医学分子生物学资料总结doc（精选）

第一篇：医学分子生物学资料总结doc（精选）

医学分子生物学资料小结

1、质粒——是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子，能独立进行复制。质粒只有在宿主细胞内才能够完成自己的复制。

2、基因——指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列及表达这些信息所需的全部核苷酸序列，是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位。

3、癌基因——是细胞内控制细胞生长和分化的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。

4、基因克隆——是指把一个生物体的遗传信息（基因片段）转入另一个生物体内进行无性繁殖，得到一群完全相同的基因片段，又称DNA克隆。

5、抑癌基因——是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。

6、基因诊断——是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。

7、管家基因——是在生命过程都是必需的，是在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因，它较少受环境因素的影响，其表达方式为组成性基因表达。

8、klenow片段——亦称DNA聚合酶1大片段，为DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段，它除了保留5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切酶活性外，失去了5′→3′外切酶活性，它具有的3′→5′外切酶活性能保证DNA复制的准确性，把DNA合成过程中错误配对的碱基去除，再把正确的核苷酸接上去。

9、核蛋白体——系tRNA与蛋白质结合生成的一种复合体，是蛋白质生物合成的场所。

10、限制性内切核酸酶——能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链DNA的一类内切核酸酶，是基因克隆中最重要的工具酶，通常所说的限制酶是指2型酶。主要从原核细胞中提取，大多数限制性内切酶是错位切割双链DNA，产生粘性末端，部分酶则沿对称轴切割DNA而产生平端。

11、Tm值——DNA变性是在一个相当窄的温度范围内完成的，在这一范围内，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度（Tm），其大小与G+C含量成正比。或:双链DNA变性一半所需要的温度叫DNA的融解温度.12、DNA的甲基化——是指DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，其作用是对自身DNA产生保护作用。

13、原位杂交——是核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交的方法。

14、DNA微陈列——系直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面所组成的微陈列（基因芯片）称为DNA微陈列。.15、顺序作用元件——是指那些与结构基因表达调控相关，能被基因调控蛋白异性识别和结合的DNA序列,抱括启动子.上游启动子元件.增强子.加尾信号和一些反应元件。

16．转位因子—是指能够在一个DNA分子内或2个DNA分子之间移动的DNA片段。

17、基因治疗--是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭和抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。

二、综合内容

1、DNA的结构、性质及特点

①一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序，二级结构是指两条DNA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构和四股螺旋结构；三级结构是指双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超螺旋结构。②DNA一级结构的基本特点：4种脱氧核糖核苷酸以3′，5′—磷酸二酯键相连，形成长链，链中的脱氧核糖和磷酸都是相同的。组成DNA的碱基有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。③DNA是由两条单链结合在一起形成的双链分子，两条单链都是由A、T、G、C以千变万化的排列组合而形成的。大多数生物的遗传信息都是储存在DNA分子中。④DNA分子主要携带两类遗传信息，即有功能活性的DNA序列所携带的信息和调控信息。⑤DNA二级结构是指DNA的双螺旋结构，其特点为：脱氧核糖与磷酸交替排列构成了DNA主链；两条脱氧核苷酸链是反向平行排列，一条是5′→3′方向，另一条为3′→5′方向；以右手方向盘绕成双螺旋构型；A配T，G配C。⑥生物体的闭环DNA都以超螺旋形式存在，如细菌质粒、一些病毒、线粒体的DNA等。

2、RNA的结构、功能、特点

①由4种基本的核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键连接而成的长链，碱基中没有T，而为尿嘧啶（U）。②分为mRNA（信使RNA），tRNA（转RNA，转运氨基酸）和核蛋白体RNA（rRNA）。mRNA结构特点：不稳定、代谢活跃，更新迅速，寿命短。原核生物mRNA具有操纵子结构，主要是多顺反子，mRNA5′端无帽子结构，3′端一般无多聚A尾巴，没有修饰碱基；真核mRNA5′端有帽子结构、3′端大多有多聚腺苷酸尾巴、分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化、有编码区和非编码区。tRNA的结构特点及作用：作用：在蛋白质合成过程转运氨基酸，参与蛋白质的翻译。一级结构含有稀有碱基如DHU，3′端为3个同样的核苷酸序列（CCA）序列，此序列是tRNA结合和转运安基酸而生成氨酰tRNA所必需的。5′端为G、具有TΨC；二级结构为三叶草形，三级结构为倒L形； C、rRNA即核蛋白体RNA：为细胞内含量最丰富的RNA，约占细胞总RNA的80%以上,参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。原核生物核糖体的沉降系数为70S，由50S和30S两个大小亚基组成，30S小亚基含16SrRNA和21种蛋白质,50S大亚基含23S和5SrRNA以及34种蛋白质；真核生物细胞核糖体的沉降系数为80S，由大小亚基组成，40S小亚基含18SrRNA及30多种蛋白质，60S大亚基含3种rRNA(28S.5.8S.5S)以及大约45种蛋白质。④hnRNA即核内不均-RNA，为真核生物转录生成的mRNA前体。⑤SnRNA即小分子核内RNA，不单独存在，常与多种特异的蛋白质结合在一起，形成小分子核内核蛋白颗粒，在mRNA的剪接中起重要作用。⑥反义RNA，又称调节RNA，主要封闭RNA。

3、参与蛋白质合成的氨基酸在特异的氨基酰tRNA合成酶催化下，与其相应的tRNA结合成氨基酰—tRNA。真核生物起始tRNA结合的氨基酸为蛋氨酸，结合形成Met-tRNAimet，翻译起始时首先与40S核糖体小亚基结合形成复合物。原核生物的起始氨基酸为甲酰化蛋氨酸，结合形成fMet-tRNAffmet。导致DNA变性的常用方法有热变性、碱变性和化学试剂变性。DNA变性的结果：粘性降低，密度增加，A260紫外吸收值增加。

4、蛋白质的结构、功能特点

①蛋白质又称为“功能分子”，根据功能分为结构蛋白、活性蛋白和信息蛋白。蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸排列的顺序。蛋白质一级结构发生改变，可以使蛋白质的功能发生改变，严重时可导致疾病的发生。②因基因突变而导致的蛋白质一级结构改变后表现出生理功能的异常，使机体出现病态现象，称为分子病。③蛋白质的二级结构单元（形式）有a-螺旋、β-折叠、-转角、无规则卷曲。④一级结构的化学键是肽键及二硫键；二级结构主要化学键为氢键；三级结构的主要靠疏水作用、离子键、氢键和范得华力等；四级结构的结合力主要是疏水作用、氢键和离子键。

5、端粒的主要特点和功能：特点为：位于真核生物染色体末端、端粒酶催化端粒DNA延长、在决定细胞寿命中起重要作用、含短的高度重复序列。其主要功能有：保护线性DNA的完整复制、保护染色体末端、决定细 2 胞的寿命。

6、DNA聚合酶（DNApol）

①作用是催化DNA合成，其活性需要Mg2+的存在。大肠杆菌DNA聚合酶有I-II、II3种（即原核生物DNA聚合酶）。②DNApolI的功能有：a、聚合作用，使DNA链沿5′→3′方向延伸，b、3′→5′外切酶活性，即能从DNA链3′端开始沿3′→5′进行水解反应，产生5′单核苷酸，纠正复制过程中的错误，保证DNA复制的正确性，因而具有校对功能；C、5′→3′外切酶活性，参与RNA生物的切除、填补冈崎片段间的空隙以及DNA损伤的修复。③DNApolII：具有5′→3′DNA聚合酶活性及3′→5′外切核酸酶活性，可能参与DNA损伤的应急状态修复。④DNApolII：α亚基具有催化合成DNA的功能；ε亚基具有3′→5′外切酶活性及编辑和校对功能，θ则为装配所必需，是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA聚合酶的共同性质是：需要DNA模板；RNA或DNA作为引物；ATP与Mg2+的参与；以dNTP作底物；DNA合成的方向是5′→3′。反应特点：新生链的延伸方向为5'→3'；半保留方式合成子代DNA双链；反应需要DNA引物。共同具有的酶活性：5'→3'聚合酶活性；3'→5'核酸外切酶活性。

7、RNA聚合酶

①RNA聚合酶也称依赖DNA的RNA聚合酶，能以DNA为模板，四种核苷三磷酸为底物，按照碱基配对原则，从5′→3′方向延长RNA链。②原核生物的RNA聚合酶只有一种，是由四种亚基α2ββ'σ组成的五聚体蛋白质，称为全酶。去掉σ亚基后，剩下的α2ββ’称为核心酶。活细胞的转录起始，需要全酶；而核心酶负责催化RNA链的延伸。③真核生物RNA聚合酶有三种，即RNA聚合酶I、II、III。RNA聚合酶I定位在核仁，主要转录5.8S、18S、28S-rRNA基因；酶II定位在核浆，主要转录编码蛋白质的基因，即主要转录产生mRNA；酶III定位在核浆，主要转录tRNA和5S-rRNA基因。④RNA聚合酶催化聚合反应时需要有Mg或Mn的存在，无3’→5’外切酶海性，无校对功能。

8、密码子分为起始密码和终止密码，起始密码为AUG，终止密码为UAA、UAG和UGA，共有64种不同的密码。可作为原核生物起始密码的是：AUG.GUG.UUG。

9、遗传密码具有以下特点：

A、连续性：两个密码子之间没有任何核苷酸加以分隔，即密码是无标点的。B、方向性：mRNA中密码子的排列是有方向性的，即起始密码子总是位于编码区5’末端，而终止密码子位于3’末端。每个密码子的三个核苷酸也是5’→3’方向阅读，不能倒读。C、简并性：是指遗传密码中除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2～6个密码子为其编码。D、通用性：从最简单的病毒、原核生物、直至人类，都使用同一套遗传密码。E、摆动性：翻译过程中，氨基酸的正确加入，要靠mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子相辩认。密码子与反密码子配对辩认时，有时不完全遵守碱基互补规律，即使不严格互补也能辩认配对，这种现象称为摆动。

10、转录的过程及特点

①转录是以DNA为模板，以4种NTP为原料，依碱基配对规律，在DNA指导的RNA聚合酶催化下合成RNA的过程，其过程包括：起始、延长和终止三个阶段。②转录的特点：A、对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制。B、转录是不对称的。C、转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。D、转录的单向性，即RNA生物合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为3’→5’，而RNA链的合成方向为5’→3’。E、有特定的起始和终止位点。参与转录终止的因素为ρ因子或转录产物的3'端发夹结构,转录终止的修饰点:AATAAA+GT序列。

11、原核生物DNA复制的过程及特点

①复制过程包括：起始（复制起始位点识别、解螺旋酶解开DNA双链，引发体合成RNA引物）延伸（DNA聚合2+

2+ 3 酶催化聚合反应，连续合成前导链，不连续合成随从链）。终止（RNA引物去除、冈崎片段连接、在特殊的终止结构区域停止）。②复制的共同特点为：半保留复制和半不连续复制、聚合反应都需要模板、底物、DNA聚合酶及其它酶和蛋白质。

12、真核生物染色体DNA复制的特点：（原核相反）

①复制起始点为多个；②复制叉移动速度慢；③复制方向大多数为双向；④RNA引物短；⑤冈崎片段短，⑥不可连续复制

13、翻译的主要过程及特点

①起始：形成翻译起始复合物②延长：指每加一个氨基酸经过进位、成肽和转位，使肽链从N端向C端延长。③终止（当mRNA分子中的终止密码子出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离）。蛋白制合成是一个耗能过程，每生成一个肽键，要消耗2个高能磷酸键，氨基酸活化要消耗2个高能磷酸键，整个过程可能多于4个高能磷酸键。

14、原核生物mRNA的加工：转录产物mRNA分子不需加工。tRNA结构基因的初级转录产物需要加工，才能成为具有生物功能的成熟分子。tRNA前体的加工包括剪切作用（切除多余核苷酸）、添加和修复3'端CCA序列，某些碱基的化学修饰（成熟tRNA分子中有稀有碱基）。

15、翻译后的加工修饰：

①加工包括：A、去掉N-甲酰基、N-蛋氨酸或N端序列。B、个别氨基酸的修饰（羟化、磷酸化形成-S-S-等）。C、多蛋白水解修饰，D、分子伴侣，蛋白质二硫键异构酶，肽-脯氨酰顺反异构酶辅助折叠成空间构象。E、亚基聚合，F、辅基的结合（糖基化等）。其中A、B、C属一级结构修饰，D、E、F属空间结构修饰。②多肽链形成后，氨基酸残基可进行多种共价修饰，包括；磷酸化，羟基化，ADP-核糖基化，形成胱氨酸及乙酰化。③翻译过程涉及多种分子之间的相互作用，可以归纳为：RNA-蛋白质相互作用，蛋白质-蛋白质相互作用及RNA-RNA相互作用。④参与翻译终止的蛋白质因子包括：RF、PR、IF。⑤广义的核蛋白体循环包括：翻译起始，进位，成肽，转位和翻译终止。

16、真核生物mRNA的加工包括：

①5′端加帽（由加帽酶催化5′端加入7-甲苷乌苷酸，形成帽子结构mGpppmNP-）。②3′端加入Poly(A)尾（A、组蛋白的成熟mRNA无需加polyA尾；B、加尾信号包括AAUAAA和富含GU的序列；C、加尾不需模板；D剪切过程需要多种蛋白质因子的辅助）。③mRNA前体的剪接（剪接加工以除去内含子序列，并将外显子序列连接成为成熟的有功能的mRNA分子。内含子两端的结构通常是5′-GU„„AG-3′。选择性剪接的作用机制包括；A使用不同的剪接位点，B选择使用外显子，C、反式剪接，D、使用不同的启动子，E、使用不同的多腺苷酸化位点）。④RNA的编辑（发生于转录后水平，改编mRNA序列，C→U或A→G，增加遗传信息容量）。

17、基因表达是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥特定的生物学功能和生物学效应的全过程。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质，tRNA、rRNA编码基因转录生成RNA的过程也属于基因表达。基因表达受到多级水平的调控，具有阶段特异性（时间特异性）和组织特异性（空间特异性）。基因表达分为几个阶段：基因活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工等、产物是RNA和有功能的蛋白质。

18、原核生物基因表达调控的环节，主要在转录水平，其次是翻译水平。原核生物基因多以操纵子的形式存在，转录水平的调控涉及到启动子、σ因子（能与RNA聚合酶结合）、阻遏蛋白(负调控)、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等多种因素。而翻译水平的调控涉及到SD序列（位于AUG前）、mRNA的稳定性（不稳定，其5′端和3′端的发夹结构可保护其不被酶水解，mRNA的5′端与核糖体结合，可明显提高其稳定性）、翻译产物及小分子RNA的调控作用。4

19、真核生物基因表达的调控环节较多，在DNA水平可通过染色体丢失，基因扩增、基因重排、DNA甲基化以及染色体结构改变影响基因表达，在转录水平则主要通过反式作用因子的作用调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成；在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达；影响翻译水平的因素有影响起始翻译的阻遏蛋白、5′AUG、5′端非编码区的长度、mRNA的稳定性调节及小分子RNA等。真核基因调控中最重要的环节是基因转录，真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。

20、反式作用因子：指能直接或间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，其主要特点包括三个功能结构域（DNA识别结合域、转录活性域、结合其它蛋白的结合域）、能识别并结合上游调控区的顺式作用元件、对基因表达有正性和负性调控作用。其活性调节方式：表达式调节，共价修饰，配体结合及蛋白质-蛋白质相互作用。作用方式:成环、扭曲、滑动、Oozing。DNA结构域包括：锌指、螺旋—转角—螺旋、亮氨酸拉链和螺旋—环—螺旋。转录激活域富含：酸性氨基酸、脯氨酸和谷氨酰胺。

21、参与DNA复制（合成）的物质包括：

①模板（解开成单链的DNA母链）。②引物（提供3’—OH未端使dNTP可以依次聚合）。③底物（dATP，dGTP，dCTP和dTTP）。④聚合酶（依赖DNA的DNA聚合酶（DNA—pol））。⑤其它的酶和蛋白质因子。DNA复制的基本过程包括：①DNA双链解开，②RNA引物的合成，③DNA链的延长，④切除引物，填补缺口，连接相邻DNA片段，⑤切除和修复错配碱基。

22、结构基因突变的类型包括点突变、缺失、插入和倒位四类，遗传密码的改变分为错义突变、无义突变、同义突变和移码突变。

23、癌基因恶性激活的机制包括：①原癌基因点突变，②原癌基因获得外源启动子而激活，③原癌基因因甲基化程度降低而激活，④基因易位或重排使原癌基因激活。

24、逆转录病毒载体是基因治疗中最常用的载体。造血肝细胞是基因治疗中最重要的靶细胞，禁用生殖细胞。基因转移技术(基因治疗技术)包括生物学方法和非生物学方法:生物学方法有:逆转录病毒载体.腺病毒载体.腺相关病毒载体.单纯疱疹病毒载体;非生物学方法有：脂质体、直接注射、受体介导基因转移技术、DNA—磷酸钙沉淀法、电穿孔法、显微注射、颗粒轰击。

25、DNA甲基化的一个特点是它们经过细胞许多代分裂之后仍保持稳定。在真核生物DNA中，几乎所有甲基化均发生于二核苷酸序列5’—mCG—3’上。

26、一个基因所包括的序列有：编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列、保证转录所必需的调控序列、位于编码区5’端上游的非编码序列、内含子、位于编码区3'端下游的非编码序列。

27、启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列,启动子具有方向性，真核生物的启动子必须与转录因子结合后，才能被DNA聚合酶识别和结合，真核生物的启动子元件是TATA盖,TATA盒的核心序列是TATA(A/T)A(A/T)，位于转录起始点上游—25bp处,启动子决定转录方向.模板链及转录效率。上游启动子元件包括：CAAT盒，CACA盒和GC盒。

28、逆转录：是指以RNA为模板，利用宿主细胞中4种dNTP为原料，在引物的3'端以5'→3'方向合成与RNA互补的DNA链的过程，此过程与中心法则方向相反，故称为逆转录。

29、原癌基因产物的类型及细胞定位

①生长因子及其类似物，由细胞分泌，如C-sis家族（sis编码血小板源生长因子，表达产物与PDGF链结构同源）。②跨膜生长因子受体型的酪氨酸蛋白激酶，如erb-B,表皮细胞生长因子（EGF）受体；fims,巨噬细胞集落刺激因子受体；定位于质膜。③细胞内信号传导分子，定位于胞夜,包括A、低分子量G蛋白，如H-ras等 5 基因表达产物；B、胞内蛋白激酶（包括与膜结合的蛋白酪氨酸激酶和胞浆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶），如src、abl。④核内转录因子：如myc、fos等，定位于细胞核内。⑤胞浆调节蛋白，如crk的产物是存在于胞浆中的调节蛋白，定位于胞浆。⑥可溶性蛋白酪氨酸激酶受体和非蛋白激酶受。30、细胞周期的主要调控点

细胞周期的运行受多种因素所调控，有2个主要调控点，亦称为检测点。①G1/S期检测点：在酵母中称起点，在哺乳细胞中称限制点,是控制细胞进入S期检测点（G1期检测点）,cyclinB与CDK4和CDK6结合，cyclinE与CDK2，CDK3结合，通过磷酸化使它们活化。cyclin-CDK复合物可使Rb蛋白磷酸化，从而释放转录因子E2F，促进DNA复制相关基因的表达。CDK2也可和cyclinA、cyclinA1结合，促进早S期DNA合成的起始。②G2/M期检测点：是控制细胞进入M期检测点（G2期检测点），促有丝分裂因子（MPF）由cyclinB和CDK1组成，是启动有丝分裂的关键因子。细胞何时进入M期取决于Cdc2的磷酸化状态。

31、真核细胞转染的基本方法：

①磷酸钙沉淀法。②电穿孔法。③脂质体介导的基因导入法。④DEAE-葡聚糖法。⑤显微注射法。

32、DNA损伤的主要类型

①碱基和糖基破坏②错配③DNA链断裂：电离辐射致DNA损伤的主要形式④DNA变联。上述DNA损伤可导致DNA模板发生碱基的置换、插入、缺失、链的断裂，并可影响到染色体的高级结构。DNA链中一种嘌呤被另一种嘌呤取代，或嘧啶被另一种嘧啶所取代，称为转换；嘌呤被嘧呤取代，或反之，称为颠换；转换和颠换在DNA复制时可引起碱基错配，导致基因突变；碱基的插入和缺失可引起移码突变。

33、DNA修复机制的主要类型

①光修复；②切除修复；③重组修复；④SOS修复；⑤错配修复。

34、基因文库筛选的主要方法及原理

(1)根据抗药性标志筛选：对于带有某种抗药性标志基因，只有转化成功的受体菌才可能在含该抗生素的培养基中生存并形成菌落；而没有转化成功的受体菌，不能在培养基中生长，以此可选择阳性菌。(2)根据菌落的呈色反应筛选（互补、蓝-白筛选）：根椐菌落的颜色并结合插入片段的序列测定筛选。(3)营养缺陷型标记法:(4)核酸分子杂交法：即采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，以确定重组体中带目的基因。包括原位杂交和southern印迹杂交。（5）遗传互补法：载体上的营养代谢标记可以对宿主细胞的营养代谢缺陷进行互补，以此作为筛选重组体的标记。（6）免疫学方法：如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可以用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。

35、PCR的主要步骤及引物设计的基本要求

①PCR的主要步骤：PCR又称聚合酶链式反应，是在体外进行的DNA复制反应过程。其基本过程包括：A、双链DNA模板加热变性成单链(变性),温度95度左右。B、在低温下引物与单链DNA互补配对(退火),85-90度。C、延伸：在四种DNTP底物及Mg存在条件下，TaqDNA聚合酶在最适作用温度（70~75℃）下，根据碱基互补配对原则，从特异结合到DNA模板上的引物3′-OH端开始掺入单核苷酸，合成新的DNA分子。②引物设计的基本要求：A、引物长度一般为15~30个核苷酸。B、引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象，尤其在3′端避免连续3个G或C。C、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。D、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。E、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。F、引物与模板结合时，引物的5′端可以修饰。2+ 6

36、乳糖操纵子的正、负调节机制

乳糖操纵子包含3个结构基因Z.Y.A（编码β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷通透酶和转乙酰基酶）、3个调控元件（启动子、操纵基因和CAP结合位点）和1个调节基因（编码阻遏蛋白）。乳糖操纵子的转录起始是由CAP和阻遏蛋白两种调控因子来调控的。（1）阻遏蛋白的负调控：无乳糖时，阻遏蛋白结合操纵基因，妨碍RNA聚合酶结合启动子，从而抑制结构基因转录。有乳糖时，生成半乳糖（诱导剂）结合阻遏蛋白，使阻遏蛋白构象改变，变构的阻遏蛋白不能与操纵序列结合，阻遏机制解除，结构基因可以转录，基因得以表达。③cAMP-CAP复合物的正调控:无葡萄糖时，cAMP浓度高，形成的cAMP-CAP复合物结合于CAP结合位点，增强启动子转录活性，促进下游基因得以表达；有葡萄糖时，cAMP浓度低，cAMP-CAP复合物形成受阻，影响转录活性。④正、负调控机制相辅相成：cAMP-CAP复合物是转录必需的，同时阻遏蛋白进一步控制转录启动。综上，乳糖操纵子最强的表达条件是有乳糖而无葡萄糖。

37、双脱氧末端终止法DNA测序的主要步骤：双脱氧末端终止法是以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生DNA的合成，又称为引物合成法，或酶促引物合成法。其主要步骤为：①制备单链模板。②模板与测序引物结合。③掺入法标记反应。④延伸-终止反应。⑤变性胶电泳。⑥放射自显影。⑦阅读测序结果。

38、常用的分子生物学技术的原理、过程及特点

①核酸分子杂交技术：基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。特点：直接检测血清中病毒基因组，无须扩增，灵敏度较PCR低。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针。②聚合酶链反应（PCR）：PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物（4种dNTP）、DNA聚合酶以及模板（待扩增片段的DNA分子）的反应体系中，经过高温变性（使DNA链解开）、低温退火（使引物与模板结合）和适温延伸（新合成的DNA片段）三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。特点:极强的扩增能力,度高灵敏性,高度特异性，只需微量模板,只需数小时,扩增产物量大,变性.复性.延伸三个步聚循环进行,操作简便，适用广泛，但可出现假阳性.③DNA序列测定：DNA序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的，包括Sanger双脱氧链末端终止法和化学降解法。Sanger法的基本原理是：双脱氧核苷酸（ddNTP）在DNA合成过程中代替相应的脱氧核苷酸（dNTP）作为底物，不能形成3′，5′-磷酸二酯键而导致链延伸终止。化学降解法：是采用化学试剂处理末端放射性标记的DNA单链片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测DNA的核苷酸顺序。

④DNA芯片技术：DNA芯片技术是一种大规模集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。DNA芯片的主要技术流程包括：芯片的设计与制备、靶基因的标记（常用荧光色素.生物素或放射性核素标记dNTP）、芯片杂交与杂交信号检测。特点：高通量.鉴别诊断。酶：DNA聚合酶。所需探针：合成的寡核苷酸片段，cDNA，已克隆的基因片段，双链或单链DNA或RNA，肽核酸。

⑤基因克隆技术（重组DNA技术）：基因克隆是指某种目的基因的扩增与分离过程，具体是从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA片段，再通过DNA序列扩增形成由众多拷贝组成的DNA拷贝群体的过程。其基本过程为：A-目的基因的制备；栽体的选择与制备；B-DNA分子的体外连接；C-将外源DNA导入宿主细胞；D-目的基因的筛选与鉴定；E-DNA重组体的扩增与表达

39、原核生物与真核生物转录调控的特点比较：

①两者均涉及RNA聚合酶和转录调控序列（启动子等）的相互作用。②真核需要多种转录因子辅助、原核不需要。③真核以正调控为主，原核以负调控为主。④真核3种RNA聚合酶负责不同种类基因的转录，原核只有1种RNA聚合酶。

40、原核生物和真核生基因表达调控特点的比较。

①相同点：转录起始是基因表达调控的关键环节②不同点：A、原核基因表达调控主要包括转录和翻译水平；真核基因表达调控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。B、原核基因表达调控主要为负调节，真核主要为正调节。C、原核转录起始不需要转录因子，RNA聚合酶直接结合启动子，由σ因子决定基因表达的特异性；真核转录起始需要基础、特异两类转录因子，依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用，调控转录激活。D、原核基因表达调控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白质的协调表达机制更为复杂。

41、质粒的特征：

①原核细胞中染色体外的共价闭合的环状DNA分子。②能独立于细胞的染色体而进行复制，并依赖于宿主细胞。③在同一宿主中具有不相容性，即具有相同复制起始位点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌。④具有严格的遗传控制系统（复制调控系统，分配系统，细胞分裂控制系统，位点特异重组系统）。⑤其所携带的遗传信息能赋予宿主细胞特定的遗传性状。⑥是DNA重组技术中所使用的主要载体。作为克隆载体的质粒具有的特点：分子量较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数；具有一个以上的遗传标志；具有多个限制酶的单一切点，称为多克隆位点，便于外源基因的插入。

42、真核生物基因组结构与功能的特点。

①每一种真核生物都有一定的染色体数目，体细胞一般为双倍体。②真核基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点。③真核基因组由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子mRNA只能翻译一种蛋白质。④真核生物分子含有大量重复顺序。⑤真核生物基因组内非编码的顺序占90%以上。⑥真核基因是断裂基因。⑦功能相关的基因构成各种基因家族。⑧真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素。

43、蛋白质生物合成后的靶向输送过程及特点：

蛋白质合成后，定向地被输送到最终发挥生物学功能的部位称为靶向输送。靶向输送的蛋白质的N端往往有一些特异的氨基酸序列，称为信号序列，是决定蛋白质靶向输送特性的重要元件，通过信号序列引导蛋白质从胞浆进入内质网.线粒体.叶绿体和核内，靶向不同的蛋白质各有特异的信号序列。分泌型蛋白合成后进入内质网，经加工，包装成分泌小泡，再转移.融合到靶部位或分泌出细胞，其靶向输送主要靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合后，将所携带的蛋白质送出细胞；线粒体蛋白的靶向输送靠导肽与多种蛋白复合体介导进入基质和膜间腔，然后自发的或在分子伴侣HSP70帮助下折叠形成有功能的蛋白质；而细胞核蛋白的靶向输送则通过核定位信号与核输入受体结合形成核蛋白-受体复合物，被导出核孔，再与核孔复合体结合后进入细胞核。

44、核酸分子杂交的基本方法包括：Southern印迹杂交（鉴别DNA靶分子的杂交、待测核酸是DNA片段）、Northern印迹杂交（鉴别RNA靶分子、待测核酸是RNA）、斑点杂交、原位杂交和液相杂交。

45、DNA复制与转录的异同。

相同点：①模板是DNA②遵守碱基互补规律③新链合成方向为5'→3'④催化核苷酸以磷酸二酯链连接⑤合成部位在细胞核。

不同点：①复制的原材料是dNTP，转录的原料是NTP②复制的主要酶类是DNA聚合酶，转录酶是RNA聚合酶③复 8 制需要RNA引物，转录不需要引物④复制的产物是双链DNA，转录的产物是单链RNA⑤复制的模板是DNA双链（半保留复制），转录的模板是DNA单链（不对称转录）⑥复制的功能是传递遗传信息给子代 ,转录是表达信息所需步聚.46、双脱氧核苷酸末端终止法DNA序列测定中所需要的顺序试剂：M13载体、dNTP、DNA聚合酶I的klenow片段，逆转录酶，TqaDNA聚合酶（耐热DNA聚合酶），经过修饰的T7噬菌菌体DNA聚合酶，测序酶2.0版，双脱氧核苷三磷酸（即2',3'-ddNTP）、dNTP类似物，放射性标记的[aP]dNTP。

47、PCR体系的主要成分。

引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、模板核酸、缓冲液。

48、DNA聚合酶I的作用特点：

①模板为DNA，②底物为4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），③Mg参与，④DNA合成方向为5'→3'，⑤具有DNA聚合酶活性，3'→5'及5'→3'核酸外切酶活性，其5'→3'核酸外切酶活性，用于缺口平移法标记DNA探针。

基因治疗的方法有两种：体内直接转基因，称为体内法；细胞介导的基因治疗，称为回体法。基因灭活技术有：反义核酸技术，核酶技术，三链技术，干扰RNA技术。人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列。

49.信号肽的特点:能与细胞质中的信号识别颗粒结合,SRP受体是蛋白质进入内质网所必需的,N端一小段富含蔬水氨基酸的序列,翻译的同时引导新生多肽链穿过内质网.基因组文库—采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，将全部DNA分子都引入宿主细胞并扩增所得到的分子克隆混合体叫基因组文库。

50.基因重组是指DNA之间的共价连接.在分子克隆中的克隆是指无性繁殖DNA。基因工程中目的基因的来源可以是:化学合成.PCR合成.细胞DNA.组织DNA.cDNA文库。

分子生物学需要掌握的重点：

DNA、RNA、蛋白质、质粒、基因、端粒、聚合酶、密码子、突变、变性的概念或结构、性质及特点；

复制、转录、逆转录、翻译、加工修饰、靶向输送的主要过程及特点；

癌基因的概念、原癌基因产物的类型及细胞定位、癌基因活化致癌的主要机制；

常用分子生物学技术的原理、主要步骤、酶学及特点；

基因表及其调控的原理、主要过程或步骤，乳糖操纵子的正、负调节机制；

常用的基因诊断及基因治疗技术；

基因克隆、基因诊断、基因治疗、管家基因、抑癌基因、Klenow片段、核蛋白体、限制性内切核酸酶、人类基因组计划、原位杂交的概念；

双脱氧末端终止法DNA测序、重组DNA技术的主要步骤；

结构基因、顺式作用元件、启动子、遗传密码、反式作用因子、氨基酰-tRNA、基因组文库、DNA多态性、转位因子、探针、Tm值、DNA微阵列、DNA甲基化的概念、性质；

核酸分子杂交的主要类型、PCR的主要步骤及引物设计； DNA、RNA及多肽链的合成方向；

真核细胞转染的基本方法；

细胞周期的主要调控点；

DNA损伤及修复的主要类型和机制；

基因文库筛选的主要方法及原理。

《医学分子生物学》主要内容

2+

321、医学分子生物学：医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。

2、基因的概念、功能

基因：是贮存遗传信息的核酸（DNA或RNA）片段，包括编码RNA和蛋白质的结构基因以及转录调控序列两部分。

基因的功能：

1、利用4种碱基的不同排列荷载遗传信息；

2、通过复制将所有的遗传信息稳定、忠实地遗传个子代细胞；

3、作为基因表达的模版。

3、DNA、RNA的结构和功能

功能：DNA:DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。

RNA:

1、mRNA：携带蛋白质的序列信息，在翻译过程作为模板指导蛋白质的合成

2、tRNA:在蛋白质生物合成时运输氨基酸

3、核蛋白体：介导rRNA与mRNA的结合 rRNA与核蛋白体蛋白的结合 rRNA与tRNA的相互识别和相互作用

4、小分子RNA：参与mRNA的剪接、加工

U3与rRNA加工有关

4、不同生物基因的基本结构特点

原核生物：5’-启动子-结构基因-转录终止子-3’

真核生物：由1个结构基因+转录调控序列组成，mRNA多是单顺反子，rRNA基因结构是多顺反子 病毒：与真核基因相比很小，一般没有内含子，调控序列较少，有不规则基因

5、原核、真核生物基因的转录调控序列有哪些

（1）原核生物：启动子、终止子、操纵原件、正调控蛋白结合位点；

① 启动子：提供转录起始信号，其本身不出现于RNA产物中。其中有着“TATAAT”的共有特征序列，称为普里布诺盒。

② 终止子：提供RNA合成终止信号。其含有GC富集区组成的回文特征序列。③ 操纵元件：被阻遏蛋白识别与结合。与启动子通常有部分重叠。④ 正调控蛋白结合位点：加强下游结构基因的转录。

（2）真核生物：启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

① 启动子：提供转录起始信号，启动子本身通常不被转录，除了编码tRNA基因的启动子。分为三类：I类启动子富含GC碱基对，编码rRNA的基因，除了5SrRNA。II类启动子具有TATA盒特征结构,编码蛋白质（mRNA）的基因和一些小RNA基因。III类启动子包括A盒、B盒、C盒，编码5SrRNA、tRNA、U6snRNA。

② 增强子：顺式作用元件，增强邻近基因的转录。③ 沉默子：负性调控元件，可抑制基因转录的特定序列。

6、操纵子、启动子、增强子、断裂基因、内含子和外显子的概念

操纵子：功能上相关联的数个结构基因串联在一起，由一套转录调控序列控制其转录，构成的基因表达单位。

启动子：指结构基因的转录起始位点附近的一段DNA序列，它结合RNA聚合酶（真核生物还需要结合其他蛋白质因子）后能够开放基因转录。

增强子：是可以增强真核生物基因启动子的工作效率的顺式作用元件。断裂基因：真核生物的结构基因中，编码区与非编码区间隔排列。

内含子：指在真核生物的断裂基因及其初级转录产物中出现，但在成熟RNA中被剪接除去的核酸序列。

外显子：指在真核生物的断裂基因及其成熟RNA中都存在的核酸序列。

7、基因组的定义和功能

定义：细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。

功能：储存和表达遗传信息

8、真核生物基因组的特点

真核生物的基因组庞大，出了结构基因的结构与原核生物大不相同以外，还存在大量的非结构基因区域。真核细胞基因组具有结构基因呈断裂基因形式、以单顺反子转录、结构基因在基因组中所占比例小于非编码区域的特点。真核细胞基因组存在大量重复序列，可以分为高度重复序列、中毒重复序列和单拷贝或低度重复序列等3种。真核基因组的另一特点是存在多基因家族。

9、原核生物基因组的特点

原核生物的基因组主要是染色体DNA。

特点：

1、基因组中很少有重复序列；

2、编码蛋白质的结构基因多为单拷贝基因，但编码rRNA的基因仍然是多拷贝基因；

3、结构基因在基因组中所占的比 例远远大于真核基因组，但小于病毒基因组；

4、许多结构基因在基因组中以操纵子为单位排列。

10、质粒、基因重叠、基因组、假基因、核酶

质粒：细菌细胞内的、染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子，能够独立于细胞的染色质DNA而进行复制。

基因重叠：同一DNA片段可以是2种甚至3种蛋白质分子的部分编码区。基因组：细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。假基因：与有功能的基因同源，但不能产生有功能的基因产物的基因。核酶：指具有催化活性的RNA，其作用底物是RNA，主要参与RNA的加工成熟。

11、DNA复制过程的共同特点

1、半保留复制方式保证了遗传信息的忠实传递；

2、基因组DNA都有固定的复制起始点；

3、复制子是基本复制单位；

4、双向复制形成复制泡和复制叉；

5、半不连续复制方式克服了DNA空间结构对DNA新链合成的制约。

12、DNA复制保真性的机制

1、DNA聚合酶对碱基配对的选择作用，保证严格的碱基配对规律；

2、DNA聚合酶对模板的识别作用；

3、DNA聚合酶3’→5’外切活性的校正作用，复制出错时有即时的纠错功能。

13、真核生物DNA复制的基本过程

1、DNA复制的起始；

2、DNA链的延伸。DNA链的延伸主要由DNA聚合酶完成。DNA聚合酶催化的反应是以亲代DNA为模板、4种脱氧核糖核苷三磷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP为原料底物，一句碱基配对原则，在RNA引物链的3’-OH上开始逐个添加dNTP，从而延伸为子代DNA链；

3、复制的终止。复制的终止过程包括去除RNA引物、冈崎片段的连接等反应，最终形成两个完整的子代DNA双链。

14、端粒、端粒酶

端粒：是位于真核生物染色体末端的、由DNA和蛋白质组成的一膨出结构。端粒DNA由短的高度重复序列组成，不同生物的重复序列不同。

端粒酶：是反转录酶，由蛋白质和RNA共同组成能以自身的RNA为模板反复延伸端粒的重复序列。

15、DNA损伤的因素、类型

DNA损伤的因素包括：电离辐射、紫外线、碱基类似物、碱基修饰剂、某些化学染料和自由基。DNA损伤的类型有碱基和糖基破坏、错配、DNA链断裂、DNA交联等。

16、DNA损伤的修复方式

DNA损伤的修复方式：直接修复、切除修复、重组修复和损伤跨越。

17、切除修复、重组修复

切除修复：在多种酶作用下，先将损伤区域切除，然后利用互补链为模板，合成一段正确配对的碱 11 基顺序来修补。

重组修复：重组酶系将未受损伤的DNA片段移到损伤部位，提供正确的模板，进行修复。

18、基因表达的概念

基因表达：指基因转录及翻译的过程，基因表达的最终产物是蛋白质或者rRNA、tRNA等。管家基因是组成性表达，而可调节基因的表达具有时空特异性。

19、何为转录？转录的体系？复制和转录的区别有哪些？ 转录：以DNA为模板合成RNA的过程称为转录。

转录体系：

1、模板：DNA；

2、原料：ATP、GTP、CTP、UTP；

3、RNA聚合酶：原核细胞：全酶α2ββ'σ；真核细胞：RNA聚合酶I、II、III 复制和转录的不同点：1)复制的模板是DNA双链（半保留复制），转录的模板是DNA单链（不对称转录）。2）复制的原料是dNTP，转录的原料是NTP。3)复制的主要酶类是DNA聚合酶，转录酶是RNA聚合酶。4)复制需要RNA引物（由引物酶合成），转录不需要引物。5)复制的产物是双链DNA，转录的产物是单链RNA。6）复制的功能是传递遗传信息给子代，转录是表达遗传信息所需步骤。20、原核、真核生物RNA转录的基本过程

转录起始：转录起始复合体在启动子部位形成（形成开放转录复合体）① 原核生物：RNA聚合酶与启动子相互作用。② 真核生物: RNA聚合酶、反式作用因子与顺式作用元件相互作用。转录延长：RNA链随着转录泡的移动得以延长 ①原核生物：核心酶催化(α2β'βω)② 真核生物：磷酸化的RNA聚合酶催化，核小体解聚。

转录终止：转录终止受DNA模板上终止信号的控制 ① 原核生物：a.依赖ρ因子：ρ因子与RNA转录产物结合，结合后ρ因子和RNA聚合酶发生构象变化，使RNA聚合酶停顿，转录停止。b.非依赖ρ因子：DNA模板上靠近终止处有些特殊碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的茎环结构来终止转录。② 真核生物：转录终止的修饰点处切离并加尾。

21、蛋白质合成体系

蛋白质合成体系：

1、模板：mRNA；

2、氨基酸运输：tRNA;

3、肽链合成场所：核糖体；

4、蛋白质因子：起始、延长、终止因子；

5、原料：20种有遗传密码的氨基酸

22、原核、真核生物翻译的基本过程：

1、起始：形成翻译起始复合物；2延长：只每加一个氨基酸经过进位、成肽和转位；

3、终止：原核细胞：RF1，RF2识别终止密码，RF3激活转肽酶释放肽链；真核细胞：eRF同时具有上述功能。

23、基因表达调控的基本规律（包括基因表达的特点、方式等）

1、基因表达具有时空特异性；

2、诱导表达和阻遏表达时基因表达调控的最普遍方式；

3、基因表达受顺式作用元件和反式作用元件因子共同调节；

4、蛋白质-DNA以及蛋白质-蛋白质的相互作用是基因表达调控的分子基础；

5、基因表达调控是多层次的复杂调节。

24、RNA编辑、核蛋白体循环、分子伴侣

RNA编辑：指细胞核中初级转录产物hnRNA的序列改变，使C变为U或者A变为G，结果一个基因表达产生不止一种蛋白质，增加了遗传信息容量。

核蛋白体循环：是指氨基酸活化后，在核蛋白体上缩合形成多肽链的过程，该过程包括肽链合成的起始，肽链的延长，肽链合成的终止和释放。

分子伴侣：帮助新生多肽链折叠成天然空间构象的一类保守蛋白质（如热休克蛋白），在原核细胞和真核细胞中广泛存在。

25、乳糖操纵子作用机制

(1)乳糖操纵子包含3个结构基因（编码β－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷通透酶和转乙酰基酶）、3个调控元件（启动子、操纵基因和CAP结合位点）和1个调节基因（编码阻遏蛋白）。(2)阻遏蛋白的负调控：无乳糖时，阻遏蛋白结合操纵基因，妨碍RNA聚合酶结合启动子，抑制结构基因转录。有乳糖时，生成别位乳糖（诱导剂）结合阻遏蛋白，不能封闭操纵基因，结构基因可以转录。(3)cAMP-CAP 12 复合物的正调控：无葡萄糖时，cAMP浓度高，形成的cAMP-CAP复合物结合于CAP结合位点，增强启动子转录活性。有葡萄糖时，cAMP浓度低，cAMP-CAP复合物形成受阻，影响转录活性。(4)正、负调控机制相辅相成。cAMP-CAP复合物是转录必需的，同时阻遏蛋白进一步控制转录启动。综上，乳糖操纵子最强的表达条件是有乳糖而无葡萄糖。

26、试述原核生物和真核生物基因表达调控特点的异同(1)相同点 转录起始是基因表达调控的关键环节。

(2)不同点 1)原核基因表达调控主要包括转录和翻译水平；真核基因表达调控包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。2)原核基因表达调控主要为负调节；真核基因表达调控主要为正调节。3)原核转录起始不需要转录因子，RNA聚合酶直接结合启动子，由σ因子决定基因表达的特异性；真核转录起始需要基础、特异两类转录因子，依赖DNA－蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用，调控转录激活。4)原核基因表达调控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白质的协调表达机制更为复杂。

27、细胞通讯、信号转导的概念

细胞通讯：生物体内各种细胞在功能上的协调统一是通过细胞间相互识别和相互作用的机制来实现的，这种机制称为细胞通讯。

信号转导：是通过多种分子相互作用的一系列有序反应、将来自细胞外的信息传递到细胞内各种效应分子的过程。

28、化学信号分子的分类

化学信号分子可根据物理性质分为脂溶性化学信号和水溶性化学信号两大类。从其作用距离考虑则可分为激素、神经递质和属于旁分泌系统的细胞因子、生长因子等三大类。

29、受体的概念、分类、作用和特点

（1）概念：受体位于细胞膜或细胞内，能特异识别生物活性分子，可与之相互结合，进而引起生物学效应的蛋白质，以及个别糖脂。（2）分类： 膜受体和胞内受体 1)膜受体分类：

① 离子通道型受体 与此类受体结合的主要是神经递质，介导离子通道的打开和关闭，改变膜通透性，能迅速、准确地传递神经冲动，作用时间很短。

② G蛋白偶联受体 又名七次跨膜受体，胞浆面的第三个环能与鸟苷酸结合蛋白偶联，通过不同的G蛋白影响腺苷酸环化酶或磷脂酶C改变细胞内第二信使浓度，以实现跨膜信号传递。

③ 单次α螺旋跨膜受体 结构上具有一个跨膜α螺旋，包括受体型酪氨酸蛋白激酶和非酪氨酸蛋白激酶型受体。

2)胞内受体：多为反式作用因子，当其与相应配体（例如 类固醇激素、甲状腺素等），能与DNA的顺式作用元件结合，调节基因转录。

（3）受体作用的特点： 高度专一性、高度亲和力、可饱和性、可逆性、特定的作用模式。30、何为生物体内第二信使？主要包括哪些？

第二信使：配体与受体结合后，靶细胞内转导膜外激素信号的某些小分子化合物，在信息传递过程中产生放大的作用，称为第二信使。

主要包括：环腺苷酸（cAMP）、环鸟甘酸（cGMP）、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）、Ca2+。

31、信号转导分子下游传递信号的方式

（一）通过改变小分子的浓度和细胞内定而传递信号

1、酶促反应生成小分子信使

2、调控离子通道可改变小分子的浓度或细胞内的定位分布

（二）上游分子通过边沟激活下游分子而传递信号

1、配体结合并激活受体

2、酶分子通过共价修饰变构激活下游转导分子

3、小分子信使结合并激活下游分子

4、上游蛋白质结合激活下游蛋白质分子

32、列举膜受体介导的细胞信号转导途径 1)cAMP-PKA途径。

2)Ca2+-依赖性蛋白激酶途径 Ca2+-磷脂依赖性蛋白激酶途径和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径（Ca2+-CaM激酶途径）。3)cGMP-PKG 途径。

4)酪氨酸蛋白激酶途径 受体型TPK-Ras-MAPK途径和JAKs-STAT 途径。5)核因子κB途径 6)TGF-β/Smad途径

33、核酸分子杂交

在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件下，就可以在不同的分子间形成杂化双链。这种杂化双链可以再不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成，这种现象称为核酸分子杂交。

34、重组DNA技术的基本原理

35、目的基因获取的方法

聚合酶链式反应（PCR）、反转录-PCR（RT-PCR）、文库筛选和人工合成等

36、基因载体的概念，常用载体有哪些，载体选择标准

载体是指能够携带目的基因在宿主细胞内扩增或表达的DNA分子。常用的载体包括：质粒载体、病毒载体和人工染色体载体

载体选择应具备的条件：(1)有复制子。(2)有单一限制性内切酶位点。(3)有筛选标志。(4)表达型载体具备完整的转录单位。

37、基因克隆的基本步骤

基因克隆的基本步骤是：

1、用限制性内切酶笑话目的基因和载体DNA，使其具备能连接的末端序列特征；

2、用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接起来构成重组DNA分子；

3、将连接起产物导入合适的宿主细胞，使重组DNA分子得以复制扩增；

4、筛选及克隆化，从而获得重组克隆载体及克隆的基因。

38、cDNA文库、基因组文库

cDNA文库：指含有某种组织细胞全部mRNA信息的重组DNA克隆群体。以细胞总mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的cDNA第一链，进而形成cDNA双链，与合适载体连接后转入受体菌扩增，由此建立cDNA文库。

基因组文库：指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体。即将原核或真核细胞染色体DNA提纯，用机械法或限制性内切酶将染色体DNA切割成大小不等的片段，插入适当的克隆载体中，继而转入受体菌扩增，由此获得含有众多克隆的基因组DNA文库。

39、PCR、RT-PCR、Southern印迹、Northern印迹、RNA干扰

PCR：是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的体外复制扩增DNA片段的技术。

RT-PCR：以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA,再进行的PCR反应。

Southern印迹：是DNA定性及定量分析的方法之一，过程为

提取细胞中的总DNA，用限制性内切酶水解后进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，用DNA探针与结合在膜上的DNA分子退火形成双链，检测靶DNA的含量。

Northern印迹：是RNA定性及定量分析的方法之一，过程为

将细胞中的总RNA分子进行电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上，用DNA探针与结合在膜上的RNA分子退火形成双链，检测靶RNA的含量。

RNA干扰：由短双链RNA诱导同源RNA降解的过程，是一种特异的转录后基因沉默现象，可以认为是生物体在核酸水平的免疫反应。40、何谓药物发现

药物发现：广义定义是药物研究和开发过程，包括：某种疾病和治疗靶点确定的基础研究和可行性分析；先导化合物体外检测的生物模型和方法学的建立；药理学、药物代谢动力学和安全性研究；制剂学；专利申请以及人体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床研究和上市销售。狭义上指药物设计，即基础研究和可行性分析设计的先导化合物发现过程。

41、传统和现代药物发现模式

传统药物发现模式：

1、随机发现，包括治疗作用的随机发现和药物来源地随机发现；

2、定向筛选发现，也包括对治疗特定疾病药物的筛选和特定药物来源物质的筛选。

现代药物发现模式：1.合理药物设计：发现先导化合物是药物发现的关键一步。

2.逆向药理学

42、何谓药物靶点

药物靶点：是生物体细胞膜上火细胞内的一种特异性大分子结构。药物和信息分子能与有关受体大分子的关键部位特异性结合，生成可逆性复合物，并进一步启动功能性变化，汝开启细胞膜上的离子通道，火激活特殊的酶，从而导致生理药理变化。

第二篇：医学分子生物学与实验

1.简述动物组织蛋白质，DNA ,RNA提取的大致过程及原理。

答：共同的第一步都是取动物组织进行清洗剪碎，然后用高速组织捣碎机破碎。

DNA的提取：

通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。

RNA的提取:

取组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚液，室温下剧烈振荡10分钟。置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。

蛋白质的提取:

1.组织称重，切小块放入管中。

2.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。

4.用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。

5.裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

原理：在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，因此在提取和制备DNA或RNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl 浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0 mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14 mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。

提取出DNA或RNA-蛋白质复合体（DNP）后，在将其中的蛋白质除去

2.简述基因工程的原理及过程。

答：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

所谓基因工程（genetic engineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。一般步骤：1克隆重组：提取供体生物目的基因，酶解，连接到另一个DNA分子（克隆载体）上形成重组DNA；2转化：将重组子转入受体细胞，并在其中复制保存；3筛选鉴定：已吸收重组子的细胞；4大量培养监测外源性基因是否表达。

3.比较原核生物与真核生物的基因表达调控机制。

答：

原核生物基因表达调控 真核生物基因表达调控

启动因子：σ因子决定RNA聚合酶识别的特异性TF2D决定RNA聚合酶识别的特异性

转录激活：操纵子 调节蛋白顺式作用元件转录因子

主要机制：操纵子模型具有普遍性顺式作用元件具有普遍性

主要为负性调节（阻遏调节）主要为正性调节

特有机制：转录衰减染色体结构变化

共同点： 1.基因表达都有时间特异性和空间特异性2.基因调控的多层次性和复杂性3转录起始部分是基因表达的基本调控点

4.简述 PCR的原理及其应用，引物设计的原则。

答：PCR的原理：以扩增的DNA分子为模板，以1对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，依半保留机制沿模板链延伸直至完成2条新链合成。通过变性，退火和延伸重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。反应体系基本成分有模板DNA，特异引物，耐热性DNA聚合酶，dNTP和含有 Mg²+的缓冲液。

PCR的主要用途：1目的基因的克隆；2.基因的体外突变3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列测定5.基因突变分析

PCRD的衍生技术：1锚定PCR(anchored PCR)2..不对称PCR(asymmetric PCR)3.反向PCR(inverse PCR)4.多重PCR(multiplex PCR)5.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。⑥引物3„端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

5.简southern blot的原理及其应用。

答：原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。可用于检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

主要应用于1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.PCR产物分析。例如在研究转基因的时候，可用于检测外源基因的插入和整合情况。

第三篇：暨南大学分子生物学资料

暨南大学 2005 分子生物学复习题参考解答

2005生物化学与分子生物学专业

暨南大学 2005 分子生物学复习题参考解答

1.举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和四级结构？

二级结构:一条多肽链主链原子局部的空间排列

超二级结构:由若干个相邻的二级结构元件组合在一起,彼此相互作用形成的有规则的二级结构的组合体.ＤＯＭＡＩＮ（结构域）:多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成的三级结构的局部折叠区,是相对独立的紧密球状实体.三级结构:一条肽链的所有原子的空间排列.MOTIF:就是在许多转录因子的序列中,存在的负责与DNA结合的共同基序.这些基序通常都很短,仅含一小部分蛋白质结构,还通过与转录复合体的蛋白质之间的相互作用激活转录.如锌指基序,亮氨酸拉链等都是MOTIF.四级结构:几个亚基在三级结构的基础上相互作用所形成的空间结构．

2.定义chaperone，并解释其功能？

Chaperone:即分子伴侣，为一类与其他蛋白不稳定构像相结合并使之稳定的蛋白，他们通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在体内的折叠、组装、转运或降解等。分子伴侣在蛋白质的折叠和组装中起非常重要的作用，它是细胞内蛋白质折叠和组装的重要调节者。

分子伴侣的功能：分子伴侣是一类蛋白家族，可以在细胞内帮助蛋白折叠 • 在蛋白转运的过程中，保持蛋白质的去折叠状态 • 在受胁迫的细胞内帮助蛋白进行正确的折叠 • 阻止形成错误的折叠，抑制聚沉 • 为执行校验功能进行再折叠

• 为了防止降解使蛋白去折叠，或选择蛋白使其降解

3.分析你所认识的RNA分子二级结构？

核酸分子的二级结构，对RNA而言，是指单链RNA分子通过自身碱基的配对，折叠而成的螺旋，突环相间排列的结构。如广泛存在的tRNA的三叶草形二级结构是由于小片断互补碱基配对而形成。它包括四条根据结构或已知功能命名的手臂即受体臂，D臂，反密码臂和TψC臂。另外还有一条易变的多余臂。无法配对的碱基形成套索状结构。

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4.解释DNA聚合酶I的三种酶活性？

DNA聚合酶I 其活性主要有：①5＇→3＇聚合酶活性，即使脱氧核糖核苷酸逐个加到3＇－OH末端的核苷酸链上，使DNA链沿5＇→3＇方向延长，其聚合活性只能在已有的核苷酸链上延长DNA而不能从无到有开始DNA链的合成；②3＇→5＇核酸外切酶活性，只作用于单链DNA,此活性对DNA复制的忠实性极为重要，在极少情况下，聚合酶在3＇－OH末端加上1个与模板链上碱基不配对的碱基，此时聚合酶I即可发现并切除这个错配碱基，从而避免复制过程中的错误；③5＇→3＇核酸外切酶活性，它只作用于双链DNA的碱基配对部分，从5＇末端水解下核苷酸，此活性在切除由紫外线照射而形成的胸腺嘧啶二聚体中起重要作用，在DNA复制中冈崎片段5＇端RNA引物的切除也靠此酶。

5.解释DNA聚合酶III各亚基的功能？

DNA聚合酶III是多亚基组成的蛋白质,它在细胞中含量很少,在每个细胞中只有10～20个拷贝的全酶，Pol III全酶由α,β,γ,δ,ε,θ,τ,δ',χ,ψ10种不同的亚基组成

核心酶由α, ε，θ组成。

α亚基具有5'→3'方向合成DNA的催化活性,每秒可以合成8个核苷酸。

ε亚基具有3'→5'外切核酸酶的校对功能,在体内其基本功能是控制复制的忠实性,ε亚基常与α亚基形成一个紧密的1:l复合物,协同发挥功能.θ亚基使核心酶相互连接

τ亚基使核心酶形成二聚体，与模板连接，具有ATP活性。

β亚基是以二聚体的形式存在的.在复制过程中β二聚体环绕着DNA,并能在DNA上自由滑动,构成一个滑动钳.滑动钳可把全酶束缚在模板DNA上,从而保证高度的进行性和聚合反应速度。

γ复合物是β滑动钳的载体,可帮助β滑动钳结合到DNA上.γ复合物含有5个不同的亚基,形成一种化学计量为γ2δ1δ'1χ1ψ1的结构.β二聚体自己并不能组装到DNA 上 ,它是通过γ复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的.6.生物如何控制一个世代只复制一次？

原核生物与真核生物控制自身DNA复制次数的机理是不一样的现分别以大肠杆菌和酵母为例加以阐明：

在大肠杆菌复制起点存在一些被Dam甲基化酶甲基化的位点，包括那些DnaA特异的13bp结合位点，复制起时候再复制周期后将保持甲基化状态，并处予隔离状态约10分

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钟，在这一时期他与膜相连，而复制的再次起始会被抑制直到复制起点完全甲基化时与膜连接的DnaA取代抹上的抑制剂时DNA才开始下一次的复制

细胞分裂后，真核生物细胞和含有执照因子，它是复制起时所需的，在酵母中执照因子在复制起始后被破坏，这就能阻止再次复制周期的发生，执照因子不能从细胞只运送到细胞核中，只能在有丝分裂过程中和崩裂时才能进入核内

7.阐明Rolling Circle Replication？

滚环式复制(rolling circle replication)是噬菌体中常见的DNA复制方式。滚环式复制的一个特点是以一条环状单链DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。噬菌体的双链DNA环状分子先在一条单链的复制起点上产生一个切口，然后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。释放出的新合成的单链或是先复制成双链DNA，被酶切割成单位长度后，再形成环状双链DNA分子；或是释放出的新合成的单链DNA，先被酶切割成单位长度形成单链环状DNA分子后再复制成双链环状DNA分子。

质粒的滚环式复制有2个步骤：第一步是前导链的合成。质粒编码的复制蛋白（Rep）起始子与超螺旋DNA的正起点结合，并提供链特异性及位点特异性缺口。随着缺口的母链被替换，随着宿主编码的产的参入，前导链的合成不断进行着，当复制复合体到达重构的起点，同一个或另一个Rep分子在质粒DNA上引入一个新的缺口，使替换链从ssDNA形式解放；第二步是随后链的合成。这一过程从不同的质粒区域即单链起点起始。由于前导链和随后链的解偶联，复制是不对称的。ssDNA的产生是RC质粒的标志。宿主谱广可能是RC质粒的特征。

8.阐述端粒的结构和端粒酶功能？

端粒的结构：

端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，是由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸的蛋白质复合物，在真核生物包括原虫、真菌、纤毛虫、植物和哺乳动物中都存在．端粒DNA 由非编码的重复序列组成，不同物种的DNA 重复序列的重复数不同，如人与其他脊椎动物约为2 000 个，拟南芥是53 个拷贝．不同的真核细胞端粒存在类似的DNA 序列与结构，且高度保守。其共同的特征是富含G，而且富含G的链(5′→3′)比富含C的链(3′→5′)突出12~16个核苷酸。

尽管端粒DNA 是染色体末端的一个结构，但在染色体的中间也发现了同样的重复序列．与端粒DNA 相邻的是一“端粒下区”(subtelomericregion)，它由一些退化的端粒DNA 片断独特的重复片断组成。

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端粒除简单的核苷酸重复外，还包含有特殊的非核小体蛋白端粒结合蛋白．端粒结合蛋白依据结合特性分为两大类

(1)双链TBPs(double-strand TBPs)：这是一类可特异地与双链端粒重复序列结合的蛋白质，它在端粒长度的维持中具有重要作用，而且对端粒具有保护和调节功能。

(2)单链TBPs(single-strand TBPs)：可结合于3′单链突出的末端，对于染色体末端的“戴帽”，以及端粒酶活性的调节具重要作用。

端粒酶的功能：

端粒酶的主要作用是维持端粒的长度。端粒酶不但可以维持已经存在的端粒DNA，同时端粒酶反转录酶能够识别断裂染色体的末端，重新将端粒重复序列加到染色体的断裂末端或非端粒DNA上。端粒酶能利用端粒3′端单链为引物，自身的RNA 为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度。人的生殖细胞、造血干细胞及T，B 淋巴细胞中端粒酶有不同程度的表达，而在正常的体细胞中，端粒酶处于失活状态，因此体细胞随细胞分裂次数的增加端粒逐渐缩短。端粒的长度与有丝分裂次数相关，所以端粒又有细胞的“有丝分裂钟”之称。

9.描述The Nucleotide Excision Repair pathway。

当DNA链上相应位臵的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则需要以核苷酸切除修复(nucleotide-excision repair)方式进行修复。

1）．切除损伤部位。一种专门的核酸切割酶识别并在已损伤的核苷酸5’和3’位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12～13个核苷酸（原核生物）或27～29个核苷酸（人类或其他高等真核生物）的小片段。

2）．DNA解链酶把切除的小片段核苷酸移去。

3）．DNA聚合酶I（原核）或DNA聚合酶E以完整的互补链为模板，按5’—3’方向DNA链，填补已切除的空隙。

4）．DNA连接酶封口，修复完成。

10.解释recA, recB, recC，recD，RuvA，RuvB，RuvC genes 所编码蛋白和Chi sites 在重组中的作用。

RceA蛋白具有链交换，ATP酶及蛋白酶活性。它能结合到ssDNA上，促使DNA分子间的链交换，我们将RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段： 1RecA结合到单链DNA上。

2单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应，产生异性双链连接

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3单链从双链中转移，取代了双链中的一条链。

RecBCD是由recB，recC，recD三个基因编码的三个亚单位组成的酶，具有：核酸外切酶V活性；解旋酶；核酸内切酶；ATP酶；ssDNA外切酶活性。它能结合到双链的上并使双链解旋并分开，当遇到Chi位点时，RecBCD就切开一条单链，并失去RecD亚单位，RecBC继续解开双链。这样就得到了链交换和重组的位点。Chi是一个被recBCD基因编码的酶的作用目标。

RuvA辨认Holliday连合处的结构，RuvB是一个解旋酶，并以六聚体形式结合于双链DNA上，解开双链螺旋。

ruvC，编码了一个末端核酸酶，它能确精地辨认出Holliday结合处，结合到Holliday中间产物上，将这样的结合处分开。

11.原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么？

原核生物中绝大部分的启动子都存在位于-10bp处的TATAAT区和-35bp处的TTGACA区。这两个区是相当保守的序列，是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。在-35区和-10区之间的距离17±1bp。保持启动子这二段的序列以及它们之间的距离是很重要的，否则会改变它所控制的基因的表达水平。UP 元件，位于启动子上游-57 和-47 富含A/T。(5'-AAAATTATTTT-3').不依赖于rho因子的终止子：终止位点上游一般都存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由6-8个A组成的序列，所以转录产物的3`端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。

依赖于rho因子的终止子：依赖rho因子的转录终止区DNA序列缺乏共性。Rho因子是一个相对分子量为2.0×105的六聚体蛋白，是一种NTP酶，通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。RNA合成起始以后，rho因子即吸附在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿5`→3`方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3`-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从模板DNA上释放mRNA，完成转录过程

12.RNA聚合酶I识别的启动子包含有哪两个部分？分别有什么蛋白因子识别？

RNA聚合酶Ⅰ只转录编码核糖体RNA的基因，转录产物经切割和加工后生成各种成熟rRNA RNA 聚合酶I 的转录单位有两段起始调控序列，核心启动子(Core promoter)和与之

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相距70bp 处的上游启动元件upstream promoter element(UPE)（旧称上游控制元件(Upstream control element，UCE)）

核心启动子(Core promoter)位于起始位点周围，从-45 延伸到+20，它本身就足以起始转录。但是，其效率可被位于-180 到-107 的上游启动元件（UPE)显著提高。与一般启动子相比，这两个区域都有不寻常的组成，富含G·C碱基对，而且它们约有85%是一致的。

RNA 聚合酶Ⅰ需要UBF1和SL1两个辅助因子。UBF1 是一个单链多肽，它先后与UPE和核心启动子上富含G·C 区结合。SL1 因子是一个四聚体蛋白，其作用类似于细菌，本身对于启动子没有特异性，但一旦UBF1 结合，SL1 就可以协同UPE结合到此覆盖的DNA 延伸区域，可能其主要功能是使RNA 聚合酶正确的定位在起始位点。

发生在两个部位的结合因子之间相互作用的详细情况尚不清楚。两个因子都结合后，RNA 聚合酶Ⅰ就与核心启动子结合起始转录。

简单答案：（RNA聚合酶I识别的启动子包含-40~+50的近启动子和-165~-40的远启动子两部分。近启动子功能决定了转录起始的精确位臵，远启动子的功能是影响转录的频率。近启动子有辅助因子UBFl识别，远启动子有SL1识别。）

13.RNA聚合酶III识别的启动子有哪几类？其定位因子是什么？

RNA聚合酶Ⅲ的启动子分成两大类,由不同的因子采用不同方式识别。

5SrRNA和tRNA基因的启动子是内部（internal）启动子，它们位于起点下游（Downstream）。

snRNA（核小RNA）基因的启动子与其它启动子相似，位于起始位点上游（Upstream）。在这两种情况中，启动子的功能元件都是由可被转录因子识别的序列组成，但它反过来指导RNA聚合酶结合。

5SrRN转录产物的启动子位于基因+55和+80之间。

RNA聚合酶Ⅲ有三种类型启动子包括两种类型的内部启动子，每个都含有两个分开的结构，其中两个短序列元件被一个多变的序列分开。类型Ⅰ（5SrRN）同boxA 序列和一个隔开的boxC组成，类型Ⅱ（tRNA）由boxA和一个隔开的boxB序列组成。类型Ⅱ启动子上的A盒和B盒之间的距离可以变化很大，但两盒不能过近，太近会失去其功能。

RNA聚合酶Ⅲ的第Ⅲ类启动子有三个上游元件。负责转录snRNA的基因，其元件主要包括：Oct-PSE-TATA(PSE：近端序列元件，提高转录效率)

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有关的转录因子包括TFⅢA、TFⅢB、TFⅢC, 在Ⅰ类启动子的转录起始过程中，首先TFⅢA结合于内部部启动子的boxA，然后TFⅢC结合于boxC然后招募真正的起始因子TFⅢB，TFⅢB最后招募RNA聚合酶Ⅲ。

在Ⅱ类启动子的转录起始过程中，首先TFⅢC结合于平boxA和boxB，然后招募真正的起始因子TFⅢB，后者招募RNA聚合酶Ⅲ。

（TFⅢB含TBP是真正的转录因子，A、C可被高盐除掉，是装配因子）

14.RNA聚合酶II识别的启动子含有多种顺式作用因子，请举4例。

eg1: TATA box通常位于起始位点上游约25bp处，它组成唯一的上游启动子元件，此元件距起始位点有相对固定的位臵。它可以在所有真核生物中找到。TATA盒倾向于被富含G*C对的序列环绕，可能是TATA盒起作用的一个因子。具有选择定位转录点的功能，作为定位因子起作用的

eg2: GC box通常在起始位点上游40-70处，但在每一个启动子中，GC盒前后的情况是不一样的。功能是加强转录，两个方向都有效。

eg3: CAAT box决定了转录的效率，两个方向都有效。eg4: 八聚体（8bp元件）能增强真核生物启动子的转录功能。

15.列出能在真核生物细胞中表达载体的构件名称，并作出解释？

真核表达系统中根据受体细胞的不同，其所应用的载体和表达策略各有不同，据此可将真核生物表达系统分为三类：1酵母表达系统，2哺乳动物表达系统，3昆虫表达系统，这三类的组成元件分述如下。

1.酵母表达系统的组成元件包括

1〉 遗传标记：利于重组子的筛选、鉴定 2〉 调控序列

a.ARS：酵母自主复制序列，相当于复制起点，可启动基因在酵母中的复制 b.2μ质粒，酵母细胞中存在削夺不同类型的内源性质粒，其中一种称为2μ质粒，它以高拷贝数存在于细胞核外，为小球状DNA，长约2μm，可以独立复制转录

c.酵母启动子：在小母表达载体中必需含有酵母启动子，以启动外源基因在酵母中的表达

d.酵母着丝粒区段：增加转化的的稳定性 2.哺乳动物细胞表达载体的主要组成元件 1〉启动子

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2〉增强子，3〉筛选标记，4〉终止信号和多聚腺苷酸化信号：维系转录后能有效切割和多聚腺苷酸化，在真核表达载体中须含有转录终止信号和多聚腺苷酸化信号，5〉剪切信号，并非所有的cDNA都需要剪切信号但一般来说内含子不会降低而是提高表达的效率，6〉复制元件：可提高外源基因的表达水平，7〉为了能方便化的大量重组DNA，哺乳动物表达载体通常含有一段原核系列。-3.昆虫杆状病毒载体——转移载体的基本元件

1〉原核系列：包括复制起始点、抗性基因及多克隆位点。2〉杆状病毒启动子：常用的有P10启动子

3〉杆状病毒复制非必需区：多采用多角体蛋白侧翼序列，提供转移载体与杆状病毒细胞内同源重组的位点

昆虫细胞加尾信号

16.请阐述ALTERNATIVE SPLICING的生理学意义。

选择性剪接（ALTERNATIVE SPLICING）是指同一基因转录形成的初级RNA经过不同的剪切和连接方式形成不同的RNA的过程。真核生物含有限数目的基因，但是当严格需要时，真核生物通过一系列精确的工具来加工 mRNA,产生不同的转录类型。选择性剪接属于复杂性剪接，也就是说，一个基因的初始转录物能够加工产生出不同的 mRNA,从而产生不止一种蛋白质。一个选择性剪接的例子就是SV40,当它感染细胞时，引导2种蛋白质的合成：大T抗原和小T抗原。这两种蛋白质表达自同一种前体mRNA，通过2个5'剪切位点及一个共同的3'剪切位点的不同加工过程，表达出2种不同的抗原。一般地，真核生物一个基因的外显子和内含子的数目及所在位臵是固定的。但也可能出现外显子和内含子数目及所在位臵不固定的情况，选择性剪接的直接后果是一个基因产生多个不同功能的蛋白质。mRNA 选择性剪接涉及生命现象的很多方面，如细胞分化，个体发育，免疫机理，某些遗传病的发生等等。选择性剪接在器官发育中具有重要意义，同样的基因产生不同的蛋白质，使得不同的组织，不同的器官各自分工，形成真核生物复杂的生命体。同时可以节省大量的遗传信息。选择性剪接使真核生物在蛋白质组水平上表现出极高的复杂性，这就是人类的基因数目只有3 万多个，却有比其他生物高得多的进化程度的一个重要原因。

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17.请阐述RIBOZYME的应用？

（由于17、18题目相对开放灵活，没有大篇幅详细解答。请各位同学结合自己研究方向对感兴趣的某一方面进行详细阐述，这里只起抛砖引玉作用。）

核酶(ribozyme)是一类具有催化活性的RNA 分子,可通过碱基配对特异地与相应的RNA 底物结合,并在特定的位点切割底物RNA 分子。自美国科学家Cech 和Altman 等发现核酶至今的20多年来,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达,已相继对获得性免疫缺陷综合征、肿瘤、生殖系统疾病、病毒性肝炎、白血病、移植排斥反应等进行了广泛深入的研究。核酶的种类很多，从结构上看主要有发夹状核酶(hairpin ribozyme)和锤头状核酶(hammerhead ribozyme)。

从目前来看，核酶的应用主要在基因治疗上。即将核酶基因导入细胞内，使其在细胞内表达出相应的核酶，从而对mRNA进行切割，在翻译水平阻止某些基因的异常表达，达到治疗疾病的目的。

核酶的应用举例：

1．核酶在肿瘤治疗中的应用 主要集中在以下几个方面

①核酶与癌基因：核酶独特的切割目的基因的方式有可能阻断癌基因的表达, 从而逆转肿瘤细胞恶性增殖, 并诱导其分化和凋亡。

②核酶与多药耐药性：多药耐药性(Multidrug resistance, MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因。设计核酶抑制耐药相关基因的表达，使耐药的肿瘤细胞重新获得对化疗药物的敏感性。

③核酶和端粒酶：在高等生物细胞中, 除了精原细胞和少数造血细胞存在端粒酶活性外, 其余体细胞的端粒酶均处于失活状态。而当细胞恶变时, 端粒酶则被激活, 使端粒酶长度不随细胞分裂而丢失, 从而使细胞逃避老化死亡, 保持无限复制与增殖。现在, 人们已经开始应用核酶技术通过抑制端粒酶活性, 从而抑制肿瘤细胞的增殖。

2．核酶在抗病毒中的应用

①抗艾滋病病毒HIV：HIV的长末端重复序列(LTR)参与病毒蛋白生成的调节，起着类似“开关”的作用。HIV感染人体后，病毒的RNA在逆转录酶作用下合成DNA，然后整合到细胞染色体上，可长期潜伏。只有某些特定的激活因子作用于已整合人细胞基因的 HIV 前病毒LTR时，才能启动表达，或使表达从低水平转入高水平。利用特异性核酶在细胞内抑制HIV-1的LTR mRNA表达，能明显降低细胞HIV-1病毒蛋白的表达水平，从而

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达到抑制病毒复制的作用。

②抗乙肝病毒HBV：核酶能特异地切割HBV前基因组RNA , 使其丧失模板 活性, 如针对HBcAg mRNA 设计的核酶, 可有限的剪切HBV mRNA;针对HBV 前C/C区基因设计的锤头状核酶, 经体外转录后可定点切割靶RNA等。从而起到抗病毒的作用。

尽管核酶已经开始应用于人体内治疗,但尚有许多问题有待解决。例如:如何获得高效、无毒的特异性核酶,如何选择靶序列中最佳切割位点,如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等。

18.请阐述RNA分子功能的研究进展？

RNA是由4种核糖核苷酸组成的多核苷酸分子，在细胞内的RNA按结构与功能可分为若干类，最基础的是mRNA、rRNA、tRNA。此外还有一些小RNA分子。

RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。但长久以来，RNA分子一直被认为是小角色。它从DNA那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列发现表明，RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可透过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以透过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。

近年来对RNA分子功能的研究主要集中在以下几个方面 1．小干涉RNA(small interfering RNA, siRNA)双股RNA(dsRNA)对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。双股RNA(dsRNA)经酶切后会形成很多小片段，如siRNA。siRNA一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补合，会导致mRNA失去功能，即不能转译产生蛋白质，也就是使基因“沉默化”了。

2．小RNA(microRNA, miRNA)最近几年来，科学家在线虫(C.elegans)中相继发现了能时序性调控发育的基因lin-4和let-7，将这类基因编码的能时序调控发育进程，长度约为22个核苷酸的小分子RNA称为small temporal RNA(stRNA)。后来，科学家又相继在线虫、果蝇、鼠、人等生物中发现了许多类似的基因，把它统称作miRNA(microRNA)。miRNA的主要功能是调节内源基因的表达，参与细胞周期的调控及个体发育过程，同时它与在siRNA具有很大的相关性，可能对基因功能研究、人类疾病防治及生物进化探索有重要的意义。

此外，2004年Tomoko Kuwabara和他的同事们发现一种小dsRNA能够作用于神经

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基因的表达，并且能在转录水平上直接诱导神经干细胞向神经细胞分化.这种RNA在基因转录水平上直接参与调控，它被命名为smRNA。

19.请阐述Aminoacyl tRNA synthetases 在蛋白质翻译中的作用。

在蛋白质翻译中，每种tRNA分子在它到达核糖体之前都需与相应的氨基酸结合，这种结合是在一系列被称为氨酰-tRNA合成酶作用下完成的。大多数细胞可产生二十种不同的氨酰-tRNA合成酶，每一种酶既识别tRNA，又能识别氨基酸，对两者都具有高度专一性。它们各不相同，各负其责，使一种氨基酸与其相应的一套tRNA分子结合。这些酶可以将正确的氨基酸装载到相应的tRNA分子上，于是，tRNA就可以执行它从DNA的脱氧核糖核苷酸序列信息到蛋白质的氨基酸序列信息的翻译功能，保证了蛋白质翻译的真实性。

20.阐述IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF的功能。

起始因子

IF-1：无特异功能，仅具有加强IF2和IF3的活性作用，尤其在70S起始复合物生成后促进IF-2的释放。

IF-2：对于30S起始符合物与50S亚基的连接是必需的。

IF-3：形成三元复合物；使70S核糖体颗粒解离为30S和50S亚基。延长因子

EF-Tu：与氨基酰-tRNA及GTP结合形成三元复合体。

EF-Ts：结合EF-Tu，臵换出GDP，再被GTP取代，使失活的EF-Tu·GDP变成有活性的EF-Tu·GTP。

EF-G：介导GTP水解，为核糖体的移动提供必需的能量。

终止因子：终止因子用以识别这些密码子，并在A位点上与终止密码子相结合，从而阻止肽链的继续延伸。

RF1：识别UAG和UAA RF2：识别UGA和UAA RF3：具体作用还不肯定，可能与核糖体的解体有关。

21.原核生物如何Rescuing synthesis on “broken“ mRNA from ribosome。

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细菌mRNA寿命较短而且通常很快就被降解，所以其3’端很容易丢失。3’端丢失，一般此序列就没有终止子了，这段系列就遭到严重的破坏。没有终止子的mRNA，缺少了促使核糖体从其上面脱落的标志。如果核糖体结合了这样一个mRNA，那么它将在到达有缺陷的地方后就停止，并且无法有效的脱落。这对细胞是有害的。

E.coli有一种由ssrA基因编码小分子RNA，其前体形式有457个核苷酸，成熟形式有363个核苷酸。这种RNA又称为tmRNA 或 10SaRNA，它同时具有tRNA, mRNA两者的性质。它在蛋白质合成过程中用来拯救被困在失去终止序列的缺陷RNA上的核糖体。tmRNA有若干重要的特性： 它的二级别结构和三级结构类似于tRNA.2 它受丙氨酸的调控。它能做为mRNA使用，用来知道合成一段10个氨基酸的寡肽ANDENYALAA。E.coli中的SsrB蛋白有一个丙氨酸末端，能够结合tmRNA。后者将tmRNA带到受困的核糖体的A位点。随即肽基转移酶把新生肽，也即是原先无法继续合成的肽链的C端连接到SsrB蛋白的丙氨酸末端上。此时tmRNA也取代了原先的缺陷RNA，以自身为模板行使其mRNA功能，再合成10个氨基酸加到新生肽上。

最后加上的两个氨基酸均为丙氨酸，它们是作为水解酶ClpAP和 ClpXP识别标志而加上去了的。这样，因为核糖体受困而合成不完全的肽链能够即使的被水解。从而消除由于synthesis on “broken” mRNA from ribosome带来的潜在危害。

22.真核生物翻译scanning模型

Scanning模型是阐述核糖体在带有5′帽子结构的真核生物mRNA上翻译的起始作用。

该模型认为40s亚基首先识别5′端帽子，然后沿mRNA移动进行扫描。从5′端的扫描是一个线性过程。当40s亚基扫描先导序列时，可能遇到发夹二级结构，其稳定性应小于-30kcal，因为更稳定的发夹结构会阻止亚基的移动。

当40s亚基遇到AUG起始密码子时即停止移动。通常（不是所有情况下），第一个AUG三联体密码子为起始密码子，AUG本身并不能阻止亚基移动，并且只有在合适的位臵上它才会被高效地识别。该位臵含有序列GCCAGCCAUGG，在AUG前三个碱基位臵上的嘌呤（A或G）和随后的G非常重要，它们以10倍的关系影响翻译效率，而其余的碱基对翻译效率影响较低。当前导序列很长时，第一个亚基还未离开起始位点，5′端又会被新的亚基识别，从而在前导序列和起始位点之间形成一串亚基。

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当40s亚基定位于AUG上，即停止扫描，60s亚基加入，形成完整的80s起复合物。

23.解释大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控机制。

大肠杆菌乳糖操纵子包括三个结构基因：Z，Y和A，以及启动子，控制子和阻遏子等。转录时，RNA聚合酶首先与启动区结合，通过操纵区向右转录。转录从启动区开始，按Z-》Y-》A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这三个基因。转录的调空是在启动区和操纵区进行的。

正调空机制：

cAMP-CAP复合物与 DNA结合改变了这一区段 DNA次级结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链。这可能是cAMP-CAP通过与RNA聚合酶结合，再与DNA结合，因而促进了RNA聚合酶与启动子的结合，从而增强了转录。cAMP-CAP复合物的形成取决于细胞内cAMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为cAMP，细胞内cAMP浓度降低，形不成CAP-cAMP复合物，因而乳糖结构基因不被转录。

负调空机制：

具有活性的阻遏物只要结合在操纵基因上，就可以阻扰RNA聚合酶的转录活动，这是由于P和O位点有一定的重叠序列，O被阻遏物占据后，RNA聚合酶便不能结合到P位点上。阻遏物有无活性又受乳糖这种小分子诱导物的影响。阻遏物与乳糖结合后，由于发生构象变化而失活，不再能同操纵基因结合，于是RNA聚合酶便能结合于启动子，起动基因的表达，使乳糖利用的结构基因转录出相应的mRNA，进而再翻译出蛋白质。在酶诱导合成的这个调节系统中，阻遏蛋白是主要的作用因子，而诱导物可以影响阻遏蛋白的活性，只有阻遏物被诱导失活，结构基因才得以表达。

24.解释大肠杆菌半乳糖操纵子的两启动子调控机制。

大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括3个结构基因galE galT galk 分别编码3种酶。这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。GalR与galE、T、K及操纵区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。

分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子存在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。

从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，转录从S1开始，第13页 暨南大学 2005 分子生物学复习题参考解答

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当无cAMP-CAP时，转录从S2开始。

为什么gal操纵子需要两个转录起始位点？

半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。现在设想只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就有能合成异构酶。假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（S1）对高水平合成进行调节。

25.解释大肠杆菌阿拉伯糖操纵子的C蛋白正负调控机制。

在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA和araD，分别编码3个酶。与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域和一个调节基因araC，这个AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。AraBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。araBAD基因簇从启动子PBAD开始向左进行转录，而araC基因则是从Pc向右转录

AraC蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的。Pr是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，而Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节。在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后，产生大量的Pi，并与启动子结合。

26．解释大肠杆菌衰减子（Attenuator）调控机制。

在阻遏型操纵子中第一个结构基因之前常有一段能减弱转录的序列,称为衰减子.当操纵子被阻遏,RNA合成别终止,起终止转录信号做用的那一段核苷酸称为衰减子.在色氨酸操纵子结构基因中的一个区域,此区域以形成不同二级结构的方式,利用原核生物转录与翻译的偶联对转录进行调节.在衰减子调控方式中,起信号作用的是有特殊负载的氨基酰-tRNA的浓度.在MRNA水平上,该序列有4个调节区,分别是1,2,3,4区,其中1-2,2-3,3-4可自行配对形成RNA特有的发夹结构,但只有3-4配对才能形成茎部富含G-C,3’端有7个连续U的典型内在终止子结构.此外,该序列还编码含有14个氨基酸残基的前导肽.前导肽编码区3’端与1区部分重叠.在Trp操纵子中,该重叠序列含有两个连续的第14页 暨南大学 2005 分子生物学复习题参考解答

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Trp密码子,其他氨基酸操纵子相应地也有类似特点.以大肠杆菌色氨酸操纵子为例说明衰减子调控机制.细菌的转录和翻译几乎同步进行,RNA聚合酶在转录前导序列时,核糖体和相应的tRNA紧随其后翻译前导肽.当介质中Trp浓度很低时,tRNA-trp相应短缺,核糖体移至重叠区两个Trp密码子时因缺少相应tRNA-trp而停滞不前,使1区不能和2区配对,所以2区和3区配对,结果不能形成3-4区配对的终止子结构,因此RNA聚合酶能继续转录下去,操纵子得以表达.当介质中Trp浓度高时,核糖体与足量的tRNA-trp紧随聚合酶后迅速合成前导肽,并在位于1区和2区之间的终止密码子处停止,不影响1区和2区的配对,所以3区可以和4区配对,形成终止子结构,使RNA聚合酶在此终止,从而阻止操纵子酶基因的转录和翻译.第15页

第四篇：分子生物学总结

SectionA 1 三个域：真细菌，古细菌，真核生物 2 组装中的主要作用力：非共价健作用力

SectionB 1 蛋白质纯化的分析方法

正电荷：天冬氨酸 谷氨酸

负电荷：赖氨酸 精氨酸

组氨酸

极性：天冬酰胺 谷氨酰胺

苏氨酸 丝氨酸 半胱氨酸

非极性：脂肪族 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸

异亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸

芳香族 苯丙氨酸

酪氨酸 色氨酸 Cys 二硫键 Gly 无手性 Pro 亚氨基酸

芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白质的一级(决定蛋白折叠及其最后的形状的最重要的因素)：氨基酸脱水缩合形成肽链 N端到C端

共价键

二级：多肽链中空间结构邻近的肽链骨架通过氢键形成的特殊结构。

α转角

β螺旋 氢键为主要作用力

三级： 多肽链中的所有二级结构和其他松散肽链区域（散环结构）通过各种分子间作用力（非共价键为主），弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。

非共价键

四级： 许多蛋白分子由多条多肽链（亚基，subunits）构成。组成蛋白的各亚基以各种非共价键作用力为主，结合形成的立体空间结构即为四级结构。非共价键 偶极：电子云在极性共价键的两原子间不均匀分布，使共价键两端的原子分别呈现不同的电性

兼性离子：具有正电荷（碱性），又具有负电荷（酸性）的分子 双极性分子：

Section C 1核酸的光学特性：

增色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力增加的现象 减色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力减少的现象 Reason: 碱基环暴露在环境中的越多，对紫外的吸收力越强 Absorbance（吸收值）：Nucleotide > ssDNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(碱基有芳香环)芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280:

纯的 dsDNA：1.8 纯的 RNA：2.0 纯的 Protein：0.5 2 Tm 值（熔解温度）：热变性时，使得DNA双链解开一半所需要的温度。

Tm=2x(A+T)+ 4x(G+C)

Tm值与DNA分子的长度，及GC的含量成正比

Annealing（退火）:热变性的DNA经过缓慢冷却后复性

快速冷却： Stay as ssDNA

缓慢冷却: 复性成dsDNA 3 脱氧核糖核酸与核糖核苷酸得到画法 支持双螺旋结构的两个实验：查戈夫规则

X射线晶体衍射 5 双螺旋的内容：

双链之间的关系：DNA分子由两条链组成

双链反向平行(5’3’ 方向)

两链的碱基通过氢键互补配对，A:T;G:C。

双链序列反向互补

各基团排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外;

碱基对平面相互平行，排列在DNA分子的内部。空间结构为：右手双螺旋结构

每转一圈~10个碱基对，每一圈长度33.2A

双链螺旋中形成大沟，小沟。碱对DNA的影响：高pH值对DNA的影响比低pH值的要小。

高 pH 值(pH>11)会改变碱基构象，使DNA变性（双链解旋，成单链）

RNA的影响：高pH值，2’羟基会攻击磷酸二酯键，使其断裂，形成2’，3’-环式磷酸二酯键，从而使RNA分子断裂 共价闭合环状DNA(convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通过共价键结合形成的封闭环状DNA分子。超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型双链DNA进一步旋转后，再形成闭环结构时，就会形成DNA超螺旋结构

L=T+W 判断是否为超螺旋 正负超螺旋 拓扑异构酶：暂时断裂DNA分子中一条或两条单链上的磷酸二酯键，改变DNA分子的连接数及拓扑状态。

功能：消除DNA复制和转录等过程产生的超螺旋。

细胞中，Ⅰ型酶与Ⅱ型酶的活性保持一种平衡状态。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化” 与Ⅰ型酶“使DNA松驰化” 相抗衡，从而使DNA保持适当的超螺旋密度。EB: 嵌入DNA配对碱基之间，使DNA分子在嵌入处局部解旋，增加ccDNA其它部位的正超螺旋 Type II RE

二型限制性内切酶:识别位点一般为４～8个碱基对的回文序列

如：EcoRI

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5

Section D 1 染色体的折叠：串珠结构 ：核心组蛋白:H2A, H2B, H3 and H4.连接组蛋白 H1

核小体

30nm纤丝

高级环状结构（染色质的最高结构）

紧密缠绕结构 着丝粒：两侧是大量的名叫卫星DNA的重复序列

端粒：上百个短的重复序列

作用：端粒DNA 形成特殊的环状二级结构，保护染色体末端不被核酸外切酶降解。

抵消DNA复制时每一轮复制都导致两末端形成的后随链比母链要短一截的现象对染色体的影响 异染色质：高度浓缩，无转录活性

常染色质：结构松散，有转录活性

DNaseI 敏感区域：对区域内DNA的转录活跃

串珠结构

DNaseI 超敏感区域：转录活跃的基因的调控区域

DNA裸露 4 原核染色体结构：非特异性DNA结合蛋白：类组蛋白

位点特异性DNA结合蛋白：与特殊的DNA序列结合

有其他特殊的生理功能：RNA polymerases

对结构域的形成也很重要

复性动力曲线：

Low C0t: 高重复 卫星DNA Moderate C0t : 中重复 串联基因簇

反转座子 High C0t :单拷贝或低重复

大肠杆菌基因组 染色体结构对基因转录的影响

CpG 抑制→CpG位点中的胞嘧啶的C-5常发生甲基化(CpG甲基化），CpG 甲基化可能可以DNA转录被限制→哺乳动物基因组中，有些区域含有很多未甲基化的CpG 位点，被称为CpG 孤岛。

甲基化—转录抑制

去甲基化—恢复转录

组蛋白的乙酰化：核心组蛋白N-端的Lys被乙酰化，DNA与核心组蛋白体解聚。Gene 表达被激活

去乙酰化：抑制 gene表达

组蛋白的磷酸化:对组蛋白 H1 磷酸化，抑制基因表达 其他组蛋白中心法则

Section E 1 DNA复制：细胞中，一条双链DNA分子通过碱基配对，形成两条与其序列相同的DNA双链分子的过程。2

确定DNA半保留复制

半不连续复制 3 复制的基本步骤 复制为双向

大肠杆菌的复制：

起始AT含量高的区域

参与蛋白：DnaA（复制起始因子)：识别并结合于重复序列上，驱使富含AT的重复序列解链，需负超螺旋，及ATP

DnaB(DNA解旋酶):DNA双链解旋，形成复制叉

SSB:(单链结合蛋白):保持解旋部分的单链状态

DnaG(引发酶/引物酶):RNA引物合成，引发复制 延伸

参与蛋白：DNA Pol III全酶：负责新链的合成:前导链，冈崎片段

DNA pol

I：复制中除去引物，填补引物处空缺

终止： 真核生物的复制：

一个细胞周期内，一个DNA分子只能复制一次

Section F 1 复制忠实性的机制：

DNA复制的高精度：模板连和进入核苷酸在DNA聚合酶的作用位点正确配对

3’到5’外切核酸酶对错误碱基的校正

错配修复 2 holiday模型 3

Section K 编码链 模板链 2 大肠杆菌的转录

RNAP酶：核心酶：a 亚基：aNTD对核心酶的组装很重要。

aCTD在识别启动子、调节转录水平中起着非常重要的作用。

b 亚基：RNAP的催化中心。

与模板DNA、RNA产物、及底物核糖核苷酸紧密结合。

抗生素利福平结合在在b 亚基上，可以抑制RNAP的转录活性。

利福平只抑制转录的起始。

利迪链菌素只抑制延伸而不抑制转录起始

b’ 亚基：可能与RNAP的催化有关。

肝素与b’亚基结合后，能干扰RNAP与DNA的结合，抑制转录。

w 亚基：可能与RNAP的组装及维持RNAP结构的稳定性有关

s factor(s因子)：s factor 在启动子特异性识别过程中至关重要 移动慢的原因：可以保持与翻译同步。

与有些基因转录调控相关。

有利于转录终止

RNAP没有3’ →5’外切酶活性，不能进行转录校正。其错配率达10-4。RNAP倒退暴露新合成的错配碱基，可以有利于其他辅助核酸酶将错配碱基切除，增加转录的忠实性。s70基础启动子的一般结构

-10 序列：它对转录起始时，RNAP打开DNA双链的过程非常重要。-

10序列到TSS位点的距离对转录效率也有很大的影响-35 序列：增强RNAP s factor 的识别能力及与DNA的结合能力 4 影响启动子效率的DNA序列：

核心启动子的序列：与保守序列越像，效率越高。

TSS周围序列：影响起始效率。

转录单位的前30个核苷酸的碱基序列：影响RNAP从启动子处移动出去（启动子区清空）的速率。

核心启动子附近的调控元件。转录的起始：开放复合物 闭合复合物 无效起始

延伸：启动子的清空，链的延伸转录泡，s因子的循环利用

终止：依赖性 不依赖性

反复重复序列

Section L 1.顺式作用元件（cis-acting elements）：一般为DNA上较为保守的、有着特异性序列或结构的特定区域。它们只能影响与其在同一条染色体上的基因的活动。如：启动子，转录激活因子结合位点等。

反式作用基因/调节基因（trans-acting genes，regulator genes）

可以影响与他们不在同一条染色体上的基因的表达水平的DNA元件。2 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 正负调控都可以有诱导和阻遏两种调控方式。

正控诱导：诱导因子活化激活因子，使其可以增加基因的表达。（Lac operon，CRP调控）正控阻遏：共阻遏物使激活因子失活，减少基因的表达。负控诱导：诱导因子使阻遏蛋白失活，增加基因的表达。（Lac operon，lac repressor）负控阻遏:共阻遏物活化阻遏蛋白，使其可以降低基因的表达。（Trp operon，trp repressor）

Section M 增强子 沉默子 TFIID：可与多种核心启动子元件或特异性转录因子结合，启动二类转录预起始复合物组装的通用转录因子。

TBP(TATA-box binding protein):可识别并结合TATA-box TAFII（TBP-associated factor II）：TBP关联蛋白，TFIID中与TBP形成复合体的所有蛋白，～13个。

TFII H的结构与功能：蛋白激酶(4 个亚基)：催化蛋白磷酸化。将NTP（一般为ATP）的g-磷酸基团转移到蛋白上。

磷酸化 RNA pol II 中的CTD 结构域。TFIIE 刺激TFIIH介导的磷酸化反应。DNA 解旋酶/ATPase(5 亚基)：

水解ATP，利用其能量打开DNA的双链 TBP(TATA-binding protein): 确保 RNA Pol I能正确定位到转录起始区域上。

SP1 为组成性表达的转录因子，在所有的细胞中都存在，与基因本底表达水平有关 SL1，选择因子,RNA Pol I起始转录所必需的因子 CTD:羧基末端结构域，的磷酸化状态与转录进程有关

转录起始时期，CTD结构域一般处于去磷酸化形式，与结合启动子有关。

转录延伸时期，CTD结构域常处于磷酸化形式，与mRNA的加工有关。

Section N 1 DNA-binding domains（DBD）:DNA结合结构域

螺旋-转角-螺旋结构（域）

锌指结构（域）

碱性结构（域）

Dimerization domains：二聚体化结构域

亮氨酸拉链 螺旋 散环 螺旋 DBD+DM 激活结构域 酸性激活结构域 富含谷氨酰胺结构域 富含脯氨酸的结构域 LBD

Section O 真核生物中mRNA 加工的一般过程 5’加帽: CTD作用：转录起始时，参与加帽反应的三种酶结合在RNA Pol II的CTD结构域上。转录产物刚开始合成时，即对其5’端进行加帽反应。

作用：防止降解：核糖核酸酶一般不能降解帽结构中的三磷酸键

帮助转运mRNA到细胞质中

增强翻译水平：mRNA需要帽结合蛋白的帮助才能更好的与核糖体结合 帮助去除pre-mRNA中的第一个内含子。3’加Poly(A)尾：

作用：防止被核酸酶降解：增加mRNA的稳定性

有助于mRNA从细胞核到细胞质的转运

参与pre-mRNA的最后一个内含子的剪接。

增强mRNA的翻译水平，增加基因的表达 剪接 甲基化 2 核酶有：有催化功能的RNA即为核酶

U2 U6 RNAP 3 RNA的多样性：可变加工，反式剪接，RNA编辑 原核生物核糖体

真核生物核糖体 原核rRNA 加工的大致过程：形成多个茎环结构，与蛋白结合形成RNP，核苷酸修饰，逐级切割

真核rRNA 加工的大致过程：甲基化，切割。内含子剪接 原核tRNA 加工的大致过程:将多顺反子前体切割，分离出单顺反子前体

单顺反子前体进一步被切割，形成与成熟tRNA长度一致分子（RNases D, E, F，P

.碱基修饰，形成成熟tRNA 真核tRNA 加工的大致过程：5’-末端成熟，3’-末端成熟（添加5’-CCA-3’）去除内含子 7 miRNA and siRNA的调控机制：mRNA降解，抑制翻译，抑制转录

Section P 1 遗传密码的特性:

蛋白的编码信息由三联体密码子组成。

密码子为连续的，之间无间隔、无重叠。

除三个终止密码子之外，每个密码子对应一种氨基酸

有密码简并现象。即：多个密码子对应同一种氨基酸。

标准遗传密码子在各类生物中基本通用，不过少数生物体或细胞器中，有一些密码子对应的氨基酸与标准的不同。

生物对同义密码子的使用经常有偏好性。不同生物的密码子偏好性不同。

基因一般不重叠。一段核酸分子一般只有一个开放阅读框（open reading frame, ORF/可读框），被翻译成一个蛋白。

有些物种也有重叠基因的现象。开放阅读框:ORF 从起始密码子ATG 到终止密码子

TGA,TAA or TAG 之间的连续的蛋白编码序列

CDS 编码序列 当ORF可以预测一个蛋白时 3 tRNA 二级结构:三叶草结构 4 tRNA的特异性加载：（翻译的高保真性）

氨酰-tRNA合成酶对相应tRNA分子有很强的专一性：第二密码子：

氨酰-tRNA合成酶接受相应氨基酸时有很强的忠实性：校正：双筛选机制—酶的活性中心，酶中的编辑位点 氨酰-tRNA（AA-tRNA）： 3’-end加载了一个氨基酸的tRNA分子。是在蛋白质合成中，将密码子转换氨基酸的适配器。

Section Q 1 密码子与反密码子的反向互补配对 一个tRNA可识别的密码子数由反密码子的第一位碱基决定

摆动学说：第三位密码子与第一位反密码子的配对可以摆动

反密码子第一位为A或C时，配对无摇摆现象。3 核糖体的E，P，A位点 A位：接受AA-tRNA部位.除了起始氨酰-tRNA，其他所有AA-tRNA都只能进A位点。P位：肽酰基-tRNA结合部位。起始氨酰-tRNA也进入此位点。E位：空载tRNA离开核糖体的位点。4 核糖体各亚基的功能

核糖体小亚基功能：结合mRNA

促进密码子与反密码子的正确结合 mRNA移位

大亚基的功能A位、P位、肽酰转移酶（转肽酶）中心等在大亚基上。

负责携带AA-tRNA、肽键/肽链的形成 5 翻译的基本内容 核糖体与mRNA结合

氨酰tRNA逐个进入核糖体

氨酰tRNA通过反密码子与mRNA互补配对 氨酰tRNA分子的氨基酸之间形成肽键。空载tRNA的释放 肽链的释放

第五篇：医学检验本科班分子生物学检验技术试卷

医学检验本班《分子生物学检验技术》试卷

一.选择题（在备选答案中选择一个最佳答案,每题2分,共20分）:

1.在核酸提取时,常需要使用氯化钠,醋酸钠等盐溶液,真正的目的是（）

A.中和核酸的负离子,使其易于沉淀B.调节PH值

C.保持核算的完整性D.提高核酸的浓度

E.无特定目的2.在一个DNA分子中,如G所占摩尔比为17.2%,则A所占摩尔比为（）

A.82.8%B.32.8%C.17.2%D.65.6%E.无法计算

3.下列那项不是扩增反应所必需的?（）

A.引物和模板B.dNTPC.Mg++D.DNaseE.缓冲液

4.下列那项是分子生物学技术形成的理论基础?（）

A.基因结构与功能的关系B.基因结构变异与疾病的关系

C.病原微生物的基因结构特征D.基因的表达.调控与疾病的关系E.以上皆是

5.分子生物学检验技术主要包括那些技术?（）

A.核酸分子杂交技术B.DNA测序技术

C.PCR技术D.DNA重组技术

E.以上全是

6.下列哪项检测需应用分子生物学检验技术?（）

A.肝功能检测B.乙肝两对半检测

C.乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测D.肿瘤细胞培养

E.病原微生物培养

7.在核酸的分离纯化过程中,为保证其一级结构的完整性,应采取（）

A.尽量简化分离步骤,缩短提取时间B.适当延长提取时间

C.在37摄氏度条件下进行D.加入Mg++,Ca++等二价金属离子E.以上全是

8.有一核酸样品,测得A260/A280=2.0,请问该样品属于哪类核酸样品?（A.DNAB.RNA）

C.是DNA,但有蛋白质污染D.是RNA,但有蛋白质污染

E.DNA和RNA

9.在RNA提取和纯化过程中,为避免Rnase污染而导致RNA的降解,应采取（）

A.在洁净的实验室里操作B.带手套和口罩

C.所用器材高压消毒或DEPC处理D.冰浴下操作

E.以上皆是

10.随机引物标记法全程标记DNA时,需选用下列哪种酶?（）

A.DNA多聚酶I的Kelnow片段B.TaqDNA聚合酶

C.限制性内切酶D.DNA连接酶

E.末端转移酶

二.判断题：(你认为下列叙述正确的请在题后括号内打√,错误的打×，每题2分,共6分)

1.双脱氧核酸链终止法是最常用的DNA测序技术（）

2.TapDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，但由于缺乏3’→5’外切酶活性，无校正功能，所以在复制合成新链过程中可能会发生碱基错配，导致PCR产物的错误（）

3.采用加热煮沸法可使RNase完全失活（）

三：填空题(每空格2分,共24分):

1.在选择核酸的分离纯化方法，应遵循的总原则是：一是保证核酸（一级结构的完整性）；二是尽可能（排除其他分子的污染，保证核酸样品的纯度）。

2.在PCR反应中，Mg++是个至关重要的因素，浓度（过低）会降低酶的活性，浓度（过高）又会导致非特异性扩增。

3.用于核酸杂交的普通硝酸纤维素膜最大的优点是（本底低），因而最容易检测杂交信号，缺点是（脆性大）易破裂，且队＜５００bp的核酸结合力低。

4． 整个核酸杂交反应主要由（预杂交）、（杂交）和（洗脱）三个步骤组成。

5.转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上的核酸，其与滤膜的结合是松散的，需做进一步的固定，常用的固定方法是（烘烤）、（紫外线固定）和（碱固定）。

三.名词解释：(每题4分,共20分):

1.融点曲线分析技术：是根据野生型序列和突变序列因不同Tm而产生不同的融点曲线而设计的。

2.探针:指所有能与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并可以被检测的分子。

3.Tm值： DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。

4.转染:将外源DNA直接导入真核生物细胞的过程称为转染。

5.转化:将重组的DNA分子导入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化。

四.问答题:（每题10分，共30分）

1.简述限制性内切酶的定义、命名原则和分类。

答：定义：限制性内切酶是能识别和水解双链DNA分子内特异序列的核酸水解酶类。

命名：通常由3个斜体字母表示，第1个大写字母为来源微生物的属名第1个字母，第2、第3个小写子母取微生物种名的头两个字母。

分类：根据酶分子组成及裂解方式的不同，将限制性内切酶分3类，Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶在同一酶分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的限制水解活性，Ⅱ类限制性内切酶能识别并水解特异性的核苷酸序列是DNA重组技术中最重要的工具。

2.PCR引物的设计应遵循哪些原则。

答：1.用于PCR反应的引物需要两条，分别设在被扩增目的的片段的两端，并分别与模版正负链序列互补。

2.引物的长度一般以18-25个核苷酸为宜，引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹状结构，影响引物和模板之间的互补。

3.两条引物之间尤其在3’端的序列不能有互补，以免形成引物二聚体。

4.引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。

5.PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，两条引物的Tm值不能差太大。

6.根据需要，可在合成引物时于其5’端加修饰成分。

3.试述实时荧光PCR水解探针法的实验原理？

答：原理：PCR反应体系中除有两条引物外还需要一条荧光素标记的探针。探针的5’端和3’端分别标记荧光报告基团R和荧光淬灭基团Q，当探针完整时R基团与Q基团分别位于探针的两端，Q基团抑制R基团使其不能发射荧光。PCR过程中，TaqDNA聚合酶沿着模板移动各成新链，当移动到模板互补的探针处时，TaqDNA聚合酶同时还发挥其5’-3’外切核酸酶活性，将探针的脱氧核苷三磷酸逐个水解，R基团与Q基团随子分离。此时R基团不再受Q基团的抑制而发射荧光，仪器的检测系统便可测得荧光信号。