侵袭的造句大全

第一篇：侵袭的造句大全

侵袭拼音

【注音】： qin xi

侵袭解释

【意思】：侵入而袭击。

侵袭造句：

1、台风侵袭沿海地区。

2、当然也有其他一些人是因为忍受疼痛的侵袭和严重的焦虑。

3、其中一个盲人，自从他的视力被色素性视网膜炎（一种侵袭视网膜细胞的病毒引起的）所损坏后，这是他半个世纪以来，首次有了视觉。

4、最近俄罗斯、印度、英国的护航舰成功保卫了受海盗侵袭的船只。丹麦和美国也向此海湾给予支援。

5、他说，2000年的水母侵袭，可能是不寻常的洋流模式把漂移的水母从加勒比海带入，水母永久地生活在那里。

6、它可以侵袭毛毛虫和其他在泥土中生存的昆虫幼虫，游动进入受害者的体内，释放出可以杀死这些幼虫的细菌。

7、每一个方阵都是一座受着乌云侵袭的火山，熔岩在和雷霆交战。

8、而在这次授课的几周前，他得知癌症已经侵袭到了他的肝脏和脾脏。

9、因此,所有的DRM也是对自由软件的一种侵袭.10、这是令人感到沮丧的共识：被冲突、饥荒和疾病所包围的非洲又被一场新的联合灾难所侵袭——虽然非洲只制造了全球二氧化碳排放量的2%。

11、恶性胶质瘤是侵袭程度最高的脑瘤之一，病人存活时间基本不超过两年。

12、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞都可以在全身过敏反应和受寄生虫侵袭的组织中看到。

13、这种艺术表现有时使人想到显微镜下侵袭人体的病毒，有时是在水下深处潜伏以待的触角伸张的海葵。

14、自1962年以来就没有疟疾的澳大利亚，特别容易受到蚊子的侵袭。

15、他们知道，贫穷正侵袭着普通民众以及军队。他们想通过任何可行的政治方式解决这些问题。

16、北京政府否认任何有关政府和计算机侵袭有关的说法，并且过去说控告是无根据的。

17、严重的流感病例也是主要侵袭较年轻的人群。

18、继“极光”之后有计划的网络攻击侵袭了一个又一个行业。

19、经过了几周或几个月的时间，细菌恢复活动，此时它们的致病力和侵袭性往往比原先更强，从而引起疾病复发。

20、寒冬，又一场暴风雪侵袭了整个世界。

21、非侵袭性乳腺癌不需要进行化疗，因为这种类型的肿瘤并不会扩散到乳腺以外的组织中去。

22、这一情况也许会增加他们遭受心脏病侵袭以及糖尿病所导致的组织和脏器损伤的风险，因为他们压根就不知道自己有可能面临这样的风险。

23、当不确定感和疑惑开始侵袭，我直面那些感觉，然后问自己，作为一个独立人，我怎样才能从这些感觉中获得更多收获？

24、你把这种大规模人口剔除描述为“长久侵袭”或者“回到更理智的世界”。

25、但最重要的是，我期待一个没有经济教条的世界，这种教条侵袭了许多人的思想，被当作绝对真理。

26、这些层叠的布不仅能保护他们免受强烈的阳光和风的侵袭，也掩盖了他们的情绪。

27、拿破仑在执掌了法国政权并侵袭了整个意大利后，将他的视野投向了一个新大陆：非洲。

第二篇：台风侵袭预案

台风侵袭

防台准备

1.制定全年防风防台计划，落实台风处置预案及期间当值表及责任人,人员联络名单；

2.台风季节到来,提前作好防台准备,查看防台物质齐备适用,检查疏通相应管路,组织防台领导小组人员开会,预演防台步骤;

台风到来前

3.接气象部门通知,通知租户（业主），发出台风公告:告知台风事宜并提醒客户一些必要安排,告知紧急联络电话；

4.检查物业内设施、设备，保护及稳固；

① 各区域高空悬挂物件是否牢固，有无松脱；

② 各机房（电梯、水泵、电机房等）是否安全，备用电机是否可以随时开动； ③ 天台水箱、天线等物件是否牢固，有无不安全因素；

④ 物业内所有管道、阀门是否正常，有无堵塞，渗漏及失灵；

5.负责检查所有客房门窗内关闭情况，有无各类危险情况（如花盆在窗台，易堕落物件在阳台）；

① 锁紧窗门；

② 玻璃贴上防风胶纸，避免爆裂；

③ 装上防风卷闸或防风板（如有）；

6.建筑物若有维修棚架、围板或吊船等物体在外置放，应检查是否安全及稳固，如有需要须移走或通知施工队做好防风措施；

7.全面检查物业防风措施，查看各处下水道、落水管、雨水渠等，并及时通知清洁部或协助维修部清除可能引起淤塞的垃圾、泥沙及杂物；

8.备好沙包、雨衣、头盔、水靴、绳索、后备照明等紧急用具以随时应用；

9.应加强与部门的联络，加强巡检力度，发现问题及时反映并督促有关部门改进；

台风中

10.逗留室内安全位置或进入指定防风处；

11.佩带硬身安全帽（如外出）；

台风后

12.观察台风消息及预防余风；

13.照顾受伤人士；

14.清理受损范围，注意避免受伤；

15.维修主管巡视物业；

16.清理淤塞渠口杂物，补充紧急用具；

17.事后填写《事件报告》呈交管理处。

第三篇：黑暗侵袭 影评

友情与背叛的救赎

人们都说喜欢看恐怖电影的人或多或少的对生活中的某个方面有不满，才会以此来发泄，我想说我的生活非常幸福美满，但是恐怖电影以及科幻大片是我的挚爱。

《黑暗侵袭》我觉得是一部值得推荐的恐怖影片的代表。首先导演的思路就很新颖，打破了以往恐怖影片的鬼神之说，而是标新立异自己制造出来一些变异的“怪物”，先不深追究这些怪物的来源，当然目前影片也没有过多的介绍有关它们存在的原因，我们的目光都落在了六个女孩的身上。她们是现实生活中的好姐妹，主演莎拉因为陷入了丈夫和孩子双双死亡的悲痛心情中难以自拔，好友决定帮助她走出困境。于是一个胆大而且好于历险的好友就组织大家进行山洞探险，就这样故事一步一步的发展开来了。

要说本来极为姑娘在深冬里面探险遭遇各种离奇事件还有怪兽都是电影所呈现给我们的新鲜感官，那么《黑暗侵袭》还有一大看点，那就是人与人之间情感的脆弱呈现。首先鼓动大家来探险的好友其实是莎拉最好的朋友，但是莎拉不知道的是，丈夫与好友私通好久并且感情深厚，当大家一步一步被怪物紧逼到失去了好几个朋友的时候，另一个知道内情的朋友在意外中被与莎拉丈夫私通的好友砍伤而且非常严重，另一个好友再遇到莎拉的时候将他们私通的事情告诉了莎拉，并引起了莎拉的怀恨。故事才真正的到达了高潮。

其实好友对莎拉的感情是真诚的，并且带着深深的忏悔想用冒险的行动缓解莎拉的悲痛，哪知道东窗事发的时候，莎拉居然置她于不顾，狠心的把好友仍在了怪物的巢穴。这是我们不想看到的结局，虽然莎拉最终获救了，但是她为此付出的代价仿佛更加沉重，美好的友情在背叛与黑暗之间没有完成我们想象的救赎。

接下来莎拉还会遇到什么样的事情，接下来还会有什么精彩的故事为我们呈现呢？那就敬请关注《黑暗侵袭三》的近期上映了。

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第四篇：Transwell侵袭实验总结

1．Transwell

trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Transwell装置的纵切面

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：

小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

（2）趋化性实验

可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

（3）肿瘤细胞迁移实验

常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

（4）肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

transwell侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了，大概原理就是这样的。

2．肿瘤细胞侵袭模型

用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）： 2．1 体内癌细胞侵袭模型 2．1．1 皮下移植侵袭模型 2．1．2 肌肉内移植侵袭模型 2．1．3 腹腔内移植侵袭模型 2．1．4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型 2．1．5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型 2．1．6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型 2．1．7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型 2．1．8 视网内界膜侵袭模型 2．2 体外癌细胞侵袭模型 2．2．1 体外静止器官培养法

2．2．1．1 半固体培养基单细胞器官培养法 2．2．1．2 液体培养基单细胞器官培养法 2．2．2 半体外半体内器官培养法 2．2．3 单层细胞器官培养法 2．2．4 瘤细胞球体器官培养法 2．2．4．1 静止球体器官培养法 2．2．4．2 旋转摇动球体器官培养法 2．2．5 单层细胞侵袭实验模型 2．2．6 Transwell侵袭小室测定法

可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法。所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。

① Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB，8µm，用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB，0.4µm的2000多，是一次性的。梅林战友提供的BD价格： 240RMB一块（6.5um，24孔，12instert），好像是没胶的。liguofan说国产的boyden30块一个。jjyy提供的价格是：corning cat No.3422.6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert，Qty 48,950人民币不到。平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。

因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。maojianwen战友的使用方法： trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。② 上层培养液：

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。

③ 细胞：

值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。

④ 基质胶：

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。

⑤ 下层培养液：

下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。

⑥ 细胞培养板：

常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。

⑦ 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售），这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。zhangyong1036战友提供的价格： sigma的fibronectin，价格在1500左右

2．步骤

2．1 Transwell小室制备

2．1．1 无基质胶Transwell小室制备

① 包被基底膜：

用50mg/LMatrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

② 水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel（3.9ug/ul）60-80µl（注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。

2．1．2 有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。2．2 制备细胞悬液

① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

2．3 接种细胞

① 取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200µl。

② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③ 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。

时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象。在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

通过给细胞染色，可在镜下计数细胞：

① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。

② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：（1）不需要固定细胞，直接染色即可。（2）配制简单方便。（3）染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。

③ 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。

取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用3－5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。

第五篇：Transwell侵袭实验总结

Transwell侵袭实验实验用品：

① Transwell小室：

多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。

另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售。Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。使用方法： trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。

② 上层培养液：

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。

③ 细胞：

值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。

④ 基质胶：

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就

不需要购买了。

⑤ 下层培养液：

下层常用含5%－10%

FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。

⑥ 细胞培养板：

常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。

⑦此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售），这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。

2．步骤

2．1 Transwell小室制备

2．1．1 无基质胶Transwell小室制备

① 包被基底膜：

用50mg/LMatrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

② 水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel（3.9ug/ul）60-80µl（注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。

2．1．2 有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

2．2 制备细胞悬液

① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将

难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

2．3 接种细胞

① 取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200µl。

② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③ 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细

胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。

时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象。在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

第三节 Transwell的其他应用的实验步骤

1．Transwell肿瘤细胞迁移实验

过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤

做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请大家共同探讨：

（1）将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV（Sigma），＋＋100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca

2、Mg 2，无血清的MEM。

（2）用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

（3）离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10%胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium（Biofluids）冲洗一次。

（4）冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90%，则将细胞以10 6/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL，Costar），以37°C 5%CO2-95% 空气含5% 胎牛血清（Gibco-BRL）and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6～10天。

（5）孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片

链接：

3.metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验

我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin（10 ug/ml，50ul），37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul，用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

链接： http:///bbs/post/view?bid=66&id=2681611&sty=3&keywords=Transwell

4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验

1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serum-free MCDB131稀释的5×104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移，同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜（Olympus，DP50，Japan）。下观察并拍照，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=【（OD值给药组-OD值无刺激阴性对照）/（OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照）】×100%。

链接： http:///bbs/post/view?bid=66&id=850667&sty=3&keywords=Transwell