第一篇：分子生物学电子教案第四章资料
第四章 DNA的复制
第四章 DNA复制(DNA Replication)1．主要内容 1)DNA复制概览 2)细菌DNA复制 3)真核DNA复制 2．教学要求
1)掌握原核生物和真核生物DNA的复制特点 2)熟悉原核生物和真核生物DNA复制的酶系统
第一节 DNA复制概述 第二节 DNA复制的酶学
第三节 原核生物DNA复制 第四节 真核生物DNA复制
第一节 DNA复制概述(DNA Replication: An Overview)
一、基本概念
二、DNA的半保留复制
三、复制起点、方式和方向
四、DNA复制的半不连续性
一、基本概念
复制子(Replicon，复制单位或复制元)
DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。1.3万— 90万不等
A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator
复制体(Replisome)：复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA。
The multi protein(30±)structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA
二、DNA的半保留复制
（Semi-Conservation Replication）
CsCl(Cesium chloride)density gradient ultracentrifugation（CsCl密度梯度超离心）Labeled E.Coli DNA with 15N 14N
三、复制起点、方向和方式
• All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications.（单复制子）
1、复制起点（origin，ori 或 O，复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置 原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即——整个染色体只有一个复制单位 真核生物（Eukaryote）： 多复制起点，即－－一个genome中有多个复制单位
2、复制方向（复制过程的顺序性）复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点 复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛 真核生物的多复制子 多个复制眼（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉（2）复制的多模式
单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向(原核)多起点、双方向（真核）
3、复制方式
（1）从新起始（de novo initiation）或复制叉式（replication fork）（2）置换式（Displacement form）又称 D 环复制
（3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）DNA复制方式
（1）从新起始（de novo initiation）或复制叉式（replication fork）或θ 复制 A replication eye forms a theta structure in circular DNA.
（2）置换式 Displacement form，又称 D 环复制
线粒体和叶绿体 DNA的复制方式
（3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制 病毒、细菌因子
四、DNA复制的半不连续性
（Semi-Discontinuous Replication）
复制方向的问题：
冈崎片段（Okazaki fragment）
1968年冈崎（Reiji Okazaki）设计了两组实验，其一是脉冲标记实验（pilse－labeling experiment）。冈崎利用T4噬菌体侵染E.cili(t-)菌株，并分别用dTTP(3H-T)进行2’’，7’’,15’’,30’’,60’’,120’’的脉冲标记，分离提取T4噬菌体DNA，变性后，进行Cscl密度梯度离心，以检测具放射性的沉降片断，判断片断大小。结果表明经不同标记时间的，被3H-T标记的新合成的DNA片段几乎都为10-20s，即均为1000-2000核苷酸大小（图3-）。第二组实验是脉冲追踪实验（pulse－chase experiment），为了研究在脉冲标记实验中所发现的10－20s的小片段在复制全过程中的发展结局，冈崎将实验菌株先进行同位素标记培养30秒，然后转入正常培养基继续培养数分钟，分离DNA进行密度梯度离心，发现小片段已被连接成为70－120S的大片段。为此将DNA的这种复制方式称为不连续复制模式，将最初合成的10－20s片段称为冈崎片段（图3－）。
如果两条极性单链的DNA复制均按这种不连续的模式进行，后随链的合成可以在模板单链暴露到1000－2000核苷酸长度后，开始从5’ → 3’合成冈崎片段，而先导链的合成从进化的原则讲，大可不必按冈崎片段的模式不断地启动小片段的合成，既耗时又费能。换言之, DNA的复制应该是按一种半不连续的方式进行，即先导链以连续复制的方式完成子代DNA的合成，而后随链以不连续复制的方式完成冈崎片段的合成。但在Okazaki的脉冲标记实验结果中，被标记的DNA全部为小片段。其实在E.coli的细胞内存在dUTP和dTTP两种类似物, 其比例大约为1：300，而DNA聚合酶III又不能区分这两者，一旦将dUMP聚合到DNA分子中，必然会导致生物的基因表达与进化过程中的潜在危险，实际上E.coli 依靠了两种机制阻止了dUMP 掺入到DNA分子的过程。由dut基因编码的dUTP酶（dUTPase）能有效地将dUTP，dUDP分解为dUMP,从而避免了dUMP作为底物而掺入到DNA分子中。即使dUTPase能将绝大部分的dUTP降解，但仍有约1／1200的几率dUTP分子的逃逸，细胞内的ung基因编码的尿嘧啶－N－糖苷酶（ungase）可以迅速地将已经掺入到DNA分子中的dUMP切除，形成一个无嘌呤或嘧啶的Ap位点（apurinic 或apyrimidinic），再由Ap内切酶进一步将Ap位点酶解成缺口，以与其对应的亲代链为模板 重新聚合和连接，完成切补修复过程.显然在先导链合成的初期过程中，约1200个核苷酸就有一个dUMP被切除的可能，在Ap内切酶未完全作用前提取DNA并进行变性分析，就会得到与冈崎片段相似大小的1000－2000核苷酸的片段，这种片段也被称为dUMP片段，Okazaki对dut－和ung－两种突变体的研究结果证实。在dut－突变体的脉冲标记实验中，由于dUMP掺入的几率增加，冈崎片段变短。而在ung－突变体的脉冲标记实验中，由于已掺入的dUMP被切除的几率降低，冈崎片段变长。冈崎选用连接酶突变体（lig-）进行的脉冲追踪实验中，先导链的dUMP片段均不能被连接成大片段，（图3－）。进一步证明了在脉冲标记实验中后随链的冈崎片段与先导链的dUMP片段均以相似大小表现在其研究结果中。1978年Olivera据此提出了DNA复制的半不连续模式。
第二节 DNA复制的酶学(Enzymology of DNA Replication)复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质共同参与.DNA复制的体系
底物： dNTP(dATP dGTP dCTP dTTP)聚合酶（polymerase): DNA-pol 依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP)模板（template): 解开成单链的DNA母链
引物（primer): 寡核苷酸片段,提供3’-OH末端,使dNTP聚合 其它酶和蛋白质因子: 解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶
一、DNA聚合酶
二、DNA连接酶（DNA Ligase）
三、与DNA几何学性质相关的酶
一、DNA聚合酶
催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。(一)DNA聚合酶催化的反应
5´→3´的聚合活性
5´→3´外切酶活性
3´→5´外切酶活性1、5´至3´的聚合活性
催化四种dNTP以磷酸二酯键一个一个地接到DNA链上去
(dNMP)n + dNTP →(dNMP)n+1 + PPi 聚合反应的特点：
(1)以单链DNA为模板
(2)以dNTP为原料
(3)引物或DNA链提供3´-OH(4)聚合方向为5´→3´2、3’－5’ 外切核酸酶活性
校对功能(proofreading)
3、5’－3’外切核酸酶活性(二)原核生物的DNA聚合酶（E.coli）
1957 Arthur Kornberg 首次发现
In fact, there are 5 polymerases to date, although we will focus only on 3 DNA pol Ⅰ DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ
1.DNA Polymerase I 2.DNA Polymerase Ⅱ和 Ⅲ
DNA pol Ⅱ：5` → 3`聚合酶活性及3` → 5`外切核酸酶活性。
DNA pol Ⅲ: 由10个亚基组成，分别为α、ε、θ、τ、δ、δ`、β、κ及ψ。是原核生物体内真正起复制作用的酶。
– α亚基： 5` → 3`聚合酶活性
– ε亚基：3` → 5`外切酶,校对和编辑 – θ亚基为装配所必须
亚基决定了Pol– III全酶的持续合成能力 3.三种大肠杆菌DNA聚合酶特性之比较
三种大肠杆菌DNA聚合酶的主要功能
DNApolⅠ----主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复。 DNApol Ⅱ----是主要的修复酶 DNApol Ⅲ----是主要的复制酶
三种DNA聚合酶在决定DNA合成方面的共同特性 ①三种酶都只有５’→３’聚合酶的功能，而没有３’→５’聚合酶功能，说明DNA链的延伸只能从5’向3’端进行。
②他们都没有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下进行链的延伸，因此，DNA的合成必须有引物引导才能进行。
③三种酶都有核酸外切酶的功能，可对合成过程中发生的错误进行校正，而保证DNA复制的高度准确性。
为什么子链DNA延伸方向只能是5’ →3’
二、DNA连接酶（DNA Ligase）
催化单链DNA切口上5’-P和3’-OH形成磷酸二酯键
三、与DNA几何学性质相关的酶
(一)解螺旋酶(helicase)
模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。
解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供能，解开DNA双链。
复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C… …dna X
相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C … …Dna X
Dna A：辨认复制起始位点
Dna B：解螺旋酶
Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结合并打开双链。(二)DNA拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。
拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。 拓扑异构酶I（topo I）
－蛋白。 在原核生物曾被称为
主要作用是切开DNA双链中的一股，使DNA解链旋转中不打结，DNA变为松弛状态再封闭切口。
反应不需要ATP 拓扑异构酶II（topo II）
• 在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。
• 能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接断端。TopoI和TopoII松弛DNA负超螺旋(三)单链DNA结合蛋白(SSB): 在大肠杆菌，它是由177个氨基酸残基组成的同四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位。
SSB与解开的DNA单链紧密结合，
①防止重新形成双链，维持模板处于单链状态；
②免受核酸酶降解。
表4 参与DNA复制的酶及蛋白质 酶或蛋白质 主 要 作 用
拓扑异构酶类 克服解链时打结及缠绕、松驰或引进负超螺旋 解链酶类 解开DNA双链
单链DNA结合蛋白 维持已解开单链DNA的稳定 引物酶 合成RNA引物 DNA聚合酶Ⅲ DNA复制
DNA聚合酶Ⅰ 水解引物、填补空隙、修复作用 DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接
小结
1、基本概念 DNA复制 复制子 复制体 复制时期
2、半保留复制
3、复制起点：结构特征
复制方向：复制叉 复制眼 单双向复制的决定条件 复制的多模式
复制方式：复制叉式（从头起始）
D环复制（置换式）
σ复制（滚环复制）
4、复制酶学
1）三种DNApol DNApolⅠ和Ш的主要活性和功能 聚合活性 外切活性(两种)延伸方向 2）DNA连接酶
3）和DNA的几何学性质相关的酶
螺旋酶 旋转酶
5、DNA复制的半不连续性
实验证据 先导链 后随链 4.3 Bacterial DNA replication 4.3.1 Initiation（起始）
4.3.2 Elongation（延伸）
4.3.3 Termination of DNA replication
4.3.1 Initiation（起始）
• Study system: the E.coli origin locus oriC is cloned into plasmids to produce more easily studied minichromosomes.• Initiation is divided into the following steps: – 1.recognition of the origin（识别原点）
– 2.separation of parental strands and stabilization of single strands（分开双链，稳定单链）
– 3.initiation of daughter strand synthesis through action of the PRIMOSOME（通过引发体起动子代链的合成反应）
How do we know that there is only one origin of replication in E.coli? • 假定每个染色体都在同样的一个起始点（i）开始复制，那么距 i近的基因将先被复制而复制得多些，远离i 的基因将复制得少些。因此在一个群体中离 i 点越近的基因出现频率越高。• 假如复制是
– 单向的，基因频率呈单向梯度
– 双向的，基因频率以 i 为中心呈双向梯度
How do we know that there is only one origin of replication in E.coli? 测定了大肠杆菌染色体上很多基因的频率，发现以OriC基因附近为中心呈双向下降。What does this experiment show? • There is a single place on the chromosome where replication starts • Replication proceeds in both directions • The two replication forks meet at near 31’ on the genetic map The structure of OriC OriC How is replication initiated? • DnaA protein binds to 9-mers(9nt聚合体)• DnaA together with HU类组蛋白 denature the DNA • DnaB helicase解旋酶 binds the open DNA Initiation of DNA replication in E.coli 1.initial complex（起始复合体）
• Along with the HU protein, the dnaA protein-ATP complex binds to the DNA, encompassing包围 the four nine-mers.In all, this complex covers about 200bp.（随同HU蛋白一起，dnaA protein-ATP 复合体结合到DNA上，包围4个9-mers区，总的覆盖200bp）
2.Open complex（开放复合体）和Prepriming complex(前引发复合体)
DnaA 蛋白使13bp重复单位熔解而形成开放性复合体，这一过程需要ATP。
这时DnaB 和DnaC蛋白进入DNA的熔解区与OriC结合形成前引发复合体。
Separated strands in the oriC region are prevented from reannealing by the binding of single-stranded binding protein(SSB protein).3.The primosome complex forms • A helicase(DnaB)begins to unwind the strands.• SSB binds to prevent reannealing.• Gyrase relieves the tension.旋转酶解除链的张力 • Primase引物酶 synthesizes a short strand of RNA.• Primase binds to dnaB protein at oriC and forms a primosome引发体.Let’s review the roles of the major players
• DnaA-Recognizes origin and denatures the duplex • DnaB-Helicase that unwinds the DNA • DnaC-Required for DnaB binding • HU-histone-like protein stimulates initiation • Primase(DnaG)Synthesizes RNA primers • SSB-Single stranded DNA binding protein • RNA polymerase Facilitates促进 DnaA activity • DNA gyrase Relieves torsional扭转的 strain • Dam methylase Methylates GATC sequences at oriC Review Initiation of DNA replication in E.coli 1)oriC contains four 9 bp binding sites for the initiator protein DnaA.Synthesis of DnaA is coupled联系 to growth rate so that initiation of replication is also coupled to growth rate.2)DnaA forms a complex of 30-40 molecules, facilitating促进 melting解链 of three 13 bp AT-rich repeat sequence for DnaB binding.3)DnaB is a helicase that use the energy of ATP hydrolysis水解to further melt the double-stranded DNA.4)SSB(single-stranded binding protein)coats the unwinded DNA to prevent DNA renaturing.5)DNA primase load to负担 synthesizes a short RNA primer for synthesis of the leading strand.4.Primosome(引发体): DnaB helicase and DNA primase 4.3.2 Elongation（延伸）
• Elongation involves another complex of proteins called the REPLISOME(复制体，复制颗粒).It is assembled from its components each time replication occurs.E.coli replication machinery(Elongation phase)1)Helicase---unwind DNA at replication fork in a reaction coupled to ATP hydrolysis 2)Single-stranded DNA binding proteins(ssb)---bind and stabilize the DNA in a single-stranded conformation after melting by helicases 3)Primosome---synthesizes RNA primers on lagging strand 4)DNA Pol III----the true E.coli replicase 5)DNA Topoisomerase II – relaxes supercoiled DNA that forms ahead of replication fork – decatenates the fully replicated DNA
6)DNA Pol I----replaces RNA primers with DNA by nick-translation 7)DNA ligase连接酶----joins Okazaki fragments Concurrent协同的 DNA Synthesis The lagging template strand is looped to invert the physical direction of synthesis, but not the chemical direction-DNA polymerase III functions as a dimer, with each core enzyme achieving synthesis on one or the other strand • If the polymerase complex is moving continuously along the leading strand, how does it discontinuously synthesize DNA along the lagging strand in the opposite direction?? 4.3.3 Termination of DNA replication
• Specific termination sites of DNA replication exist in E.coli.• Termination involves the binding of the tus gene product(tus protein)--ter binding protein, an inhibitor of the DnaB helicase（终止位点结合蛋白，是DnaB解旋酶的抑制剂）
• This ter binding protein may act to prevent helicase from unwinding DNA(will therefore halt停止 pol III and pol I action).• DNA replication produces two interlocking rings（连环）which must be separated.• This is accomplished via the enzyme topoisomerase.Termination of E.coli DNA replication Terminator sequences（终止序列）：
• Trap the replication forks（使复制叉受到限制）
• Contain sequences that facilitate decate-nation and partitioning of daughter chromosomes（包含促进连锁分开和姐妹染色体分开的序列）.• <300 bp • 需要TUS（Terminator Utilization Substance）识别终止序列
Summary of steps in E.coli DNA synthesis: 1.dnaA protein melts duplex in oriC region.2.dnaB(helicase), along with dnaC and ATP binds to replication fork(dnaC protein exits).(Pre-priming complex)
3.Single strand binding protein(ssb protein)binds to separated strands of DNA and prevents reannealing.4.Primase complexes with helicase, creates RNA primers(pppAC(N)7-10)on the strands of the open duplex2(Primase+helicase constitute the Primosome).5.After making the RNA primers, DNA pol III holoenzyme comes in and extends the RNA primer(laying down dNTP's)on the leading strand.4.As the replication fork opens up(via helicase + ATP action)leading strand synthesis is an uninterrupted不间断的 process, the lagging strand experiences a gap.7.The gap region of the lagging strand can wind旋紧 around one active site unit of the Pol III complex, and bound阻止 Primase initiates an RNA primer in the gap region.8.On the lagging strand, Pol III extends the RNA primer with dNTP‘s as the lagging template strand is looped through the Pol III complex.9.After synthesis of a nascent初始 fragment the lagging strand loop is released and the single strand region further up near the replication fork is subsequently looped through the Pol III complex.10.Steps 7-9 are repeated.11.Meanwhile其间, Pol I removes the RNA primer regions of the Okazaki fragments via 5' to 3' exonuclease activity(nick translation Pol I exits and ligase joints the DNA fragments(on lagging strand).4.4 Eukaryotic DNA replication 4.4.1 Experimental system 4.4.2 cell cycle 4.4.3 initiation 4.4.4 replication forks 4.4.5 nuclear matrix 4.4.6 telomere replication 4.4.1 Experimental systems • Yeast(Saccharomyces cerevisiae)酵母: has much smaller genome(1.4 X 107 bp in 16 chromosomes)and only 400 replicons.• SV40(simian virus 40 猿猴病毒40, 5 kb): is good mammalian models for replication fork.• Cell-free extract 无细胞提取物prepared from Xenopus laevis(非洲爪蟾)eggs containing high concentration of replication proteins and can support in vitro replication.4.4.2 细胞周期（cell cycle)的调控 1.细胞周期4个时期 2.检验点及其调控
3.细胞周期蛋白和依赖于细胞周期蛋白的激酶
1.细胞周期4个时期
• cell cycle——细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的一个有序过程。• 细胞周期时相组成：
• 间期(interphase): G1 phase，S phase，G2 phase，细胞可由G1期进入一个非增殖期——G0期或称静止期。
• M phase: 有丝分裂期(Mitosis), 胞质分裂期(Cytokinesis)2.检验点（Checkpoint）及其调控
• 细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制。
• 细胞周期随细胞周围的环境而调整，以免受损伤的细胞发生增殖。
• 检验点是当外界条件不适合细胞分裂时，可以中断细胞周期的一些阶段。
• 主要检验点位于G1和G2的后期，在G1期的R点，当缺乏促细胞分裂原时，细胞会脱离细胞周期进入非增殖的G0期。
3.细胞周期蛋白和依赖细胞周期蛋白的激酶
细胞周期是通过多种蛋白激酶复合物催化的蛋白磷酸化来实施调控的，这些复合物包含: regulatory subunits（调节亚基）
——Cyclin（细胞周期蛋白）catalytic subunit（催化亚基）
——Cyclin-dependent kinase(CDK)（依赖细胞周期蛋白的激酶）
不同的复合物调控细胞周期中的不同时期。 图Cyclin-dependent kinase(Cdk)4.4.3 Origins and Initiation Origins and Initiation（起始点与起始）ARS（自主复制序列）
Licensing factor controls eukaryotic replication（特许因子）Differences in DNA between eukaryotes and prokaryotes Eukaryotic genomes are much bigger
Replication in eukaryotes occurs during a small portion of the cell cycle DNA in eukaryotes is bound by histones Eukaryotic chromosomes are linear
图Multiple Replication Origins Origins and Initiation（起始点与起始）
• Only once in one cell cycle(每个细胞周期只有一次复制）
• Clusters of about 20-50 replicons(复制子)initiate simultaneously at defined times throughout S-phase（20-50个复制子在S期同时起始复制）
• Initiation of each replicon within an initiation zone may occur at random（复制子可能在起始区域内的任意位置起始）
不同区域的染色质起始复制的时间不同
• Early S-phase: euchromatin(常染色质)replication • Late S-phase: heterochromatin(异染色质)replication • Centromeric(着丝粒的)and telomeric(端粒的)DNA replicate at last Origins（起始点）
Yeast origin: the minimal 11 bp consensus: [A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T] Bound by origin recognition complex(ORC起始识别复合体)activated激活 by CDK.ARS: Autonomously Replicating Sequence（自主复制序列）。单细胞酵母的复制起点克隆进原核生物的质粒，由于这些复制起点序列允许质粒在酵母中复制而被称之为ARS。The yeast ARS Licensing factor controls eukaryotic replication（特许因子控制真核生物DNA复制）Licensing factor controls eukaryotic rereplication DNA Replication • The machinery of replication – Additional features of eurkaryotic cells • One replication per cycle – control • The origin of replication – passage through a series of steps » Origin of replication bound by ORCs » Licensing factors bind assemble the prereplication complex » Licensing factors – at least six – Mcm2-Mcm7 » Mcm proteins move with the replication fork » Mcm proteins are then displaced from DNA but remain in nucleus » Mcm proteins cannot reassociate with an origin of replication which has already ‘fired’
4.4.4 replicaton fork • The machinery of replication：
• Additional features of eurkaryotic cells – Chromatin structure • Nucleosomes and the replication fork – Histones – H3H4 tetramers四聚体 remain intact and are distributed between the daughter duplexes – Old and new H3H4 tetramers found on each duplex – H2A/H2B dimers – separate and bind randomly to H3H4 tetramers already in place Replication of Nucleosomes Eukaryotic DNA is packaged with histones in structures called nucleosomes.What happens to the nucleosome when the replication fork and the replication machinery pass by and open up the DNA double strand? Nucleosomes are found properly spaced on both postreplicative DNA strands immediately after passage of replication fork.图A model for nucleosome replication 图A model for nucleosome replication Nucleosome and Replication fork New nucleosomes are assembled to DNA from a mixture of old and newly synthesized histones after the fork passes.Eukaryotic DNA synthesis • DNA synthesis is very similar in prokaryotes and eukaryotes • Many of the same enzyme activities are present – Helicases – Primases – Polymerases – ligases – Topoisomerases 4.4.5 Nuclear Matrix（核基质）
Nuclear matrix: Replication is spatially organized by a protein scaffold of insoluble不溶的 protein fibers.Replication factories are immobilized固定 on this matrix and the DNA moves through them.A scaffold of insoluble protein fibers which acts as an organizational framework for nuclear processing, including DNA replication, transcription Replication factories 4.4.6 Telomere replication ——The problem of linear replications • Telomere replication • Solving the problem of lagging strand synthesis--Chromosomal ends shortening 4.5 Regulation 0f DNA replication 4.5.1 大肠杆菌染色体DNA的复制调控 4.5.2 质粒DNA的复制调控 4.5.3 真核细胞DNA的复制调控 4.5.1大肠杆菌染色体DNA的复制调控
• 染色体的复制与细胞分裂同步但不直接偶联.• 复制子由复制起始物位点和复制起点组成：
– 复制起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起点与调节蛋白作用启动复制。
– 基因编码的调节蛋白通过与复制复合物的相互作用确定复制起始频率和复制方式。4.5.2 质粒DNA的复制调控
• ColE1质粒DNA复制不依赖于本身编码的蛋白质，而完全依赖宿主DNA聚合酶。4.5.3 真核细胞DNA的复制调控
（1）细胞生活周期水平调控：限制点调控，真核细胞DNA的复制发生在S期，促使细胞由G1期进入S期的多种因子调控；
（2）染色体水平的调控：决定复制子起始顺序
（3）复制子水平的调控：复制子参与的多种因子均可参与调节，主要是复制起始调控，如酵母复制起始受时序调控。Summary Bacterial DNA replication – Initiation – Elongation – Termination of DNA replication
Eukaryotic DNA replication – cell cycle – Initiation – replication forks – telomere replication 原核生物与真核生物DNA复制的不同点 不同点 原核生物 真核生物 起始位点 一个 多个(多至千个)前导链合成 DNA聚合酶Ⅲ DNA聚合酶δ 随后链合成 DNA聚合酶Ⅲ DNA聚合酶α 引物长短 50～100个核苷酸 10个核苷酸
冈崎片段长短 1000～2000个核苷酸 100～200个核苷酸 RNA引物水解 DNA聚合酶Ⅰ 核酸酶H 修补缺口 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶β 复制速度 快 慢
Regulation 0f DNA replication ─ 大肠杆菌染色体DNA的复制调控 ─ 质粒DNA的复制调控
─ 真核细胞DNA的复制调控
第二篇：分子生物学电子教案第二章
第二章 核酸的结构和功能
1、主要内容
v 细胞内的遗传物质
v 核酸的化学组成与共价结构
v DNA的二级结构
v DNA分子的高级结构
v 真核生物的染色体及其组装
v RNA的结构与功能
v 核酸的变性、复性与分子杂交
2、教学要求
v 掌握遗传物质的只要特点和种类；
v 掌握DNA双螺旋结构特点，核酸的变性、复性和分子杂交原理；
v 熟悉核酸的物理化学性质
v 熟悉DNA 多种高级结构
第一节 细胞的遗传物质
一、DNA携带两类不同的遗传信息
1.遗传物质必须具有的特性
a.贮存并表达遗传信息
b.能把信息传递给子代
c.物理和化学性质稳定
d.具有遗传变化的能力
l DNA的特征
a)各异的碱基序列储存大量的遗传信息
b)碱基互补是其复制、转录表达遗传信息的基础
c)生理状态下物理、化学性质稳定
d)有突变和修复能力，可稳定遗传是生物进化的基础
！遗传物质核酸是如何被证明的？
2、DNA携带两种遗传信息
a、编码蛋白质和RNA的信息(编码tRNA、rRNA)：64个三联体密码子：3个终止密码子，编码氨基酸的61个密码子具有简并性、通用性
b、编码基因选择性表达的信息
¨原核生物的结构基因占Genome的比例很大，Φx174phage 5386bp，结构基因用去5169bp比例达96％。
¨真核生物的结构基因占Genome的比例很小，哺乳动物中结构基因只占10％～15％。
¨其余80％以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息。
¨表现在：细胞周期的不同时相中
个体发育不同阶段
不同的器官和组织
不同的外界环境下各种基因的表达与否以及量的差异
¨所以又称－－调控序列
二、RNA也可作为遗传物质
n RNA病毒：传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳）
n Tobacco Mosaic Virus
(TMV)
n 类病毒（viroid）: 使高等植物产生疾病的传染性因子，只由RNA组成。
三、是否存在核酸以外的遗传物质
n Prion(proteinaccous infections particle)引起的**
n 朊病毒－－－蛋白质样的感染因子
1)羊搔痒病(scripie)
2)人类库鲁（kuru）病
3)牛海绵状脑炎(疯牛病)
n 均由传染性病原蛋白颗粒引起，统称Prion(朊病毒)资料：1982年，美国加利福尼亚大学教授斯坦利?普利西纳提出雅克氏病的病原体是一种“蛋白质性质的感染颗粒”，并用prion（普利昂）一词表示这种因子，国内曾译为朊病毒或锯蛋白。但这种蛋白质粒子缺乏核酸，称为病毒并不妥当，故现在称为朊毒体。
疯羊病、疯牛病及人类所患的新型雅克氏症等海绵状脑病，都是由朊毒体发生变异引起的。包括人在内的哺乳动物体内都存在朊毒体，它在正常形态下呈折叠状，但变异时会张开如同锯齿状，在大脑中撑出大量的小洞，引起人或动物患上痴呆型的传染性海绵状脑病。
朊毒体的致病过程是：首先经一定传播途径（如进食患病动物的肉和内脏）侵入机体并进入脑组织，其后沉积于不同的神经元溶酶体内，导致被感染的脑细胞受损、坏死，释出的朊毒体又侵犯其它脑细胞，使病变不断发展；病变的神经细胞死亡后，脑组织中留下大量小孔呈海绵状，并出现相应的临床症状，这就是众所周知的海绵状脑病。
普利西纳学说公布之初，在学术界曾遭到猛烈反对，多数人持否定态度。因为分子生物学的中心命题是“生物的遗传基因以核糖核酸和脱氧核糖核酸为本体”，在此之前，人们普遍认为，不存在没有核酸的病原体，这已成为常识，但普利西纳的学说却与这种认识背道而驰。经过10多年的研究和争论，大量事实确证了朊毒体的存在，普利西纳的学说最终得到了认可。鉴于这一发现的重大科学价值，普利西纳荣获1997诺贝尔生理学或医学奖。
第二节 核酸的化学组成一、含氮碱基、核苷、核苷酸
l DNA is a nucleotide polymer with covalent bonds between the sugar and Phosphate groups.l A long molecular chain containing a sugar, a phosphate and one of four different nucleotide bases.l Chemical Composition（化学组成）:
Sugar(糖): Deoxyribose(ribose核糖in RNA)Phosphate(磷酸):-phosphodiester
Bases(碱基):(G)guanine
(C)cytosine
(A)adenine
(T)thymine！稀有碱基：假尿苷（）、二氢尿嘧啶（DHU）、2`-O-甲基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷。
名称与缩写(1)¡ RNA：ribonucleic acid
核糖核酸
¡ DNA：deoxyribonucleic acid
脱氧核糖核酸
¡ pyrimidine：
cytosine(Cyt)
胞嘧啶
嘧啶
thymine(Thy)
胸腺嘧啶
uracil(Ura)
尿嘧啶
¡ purine：
adenine(Ade)
腺嘌呤
嘌呤
guanine(Gua)
鸟嘌呤
名称与缩写(2)¡ ribonucleoside
核糖核苷（不带磷酸）
adenosine(Ado)
腺(嘌呤核)苷
guanosine(Guo)
鸟(嘌呤核)苷
cytidine(Cyd)
胞(嘧啶核)苷
thymidine(Thd)
胸(腺嘧啶脱氧核)苷
uridine
(Urd)
尿(嘧啶核)苷
¡ ribonucleotide
核糖核苷酸（带磷酸）
adenosine 5’-mono(di, tri)phosphaste；
AMP, ADP, ATP ¡ deoxyribonucleoside
脱氧核糖核苷
deoxyadenosine(dAdo)…… ¡ deoxyribonucleotide
脱氧核糖核苷酸
dAMP, dADP, dATP……dNTP
二、DNA分子的一级结构
1.多聚核苷酸链主链是核糖和磷酸，侧链为碱基，由3’,5’磷酸二酯键连接
2.链的方向：同一个磷酸基的5’酯键到3’酯键的方向(5’→3’)
3、DNA一级结构的特点
a.脱氧核糖是其显著特点－－－－DNA极其稳定的根本原因
b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平面的c、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的
n 主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在生理条件下离解为负离子, 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象。
4、一级结构的概念
n 指DNA分子中的核苷酸排列顺序
n 不同生物借此贮存遗传信息
n 决定DNA的二级结构和高级结构
第三节 核酸二级结构
一、DNA双螺旋模型的提出
依据
n a.1938.W.T.Astbury 首次用X－射线分析DNA
n b.1950 Chargaff
A + G / T + C = 1
A+T ≠
G + C n c.1952 Alexander Todd
发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接
n d.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin
得到了高度定向的DNA纤维的X-射线照片
发现原子长轴存在0.34和3.4nm两种周期性
n 此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组成，且直径恒定（2nm)。
Watson-Crick的DNA双螺旋
n 两条相互独立的单链DNA分子以螺旋方式相互缠绕，形成右手双螺旋；
n 带有负电的戊糖-磷酸骨架在分子的外侧；
n 碱基则平面堆积于螺旋的内部；
n 由于骨架双链在螺旋轴上的间距不相等，从而在分子表面形成大沟和小沟。大沟和小沟。双螺旋表面的沟对DNA和蛋白质的相互识别是很重要的，因为在沟内才能觉察到碱基的顺序，而在双螺旋的表面，是脱氧核糖和磷酸重复结构，没有信息可言。（蛋白质
核酸，核酸
核酸、锌指结构）
n
双螺旋模型参数
n 直径20Å
n 螺距为34Å(任一条链绕轴一周所升降的距离)n 每圈有10个核苷酸(碱基)
n 两个碱基之间的垂直距离是3.4Å。螺旋转角是36度。
n 有大沟和小沟，配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称。
二、影响双螺旋结构稳定性的因素
氢键
范德华力（Van de waals force）
疏水作用力(Hydrophobic interaction)* 不稳定因素
n 磷酸基团间的静电斥力
n 碱基内能增加(温度), 使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱
三、双螺旋结构多样性
B-DNA：资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维。
此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋Z构象等形式。
DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同一种双螺旋结构内参数存在差异的现象。
原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键，磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键。
第四节 DNA的高级结构
1、反向重复序列与二级结构
n 反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted
repeats, IR）,又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向。有时也有不完全相同的情况。
¨RNA和DNA中都可能存在
n 此外还可有directed repeatitive sequence---正向重复序列
n 较短的回文序列可能是作为一种信号
n
如：限制性内切酶的识别位点
n
一些调控蛋白的识别位点
n 例如限制性内切酶 EcoRⅠ的识别位点
5′－－GAATTC－－3′
3′－－CTTAAG－－5′
2.DNA(Trible Helix DNA, T.S DNA)的三股螺旋结构
（1）发现和证实
1953年，Watson & Crick D.S DNA model证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体
潜在的专一与DNA(蛋白质)结合的能力
形成T.S DNA 可能性
1957 年Felsenfeld等发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链
如： polyA/polyU
polydA/polydT
polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出
1987年Mirkin.S.M证明plasmid DNA在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在，这些发现促进了三螺旋DNA的研究
（2）组成形式
a、D.S.DNA + D.S.DNA→T.S.DNA + S.S.DNA b、分子组成
☆ PY/PU + PU(偏碱性介质中稳定)
G＊G、A＊A、G＊C＋
☆ PY/PU + PY(偏酸性介质中稳定)常见类型
G＊C＋
A＊T
3、四股螺旋DNA(tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA 结构特点：基本结构单元－－鸟嘌呤四联体
可能的功能：
A、稳定真核生物染色体结构
B、保证DNA末端准确复制
C、与DNA分子的组装有关
D、与染色体的meiosis & mitosis 有关
4、DNA的超螺旋结构
⑴超螺旋(superhelix
OR
supercoil)的形成和类型
l形成
松驰态DNA（relax form）
低能量
常态
超螺旋（Supercoied）DNA
正超螺旋
负超螺旋
DNA的超螺旋结构
正超螺旋（positive supercoiled）紧缠overwinding(右旋)负超螺旋（Negative Supercoiled）
松缠unwinding(左旋)原核生物DNA的三级结构：
n 绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。
⑵超螺旋的定量描述
n White方程： L=T+W
n 连接数L（Linking nnmber）：指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数。其特点是
(1)L是整数；
(2)在cccDNA的任何拓扑学状态中其值保持不变；
(3)右手螺旋对L取正值。
n T（Twisting number）：盘绕数，即DNA分子中Watson-Crick螺旋数，初级螺旋圈数。其特点是：
(1)可以是非整数；
(2)是变量；
(3)右手螺旋时T为正值。
n W（Writhing number）：超盘绕数，即超螺旋数，直观上为双螺旋在空间的转动数。其特点是：
(1)可以是非整数；
(2)是变量；
l(3)右手螺旋时，W取负值。
l 拓扑异构酶解超螺旋的特点。
第五节 真核生物的染色体及其组装
一、真核细胞染色体组成
1、组成：DNA和蛋白质,以及少量的 RNA.2、染色体体和染色质的概念
v 染色质(chromatin)：是指细胞周期间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA组成的复合结构，因其易被碱性染料染色而得名。
v 染色体(chromosome)：是指在细胞分裂期出现的一种能被碱性染料强烈染色，并具有一定形态、结构特征的物体。携带很多基因的分离单位。只有在细胞分裂中才可见的形态单位。
！分类：
v 常染色质(euchromatin)
（间期纤丝的包装密度度比分裂期染色体的要小很多）
v 异染色质(heterochromatin)
（间期纤丝染色质区的包装密度十分致密，可与有丝分裂期染色体相比）
组成型异染色质(constitutive
heterochromatin)
兼性异染色质(facultative heterochromatin)
3、染色体中的蛋白质
组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3和H4。其特性：
v 进化上的极端保守性
不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3和H4。
v 无组织特异性
到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白两个例外。
v 肽链上氨基酸分布不对称性
碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
v 组蛋白的修饰作用
包括甲基化、乙酰化、磷酸化及ADP核糖基化等。
v 富含赖氨酸的组蛋白H5
非组蛋白：
(1)HMG 蛋白（high mobility group protein）, 这类蛋白可能与DNA的超螺旋结构有关。
(2)DNA结合蛋白
可能是一些与DNA复制或转录有关的酶或调节物质。
(3)A24非组蛋白
位于核小体内功能不详。
4、核小体的形成
八聚体在中间，DNA盘绕在外而H1则在核小体的外面，每个核小体只有一个H1。所以核小体中组蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A，H2B，H3，H4各两个，H1各一个。
5、染色体的高级包装
v 核小体的形成是染色体压缩的第一阶段，约1/7；
v 螺旋管的每个螺旋包含6个核小体，压缩比为6；
v 中期的染色质是一个细长中空的圆筒，为400nm, 由30nm螺旋管缠绕而成，压缩比为40;
v 这个超螺旋圆筒进一步压缩1/5便成为染色单体，总压缩比是7x6x40x5，将近10000倍。
第六节 RNA的结构与功能
一、RNA 的功能：
l 信息分子
遗传信息由DNA到蛋白质的中间体 的核心作用。
l 功能分子
1.作为细胞内蛋白质生物合成的主要参与者，参与在蛋白质合成中核蛋白复合物的结构组成和功能发挥；
2.具有生物催化的功能，作用于初始转录产物的剪接加工；
3.与生物机体的生长发育密切相关，参与基因的表达调控；
4.与生物体的进化有很大的关系。
5.核糖体
6.信息体
7.拼接体
8.编辑体
二、RNA的分类
v mRNA的结构
v tRNA的结构
v rRNA的结构
v snRNA v snoRNA
v 非编码mRNA！每种RNA的基本结构和功能！！！
第七节 核酸的物理化学性质
DNA双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征，也是DNA研究中一些实验技术的基础。
一、DNA分子的变性
1、条件：加热，极端pH，有机溶剂（尿素、酰胺)，低盐浓度等
2、变性过程的表现
¤ 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很窄的温度范围
¤ 导致一些理化性质发生剧烈变化
3、熔解曲线与Tm值
缓慢而均匀地增加DNA 溶液的温度（现可做到 0.1 ℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线。
Tm=℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃)或DNA双螺旋结构失去一半时的温度
这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94 ℃的原因。
4、影响 Tm值的因素
（1）在 A, T, C, G 随机分布的情况下，决定于GC含量
n GC%愈高
→
Tm值愈大
n GC%愈低
→
Tm 值愈小
（2）GC%含量相同的情况下
AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小。
碱基排列对Tm值具有明显影响
生物体内仅UAA为最有效的终止密码子
n 因为：UAA、AUU的Tm值是最低的一个，即使生理温度下也不稳定。
二、DNA分子的复性
（anneal or renaturation）
n 概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火）。
根据复性动力学公式我们可以知道什么？
(1)单链浓度随着时间的增大而减小；
(2)反应速率取决于初始的单链浓度Co；
(3)以反应浓度和COt1/2为座标可绘复性曲线;(4)通过COt1/2值可测原核生物基因组的大小;
已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec
则
(5)原核生物基因组大小不同，复性曲线也不同;(6)可用以区分真核生物和原核生物基因组。
在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些法来检测？
(1)减色效应（hpochromic effcef）
测定光密度，即OD值(optical density），DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2)羟基磷灰石柱层析
羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易吸附单链。
四、核酸分子杂交（hybridization）※ 杂交形式：
n 液相杂交
n 固相杂交(滤膜杂交)¨1975 E.M.Southern ¨Southern blot
S.S.DNA × S.S.DNA ¨1977.J.C.Alwine ¨Northern blot
S.S.RNA × S.S.DNA ¨1978.Hany Towbin ¨Western blot
Protein(antigen)× antibody ＊固相分子杂交(1975 E.M.Southern)
！复习思考题
1、碱基、核苷、核苷酸的化学组成2、核酸的一级结构
书写方向
3、Watson ＆ Crick 的Double Helix Model
参数
大小沟
二级结构的多态性
4、影响二级结构的作用力：
稳定因素
不稳定因素
5、DNA的不寻常结构：
反向重复序列
三螺旋DNA
四链DNA
6、真核生物的染色体：核小体的组成和组装
染色体的多级包装
7、RNA的种类及其相关结构和功能与及应用
8、变性：溶解曲线
Tm
影响因素（GC、化学试剂、盐、pH）
9、复性
C0t曲线
C0t（1／2）
10、核酸分子杂交的类型
11、DNA的超螺旋结构
形成、类型
组蛋白和非组蛋白
第三篇：分子生物学电子教案第六章
第六章 遗传重组
1．课程教学内容(1)同源重组(2)位点特异性重组(3)转座重组(4)逆转座子 2．课程重点、难点 几种重组的机理。3．课程教学要求
（1）理解重组产生的遗传效应；（2）掌握不同重组产生的机理。
一、概述
重组是完整DNA分子的断裂和重接
1930年，细胞学观察：染色单体断裂，重接，发生交换。
1955年，遗传学家发现交换可以发生在基因内部，推测重组是在复制时发生的，拷贝选择（copy choice）。
结论：重组是DNA分子断裂后重新连接形成的。更进一步研究证明末复制的DNA分子也可以发生重组。
遗传重组 广义地说，任何造成基因型变化的基因交流过程都称为遗传重组。狭义上的遗传重组指涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流。
根据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求，可以分为四类包括：
– 同源重组（homologous recombination）
– 位点专一性重组（site-specific recombination）
– 转座重组（transposition），被移动的DNA片段叫转座子（transposon）– 异常重组
同源重组 发生在DNA的同源序列之间。真核生物非姊妹染色子体的交换、细菌及某些低等真核生物的转化、细菌的转导、接合、噬菌体的重组都属于这种类型。大肠杆菌的同源重组需要RecA蛋白。
位点特异性重组 发生在两条DNA的特异性位点上，λ噬菌体DNA通过其attp位点和大肠杆菌DNA的attB 之间的位点特异性重组而实现整合过程 转座过程中，转座成分从染色体的一个区段转移到另一个区段或从一条染色体的转移到另一条染色体。转座作用既不依靠转座成分和插入区段的同源性，又不需要RecA蛋白质。由于转座作用总是伴随着转座成分的复制，故又称为复制重组。
异常重组不需要DNA序列的同源性和RecA蛋白质，而且它也不需要转座酶。
二、同源重组的机制
同源重组的行为本身是DNA序列的交换：两个同源的DNA双螺旋分子相互接近，接触，然后有关的部分发生交换。它的特征是任意一对同源系列都可以作为底物由有关的酶催化重组。这些酶对DNA无碱基序列的特异性，只要两个DNA序列相同或接近相同，就可催化重组。
同源重组发生在染色体上具有相同或相近序列的DNA区域 重组的起动需要DNA分子上有断裂或缺口
事实表明，DNA断裂能够大大提高重组率。因此紫外照射、X光和一些能够使DNA断裂的化学物质可大大提高重组率。在大肠杆菌中，DNA 聚合酶Ⅰ和连接酶基因的突变也有同样作用。酵母整合载体，若是线状则可提高整合率1000倍。
RecA 蛋白使单链DNA与染色体上互补序列配对。RecA蛋白: – 依赖于DNA的水解三磷酸核苷的功能 – 在两条互补的单链间促进配对的功能 – 依赖于ATP和寡聚核苷酸的蛋白水解酶的
Rec A蛋白能专一性地识别单链DNA，使它与同源染色体双链DNA的互补序列退火，替换原来的互补链。
Rec A蛋白以一定比例与单链DNA结合，一般1个蛋白多肽5个核苷酸，形成DNA-蛋白丝。在ATP存在时，Rec A可使双链解旋，形成新的杂种DNA。
在有些噬菌体，如T7和λ噬菌体中，仅有核酸酶和SSB，随机碰撞可重组。高等生物的重组需要Rec A蛋白。Rec BCD和其它蛋白在重组中的作用
若没有Rec BC，在细菌接合过程中重组率可降低100倍，这种复合酶大约300kd，具有DNA解旋和核酸酶的活性。它可以帮助有游离末端的DNA形成单链DNA片段，从而有利于RecA 蛋白作用。它识别并切割Chi序列：5'GCTGGTGG-3' 在大肠杆菌接合过程中易形成双链DNA游离末端，在P1噬菌体转导和λDNA侵染的细胞中RecBC对重组率影响极大。
一种核酸酶切开霍利迪结合点，从而完成重组。霍利迪结构 它是DNA重组过程中的一个中间体，重组时两个DNA双链体以四股DNA在连结点形成的十字形DNA分子构象。
异源双链体(Heteroduplexes)：异源双链体是指重组DNA分子上两条链不完全互补的区域。
分支迁移（Branch migration）：一旦两个重组的DNA分子形成霍利迪结构，交叉连接点很容易像拉链一样移动，从而扩大异源双链体区域，这一程 叫分支迁移。
三、位点专一性重组
是指噬菌体基因组插到细菌的染色体中，这个过程也叫整合（integrate），需要噬菌体DNA与细菌DNA的专一序列。
在位点专一性重组中没有DNA的合成，每条DNA链上的断裂和重接十分精确。λ噬菌体的整合和解离
λ 噬菌体：裂解周期和溶源化周期。
附着位点（attachment site，Att）：大肠杆菌23bp；噬菌体 240bp，相同的核心序列。
整合需要整合酶(integrase，int)和一种细菌蛋白integration Host factor(IHF)；解离需要Xis gene产物，int和IHF。
在溶源lysogenic周期中，噬菌体λ DNA是细菌染色体的一个整合部分，成为原噬菌体prophage。
在裂解lytic周期中，λDNA以独立的环状分子存在于被侵染的细菌中。两种状态的改变就包括了位点专一性重组。要进入溶源状态，游离的λDNA必须被整合(integrate)进寄主DNA；要从整合的溶源状态释放，进入裂解状态，原噬菌体DNA必须从染色体上剪切下来excise。
整合作用 整合与剪切发生在噬菌体和细菌的特殊位点上，这个位点叫附着点attachment site（att）。细菌的位点叫attB，由BOB’组成。噬菌体的位点叫attP，由POP’组成。序列O是att B和att P的共同序列，叫核心序列core sequence，重组就发生在这里。侧翼的序列B、B’、P、P’是臂，序列各不相同。原噬菌体由重组产生的新位点界定。左边的位点叫att L，由BOP’组成，右边的位点叫att R，由POB’组成。整合作用发生在att B和att P之间（att B×att P），而剪切作用发生在att L和attR之间（att L×attR），四、转座子重组（Recombination via transposon）重组不依赖DNA的序列，使一段DNA序列从染色体的一个位置移动到另一个位置，甚至从一个染色体移动到另一个染色体，这种重组叫转座重组（transposition），被移动的DNA片段叫转座子（transposon）。
转座子（或transposalole elements）：可以转移到新位置的DNA序列。
转座因子可以直接或间接造成基因组重排： ① 直接造成缺失一倒位或序列移位。② 作为小的同源区域在细胞同源重组体系作用下，相互重 组造成缺失、插入、倒位和易位(translocation)。1 细菌中的转座重组
简单转座子、复合转座子、转座的机制、TnA家族的转座子 1）简单转座子
• 最简单的转座子就叫插入序列(Insertion sequences ,IS)。λ:IS1表示IS1插入λ噬菌体的基因组。
• IS序列可以编码自己转座所需的转座酶.IS两端带有反向重复序列，中间是一个转座酶基因，不带其它标记基因。
• 在IS 转座时，插入位点的DNA序列重复了(正向重复)。不同IS插入位点不同，但重复序列大多为5-9bp。
• 每个插入序列的末端都是短的反向末端重复序列inverted terminal repeats，两个反向末端重复序列往往很相似但不一定相同。不同IS序列转座率不同，一般每代为10-3—10-4。
• 转座完成后，靶位点形成两个拷贝，位于转座子的两端，形成同向重复序列direct repeats。
2）复合转座子Composite Transposons • 有些转座子除了与转座有关的功能外，还带有抗药性或其它标记，这些转座子命名为Tn加数字。复合转座子是一种大的转座子，中间区带有抗药标记，两边各带一个由IS因子组成的臂，这两个臂可以是同向或反向的。
• 由于IS序列成为复合转座子的一个组成部分，所以又把IS序列称为IS元件module。因为每个元件都有一对反向末端重复，所以整个复合转座子的末端也是反向重复序列。• 转座使靶位点加倍。
• Tn5的两个边界IS50R序列只差一个碱基，IS50R是有功能的，IS50L无转座功能
3）TnA家族的转座子
• Tn A家族的转座子不与IS元件复合，只含有长度为37－38bp的反向末端重复。• 这类转座子在靶位点上产生5bp的同向重复。
• TnA家族转座子的运动需要转座 酶的作用，解离需要一个特殊解离位点，这是TnA家族的特征。
• 这类转座子含有3个基因，beta-内酰胺酶，解离酶，转座酶。4）转座子的转移机制
① 转座子能够精确的转座，带着在原来位置上的所有DNA序列，而不带任何相邻序列，这可能就涉及到转座酶能够准确地识别两个转座子的末端。② 在目标DNA的位置有3-12 个碱基(决定于转座子)被精确地复制了，在转座子两端各有一个拷贝。所以，在转座子过程中一定有DNA的合成。③ 虽然大部分转座子可插入基因组任何区域，但它们的移动也不是完全随机的，而是更易于插入某些区段。5）转座作用的遗传效应
• 转座引起插入突变 各种IS, Tn 都可以引起插入突变
• 转座产生新基因 如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突变，同时也使这个位点带有抗药性
• 转座产生染色体畸变 当复制性转座发生在缩主染色体DNA原有的位置附近时，往往导致转座子两个拷贝的重组，引起DNA的缺失和倒位。当重组发生在两个正向重复转座区之间，就导致宿主染色体缺失。如果重组发生在两个反向重复转座区，则引起染色体DNA 倒位。• 转座引起生物的进化 6）转座子转座的特征
• 转座不依赖于靶序列的同源性 • 转座后靶序列重复 • 转座子的插入具有专一性 • 转座子具有排它性 • 转座具有极性效应 • 活化邻近的的沉默基因 • 区域性优先 2真核生物中的转座 1）玉米的转座子
四十年代玉米遗传学研究发现，在体细胞分裂过程中所发生的变异是由一些控制因子(controlling elements)决定的，这些因子可以从一个位置移动到另外一个位置。这些控制因子是由McClintock 鉴定的，现在都可以认为是转座子。
• 自主成分autonomous elements：它们具备使自身切除或转座的能力，它们可在任意位点插入并产生不稳定的或可变化的等位基因。• 非自主成分nonautonomous elements：它们只有在同家族的自主成分存在时才能切除或转座，它们自身很稳定，不能单独移动。非自主成分由自主成分衍生而来，当自主成分丢失了某些对转座必需的功能后，就形成了非自主成分。
玉米有几组不同的控制因子，每组又都有自主型和非自主型（autonomous and nonautonomous elements）。
2）果蝇的转座子
果蝇的P转座子引起的杂种不育
3）逆转录转座子
• 逆转录转座：将从DNA到DNA的转移过程称为转座，从DNA到RNA到DNA的转移过程称为逆转座子。
• 经RNA中间体介导的转座是真核生物所特有的过程。逆转录病毒能够将RNA病毒基因组的DNA拷贝整合到宿主细胞染色体中。
• 逆转录子：一类移动因子在转录过程中需要以RNA为中间体，经过逆转录再分散到基因组中。• 酵母的Ty转座子 • 果蝇的copia转座子 逆转录子的结构特点：
• 逆转录子转座关键酶是逆转录酶和整合酶 • 逆转录子自身编码逆转录酶和（或）整合酶 • 结构特征：
具有与逆转录病毒类似的长末端重复，并有gag和pol基因。如酵母的Ty, 果蝇的copia和gypsy,人类的THEI。不具有LTR，但有3polyA,中心区含有gag，pol类似序列。如果蝇I因子，哺乳类的长分散因子L1.
第四篇：分子生物学电子教案第九章剖析
第九章 分子生物学研究方法
1．课程教学内容
(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序
(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术 2．课程重点、难点
基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术 3．课程教学要求
掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容
• 核酸的凝胶电泳 • DNA分子的酶切割 • 核酸的分子杂交 • 基因扩增
• 基因的克隆和表达 • 细菌的转化 • DNA核苷酸序列分析 • 蛋白质的分离与纯化
• 研究DNA与蛋白质相互作用的方法
一、核酸的凝胶电泳
基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的 分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix(胶支持物)is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose(琼脂糖):(1)a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kb DNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide(EB 溴化乙锭)Polyacrylamide(聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range(1 to a few hundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis(脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are oriented orthogonally(直角地)to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as well as to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up to several Mb in length.二、DNA分子的酶切割
Restriction endonucleases(限制性内切酶)cleave DNA molecules at particular sites Restriction endonucleases(RE)are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize(识别)short(4-8bp)target sequences that are usually palindromic(回文结构), and cut(切割)at a defined sequence within those sequences.e.g.EcoRI The random occurrence of the hexameric(六核苷酸的)sequence: 1/4096(4-6=1/46)(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2)Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3)Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends(平末端), sticky/staggered ends(粘性末端).(4)Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交
原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。
在大多数的核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细血管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地吸印上去。
常用的滤膜有尼龙膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸和二乙氨基乙基纤维素滤膜
核酸杂交通常包括两个步骤：
第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移
第二，将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。Southern Blotting：
根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA 或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA 印迹杂交技术。是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做Southern DNA印迹技术。Northern Blotting 1979年，J.C.Alwine 等人发展出的一种用于RNA杂交的新方法。将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其它化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起。称为Northern Blotting 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白的抗体反应，这种技术叫做Western Blotting.定义：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。
斑点印迹杂交（dot Blotting）：基本原理和操作步骤是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后同Southern 印迹一样的方式同核酸探针分子杂交。菌落（噬菌斑）杂交：
1975 年，Mgrunstein和D Hogness根据检测重组体DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern 吸引技术做了一些修改，发展出了一种杂交技术。
在1977年，W.D.Benton和R.W.Davis又发展出了与此类似的筛选含有克隆DNA噬菌体的杂交技术。
菌落杂交或噬菌斑杂交有时也叫做原位杂交，因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑，按其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交。
四、基因扩增
基因扩增的五个方面的内容：
第一，在体外应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）技术和合成的寡核苷酸引物，导致特定基因的拷贝数发生快速大量的扩增。
第二，通过体外 DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数的质粒载体分子上，并转化到适当的寄主细胞，于是在体内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝数也得到了有效的扩增。
第三，在有些外界环境因子的胁迫下，真核生物的有关细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因的产生和明显的扩增。
第四，程序基因扩增
第五，在生物的进化过程中发生的基因加倍与扩增，结果使相关基因在基因组上聚集成簇。
聚合酶链式反应：是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K B Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因 或DNA序列的方法。
PCR技术 的 基本原理：首先使双链的DNA分子变性为单链DNA分子
然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生 DNA 互补链。
DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动新链的合成。因此新合成的DNA链的起点，是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条单链都可以作为合成新生互补链的模板。
在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点，然后反应混合物经再次加热使新旧链分开，并加入下轮的反应循环，即引物杂交、DNA合成和链的分离。
PCR反应的最后结果是，经过几次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的拷贝数2n.PCR技术的两个特点：第一，能够知道特定DNA序列的合成；第二，特定的DNA区段得到了迅速大量的扩增。例如，经过30次循环，便可使靶DNA得到109 倍的扩增。
PCR反应及多次重复进行的温度周期，而每一个温度循环周期均是由高温变性、低温退火及适温延伸等三个步骤：首先是将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温环境加热1分钟，使双链 DNA发生变性，分离出单链的模板DNA；然后降低反应温度使专门设计的一对寡核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用，结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，将反应混合物的温度上升到72度左右保温1.5分钟,这时 在DNA 聚合酶的作用下，链得到延伸。寡核苷酸引物：
引物长度：通常在15-30mers 简并引物：是一类由寡核苷酸组成的混合物，彼此仅有一个或几个核苷酸的差异。嵌套引物
Taq DNA聚合酶：Klenow片段热敏感，易失活；反应温度低，出现错配碱基；1986年，从75度的热泉中的细菌中分离纯化出Taq酶。与大肠杆菌DNA聚合酶相比，Taq酶使PCR的特异性和敏感性高
PCR 技术的应用：基因组克隆、反向PCR和染色体步移、不对称 PCR 与DNA序列测定、RT-PCR 与RNA分析、基因的体外诱变、基因组的比较研究
五、基因的克隆和表达
Processes(过程)of DNA cloning：
1）Form the recombinant DNA molecules(重组DNA)by inserting your interested DNA fragments into a proper vector(载体).(Require restriction enzymes and ligase)2）Transform(转化)the recombinant DNA molecules into competent cells(感受态细胞).3）Propagation of the cells containing the recombinant DNA to form a clone(克隆), a set of identical cells containing the same recombinant DNA.4）Select the desired clones using the selective marker.5）Host organisms/cells（宿主）: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning.---Prokaryotic host(原核宿主): E.coli(most cases)---Eukaryotic host（真核宿主）: Yeast Saccharomyces cerevisiae(large fragments of human genome)General features of a Vector（作为载体的一般特征）：1）They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of host’s genome.2）Easily to be isolated from the host cell.Most are circular, some are linear(e.g.YAC vector).3）Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not.4）Contains a multiple cloning site(MCS)to be cut by restriction enzymes for DNA manipulation.Cloning vectors(克隆载体): allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated at DNA level.E.coli cloning vector(circular): plasmids(质粒)、bacteriophages(l and M13)(噬菌体)、plasmid-bacteriophage l hybrids(cosmids)(考斯质粒－质粒和噬菌体杂和体)。
Yeast cloning vector: yeast artificial(Linear)。
Plasmids: small, extrachromosomal circular molecules, from 2 to ~200 kb in size, which exist in multiple copies within the host cells.Contain an origin of replication（复制起点）, at least one selective marker（选择标记）and multiple cloning site（多克隆位点）.Example of selective marker: ampr gene encoding the enzyme b-lactamse which degrades penicillin antibiotics such as ampicillin.（抗氨苄）The commonly used plasmid are small in size(~ 3 kb)Libraries of DNA molecules can be created by cloning(Genomic library and cDNA library)：
A DNA library(DNA文库)is a population of identical vectors that each contains a different DNA insert.Genomic Library(基因组文库): the DNA inserts in a DNA library is derived from restriction digestion or physical shearing of the genomic DNA.cDNA library(cDNA文库): the DNA inserts in a DNA library is converted from the mRNAs of a tissue, a cell type or an organism.cDNA stands for the DNA copied from mRNA.chromosomes(YACs，酵母人工染色体)cDNA library generation：The mRNAs are firstly reverse transcript into cDNA, and these cDNA, both full length and partial, are cloned to make the cDNA library.Colony screening ：
1）Antibiotic screening(抗生素选择)： only the recombinant plasmids grow on the antibiotic-containing plate.2）Blue-white screening(蓝白斑选择): DNA insertion in the vector shuts down the LacZ gene expression, and turns the colony（菌落）to white.3）Colony hybridization screening(菌落杂交筛选)from a library.Analysis of a clone ：1）Restriction mapping: digestion of the plasmid prepared from a clone with restriction enzymes to investigate if the interested DNA is inserted the recombinant plasmid.2）Sequencing the cloned DNA to see if the inserted DNA maintains the correct sequence.六、细菌的转化
转化：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。
感受态：处于感受态的细胞，某种蛋白能够同核酸作用的复合形式。
大肠杆菌的转化：1）用CaCl2处理大肠杆菌细胞，制备感受态细胞；2）将正在生长的大肠杆菌在0度下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）；3）同加入在转化混合物中的质粒DNA形成一种粘着在细胞表面上的对Dnase抗性的复合物。4）转移到42 度下作短暂的热应激，这种复合物便会被细菌吸收；5）在富裕培养基中生长一段时间，再涂布在选择性的培养基中分离转化子。细菌转化效率
影响细菌转化效率的因素：DNA浓度、纯度和构型，转化细胞的生理状态及其在 CaCl2处理和贮藏之后的成活率，以及转化的环境条件（温度、PH值、离子浓度）。
环型的质粒DNA分子进入细胞，能够抗御细胞中固有的核酸酶的作用，而线性的DNA分子，则对自由末端的降解作用是极其敏感的，环型DNA比线性的高出10-100倍。
对于同样的转化DNA而言，大分子量的转化效率要比小分子量的低一些。以每微克质粒DNA 出现的转化子菌落数表示的转化频率。
应用与大肠杆菌转化程序相类似的方法，也可以成功地转化各种真核细胞，将酵母用酶处理消化细胞壁之后，就会变成原生质体
在具有PEG和CaCl2的转化反应体系中，让酵母原生质体同转化DNA接触，那么由于原生质体在生理上得到恢复并再生出细胞壁后，将其涂布在选择性培养基上便可以鉴定出转座子。
七、DNA核苷酸序列分析
1、Sanger 双脱氧链终止法：
利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国科学家 Sanger 等1977年发明的。
其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，合成出其互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2 ’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参入到寡核苷酸链的3’末端，从而终止 链的生长。2）Maxam-Gilbert化学修饰法：
原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生不同长度的 链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影后，便可根据x光片底版上所显现的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。3）DNA杂交测序：
步骤：将待测定的靶 DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交；对能够同靶 DNA分子形成完全双链体分子之间的碱基重叠关系比较分析，并据此推算 靶DNA的核苷酸序列结构。
八、蛋白质相关技术
Protein purification(蛋白质纯化)、Affinity chromatography can facilitate more rapid protein purification(亲和层析纯化)、Protein separation by PAGE gel electrophoresis(蛋白质分离)and identification by Western analysis、Protein sequencing(蛋白质测序)、Proteomics(蛋白质组学)。
九、研究DNA与蛋白质相互作用的方法 凝胶阻滞试验 DNaseI足迹实验 甲基化干扰实验
凝胶阻滞试验：又叫 DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay）,是1980年代初出现的用于体外研究与蛋白质相互作用的一种特殊的电泳技术。
当DNA 分子结合上一种蛋白质,由于分子量加大在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正极移动的距离相应的缩短了。所以当特定的 DNA片段同细胞提取物混合之后，如果其在凝胶中的距离缩小了说明它同细胞提取物中的某种特殊的蛋白质分子发生了结合作用。
DNaseI足迹实验
是一类用于检测与特定的蛋白质结合的DNA序列及特性的专门技术 足迹实验的一个明显的优点是可以形象地展示出一种特殊的蛋白因子同特定 DNA 片段之间的结合区域。
甲基化干扰实验（methylation interference assay）
根据DMS能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理还设计出另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法。
甲基化干扰试验的具体操作：先用DMS处理靶DNA，并控制反应条件，使之达到平均每条DNA分子只有一个G残基被甲基化；而后将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当的细胞提取物一道温育，并做凝胶阻滞试验。
第五篇：分子生物学电子教案第一章
第一章 绪论
1．课程教学内容
（1）十九世纪和二十世纪生命科学的回顾（2）分子生物学的概念
（3）二十一世纪分子生物学展望 2．课程重点、难点
分子生物学的概念、研究内容和发展历史 3．课程教学要求
（1）理解分子生物学研究的内容；
（2）掌握分子生物学领域一些具有里程碑意义的事件。
一、什么是分子生物学？
分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性和规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界主动地改造和重组自然界的基础学科。创世说与进化论
•许多年来，人们反复提出的3个与生命和一切生物学现象有关的问题：生命怎样起源？为什么有其父必有其子？动植物个体怎样从一个受精卵发育而来？
•十九世纪初叶，对于这些问题只能从宗教或迷信的角度进行回答---上帝创造了一切。•1859年，伟大的英国生物学家达尔文发表了物种起源一书，确立了进化论。
细胞学说
•17世纪末叶，荷兰籍显微镜专家 Leewenhoek 制作成功了世界第一架光学显微镜。•与Leewenhoek同时代的Hooke, 第一次用细胞这个概念来形容组成软木的最基本单元。虽然这一概念到十九世纪中叶，才正式被科学界接受，但它对生物学的贡献是不可估量的。•细胞学说是由德国植物学家 Schleiden和动物学家Schwann建立的。这一发现被称为十九世纪的三大发现之一。
•Schleiden出生于德国汉堡，22岁就获得了法学博士学位，但他并不喜欢当律师，28岁时他到哥廷根和柏林学习植物学和医学，36岁获得医学和哲学博士学位。
•Schwann是首饰匠的儿子，16岁高中毕业后，没有按照父母的意愿学习神学，而是到柏林学医，24岁获得了博士学位。在柏林解剖博物馆工作时结识了Schleiden.•他们虽然个性、经历迥然不同，但共同的志趣促成了他们多年的合作。Schleiden研究植物的囊胚，Schwann研究蛙类的胚胎组织，相同的研究方向，相似的研究方法，使他们取得了一致的见解，共同创立了生物科学色基础理论。
•所有组织的最基本的单元是形状非常相似而有高度分化的细胞。细胞的发生和形成是生物学界普遍和永久的规律。
•细胞学说对生命现象实际上是细胞活动的总和，所以细胞可以而且应该成为生物学研究的主要对象。
经典的生物化学和遗传学
•进化论和细胞学说相结合，产生了作为主要实验科学之一的现代生物学，而以研究动、植物遗传变异规律为目标遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。
•在十九世纪中叶，人们发现动物和植物细胞的提取液中主要是一些能受热或酸变性形成纤维状沉淀的物质。DNA的发现
早在 1928年英国科学家Griffith等人就发现，肺炎链球菌使小鼠引起死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒性是由细胞表面夹膜中的多糖所决定的。具有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有夹膜的多糖而能使小鼠发病，具有粗糙外表的R型细菌因为没有夹膜多糖而失去致病力。首先实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery.实验过程
• 首先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失致病能力。• 再用活的粗糙型细菌来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无致病力。
• 然而当他们将经烧煮杀死的S 型细菌和活的R型细菌在混合感染小鼠时，实验小鼠每次都死去。
• 解剖死亡的小鼠发现大量的活的S 型细菌。
Hershey和他的学生Chase的噬菌体侵染细菌的实验
• 噬菌体用尾部的末端吸附细菌表面
• 噬菌体通过尾轴把DNA全部注入细菌细胞内，噬菌体的蛋白外客则留在细胞外面。
• 噬菌体的 电脑啊一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成噬菌体自身的DNA和蛋白质
• 新合成的DNA和蛋白质外壳，能组装成许多与亲代完全相同的子代噬菌体； • 子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细菌。在整个过程中，DNA起了关键的作用。
二、分子生物学的发展简史
• 从1847年提出细胞学说至今一百多年间，我们对生物大分子即细胞的组成有了深刻的认识。为了全面了解分子生物学的的发展，我们不妨来看一看部分诺贝尔生理医学奖和化学奖作为纽带的分子生物学发展简史。
• 1910年，德国科学家Kossel因为蛋白质、细胞和核酸化学的研究而获得诺贝尔生理医学奖，他首先分离出腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸
在量子力学家薛定谔的《生命是什么?》(1944年)一书的影响下，许多物理学家和化学家投身于生命的分子基础和基因的自我复制这两个生物学中心问题的研究,将现代物理学和化学的最新成果、理论和方法带入了生物学研究中。
(1)1953年4月25日出版的Nature杂志上，沃森(Watson)和物理学家克里克(Crick)提出了DNA双螺旋结构模型，标志着遗传学以及整个生物学进入分子水平的新时代。(2)50年代初，Barbara Mclintock 在玉米中发现可动遗传因子即转座因子，但是这个过于超时代的发现当时并未得到承认，甚至受到讥笑。(3)1961年克里克等证明了他于1958年提出的关于遗传三联密码的推测。1969年Nirenberg 等解译出全部遗传密码。
(4)60年代，阐明mRNA、tRNA 及核糖体的功能、蛋白质生物合成的过程、“中心法则”等。（5）70年代，发现限制性核酸内切酶、人工分离和合成基因取得进展，1972年P.Berg 成功实现了DNA体外重组;1973年S.N.Cohen 通过DNA的体外重组成功地构建了第一个有生物学功能的细菌杂交质粒，从而兴起以DNA重组技术为核心的基因工程研究。
（6）80年代，基因工程技术飞速发展，基因工程药物和疫苗投入临床使用，转基因动植物产品上市销售，转基因动植物生物反应器研究成为热点并实现商品化。
（7）90年代，1992年“人类基因组计划”开始实施，投资30亿美元旨在测定人类基因组全部30亿个核苷酸对的碱基序列，是在破译生物体全部遗传密码的征途上迈出的第一步，将为揭开人类和生物体生长、发育、疾病、衰老和死亡的奥秘奠定基础，其意义与原子弹研究曼哈顿计划和载人登月阿波罗计划相比有过之而无不及。克隆羊“多莉”(Dolly)诞生之后，克隆牛、羊、小鼠等动物纷纷获得成功。
（8）21世纪初人类基因组计划提前完成，遗传学面临新的挑战和使命，即进入了“基因组后研究”时代，在搞清楚基因组的全部序列的基础上，还要 彻底阐明基因组所包含的全部遗传信息的生物学功能，及其所编码的蛋白质的结构和功能，所以又称为“蛋白质组”研究。同时，还要应用基因工程和蛋白质工程技术，改造蛋白质，使人类对生命活动的认识和支配由必然王国进入自由王国。
三、分子生物学的研究内容
分子生物学的三条基本原理：构成生物体各类有机体大分子的单体在不同生物中都是相同的；生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则；某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。
分子生物学涉及的范围极为广泛，研究内容也似乎包罗万象，事实上它研究的内容不外乎以下四个方面：DNA重组技术、基因表达与调控、生物大分子的结构与功能研究、基因组、功能基因组和生物信息学。1）DNA重组技术 DNA重组技术（基因工程）是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结果，而限制性内切酶、DNA连接酶及其他工具酶的发现和应用则是这一技术得以建立的关键。
DNA重组技术的应用：大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体等；可以定向改造某些生物的基因组结构，是它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百上千倍的提高。DNA重组技术还被用来进行基础研究。2）基因表达调控研究
• 基因表达调控主要表现在信号转导研究、转录因子研究和RNA剪辑3个方面。• 信号传导是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部、并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能方面的应答过程。信号转导之所以能引起细胞功能的改变，主要是由于信号最后活化某些蛋白质分子，使之发生构型的变化，从而直接作为靶位点，打开或关闭某些基因
• 转录因子是是一群能与基因5„端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
• 真核基因转录成前体mRNA后，除了在5„端加帽及3‟端加多聚A之外，还要切去隔开各个相邻编码区的内含子，使外显子相连后成为成熟mRNA.3）生物大分子的结构功能研究
• 生物大分子发挥生物学功能时，必须具备两个前提：有特定的空间结构；在发挥生物学功能过程中必定存在着结构和和构象的变化。
• 结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
4）基因组、功能基因组与生物信息学研究 • 基因组学 • 功能基因组学 • 蛋白组学 • 生物信息学
四、分子生物学展望
人类基因组计划的开展到其他生物的基因组测序。
基因工程----转基因动物植物，提高产量、质量到生产药物蛋白，转基因克隆技术等。生物学在各个学科之间广泛渗透，相互促进，不断深入和发展。科学家从分子水平、细胞水平、个体和群体等不同层次深入探索各种生物现象。
分子生物学与其他学科的融合：与细胞生物学、神经生物学、与遗传学、与分类学和生物进化研究、与发育生物学
1、生命科学可望成为21世纪的领衔学科
在科学发展的历史上，各门学科并非齐头并进，总有一门或一组学科走在其他学科的前面，从理论观念、思维方式或科研方法上对其他学科发挥重要的影响，人们称之为带头学科。近代科学的带头学科是力学，现代科学的带头学科是物理学，21世纪的带头学科将是什么？人们看好生命科学。回顾科学的发展史，我们就能看到力学和物理学成为近代和现代科学的带头学科的必然性。
20世纪下半叶以来，生命科学文献在科学文献中的比重、从事生命科学研究的科学家人数在自然科学家中所占的比重都在迅速增长。生命科学的发展对科学技术的发展产生重要影响。
生命现象中还有狠多重大问题需要人们去解释。例如生物体产生的有机分子为什么都有特定的结构？遗传密码是怎样形成的？当代许多新兴学科（系统论、信息论、控制论、耗散结构理论等等）都是从生命科学知识中受到启发，生命现象中的许多问题的解决必将给科学的发展带来新的启迪。生命科学的发展必将促进海洋科学、空间科学、能源科学、材料科学等当代新兴科学技术的发展。
2、分子生物学对社会发展的影响 1）与医学
繁殖性克隆动物克隆是指由一个动物经无性繁殖产生多个后代个体，同一克隆内所有成员的遗传信息是完全相同的。治疗性克隆概念利用核重组技术培育早期胚胎及由此衍生的胚胎干细胞来生产人类所需要的器官和组织。
基因是一种有限的资源，一个基因可成就一家企业，带动一个产业，下一个创造更大财富的人将有可能出现在基因领域？
PPL公司成功获得GT-knockout 猪：2001年12月25日，PPL公司成功地获得了5头“Knock-out”（基因敲除）母猪，命名为Noel, Angel, Star, Joy 和 Mary。这些猪基因组上的alpha 1,3
galactosyl transferase 被敲除，而该酶是负责将糖基加入到猪细胞膜上，产生被人体免疫系统视为抗原的物质，从而激发人体免疫系统对移植的猪器官产生超急性排斥反应。因此，对猪阿尔法1,3半乳糖苷转移酶基因的敲除成功，是人类为实现异种器官移植迈进了决定性的一步
2）分子生物学与农业的可持续发展
转基因植物（Transgenic Plants）；转基因动物（Transgenic Animals)；动物克隆(Animal Cloning)
3）分子生物学与能源问题
地球上的煤和石油化石能的枯竭指日可待，核燃料也有告罄之时。而利用太阳能有条件的限制。
人们把希望寄托于生物技术来解决能源问题：用农副产品发酵生产酒精，代替汽油做燃料；培育含油量高的植物生产燃料用油；研究清楚植物光合作用中将水分子分解为氢气与氧气的机制及其催化剂酶的结构，人工模拟光合作用，利用太阳能分解水得到氢燃料。4）与伦理道德问题It has been realized that it would also raise a number of complex ethical, legal and social issues.复习思考题
1.现代分子生物学的含义和包括的研究范围? 2.分子生物学发展史史上的重大事件？ 3.谈谈你对分子生物学在今后的生物科学有什么样的重要意义？
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