，至今仍无有效的治疗药物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后预防。其中暴露前免疫主要是针对动物而言，因为人的狂犬病来源于动物，只要动物的狂犬病免疫预防有效，可完全控制人狂犬病的发生；而暴露后预防主要用于人，因为人一旦被带毒动物咬伤，必须及时进行全程的暴露后预防才能防止感染狂犬病病毒。
不论是暴露前免疫，还是暴露后预防，都离不开安全、有效、廉价的疫苗。人和兽用狂犬病疫苗的发展，都依赖于病毒培养技术的不断进步，尤其是微载体、发酵技术和无血清培养基的广泛应用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一个新的水平，同时降低了生产成本，从而使高质量的细胞纯化疫苗逐渐占领市场。
无论是传统的体内培养技术，还是现在的细胞培养技术，以及新型的细胞发酵和生物反应器，目前都广泛应用于狂犬病病毒的实验室研究或疫苗生产。本文主要就狂犬病病毒培养技术的发展和新技术的应用现状综述如下。体内培养技术
体内培养技术利用了狂犬病病毒的嗜神经特性，具有敏感性好的优点，可以提高病毒检测的阳性率，而且易于操作，适用于不具备组织培养条件的实验室。其中，小鼠脑内接种是实验室最常用的狂犬病诊断和病毒培养技术之一，其他动物如大鼠、羊、兔等，过去主要用于狂犬病神经组织疫苗的生产。
禽胚胎培养技术主要是利用鸭胚和鸡胚进行狂犬病病毒培养，如鸡胚传代致弱的Flury-HEP、Flury-LEP和Kelev毒株。
1.1 脑内培养技术
小鼠脑内接种是最常用的狂犬病病毒脑内培养技术，最早用于狂犬病野毒株的分离培养是在1925年[5]。1955年，该技术开始用于疫苗生产，Fuenjalida和Palacios用新生鼠脑制备出人用组织疫苗（SMBV），该疫苗曾在南美洲使用了40多年，最终因使用后会引起严重的神经综合症而被迫停产[1]，但是小鼠脑内接种技术却一直延用至今。目前，该技术已成为病毒分离、毒力测定及中和试验等的常用方法，所用动物一般为小鼠，乳鼠对狂犬病病毒脑内接种的敏感性高于幼鼠和成年鼠[6]。小鼠中，以瑞士白化鼠（Swiss albino）为首先品种，该品种小鼠在实验室饲养容易，对狂犬病病毒高度敏感，但迄今尚未发现任何对狂犬病病毒具有遗传抗性的小鼠品系，因此也可使用其他品种的小鼠。实验室一般不采用野生灰鼠或家鼠，因为其野性较大，人工饲养困难。狂犬病脑内接种试验周期长，通常需观察21天，且成本较高，操作技术性强，鉴于此，有的实验室已改用细胞（如小鼠成神经瘤细胞和BHK细胞等）代替小鼠进行试验。
其他脑内培养技术（大鼠、羊、兔等动物的脑内培养技术）在20世纪80年代以前曾广泛应用于人狂犬病脑组织灭活疫苗的生产，如Semple、Fermi和Hempt疫苗等。但是，随着细胞疫苗的发展和神经组织疫苗的使用安全问题，该技术已不再常用。
1.2 禽胚胎培养技术7－10
鸭胚培养技术过去主要用于人用狂犬病疫苗的生产，目前在实验室使用较少。1955年，Peck等开始研制狂犬病鸭胚疫苗，该疫苗于1957年在美国上市，到1973年已成为美国主要的狂犬病疫苗，但是进入80年代后，在疫苗生产中人二倍体细胞（HDC）培养取代了鸭胚培养技术。
在狂犬病病毒适应鸡胚培养的研究发现，连续传40～50代时，获得的低胚传代株（Flury-LEP）对小鼠、大鼠和仓鼠进行脑内或肌肉接种时仍具有致病性，豚鼠脑内接种也可感染，但肌肉接种时则无致病力；家兔脑内和肌肉注射均不发病；犬肌肉接种也不发病。但是，病毒在传代176至182代时（Flury-HEP）大部分毒力会丧失，此时将病毒脑内接种成年鼠、兔、犬时，均无致病性。因此，一般高代次的Flury-HEP推荐在牛和猫中使用，Flury-LEP仅用于犬。Kelev株鸡胚疫苗系经鸡胚传代60～70次的病毒，该病毒对仓鼠、豚鼠和兔的脑内和肌肉的接种均不产生感染症状；以高浓度的病毒对犬进行肌肉接种，也不出现感染症状。Flury和Kelev株均适于在鸡胚中生长，过去一直用于犬狂犬病疫苗的生产，其中Flury株在世界范围内广泛使用。
鸭胚和鸡胚的接种基本一致，选取培养7天的健康胚，将狂犬病病毒毒液接种到卵黄囊内，鸭胚培养10～14d，鸡胚培养9～10d。
2.体外培养技术
1913年，Noguchi和Levaditi首次将组织培养技术用于狂犬病病毒的研究。1930年，Stoel将狂犬病病毒在移植于兔血浆凝块中的鸡胚脑和心脏内培养了5代，病毒感染力没有丧失。Atanasieu等利用小鼠食管膜瘤细胞系（一种非神经细胞）培养了狂犬病病毒街毒株和固定毒株，首次在细胞培养系统中报道了类似于Negri小体的胞浆内包涵体。
人用狂犬病细胞培养灭活疫苗的研究始于1964年,该项研究表明，人二倍体细胞株WI-38株可以作为狂犬病固定毒PM株的适应细胞，用于疫苗生产。1967年，Merieux研究所开始利用人二倍体体细胞进行疫苗研发。1974年，人二倍体细胞培养灭活疫苗在法国批准使用，1978年开始商业化生产。
2.1 原代细胞培养技术
前苏联以狂犬病病毒Vnukovo-32株感染原代地鼠肾细胞（PHKC），经紫外灭活后制备狂犬病疫苗，我国则以原代地鼠肾细胞（PHKC）培养狂犬病固定毒北京株，经甲醛灭活制备狂犬疫苗，主要用于暴露后治疗，其年需求量也相当大。
还有一些类似的疫苗是在原代胎牛肾细胞和犬肾细胞上培养并制备的。其中原代胎牛
肾细胞（FBKC）培养疫苗的适应毒株是巴斯德固定株PV-31，于1984年在法国批准用于暴露后治疗，1987年以后不再生产。有报道显示，FBKC疫苗有很好的耐受性和免疫原性，抗体反应类似于HDC疫苗。原代犬肾细胞疫苗的适应株是狂犬病固定毒PM株，PM株对人二倍体细胞也适应。
不同动物（小鼠、仓鼠、猪、犬和猴）源性的原代肾细胞培养物和禽类胚胎成纤维细胞对狂犬病病毒的易感性，证实了这些细胞具有用于狂犬病疫苗生产的潜力。如1960年Fennie报道了第一个用原代仓鼠肾细胞制备狂犬病疫苗，经过修饰后，结合狂犬病病毒北京株，我国已经将其用于人狂犬病疫苗的生产。Vnukovo-32株也是以类似的方式在前苏联用于狂犬病疫苗生产的。此外，人用疫苗也有以牛肾细胞、犬肾细胞和鸡胚成纤维细胞生产的，后者采用的病毒株为Flury LEP C25。
人用狂犬病原代仓鼠肾细胞成品疫苗有冻干和液体2种剂形，由原代仓鼠肾细胞培养的狂犬病病毒固定毒株经甲醛灭活后制备，是我国此前主要的人用狂犬病疫苗品种。狂犬病固定毒北京株在适应原代仓鼠肾细胞（PHKC）培养后，用于疫苗生产。该毒株是1931年从中国北京1条死于狂犬病的犬脑内分离得到的。通过在兔脑内连续传代后得到固定毒株，到1980年为止主要用于Semple神经组织疫苗的生产。
狂犬病病毒Vnukovo-32株是SAD株的衍生株，该毒株源于1935年从美国阿拉巴马州的一条犬中分离出的野毒（SAD），经鼠脑和PHKC交替传代传代35代，再在37℃下经PHKC连续传10代，达到第32代，完成该毒株在原代仓鼠肾细胞（PHKC）中的适应，即称为Vnukovo-32。适应的毒株，在32℃，PHKC上培养，以第33代～178代毒建立基础种子库和工作种子库，－60℃或冻干保存。
2.2 传代细胞培养技术
人二倍体细胞（Human diploid cell, HDC）疫苗是最早商品化的细胞培养疫苗，目前已在世界范围内得到广泛应用，并成为其他狂犬病细胞培养疫苗的参照标准。法国Marcy l´Etoile的Merieux研究所和德国Marburg的 Behring研究所研制的人二倍体细胞疫苗均以人二倍体细胞MRC-5培养，经β-丙内酯（BPL）灭活后制得。两者不同的是，Behring研究所生产的疫苗经梯度超速离心进行浓缩和纯化，而Merieux研究所系通过超滤实现疫苗的浓缩。
人用纯化鸡胚细胞疫苗(PCEC)是以原代SPF鸡胚细胞培养制备的，该疫苗为冻干品，其制备过程主要包括β-丙内酯灭活后狂犬病病毒抗原的纯化和浓缩等。
早期对组织培养的研究发现，经鸡胚细胞培养的低代狂犬病病毒Flury株(low egg passage Flury strain, Flury-LEP)更适于作为疫苗株使用。在此基础上，1973年以Flury-LEP株研制出兽用灭活疫苗。以此系统进行人用鸡胚细胞疫苗的生产，首先须将收获的狂犬病病毒经蔗糖密度梯度离心，达到浓缩、纯化的目的。改良后的抗体结合试验可以用于灭活后狂犬病病毒抗原成分的定量。20世纪80年代，建立了多种适用于纯化鸡胚细胞疫苗的实验室检
测方法，并开始了在人的临床试验。
恒河猴胎猴肺二倍体细胞（FRhMDC）疫苗是由美国的公共卫生部的密歇根州生物制品研究所在20世纪70年代开发的。1979年开始在志愿者中进行临床试验，1988由美国食品与药物管理局（FDA）批准用于暴露前后狂犬病防治。
人用狂犬病犬肾细胞疫苗是利用犬肾细胞在微载体上培养的。疫苗的冻干品包括经ß-丙内酯灭活的狂犬病病毒固定毒株和用以吸附病毒的磷酸铝佐剂。
建立了敏感的细胞系和细胞株以后，可以系统研究狂犬病病毒及病毒与宿主细胞的相互作用。迄今已有很多传代细胞系用于动物狂犬病疫苗的制备，如BHK-
21、仓鼠肾成纤维细胞（Nil-2）和鸡胚相关细胞（CER）。但由于某些细胞系的异源特性和潜在致瘤性，目前只有猴肾细胞Vero用于人狂犬病疫苗的制备。
人二倍体细胞（WI-38）在1964年首次报道用于人狂犬病疫苗生产，此后，其他二倍体细胞如人胚肺细胞（HEL）、人肺细胞（MRC-5）和恒河猴二倍体细胞系也用于人狂犬病疫苗生产。
除了上面提到的细胞以外，狂犬病病毒还可在胚胎鸡肌管、鼠的巨噬细胞、大鼠感觉神经系统、大鼠垂体肿瘤细胞、黑山羊和豚鼠肾细胞、胎儿蝙蝠细胞、人滑液（McCoy）细胞、日本鹌鹑胚胎细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中复制。病毒接种昆虫细胞也能检测到病毒特异性抗原，但其水平明显低于其他细胞。
人和小鼠源的成神经细胞瘤细胞已广泛用于狂犬病病毒研究，尤其是鼠成神经细胞瘤细胞（NA-C1300，为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷细胞株），显微镜下观察，该细胞与人的神经元大致相同，细微结构都有神经元样形态，在微管蛋白、神经递质合成酶和可兴奋细胞膜上也有很多共同特征。
狂犬病病毒固定毒株HEP Flury和LEP Flury可以在原代鸡胚细胞中培养，经β-丙内酯（BPL）灭活后制备疫苗。20世纪60年代，Kondo等研制出了纯化的鸡胚细胞培养疫苗（PCEC），1980年批准使用。此后，很多国家引入了纯化鸡胚细胞培养疫苗用于暴露后治疗，特别是一些东南亚国家。德国Behring研究所也研制了一种类似的疫苗。一项935名受试者接种4247剂纯化鸡胚细胞疫苗的临床试验表明，与人二倍体细胞苗相比，纯化鸡胚细胞培养疫苗可诱导产生更高的抗体滴度。在欧洲，印度次大陆以及东南亚地区（泰国）均有大量此种疫苗生产并应用于暴露后治疗。
接种病毒的组织培养细胞可用常规的单层或旋转培养法培养，悬浮培养也已成功。培养液的最适pH为7.4～7.6，适宜温度范围为30～40℃，但低温培养(32℃)尤为适宜。
3.细胞发酵和生物反应器技术
前一节介绍了狂犬病人二倍体细胞培养疫苗(HDC)的制备。尽管人用二倍体细胞疫苗安全性良好、免疫原性也高，但人二倍体细胞培养的病毒滴度相对较低，必有经过浓缩才能获
满足质量要求的疫苗，致使本疫苗的大规模生产受到了限制。脊髓灰质炎灭活疫苗是最早使用人二倍体细胞生产的疫苗，因为产毒滴度不高，WHO生物标准化专家委员会为此还对该疫苗的质量标准进行了修正。
微载体细胞培养技术（由Van Wezel发明）的出现，使细胞得以大规模培养并应用到人用疫苗的制备中。随着脊髓灰质炎病毒Vero细胞灭活疫苗的成功研制，人们开始转向以Vero细胞培养狂犬病病毒并制备灭活疫苗。因为该疫苗要求有纯化过程，以除去残留的细胞DNA成分，因此该疫苗称为狂犬病Vero细胞纯化疫苗（purified Vero cell rabies vaccine, PVRV）。
考虑到HDC的生产成本，开发商们开始寻找适应狂犬病病毒增殖的新的细胞系、细胞培养体系、病毒株和相关的生产技术，希望能够在保持疫苗高效力的同时，降低生产成本。最早用于狂犬病疫苗生产的传代细胞系是用微载体系统进行培养的Vero细胞，是来源于非洲绿猴的肾细胞系。
1984年11月，WHO和RF合作，采用微载体技术高密度灌流Vero细胞，工业化生产狂犬病疫苗，历时15年，取得成功。目前，Vero细胞疫苗已经在世界上许多国家取得了安全有效的使用经验。
参考文献：
[1] Meslin FX ,Kaplan MM ,Koprowski H.Laboratory techniques in rabies[M].Fourth edition ,WHO,Geneva ,1996.80-87.Woldehiwet Z, 2005.Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus.Clin Chim Acta, 351(1-2): 49-63
[5] Webster LT，Dawson JR.Early diagnosis of rabies by mouse inoculation: measurement of host immunity to rabies by mouse protection test．Proc Soc ExP BioI Med.1935, 32: 570-573.[6] WHO Expert Committee on Rabies.VIII Report 1992;Technological Report Series 824, WHO.Geneva．
[7] Dietzschold B, Wiktor TJ, Wunner WH, et al.1983.Virology, 124: 330-337
[8] Gluck R, Matthieu JM, Wegmann A, et al.1986.Absence of myelin basic protein in an improved purified duck-embryo rabies vaccine.Neurochem Pathol, 4: 69-75
[9] Gluck R, Wegmann A, Germanier R, et al.1984.A new highly immunogenic duck-embryo rabies vaccine.Lancet, 1: 844-845
[10] Koprowski H, Cox HR.1948.Studies on chick-embryo-adapted rabies virus;culture characteristics and pathogenicity.Journal of Immunology, 60: 533-544
[11]
第二篇：猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展
猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展
猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011年猪圆环疫苗上市至今，已有17家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。
1.PCV-2国内外最新流行动态
由PCV-2引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起PMWS后[1]，学者通过调查本国包括SPF猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪群中PCV-2血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中PCV-2抗体阳性率分别为86％和92％。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在PMWS。在我国猪群中PCV-2感染情况也不容乐观。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22个猪群采集了559份血清，用ELISA方法检测PCV-2抗体，其阳性率高达5l％，表明我国猪群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒2型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒2型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等[4]在2010年对安徽省PCV-2流行病学调查，结果表明安徽省14个市(县)的PCV-2抗体阳性率平均为74.36％，表明安徽省猪群中普遍存在着PCV-2的感染。从上述报道表明PCV-2在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中PCV-2抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与PCV-2混合感染率达到了20％[5]。陕西省PCV-2与PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陈义祥等对广西地区197份组织病料检测发现，PCV-2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占总病料数量的57.73％。2003年王文军等[7]对黑龙江地区PCV-2阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。
哈尔滨兽医研究所刘长明[8]在2007年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群480份血清和发病猪群424份血清，抗体阳性率分别为79.2%和91.7%，表明PCV-2在猪群中感染率非常高。山东农科院畜牧兽医研究所吴家强博士检测结果也证实PCV-2防控比较糟糕，PCV-2，2010年检出率为34.66%（124/357），2011年检出率为25.59%(174/588)；2012年检出率为2
1.38%(147/683)，圆环病毒病依然严重，但有下降趋势，这个和使用圆环疫苗免疫有关系。
第三篇：酵母双杂交技术研究进展
酵母双杂交技术研究进展
提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统，它自建立以来经过了不断的改进与完善，不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性，而且在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。这些都将对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到促进作用。
0 引言
随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，大量关于基因结构的信息不断涌现，对这些信息进行系统研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。这不仅需要利用计算机进行生物信息学的分析和预测，而且必须结合生物学实验获取证据。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的发展趋势，已出现了很多新技术，如DNA微阵列技术（DNA micoarry）,基因表达的系列分析（SAGE）,肽质谱分析法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。酵母双杂交技术的基本原理
1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。酵母双杂交技术的应用现状
酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相
互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。常见问题的解决与改进
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：
(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。
（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。
在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。
转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法。酵母双杂交技术的新发展
酵母双杂交技术在应用中发挥了巨大的作用，但人们也注意到了它有一定的局限性。为此发展了多种适应不同目的需要的改型的双杂交技术。
反向双杂交技术 在研究中检测并鉴定出那些能阻断两个蛋白间相互作用的因素有重要意义。在研究那些能使相互作用被阻断的因素(如寻找哪些结构域上发生突变可使相互作用中
断或那些分子可以阻断相互作用)时，传统的双杂交技术有较大的局限性。因此，反向双杂交系统(Reverse Two-Hybrid System)应运而生。这项技术的特点是采取了反选择筛选策略。根据反选择设计的不同，大致可以分为两类。一类是用便于反选择的URA3或CYH2基因作为报告基因。URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质，使细胞无法生长。反之，在能生长的细胞中，外界因素已使蛋白间的相互作用不能发生，而我们想知道的正是这些因素。因此，只要对存活的克隆进行检测就可以得到结果。Vidal等人用这种技术发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用必需区内的点突变。另一类是将常规报告基因(如HIS3)置于大肠杆菌转座子Tn10编码的tet-抑制因子(TetR)/操纵基因控制之下。待测蛋白之间发生相互作用后首先激活tet-R基因表达抑制因子TetR,TetR结合到tet操纵基因后就抑制了报告基因的表达，结果转化子不能生长。只有当待测蛋白之间的相互作用被某种因素所阻断而无法激活tet-R基因时，报告基因才能摆脱tet操纵基因的控制而表达，使转化子获得在选择培养基上生长的能力。Shih 等人利用这种方法鉴定出cAMP-应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位点的Ser133突变会阻断其与辅助激活因子(CREB结合蛋白)的相互作用。
三杂交技术 在许多细胞内信号传递过程中，两个蛋白间的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究这些大分子对蛋白间相互作用的影响过程中发展了一种新的技术系统——三杂交系统(Three-Hybrid System)，其本质与双杂交是相同的，只是需通过第三个分子的介导把两个杂交蛋白带到一起。例如小配体三杂交系统(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以渗透的二聚体化学诱导物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作桥梁，将AD和BD融合蛋白连接到一起，激活报道基因的表达。研究较多的是免疫抑制剂FK506。Belshaw等将FK506与环孢菌素A(Cyclosporin
A)构建成异源二聚体，它能把分别与FK506和环孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活报告基因。Licitra将FK506与地米塞松(dexamethasone)通过共价键连接成二聚体。通过实验进一步证实了FK506与蛋白FKBP-12间的特异性相互作用，表明用这种方法鉴定蛋白与小分子间的相互作用是切实可行的。RNA与蛋白之间的相互作用是许多细胞生命活动的基础，例如mRNA的翻译，早期发育以及RNA病毒的感染等。然而可用于这方面研究的简便方法却很少。RNA三杂交系统(RNA Three-Hybrid System)的建立为分析RNA与蛋白之间的相互作用提供了有效的手段。这个系统主要是由一个RNA分子和两个都能结合该RNA的蛋白质组成。此RNA的一部分与一个已知蛋白结合后就可利用它的另一部分去筛选新的RNA结合蛋白。因此这种技术既可检测由RNA介导的两个蛋白质之间的相互作用，也可筛选鉴定新的蛋白结合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突变体RevM10与Gal4 DB域融合作为诱饵蛋白，利用该RevM10蛋白能识别并结合其靶RNA中Rev蛋白反应元件(Rev responsive element,RRE)的作用去筛选同样也能与此RNA结合并已与Gal4 AD域融合的未知蛋白。根据同样的原理，如将一个已知RNA与RRE融合形成杂合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作为诱饵，便可用于筛选该RNA结合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌体衣壳蛋白能识别结合其基因组内一种21核苷酸的RNA茎环结构的特性，将RNA噬菌体衣壳蛋白与Lex DB域融合，构建成可用于寻找体内的RNA结合蛋白的酵母三杂交系统。
核外双杂交技术 在传统的酵母双杂交系统中，蛋白之间的相互作用是在细胞核内发生的。因此,它不能检测某些在核外蛋白之间的相互作用。为了克服这种局限性，近年来有人建立了核外双杂交技术。其中SRS 和USPS就是这种技术的两个代表。SRS也称Sos蛋白召集系统(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分别将待测蛋白X与哺乳动物细胞的一种鸟苷交换因子(EGF)Sos蛋白融合；将Y蛋白与锚定在酵母细胞膜上的Src肉豆寇烯化信
号蛋白融合，并使它们共表达于一个cdc25-2基因温度敏感型突变的酵母菌株内。由于该菌株中cdc25-2基因编码的EGF蛋白在36℃条件下不能激活细胞膜上的Ras蛋白，Ras途径不通。所以细胞无法在36℃条件下生存。但如果待测蛋白X与Y之间发生相互作用就能把Sos蛋白带到细胞膜上并激活附近的Ras蛋白，从而打通Ras途径，使该菌株获得在36℃条件下生存的能力。Aronheim等用此技术鉴别出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分离到了一个AP-1抑制因子JDP2。USPS也称为基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的设计是根据这样一个事实，即真核细胞中遍在蛋白与某一蛋白之间新生成的融合会被遍在蛋白特异的蛋白酶(UBPs)迅速切开，但这种切割只有当遍在蛋白正确折叠时才会发生。研究发现，遍在蛋白基因的N端和C端这两部分即使分离，只要共表达与同一个细胞内，它们仍能正确折叠。将待测蛋白X与带有点突变的遍在蛋白N端片段融合，将待测蛋白Y与下游接有报告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它们共表达与同一个细胞内。因遍在蛋白N端片段内含有点突变，它与C端片段之间不能自然形成正确的折叠。只有当蛋白X和Y之间发生相互作用时才能克服点突变的影响，使遍在蛋白的两端形成正确折叠，从而引来UBPs切除与C端片段连接的报告蛋白。此技术建立之初是通过Western blot检测有无被切下的报告蛋白来判断待测蛋白之间是否发生了相互作用的，所以操作比较繁琐，不便于推广。最近有人对它作了改进，以一种融合的转录激活因子PLV作为报告蛋白。PLV一旦被从遍在蛋白C端片段上切下，它就会进入细胞核内激活特定的报告基因，如：LacZ 和HIS3等。这样就可以根据转化细胞是否生长及显色来判断待测蛋白之间有无相互作用。因此极大地简化了操作步骤，提高了筛选效率。酵母双杂交技术发展与应用的趋势
在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图(linkage-map)。Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类(非编码序列除外)通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图。这是以往的实验所难以获得的。
为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点：
(1)来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA；
（2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡；
（3)含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。
这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。
最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。
胡文峰
2007040380106
第四篇：病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三
病毒核酸检测常用技术
（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in
Common Use）
近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。
实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
图23-1 PCR基本原理示意图
本实验是将被检样品中ILTV 颗粒经裂解、变性后，分离ILTV—DNA。选择鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因保守序列设计引物，由于引物与鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因存在着特异的互补性，当加入DNA聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段基因，该基因片段通过人工扩增后，经含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可显示橙红色ILTV—DNA条带，根据片段大小来判定标本中鸡传染性喉气管炎病毒的存在。
【器材准备】
1．病毒裂解液：醋酸钠1.7g，EDTA钠盐4.65g，20mg/ml蛋白酶K 2.5ml，100g/L SDS 10ml，DEPC三重蒸馏水加至50ml。
2.3mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2)，酚/氯仿/异戊醇混合液(25：24：1)，无水乙醇及70％乙醇。
3.2.5mmol dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM。
4.10×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶。
5.DNA分子量标准。
6.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，操作时应戴手套)，琼脂糖。
7.50×TAE缓冲液：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液为1×。
8.ILTV北京E2 株、ILTV-DNA可疑组织样品、ILTV-DNA阴性组织样品等。
9.引物序列: 参考已发表的ILTV的TK基因序列,设计并合成了一对引物,其序列如下：引物P1：5’-TTCGAGAACGATGACTCCG-3’；引物P2：5’-ATAGTCATCTGAACTTCCGC-3’。
10.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf 管与吸头等。
【实验步骤】
1.病毒核酸的分离
（1）取ILTV-DNA可疑组织样品上清液200μL、病毒裂解液20μL于Eppendorf管中，60℃水浴1h，同时设ILTV北京E2 株、ILTV-DNA阴性组织样品对照。
（2）加酚/氯仿/异戊醇混合液200μL，上下颠倒混匀，14000rpm离心5min，吸上清液于另一新的Eppendorf管中。
（3）加1/10体积的3 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2)及2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜。14000rpm离心15min，弃上清液。
（4）加70％乙醇至Eppendorf管2/3处，混匀，洗涤沉淀。14000rpm离心15min，弃上清液，室温中使乙醇挥发。
2.加样及PCR扩增
（1）按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendorf管中。
10×PCR buffer μl 2.5mM dNTPs
μl
引物P1（25pmol/μL）μl
引物P2（25pmol/μL）μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）
0.5 μl 模板液（病毒核酸的分离液）μl 加ddH2O至
μl
（2）将上述混合液稍加离心，调整好反应程序，立即置PCR仪上，执行扩增。一般在94℃预变性3min，进入循环扩增阶段：94℃ 60s→58℃ 30s→72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
3.电泳检测
（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。
（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。
（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使其没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。
（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。
（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。
（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。
4.结果判定
在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。若样品扩增带与阳性对照扩增带（约265bp）处于同一位置，则判定为ILTV-DNA阳性，否则判定为阴性。
【注意事项】
1.所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（1）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因有Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。保证引物的3’端与靶基因的互补。PCR反应的各温度点的设置要合理。
（2）假阳性：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，所以污染是PCR假阳性的主要根源。污染的原因可能有：
① 样品间交叉污染。样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染；样品核酸模板在提取过程中，由于移液器污染导致样品间污染；有些微生物样品尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
② PCR试剂的污染。主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于移液器、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
③ PCR扩增产物污染。这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染移液器的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
④ 实验室中克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时采取如下措施：
① 合理分隔实验室。将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。
② 移液器：移液器污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
③ 预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
④ 防止操作人员污染，手套、吸头、小离心管应一次性使用。
⑤ 设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
⑥ 减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。
⑦ 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部，开管动作要轻，以防管内液体溅出。
2.注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB（Times New Roman体）可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧作无害化处理。
3.实验用品应专用，实验前应将实验室用紫外线照射以破坏残留的DNA或RNA。总而言之，PCR的条件是随系统而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后可以通过稍稍改变各参数，使反应条件得到优化，以取得优良的特异性和产率。
【实验报告】
1.实验结果（1）你所做的PCR实验阳性对照是否出现相应扩增带? 如果有扩增带，请对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）PCR技术的基本原理？
（2）影响PCR实验成功的因素有哪些？
（3）PCR检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？
（4）根据实验过程中的体会，总结如何做好PCR实验？关键因素有哪些？
实验2 RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（RNA）的分离与RT-PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一种传染病,其临诊特征为各种年龄的猪均可感染,病猪厌食、嗜睡、体温升高,妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎,种公猪性功能下降,仔猪和育肥猪呼吸障碍。1987年该病首次报道于美国,随后迅速蔓延北美、欧洲及亚洲各国,目前已成为一种地方性流行病。1996年初,我国也报道了本病的发生。由于PRRS与其它引起猪繁殖障碍的疾病存在着非常类似的临诊症状,根据现场诊断很难做出准确鉴别。实验室诊断方面,如病毒的分离与鉴定,抗原及抗体的检测等方法或特异性、敏感性差,或操作技术复杂、费时费力等缺点,不能满足临床需要。PRRSV属动脉炎病毒科成员，有囊膜，基因组为单股正链RNA，大小约15kb。反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法具有特异、敏感、快速诊断等优点，因此PRRSV适用RT-PCR方法进行检测。
RT-PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，它是以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)。基本过程是以dNTP为底物，以RNA为模板，按5’→3’方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成(图23-2)，然后将DNA进行PCR扩增。PCR扩增的基本原理见实验1部分。
图23-2 RT-PCR基本原理示意图
【器材准备】
1.TRIzol LS Reagent RNA提取试剂。2.氯仿、异丙醇、70%乙醇。
3.DEPC处理水：按1∶1000的比例将DEPC加入三蒸水，室温放置12h以上。4.5×反转录反应缓冲液。
5.SuperScriptTMⅡ反转录酶（200U/μL）。6.RNA酶抑制剂(40U/μL)。
7.2.5 mM dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mM。
8.10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶。9.DNA分子量标准。
10.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，操作时应戴手套)，琼脂糖。
11.50×TAE：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液为1×。
12.PRRSV标准毒株、PRRSV-RNA可疑组织样品、PRRSV-RNA阴性组织样品等。13.引物：
（1）反转录引物：可用随机引物（Random Primers）（市售）、Oligo（dT）12-18（市售）或Random Primers与Oligo（dT）按3：1混合而成的引物Oligo（dT）/Random primer，或用相对PRRSV RNA来说的PCR下游单侧特异性引物。
（2）PCR引物序列：以高度保守的ORF7作为扩增靶区设计并合成一对引物，序列如下：引物F：5-ATGCCAAATAACAACGGCAAGC；引物R：5-TTAATTTGCACCCTGACTG-3。
14.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf 管、吸头与水浴箱等。
【实验步骤】
1.病毒核酸（RNA）的分离：病毒核酸（RNA）分离方法很多，实际应用时可灵活考虑。本实验选择市售商品化TRIzol LS Reagent RNA提取试剂完成猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)基因组RNA的分离。操作按TRIzol LS Reagent RNA提取试剂使用说明书进行，步骤如下：
（1）在1.5mL离心管中加入250μL的PRRSV细胞培养物和750μL TRIzol LS，盖上管盖，倒置混匀，室温放置10min。
（2）加入200μL氯仿，将匀浆剧烈振荡15sec，室温静置5min使核蛋白质复合体彻底裂解。
（3）4℃ 12 000 rpm离心15min，将上层含RNA的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。（4）加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，室温放置10min。
（5）4℃ 12 000 rpm离心15min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤沉淀，然后离心，再用吸头彻底吸弃上清，在自然条件下干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水中。直接用于RT-PCR或-80℃贮存，备用。
（6）另外，也可选择异硫氰酸胍法完成PRRSV RNA的提取。2.病毒cDNA第一链的合成（反转录，RT）
病毒cDNA第一链的合成参照Invitrogen公司的SuperScriptTMⅡ反转录酶使用说明进行，步骤如下：
（1）于微量离心管中加入6μL RNA、2μL反转录引物：Oligo（dT）/Random primer混合物，混匀，65℃ 5min。（2）冰浴2min，离心。（3）继续加入以下组分：
5×反转录反应缓冲液 4μL 0.1 m M DTT 2μL 2.5mmol dNTPs 2μL SuperScriptTMⅡ反转录酶 1μL（200U/μL）RNA酶抑制剂 0.5μL（40U/μL）DEPC水 2.5μL（4）混匀，42℃水浴50min，最后70℃水浴15min，完成cDNA链合成。取出后可以直接进行PCR，或者放于-20℃保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。
3.PCR扩增
根据扩增目的选择引物F与引物R，按TaKaRa公司Ex-Taq DNA 聚合酶使用说明进行，步骤如下：
按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendoff管中。
双蒸灭菌水 37.5μL 反转录产物 4μL 引物F（25pmol/μL）0.5μL 引物R（25pmol/μL）0.5μL 10×PCR Buffer 5μL 2.5mmol dNTPs 2μL Taq酶 0.5μL（5U/μL）
注意首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。
（4）全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到Eppendorf管底。（5）在PCR扩增仪上执行如下反应程序：94℃ 3min；94℃ 30 sec，50℃ 45 sec，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min结束。可根据扩增目的基因的不同，选择不同的循环参数。
4.电泳检测
（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。
（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。
（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。
（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。
（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。
（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。
5.结果判定
在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。
若样品扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置，则判定为PRRSV-RNA阳性，否则判定为阴性。
【注意事项】
1.分离高质量的病毒RNA是RT-PCR成败的关键。由于RNA酶无处不在，且可耐受多种处理（例如煮沸）而不失活，因此RNA在分离过程中极易受其污染而降解。为了获取完整的RNA，应创造一个无RNA酶的环境。整个操作过程应戴一次性手套并勤换。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。注意采用灭菌的一次性塑料制品，且不得重复使用；非一次性的玻璃和塑料用品须在使用前应用0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC）室温处理过夜，然后高压灭菌去除DEPC，以确保无RNA酶；所有溶液（Tris除外）均须加入0.05% DEPC浸泡过夜后高压灭菌。
2.病毒cDNA第一链的合成（反转录）步骤（1）、（2）中，将RNA溶液置65℃中温育，然后冷却再加样目的是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率，此步骤不能省略。
3.RT-PCR过程中的PCR步骤中最常见的问题参见实验1注意事项内容。
【实验报告】
1.实验结果
（1）你所做的RT-PCR实验阳性对照是否出现相应扩增带? 如果有扩增带，请对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）RT-PCR技术的基本原理？
（2）影响RT-PCR实验成功的因素有哪些？
（3）RT-PCR检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？
（4）根据实验过程的体会，总结如何做好RT-PCR实验？关键因素有哪些？
实验3 核酸杂交技术检测病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸杂交技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
鸡马立克氏病(Marek’s Disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤病,它同时还能引起感染鸡的免疫抑制,从而导致对多种疫苗免疫效应降低。应用特异、敏感的方法对该病作出早期诊断是控制其流行的一项重要措施。实验室诊断MD的方法很多,到目前为止有琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验等,但这些方法存在敏感性低及易出现非特异性反应等缺点。近年来业已建立的一些分子生物学方法,如核酸探针技术，以其特异、快速、敏感，适合检测和早期诊断等特点,已在MDV检测及MD的诊断上得到应用。
核酸杂交技术是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的方法。其原理主要是利用四种脱氧核苷酸中碱基配对原则(G=C、A=T)，核酸变性和复性理论（图23-3）。
图23-3核酸分子杂交原理示意图
病毒核酸杂交基本原理是将和已知病毒核酸特定区域碱基互补的DNA或RNA克隆片
32段，用非放射性物质(如生物素、地高辛)或放射性物质(如P)标记，制备成核酸分子探针。在适当条件下，核酸探针与临床样品中的病毒核酸形成双链结构而被保留，然后通过放射自显影或免疫技术检测标记的核酸片段。若被检样品与探针形成杂交双链，则显示阳性结果。如样品中无与探针互补的序列，则不发生分子杂交，结果为阴性。常用的杂交方法有DNA斑点杂交、原位杂交、Southern杂交和Northern杂交。
下面以地高辛(Dig)标记的单链DNA探针试剂盒检测MDV核酸为例，对常用的DNA斑点杂交法进行介绍。将MDV-DNA样品滴于硝酸纤维素膜上，MDV-DNA经处理变性，双螺旋DNA变为单链DNA吸附在固相滤膜上，再加分子质量较小的地高辛标记的单链DNA（即核酸探针），在一定条件下按互补碱基顺序配对的特点进行结合，形成DNA—DNA的双链杂交分子。然后用偶联有酶的抗地高辛抗体结合物作为酶标记，再分别用显色底物使杂交部位显色以达到检测目的，其反应过程见图23-4。
图23-4 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应
【器材准备】
1.Dig-MDV-DNA探针：参照Dig-DNA探针标记试剂盒说明进行制备。2.预杂交液（pH7.0-8.6）：Ficoll 0.8ml，2.0g/L BSA 0.8ml，20g/L PVP 0.8ml，20×SSC 2ml，1 mg/m1小牛胸腺DNA 0.4ml, 双蒸水2.8ml,0.5mol/L HCl 0.4ml。
3.漂洗液（1）20×SSC：NaCl 175.32g，枸橼酸钠(2H2O)88.2g，加双蒸水至1000ml。（2）4×SSC-1.0g/L SDS：20×SSC 100ml，100.0g/L SDS 5ml，双蒸水395ml。（3）参照（2）法配制4×SSC-5.0g/L SDS、0.1×SSC-1.0g/L SDS。
（4）3mol/L NaCl-0.5mol/L Tris：NaCl 175.32g，Tris 60.5g，双蒸水395ml。
4.MDV 中国疫苗株814 株或中国标准株Jing-1 株、MDV-DNA可疑组织样品与MDV-DNA阴性组织样品等。
5.器材：负压抽滤点样器、硝酸纤维素膜、塑料袋、烤箱、水浴箱、冰箱、塑料封接机。
【实验步骤】
1.病毒DNA 分离：MDV核酸分离方法参照实验1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸部分（1.病毒核酸的分离）进行。
2.探针标记：MDV pp38基因片段DNA 特异寡核苷酸探针标记，参照Dig-DNA探针试剂盒说明书进行。
3.点样：将上述适度稀释的病毒核酸（DNA）80μl、阳性对照80μl、阴性对照80μl点样于硝酸纤维素膜(NC膜)或尼龙膜上，负压抽滤。
4.变性：用0.5 mol/L NaOH变性点样膜10min，再抽干水分按下述顺序洗膜。（1）0.5 mol/L HCl漂洗1次，每次10min。
（2）3 mol/L NaCl-0.5 mol/L Tris(pH7.5)漂洗1次，每次15min。（3）1 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（4）0.5 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（5）0.2mol/L Tris-EDTA(0.002mol/L)(pH7.5)漂洗1次，每次5min。
（6）2×SSC漂洗1次，每次5min。
（7）80℃ 5min，氯仿浸泡5min，再80℃烘干2h。
5.预杂交：将滤膜和预杂交液—起放塑料袋内密封65℃水浴5h。
6.杂交：
（1）将地高辛标记的MDV pp38基因探针放沸水中煮沸10 min ,再置冰中速冷变性。（2）在塑料袋内留有适量预杂交液，加入变性的Dig-ILTV DNA，除去气泡，充分混匀，密封，68℃摇动，杂交过夜或6 h 以上。
7.洗膜：按下列顺序充分洗去未杂交的标记物。
（1）4×SSC 1.0g/L SDS漂洗1次，每次10～30min。（2）4×SSC 5.0g/L SDS 65℃漂洗1次，每次4h。（3）0.1×SSC 1.0g/L SDS 45℃漂洗1次，每次2h。
8.显色：将杂交膜置80℃烘干30min，再装入塑料袋内，加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，室温显色3～4h；双蒸水洗涤，终止反应，以BCIP和NBT为底物进行显色。
9.结果判定
在阴阳对照正常的情况下，阳性标本硝酸纤维素膜点样处呈紫色。可与同时杂交的已知的MDV DNA样品显色强度相比较，进行样品中MDV DNA的定量检测。阳性与阴性结果如图23-5。
图23-5 DNA斑点杂交检测结果
【注意事项】
1.实验要设立各种对照（阳性对照、阴性对照与空白对照）。
2.非特异显色的排除。非特异显色是固相膜杂交方法常遇到的问题，指标记DNA非特异结合到空白膜上而显色，即本底。这个问题的克服一是使用高纯度的核酸制品和充分严格的杂交条件，二是选择合格的杂交反应液充分封闭膜上的非特异结合位点和对膜进行处理。
3.使用的抗体进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。抗体的有效期和保存条件要经常检查，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。底物显色液最好新鲜配制，如有沉渣应进行过滤后再用。
4.显色过程最好实时监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
5.结果判定时，应与阳性、阴性对照进行比较，克服肉眼观察所造成的误差。
6.在实验过程中应严格注意控制污染，所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。另外，在处理点样硝酸纤维素膜(NC膜)或尼龙膜时，自始至终应保持湿润，勿令其干燥。
【实验报告】
1.实验结果
DNA斑点杂交实验设立的各种对照显色是否正常? 并对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）核酸杂交技术的基本原理？请阐述斑点杂交法主要步骤。
（2）在斑点杂交实验中引起非特异性染色的主要因素有哪些？应如何排除？
(陈金顶)
参考文献
1.J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1999 2.魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，1999 3.郝福英.分子生物学实验技术.北京：北京大学出版社，1999 4.殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学技术出版社,1997 5.陆承平.兽医微生物学.第三版.北京：中国农业出版社，2001
6.刘水平，邬国军.医学微生物学实验指导.西安：世界图书出版公司西安公司，2002 7.张卓然.医学微生物实验学.第二版.北京：科学出版社，2002
8.徐秀芬，赵曼瑞，胡军.微生物与免疫学·寄生虫学实验指导.北京：人民军医出版社，2005
9.曹澍泽等主编.兽医微生物学及免疫学技术.北京：北京农业出版社，2003
第五篇：伪狂犬病防制技术规
伪狂犬病防制技术规范
伪狂犬病（Pseudorabies,Pr 又名Aujeszky’s disease,AD）。是由疱疹病毒科猪疱疹病毒I型（伪狂犬病毒PrV）引起的各种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为特征的急性传染病。除猪以外的其它动物发病均以死亡而告终，但呈散发形式或地方疫源性疾病。该病对养猪业的危害最大，在猪呈爆发流行，常引起妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、新生仔猪大量死亡，育肥猪发生严重的呼吸道症状和增重滞缓、种猪不育，给养猪业造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织（Wold Organisation for Animal Health，简称OIE）将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。
为了预防、控制和消灭伪狂犬病，依据（中华人民共和国动物防疫法）和共他相关法律法规，特制定本技术规范。
1．适用范围
本规范适用于中华人民共和国境内一切从事哺乳动物饲养、经营、使用、屠宰、加工、运输等相关活动中的动物疫病防治工作。
2．诊断
根据流行特点，临床特征和病理变化，结合乳胶凝集试验（LAT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）作出初步诊断。确认需进一步做病毒中和试验（NT）或病毒分离鉴定或动物接种试验或聚合酶链反应（PCR）。
2．1 流行特点
本病与其他疱疹病毒病不同，宿主范围广，猪、牛、羊、犬、猫最易感，寒冷季节多发，本病在猪呈爆发流行，猪是伪狂犬病毒储存者和传染源，病猪、隐性感染猪和康复猪可以长期带毒。病毒在猪群中主要通过空气传播，通过呼吸道和消化道感染，也可通过胎盘感染胎儿，除猪以外的其它动物感染伪狂犬病毒后，发病均以死亡告终，但呈散发形式或地方疫源性疾病。
2．2 临床表现：
2．2．1 潜伏期一般为3-6天
2．2．2 牛、羊、犬、猫、兔等动物感染本病后以发热、兴奋、奇痒、脑脊髓炎症状，结果均以死亡转归。
2．2．3 母猪感染伪狂犬病毒后常发生流产、产死胎、弱仔、木乃伊胎。青年母猪和空怀母猪常出现返情、屡配不孕或不发情；公猪常出现睾丸肿胀、萎缩、性能下降、失去种用能力；新生仔猪大量死亡，15日龄内死亡率为100%；断奶仔猪发病20-30%，死亡率为10-20%；仔猪症状病初高烧、腹泻、呕吐、精神不振，随后出现转圈、震颤、鸣叫、昏睡等神经症状；育肥猪出现严重呼吸道症状，生长滞缓，饲料报酬降低。2．3 病理变化：
病理组织学呈现非化脓性脑炎变化，剖检脑膜瘀血、出血，肾脏布满针尖样出血点，其它大体剖检特征不明显。
2．4 实验室诊断：
2．4．1 病原学诊断：
2．4．1．1 动物接种：
采取病猪扁桃体，嗅球、脑和肺，用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）制成10%悬液，反复冻融三次后离心取上清液接种于家兔皮下或者小鼠脑内，（用于接种的家兔和小白鼠必须事先用乳胶凝集试验或ELISA检测伪狂犬病毒抗体阴性者才能用），家兔经2-5天或者小鼠2-10天发病死亡。家兔发病时先用舌舔接种部位，以后用力撕咬接种部位，使接种部位被撕咬伤、鲜红、出血，持续4-6小时，病兔衰竭，倒卧于一侧，痉挛，呼吸困难而死亡。小鼠不如家兔敏感，但明显表现兴奋不安，神经症状，奇痒和四肢麻痹而死亡。
2．4．1．2 鸡胚接种：
取上述上清液接种9-10日龄鸡胚绒毛尿囊腔，经3-4天后形成特征性痘疱样白斑，死亡的鸡胚神经系统出血导致胚胎颅腔突出，取尿囊液做病毒中和试验，进行病毒鉴定。
2．4．1．3 用细胞培养分离病毒，见附件一。
2．4．1．4 聚合酶链反应（PCR）诊断，见附件二。
2．4．1．5荧光抗体试验（见附件三）
2．4．2 血清学诊断（抗体检测）
2．4．2．1 微量中和试验（固定病毒、稀释血清）见附件四
2．4．2．2 酶联免疫吸附试验（见附件五）
2．4．2．3 乳胶凝集试验（见附件六）
2．4．2．4 琼脂扩散试验（见附件七）
2．4．2．5 区分强弱毒感染鉴别乳胶凝集试验（见附件八）
2．4．2．6 区分强弱毒感染鉴别ELISA（见附件九）
3．疫情报告
凡发现疑似疫情的单位和个人，均应及时报告所在地基层动物防疫组织或动物防疫监督机构。
接到报告后的基层防疫组织和动物防疫监督机构，按《动物疫情报告管理办法》的规定上报。
4．疫情处理
4．1 紧急免疫接种：对发病种母猪、种公猪，用gG单基因缺失灭活疫苗作紧急免疫接种注射，第一次注射后间隔4-6周后再加强免疫一次，以后按种猪免疫程序进行，对正在发病的猪场，仔猪采用TK-/gG-双基因缺失弱毒疫苗作超前
--免疫，即滴鼻或注射一头份剂量。对正在发病的仔猪用TK/gG双基因缺失弱毒
疫苗滴鼻或肌肉注射作紧急预防接种可收到很好的效果。同时对所有的其它种猪用gG单基因缺失灭活疫苗注射，仔猪和肥猪用TK-/gG-双基因缺失弱毒疫苗注射。
4．2 消毒：对栏舍、场地、道路等用2%的氢氧化钠溶液1-3%的漂白粉液。1:300的消毒灵或1:300的复合酚溶液喷洒；对金属器具用0.5%的次氯酸钠薰蒸消毒；工作人员服装、鞋帽等用消毒液浸泡、高压灭菌法消毒。
4．3 严格禁止狗、猫、鸡、鸟类等动物进入猪场，加强灭鼠。
4．4 严格限制和减少猪场外来人员和外来车辆进入场内，同时要限制场内饲养员和工作人员在各猪舍互相来往和串门，以免人为扩散原病。
4．5 对病死动物尸体、剖检动物、死胎、流产物及其它污染物和排泄物作销毁无害化处理或者按《病死动物及产品深埋处理技术规范》深埋处理。
4．6 进行紧急免疫注射见效果后，以后按伪狂犬病根除计划方案中伪狂犬
病阳性场根除方案进行伪狂犬病的根除计划（见5、6伪狂犬病根除计划方案），直到最终消灭此病。
5．预防与控制：
5．1养畜场（含种畜场）的选址和布局要符合《动物防疫法》和国家畜牧兽医主管部门规定的防疫条件，并取得动物防疫监督机构颁发的《动物防疫合格证》。
5．2 经常保持场（户、舍）的清洁卫生、严格灭鼠，严禁其它动物和鸟类进入场内，避免因动物带毒传播。
5．3 新进动物必须来源于非疫区（非疫场），并进行严格检疫，伪狂犬抗体阴性或强毒感染阴性的猪才能引进。对出场、厂（户）种畜由动物防疫监督人员进行检疫、监测阴性的方出具检疫合格证明，准予出场、厂（户）；或经动物防疫监督机构检疫，并持有检疫合格证明。
5．4 免疫预防：对饲养动物（特别是猪）进行定期免疫。免疫用疫苗首选基因缺失苗，种猪选用gG-或gE-单基因缺失标志灭活疫苗、仔猪和育肥猪选用----TK/gG或TK/gE双基因缺失弱毒疫苗，注射剂量、部位和方法及疫苗保存、运输方法等按生产厂的说明书要求进行。
免疫程序：种猪第一次免疫后，间隔4-6周后加强免疫一次，以后每6个月免疫一次，产仔前一个月加强免疫一次，经过前面规则免疫后的种猪所产仔猪，其母源抗体可以维持到60日龄左右，因此后备种猪可在60-70日龄首免。间隔4-6周后加强免疫一次作为基础免疫，以后按种猪的免疫程序进行免疫，育肥猪是经过前述规则免疫后所产的仔猪，应在60-70日龄用基因缺失弱毒疫苗免疫一次，间隔4-6周后加强免疫一次，直到出栏。如果是没有规则免疫母猪所产的仔猪，可提前到断奶时注射一次，间隔4-6周后加强免疫一次，直到出栏。
5．5 监测：对种猪场、育肥猪场要定期进行该病的监测。监测方法采用乳胶凝集试验或ELISA方法，种畜场每年监测2次，商品场每年监测一次，监测时种公猪（含后备种公猪）应100%，种母猪（含后备种母猪）按20%的比例抽检，商品猪按5%的比例不定期进行抽检；对有流产、产死胎、产木乃伊胎等症状的种母猪100%进行检测。
5．6 伪狂犬病根除计划方案：
根据不同的猪场、不同情况和实验室检测情况，选择不同的方案与措施。
种猪与种猪场
伪狂犬病毒是属于高度潜伏感染的病毒，而且这种潜伏感染随时都有可能被体内外和环境变化的应激因素刺激而引起疾病爆发，同时基因缺失弱毒疫苗注射带有野毒潜伏感染的动物时，由于活病毒之间发生基因交换和重组的可能性，加上种猪饲养的时间长（3-4年），因此这种可能性和机率就会增大，而且国内外都有因注射弱毒疫苗而引起伪狂犬病爆发的例子。因此在西方发达国家如德国严格规定种猪只允许使用灭活疫苗。美国在其伪狂犬病的根除计划中，也规定种猪只允许使用灭活疫苗。根据以上这些特点，因此建议在我国种猪也只能使用基因缺失灭活疫苗。华中农业大学专门研制了针对种猪用的单基因缺失浓缩灭活疫苗。尤其是gG单基因缺失灭活疫苗对病毒的免疫原性几乎完全没有什么影响。因为gG是病毒的非结构蛋白基因，gG蛋白是病毒繁殖时分泌到细胞培养的上清
中与病毒免疫原性无关；该基因缺失后，对病毒的免疫原性没有什么影响，但又可以作为鉴别诊断。鉴于国内外已大量使用gE缺失疫苗，为了与国际接轨，我们也研制了gE单基因缺失灭活浓缩疫苗。
育肥用的仔猪和架子猪可以使用双基因缺失的弱毒疫苗。华中农大研制的TK-/gG-和TK-/gE-双基因缺失弱毒疫苗都是缺失了伪狂犬病毒的主要毒力基因TK，该基因缺失疫苗可用作于新生仔猪（未吃初乳）的超前免疫，尤其是TK-/gG-缺失疫苗可用于发病仔猪的紧急预防接种，具有明显的急救和预防效果。也可用于断奶仔猪和生长育肥猪的免疫，可预防各种年龄猪的伪狂犬病，具有明显的促生长作用。由于育肥猪的生长周期短（6个月左右），因此不存在病毒重组变异和返强的危险。
5．6．1 种猪及种猪场的根除计划
5．6．1．1 在没有使用过疫苗的猪场，先作普遍血清学检查，如果发现血清学阳性猪，最好是能将血清学阳性猪与血清学阴性猪分群饲养。然后将血清学阳性猪和血清学阴性都用基因缺失灭活浓缩疫苗注射，所有猪普遍注射一次疫苗后，间隔4-6周再加强免疫一次。以后血清学阴性猪群按每半年注射一次，血清学阳性猪群每4个月注射一次，然后每半年进行一次血清学鉴别检查，凡是注射疫苗血清学阳性的猪归为健康群，凡是野毒感染血清学阳性猪归为另一群，逐步缩小和有计划的淘汰野毒感染猪群，逐步达到完全健康无野毒感染的猪群。直到最后根除消灭伪狂犬病。
5．6．1．2 对已经注射过疫苗的猪场，首先将疫苗完全换成浓缩单基因缺失灭活疫苗。免疫程序按每4个月注射一次。每半年进行一次血清学鉴别检查，逐步开始分群将基因缺失疫苗免疫血清学阳性猪视为健康群分开饲养，将野毒感染血清学阳性猪分为另一群分开饲养，逐步淘汰和缩小野毒感染猪群，最后建立完全健康无野毒感染的猪群。
5．6．1．3 以上述经过规则免疫后的种猪所生仔猪留作种用的仔猪在100日龄时作一次伪狂犬病普通血清学检查，凡是抗体阴性者留作种用。对检出的抗体阳性者作进一步的鉴别血清学检查，对野毒感染阴性者同样可用作种用，对强毒感染阳性者淘汰作为肥猪用，不能作为种猪用。对伪狂犬病抗体检测阴性猪和野毒感染阴性猪等留作种用的仔猪用伪狂犬病浓缩单基因缺失灭活疫苗在100-110日龄接种一次，再到130-140日龄时加强免疫一次，以后按种猪的免疫程序每半年注射一次浓缩基因缺失灭活疫苗。同时每半年抽血样进行一次鉴别血清学检查，如发现野毒感染血清学阳性猪应及时隔离淘汰处理，以保持猪群无野毒感染，安全健康。
5．6．1．4 对种用仔猪经上述检测，发现和分群隔离的野毒感染血清学阳性猪，立即注射灭活疫苗或基因缺失疫苗，最好是间隔4-6周注射2次，作为育肥猪饲养出栏。
5．6．1．5 以上是在种猪群和种猪场进行伪狂犬病根除计划的最佳方案。但考虑到我国养猪业的实际情况，一般猪场的养猪数量都已达到满负荷的程度，猪舍和栏圈都比较紧张，对采取隔离分群有困难时，此种情况在没有注射过疫苗的场先进行抗体检测，确定有无感染存在，或是已经注苗的场先将疫苗更换为浓缩单基因缺失灭活疫苗，再按前述的种猪及种猪场的免疫程序进行免疫。即抗体
阴性猪首先作两次基础免疫，其间隔4-6周。然后每半年注射一次。如是野毒感染阳性猪群先作两次基础免疫后，再每4个月免疫一次，直至野毒感染抗体消失后，改为每半年一次。对已经免疫过的猪群，则将疫苗更换成浓缩单基因缺失疫苗就行。然后按每半年抽血检查一次。逐步缩小野毒感染的猪。这就是要比前述的采取分群隔离的措施达到净化根除的目的要慢一些。
5.6．1．6 对正在爆发伪狂犬病的猪场，种猪除进行两次间隔4-6周基础免疫外：种猪应在配种前注射一次，产前一个月加强免疫一次，均使用浓缩的单基因缺失的灭活疫苗。育肥猪用基因缺失弱毒疫苗进行两次免疫。如仔猪发病用基因缺失疫苗紧急预防接种效果显著。
5．6．1.7 对新引进的种猪，要进行严格的检疫，最好是要引进伪狂犬病抗体阴性猪或野毒感染抗体阴性猪，引到本场后，隔离饲养2个月，抽血样检查，抗体或野毒感染抗体为阴性者再与本场其它猪混群饲养。与其它猪群一样，每半年作一次检查。对于检测出的野毒感染阳性猪要严格隔离，注射疫苗后，看情况能否作为种用，最好是将其淘汰不作种猪用。
5.6．1．8 猪场要进行定期严格的消毒管理措施，最好是使用2%的氢氧化钠（烧硷）溶液或酚类消毒剂。猪舍、栏圈的清洗消毒，最要选择气候干燥和具有阳光照射下进行效果最佳。
5.6．1．9猪场严格禁止养狗、养猫、养鸡，严格禁止狗、猫、鸡和其它鸟类及动物进入猪舍。在猪场内要进行严格的灭鼠措施。消灭鼠类带毒传播疾病的危险。
5.6．1．10 要严格禁止人员和车辆等进入猪场，避免因人员和机械带毒传播疾病。
5．6．1．11在5公里方圆范围内的相关猪场都必须统一采取同样措施，因为伪狂犬病可在方圆5公里范围内通过空气传播。
5．6．2育肥猪场伪狂犬病的根除计划
上述种猪及种猪场的根除计划措施完全适用于育肥猪场。育肥猪场种猪的伪狂犬病根除计划措施与上述的种猪的根除计划措施是完全一样的。不同的只是在育肥猪方面，首先应对育肥猪群在70-100日龄的猪进行伪狂犬病血清学检测，如发现有抗体阳性或野毒抗体阳性猪，所有的猪只都应注射疫苗。经过规则免疫的种猪所生的仔猪，一般在60-70日龄注射一次基因缺失弱毒疫苗，间隔4-6周后再加强免疫一次。一般情况下在育肥猪场种猪育肥猪都应进行免疫。如只免疫种猪，大量的育肥感染病毒，在那里大量增殖病毒并向猪舍内排毒，直接威胁着种猪，因而种猪的免疫效果受到影响。此外育肥猪感染伪狂犬病毒后，虽不表现出典型的临床症状和发生死亡，但可明显的引起呼吸道症状，增重迟缓，饲料报酬降低，推迟出栏，其间接经济损失也是巨大的。经实验室的动物实验和临床上的观察证实，感染了伪狂犬病毒的育肥猪群，注射疫苗与不注苗其增重相差约1/3。即注射疫苗猪比未注射疫苗猪在同等饲养条件下多增1/3，可见育肥猪应该进行伪狂犬病免疫的重要性。
6．无病标准：
首先要配合我国无特定病原区的建设的工作计划，划定一定的区域，对区域内的猪场进行血清学调查，了解和掌握伪狂犬病猪场和猪群阳性感染率的情况，制定伪狂犬病的免疫预防计划与措施。按照前述伪狂犬病的根除计划方案，实施强制性免疫计划，配合强有力和有效的区分强弱毒感染的监测，建立健康群，通过有计划的免疫，使猪群伪狂犬病强毒感染率降到10%左右时，就可以采取捕杀或淘汰野毒血清学阳性猪，建立健康猪群。最后要在一定的区域范围内或甚至是全国范围内，经过较长时间的监测没有再发现野毒感染猪。在稳定控制标准的基础上，停止注苗后，连续3年无临床病例出现，由国家指定的专门实验室到该区域内的猪场随机抽血样检测伪狂犬病毒抗体为阴性，没有阳性猪出现，才算消灭或根除了伪狂犬病。
点击咨询 