医学 分子生物学实验课教学的实践和思考

第一篇：医学 分子生物学实验课教学的实践和思考

医学 分子生物学实验课教学的实践和思考

[摘要]为了提高医学生的自主动手能力和创新能力，本文对医学分子生物学实验课常见的问题进行思考，并从建设分子生物学实验室和师资队伍、规范实验室用品、完善实验内容和实验指导手册、增加多媒体教学和改革实验成绩评定方法、提高学生的重视度等几个方面分析医学分子生物学实验课教学改革方案。

[关键词]医学分子生物；实验教学；教学改革；医学检验

[中图分类号] G712 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）2（c）-0138-03

21世纪是生命科学的世纪，生命科学的发展伴随着探究技术的提升和人才的培养。在科学发展过程中，分子生物学的理论和技术已与生物学，医学和药学等众多领域交叉、融合，是提高探究技术水平和人才质量的一门重要学科[1]，因此，作为医学人才培养的医学院校，医学分子生物学是不可缺少的一门学科。目前，我校仅对医学检验专业和医学实验技术专业开设医学分子生物学的理论和实验教学。本文总结了一些在医学分子生物学实验课教学过程中的心得和体会，希望通过不断的反思和改进培养出满足社会和人民需要的高素质人才。

1医学分子生物学实验课的主要特点

医学分子生物学是一门理论与实践相结合的医学基础学科，以核酸和蛋白质为研究对象，利用先进的分子生物学实验技术对临床疾病进行诊断，特别是进入21世纪后的短短几年，无论是疾病发生、发展机制的阐明，患病风险的预测与评价，还是疾病的早期诊断和个体化医疗的开展，都愈来愈依靠和依赖分子生物学[2]，常见检测内容包括微生物检验[3]、肿瘤诊断[4-5]、遗传病诊断[6-8]和人体各类免疫疾病[9]等。

临床中应用医学分子生物学技术的項目很多，但目前学院针对医学生开设的分子生物学实验项目有限，例如小鼠肝组织DNA提取和保存，琼脂糖凝胶电泳检测核酸，PCR技术等。然而，医学分子生物学技术发展迅速，传统的医学分子生物学实验室仅结合学院现有的条件开展分子生物学实验教学项目，内容陈旧，技术简单，缺乏临床结合，不利于学生动手能力和创新能力的培养。随着分子生物学的不断发展，越来越多的高等学校将分子生物学设为必修课和选修课。我们作为国家医学人才培养的摇篮，随着技术的更新和发展，国家和社会对医学分子生物学重视程度的增加，这对老师和学生提出了更高的要求，教师应不断更新教学内容和实验技术，学生应掌握理论知识和实验技术，设计实验紧密结合临床，紧跟科学技术发展的步伐。目前医学分子生物学实验教学面临的问题

2.1分子生物学实验室建设不足

医学分子生物学是21世纪研究的新兴学科，主要以核酸和蛋白质分子为研究对象，对实验室的条件和设备的投入要求较高，然而目前学院对分子实验室建设的重视程度不高，通常与其他学科共用实验室，实验环境达不到标准，仪器共用、陈旧且破损，使得分子实验不能顺利开展；分子实验的目的是通过将理论知识应用于实践进而培养学生的动手能力、结果分析能力和创新能力，但分子实验试剂和耗材均需进口，价钱昂贵，在实验试剂和耗材使用方面不能满足人人均有，导致大部分学生没有参与实验，降低了学生对分子生物学实验课的积极性。分子生物实验均需要低温高速离心，为了提高分子实验结果的成功率，低温高速离心机是分子生物学实验室必备的，且每个教室最少配备一台低温高速离心机。在核酸电泳检测过程中，需要使用溴化乙锭（EB）或其替代物染色，而溴化乙锭为强致癌物质，因此，实验室需要设置EB专用实验台，避免学生操作不当引起实验隐患；对于核酸电泳结果均要在紫外灯下检测，紫外灯下不利于实验结果的分析，也不能确保所有学生都能观察到实验结果，准确分析实验结果，学院应在学生教室配备多媒体，将每个实验结果直观地展现给学生，让学生观察并分析，带动学生的积极性，因此，为了培养社会和国家需要的创兴型人才，学院应该加强分子实验室的建设，建立单独的分子生物学实验室，对相应仪器和耗材的采购应给予大力支持。

2.2实验用品准备不规范

分子生物学实验对试剂和耗材洁净度高，且试剂名均为英文，分子生物学这门课程的理论和实验内容在学院的开设时间较晚，现在从事分子实验耗材准备的老师专业和英语水平有限，在实验试剂、耗材和仪器准备过程中空难重重，且准备不全面，影响实验的顺利开展。为了促进分子生物学实验顺利进行，降低实验准备中试剂和耗材的损失，实验室或代课教研室应对实验技术老师进行规范性培训，如RNA提取过程中使用的吸头和离心管均为无RNase，学生实验开始前应组织实验老师了解实验条件的严格性，在口罩和手套配备齐全的基础上，将吸头放置配套的吸头盒内，而不是随意将吸头倒在一次性手套上，这将误导学生对分子生物学实验严谨性的认识。学院也可以相应的引进分子生物学背景的实验技术老师从事教辅或教学工作，这对于分子生物学实验顺利而准确的进行起到重要作用。3 医学分子生物学实验课教学心得

3.1完善分子生物学实验内容和指导手册

分子生物学是跨越生物、医学、农学乃至药学的一门新型学科，优质的分子生物学实验课程开设离不开与相关专业的紧密渗透[10]。目前我院仅对医学检验专业和医学实验技术专业开设分子生物学实验，这就要求教师结合学生的专业和发展方向设计实验内容。只有结合学生的专业才能更好的将理论和实际相结合，激发学生的积极性。在目前教学中，只能依据实验室的环境和设备的变化，结合教学老师主持的科研课题开展一些简单的分子生物学实验，而忽略了结合学生的专业开设特色的实验内容。由于固定的实验材料和内容多变，没有完善的分子生物学实验指导手册，这使学生对即将做的实验毫无头绪，降低了学生学习分子生物学的积极性，不利于学科的发展和创新人才的培养。

3.2建设师资队伍

分子生物学实验内容设计，实验方法的使用以及实验结果的解析与教学老师的知识背景和能力具有紧密的联系，也是确保良好教学质量的关键。目前我们生物与分子生物学教研室的老师分别承担国家自然科学基金，省级科学基金、省级教育厅课题以及校级课题等多项科研项目，且均为硕士研究生以上学历，具有较扎实的分子生物学理论基础和熟练的分子生物学技术，可以巧妙灵活的为学生设计相关的分子实验内容。但是分子生物学内容和技术更新换代，学院可以提倡或执行“送出去，引进来”的政策，让教师得到全面的提高，让学生拓宽眼界享受先进的知识课堂。

3.3提高学生的重视度

分子生物学是一门抽象难懂的技术学科，学生对分子生物学的理论和技术应用了解的并不多，所以学生对分子生物学理论学习和实验操作均表现为消极，应付的心态。导致学生对分子生物学不重视态度的原因之一，是学生没有了解到分子生物学在临床或是研究生生活中的重要性。目前，我们教授的学生为大三学生，已经有了很强的思考能力，对自己的发展有了一定的规划，为了提高学生对分子生物学的重视程度，学院可以安排学生进入实习单位，比如医院，检测单位或是一些科研机构，让学生在实实在在的生活中了解分子生物学的中重要性以及操作过程的规范性；也可以举办学生经验交流会，让学院已经毕业工作的学生、实习的学生或者读研究生继续深造的学生分享分子生物学的重要性，提高学生的自主学习能力和对分子生物学由衷地热爱。

3.4增加多媒体教学

多媒体课堂教学已成为理论课上必不可少的教学手段，但在实验教学中应用的较少。分子生物学是通过多种先进技术手段研究核酸等生物大分子的功能、形态结构及其重要性和规律性的科学[11]。其内容抽象，枯燥无味，实验结果无法直观地展现给学生，使学生很容易产生厌学的情绪[12]。为了提高教学质量，我们应该利用多媒体将一些难懂的分子生物学技术原理和过程通过动画、幻灯片和视频等直观地展现给学生，如大肠埃希菌质粒的提取和检测，PCR技术的原理和操作过程等，使学生在轻松愉快的氛围下，快速掌握分子生物学知识。实验结果检测过程中，我们可以通过多媒体将检测的结果展示给学生，让学生观察讨论，给出依据并提出相应的答案，教师通过分析学生的討论结果，了解学生的思维动态，并给出正确结果。根据学生的反馈，板书教学结合多媒体展示利于学生对知识的认知和掌握。

3.5 开放实验室（先发表后付费带写带发教育、医学等论文，微，信***，扣，扣1324725251）

要想成为一名国家需要的优秀人才，除了掌握扎实的理论知识，具有熟练的实验室操作技能，同时也要具备活跃的创新思维。因此，为了更好地培养学生的各方面能力，实验室可以结合实际课程开放实验室，让学生查阅文献，巩固理论知识，应用实验课上的分子生物学技术结合临床疾病设计实验，给学生提供更多的动手机会，培养学生的自主学习能力和创新能力[13-15]，同时提高学生对分子生物学课程的兴趣和重视。在开放实验室期间，至少安排一位指导教师，既规范学生的操作技能，又可以帮助学生分析实验结果，这样培养学生的思考能力和分析问题的能力。目前学校仅对医学检验专业和医学实验技术开设医学分子生物学实验课，开放分子生物实验室，不仅让已学习分子生物学的专业的学生巩固理论知识和实验课内容，也为其他医学生提供了学习机会和创新平台。

3.6 鼓励学生参与教师科研

生命科学的研究离不开分子生物学技术，目前学校的教师均有自己的研究课题，学生可以适当参与教师的科研工作，了解分子生物学的重要性，增强学生学习的主动性和积极性。学校也为学生开设大学生创新项目，学生将学习的分子生物学理论和实验技术结合临床设计实验，大大地发挥学生的主观能动性，激发学生的求知欲和创新能力。科研和教学的相互结合，相互渗透，不仅丰富了分子生物学实验教学的内容，也提高了学生的综合素质和科研思维[16]，为国家和社会培养更优秀的人才。

3.7改革实验成绩评定方法

常规的实验成绩评定是根据学生提交纸质的实验报告进行评定，然而，医学分子生物学实验课不仅仅评定学生掌握的理论知识，同时考察学生们的动手能力、分析结果能力、创新能力等，因此，将医学分子生物学实验成绩评定内容分为实验理论测评和实验操作技能测评，实验理论测评包括实验原理，实验步骤以及实验内容的应用，这样有利于学生自主学习医学分子生物学并加深对分生生物学的认识；实验操作技能的测评：考察学生的实验设计能力、动手操作能力、实验结果分析能力。经过观察实验课堂学生的表现，部分同学主动参与到实验课堂中，而其他同学仅仅是旁观者，通过实验成绩评定的改革，提高学生实验设计能力、自主动手能力和分析问题能力，为国家和社会培养创新人才具有重要的意义。

总结

医学分子生物学实验课程已经是高等院校开设的一门重要学科，是医学检验的一项重要检测手段。良好的实验环境，必备的实验仪器和完善的实验体系结合先进的、可持续的检测技术才能培养出国家需要的高素质人才。

[参考文献]

[1]高利臣，肖璐，冯涛.分子生物学实验教学改革的几点思考[J].实验室研究与探索，2010，29（4）：104-107.

第二篇：医学分子生物学与实验

1.简述动物组织蛋白质，DNA ,RNA提取的大致过程及原理。

答：共同的第一步都是取动物组织进行清洗剪碎，然后用高速组织捣碎机破碎。

DNA的提取：

通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。

RNA的提取:

取组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚液，室温下剧烈振荡10分钟。置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。

蛋白质的提取:

1.组织称重，切小块放入管中。

2.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。

4.用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。

5.裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

原理：在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，因此在提取和制备DNA或RNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl 浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0 mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14 mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。

提取出DNA或RNA-蛋白质复合体（DNP）后，在将其中的蛋白质除去

2.简述基因工程的原理及过程。

答：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

所谓基因工程（genetic engineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。一般步骤：1克隆重组：提取供体生物目的基因，酶解，连接到另一个DNA分子（克隆载体）上形成重组DNA；2转化：将重组子转入受体细胞，并在其中复制保存；3筛选鉴定：已吸收重组子的细胞；4大量培养监测外源性基因是否表达。

3.比较原核生物与真核生物的基因表达调控机制。

答：

原核生物基因表达调控 真核生物基因表达调控

启动因子：σ因子决定RNA聚合酶识别的特异性TF2D决定RNA聚合酶识别的特异性

转录激活：操纵子 调节蛋白顺式作用元件转录因子

主要机制：操纵子模型具有普遍性顺式作用元件具有普遍性

主要为负性调节（阻遏调节）主要为正性调节

特有机制：转录衰减染色体结构变化

共同点： 1.基因表达都有时间特异性和空间特异性2.基因调控的多层次性和复杂性3转录起始部分是基因表达的基本调控点

4.简述 PCR的原理及其应用，引物设计的原则。

答：PCR的原理：以扩增的DNA分子为模板，以1对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，依半保留机制沿模板链延伸直至完成2条新链合成。通过变性，退火和延伸重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。反应体系基本成分有模板DNA，特异引物，耐热性DNA聚合酶，dNTP和含有 Mg²+的缓冲液。

PCR的主要用途：1目的基因的克隆；2.基因的体外突变3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列测定5.基因突变分析

PCRD的衍生技术：1锚定PCR(anchored PCR)2..不对称PCR(asymmetric PCR)3.反向PCR(inverse PCR)4.多重PCR(multiplex PCR)5.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。⑥引物3„端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

5.简southern blot的原理及其应用。

答：原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。可用于检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

主要应用于1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.PCR产物分析。例如在研究转基因的时候，可用于检测外源基因的插入和整合情况。

第三篇：分子生物学实验总结

分子生物学实验

1.TOMY全自动灭菌锅的使用

（1）检查排放蒸汽的水壶，腔体内的水位与托板齐平。（2）SET键设置温度和时间（121℃，20min）（3）关闭排气阀，Start机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行。（4）程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子。（5）腔体内经常清洁。2.LB液体培养基（1000mL）

将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1000mL，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。固体还要再加琼脂。3.碱裂解法

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此缠绕，仍会紧密的结合在一起。当加入 pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液，恢复pH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。溶液Ⅱ：氢氧化钠，SDS 氢氧化钠加入后碱性环境12-12.5促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子去垢剂，它的主要作用有：①溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质与DNA分开；③SDS能与蛋白质结合成为SDS-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止对DNA的降解。

溶液Ⅲ：乙酸钾。用pH4.2的KAc溶液是为了调整溶液pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L醋酸钾(KAc)有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。4.loading buffer 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。5.限制性内切酶（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

(II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。6.引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为16～30bp；引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度；四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误；引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对；在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构；两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量；引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点；引物不与模板结合位点以外的序列互补；简并引物应选用简并程度低的密码子；引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量。7.dNTP 常用的浓度为20～200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入；dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度；注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。8.感受态

处于对数生长期的细菌经低温CaCl2处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源 DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。9.转化

转化是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。10.DNA连接酶

有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶；DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过牛小肠碱性磷酸酶CIP处理克服； 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定；

pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体，该载体由pUC18 载体改建并在其3’端添加“T”而成

大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率；

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程 11.α互补

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法； α互补：质粒载体上lacZ’基因编码的α肽段与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象，由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal显色测定出来；任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

第四篇：分子生物学实验 心得体会

关于分子生物学实验的体会

梁慧媛（生技01级）

不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。

首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。

失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。

一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的“试炼”。

分子生物学实验心得体会

刘东强（生科01级）

分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。

随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA的制备、PCR技术等。

我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。

此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。

总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值。

刘佳凝（生技01级）

一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会：

1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我们在学习操作。

2、实验老师的耐心指导对我们帮助很大。他们要求严格，待人和蔼可亲，实验要求严且对实验技术的知识的深刻掌握与理解给我们留下了很深刻的印象。在老师们的带领下我们都很认真完成了每一次的实验与之后的总结与报告。

3、由于分子生物学实验是我们上大学后接触的第一个大型实验课，所以这对我们来说是一个磨练的过程。从不熟练当熟练，从不耐烦到耐心认真，每个人在一学期后都有一种“脱胎换骨”的感觉。同时这个实验帮助我们从分认识到生物学的不可知性、变化多样性及创新空间的广博性。在学期后的设计实验中，每组同学都努力开动脑筋，搜集资料，查阅文献，提出了很多好的实验方案。这种设计与创新调动了同学的同学们的积极性，使得大家在实验过程中都更加认真、仔细、一丝不苟，并在获得到好的实验结果后体会到了前所未有的成就感。

所以我们都很感谢分子生物学实验的老师及设计这门课的老师们。这个实验让我们受益非浅。

实验心得体会

张鑫蕊（生科01级）

通过分子生物学实验课的学习，我们首先了解了分子生物学常用的载体，即质粒载体的制备及宿主细胞的感受态的制备。这些都让我们在学过书本状的知识以后有了一个亲手操作，更深一步所学的知识的机会。

生物学以及分子生物学本身就是一门实验性的学科，如果只有单纯的理论课上的讲解而没有与之相配套的实验操作，跟的无法使我们深刻体会到我们所学的那些如转导转化之类究竟是怎样操纵的。

至于PCR基因扩增、RT-PCR、蛋白质印迹这些实验操作技术的学习对我们以后生物化学大实验、生化技术原理、基因工程、蛋白质工程的学习都奠定了一个很坚实的基础，帮助我们对这一系列等分子生物学技术有了很好的了解和掌握的。

相配套的理论课的学习与实验操作上是非常必要，我觉得分子实验课的时间安排就相当合理，在我们学理论课的同时就进行实验课的操作，这样相辅相承的学习，才能促进我们的进一步提高。

实验心得

刘娟（生科01级）

一、实验操作：

同样的样品，同样的步骤，不同的人可以作出不同的结果。

当然分子生物学实验本身的结果就有一定的偶然性，因为所操作的材料是极其微小的，肉眼无法看见的，所以用理论来预见可行的实验，结果往往有些出乎意料。而每个人操作上的细微差别对RNA、DNA而言就是一场地震。

有人说做生物实验和学数学不一样，数学只要用灵活的思维，严禁的逻辑就行，而生物实验要求的往往不止这些，不只要心灵还要手巧肯干，而分子实验又比其他实验要求严格，每一步都须三思而后行，而且必须有极大的耐心去重复一些枯燥的步骤。

二、关于设计实验：

想总比做起来容易，当初觉得mRNA差异显示原理简单，操作应该不成问题。结果第一天的实验便给了个下马威，不仅结果等于没有，而且对接下来的步骤更是一无所知，无从下手。而最终自己的实验结果只不过是mRNA差异显示地预实验，由于该方法的假阳性率极高，正常的科研实验是需要反复重复实验，并将最后的结果测序分析，并进一步分析是否为新基因，当然我们不可能接着做，只完成了该实验的一小步，也已经学到了很多书上没有的东西。

三、还存在的问题：

自己在做的过程中，有时会有“照方抓药”的情况出现，并不完全明白自己所做的步骤有什么作用便做了，事前事后缺乏思考。实验过程中，仪器、试剂的收集，总只有几个人在做，其他人只是张口就问在哪，说明摆放无秩序，做实验时依赖心理太强，（看完其他国外的几个实验室照片后，觉得我们实验室已经不错了。）

每一步骤最好都有记录，特别是样品多时，要有据可查。

一门好实验课

中国协和医科大学基础医学院 2003级研究生 陆璐

我是生物科学专业99级的学生，在大三的时候选修了分子生物学实验这门课。在半年的学习和实践中，我学会了很多基础的分子生物学实验方法，掌握了一定的实验技能，这些都为现阶段的实验工作提供了很大的帮助，这使我避免了刚刚进入实验室工作时要一切从头学起的忙乱，节省了大量时间。

分子生物学实验课上所讲授的质粒提取、蓝白斑筛选、RNA提取及鉴定、基因组DNA提取、western blot、琼脂糖凝胶电泳、PCR技术等都是我现在常用的技术。在实验课的训练中，我也逐步养成了良好的实验习惯。

分子生物学实验课程让我受益很多，老师们认真负责的态度也必然让更多的师弟师妹们从中获益。

我是北京师范大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2002级的硕士研究生，在研一第一学期参加了分子生物学实验课程。这门课程将分子生物学实验操作的理论与实践相结合，不仅使我在分子生物学实验技能方面得到系统的训练，而且让我对具体实验操作的原理有了清晰地认识。尤为难得的是，作为一门实验课，它还锻炼了我运用已学到的理论知识和已掌握的实验技能综合解决科学问题的能力。这些都为我之后研究生阶段的工作做了必要的准备，打下了良好的基础。

这门课程开设的实验以综合性为主，涵盖面广，几乎包括一般分子生物学研究会涉及的所有内容：最基本实验技术，如琼脂糖凝胶电泳检测DNA；基因克隆所要用到的技术，如质粒提取、DNA重组及重组子筛选、细菌感受态的制备及转化、外源基因的诱导表达等；还有一些其他的常用技术，如动、植物基因组DNA的提取、植物总RNA的提取、PCR扩增、蛋白质印迹、Southern杂交等。

我研究生阶段的一部分工作是要将外源基因通过农杆菌介导的方法转入植物中，并鉴定转化是否成功。首先要用到质粒提取、DNA重组等技术来构建插入有外源基因的表达载体。转化植物成功后，就需要提取植物基因组DNA及总RNA，利用PCR扩增、Southern杂交、RT-PCR、蛋白质印迹等技术，对外源基因进行不同水平的鉴定。

正是因为分子生物学实验课对基本原理的详细讲解、对实验技能的系统训练，使我在工作中比较容易上手，工作进度也有了保证。另外，通过在这门课上系统地、全面的学习，也使我在工作需要学习新的实验技术时，触类旁通，比较容易理解消化。

分子生物学课程对我的科研工作的帮助

胡丽娅

进入实验室做课题已经一年多了，在日常的科研工作中，分子生物学实验课中学到的知识和技术给了我很大的帮助，例如“外源基因在大肠杆菌中的诱导表达”和“SDS－PAGE检测蛋白”等等。

我的课题主要是研究钙调磷酸酶的折叠机制，而整个研究的基础就是要拿到纯的、具有完整的生物活性的酶。这是整个工作的第一步，也是非常关键的一步。刚开始参与科研工作时，我遇到了蛋白表达为包含体的问题，因为拿不到蛋白，实验无法进行下去。于是我运用在分子生物学实验课中学到的知识，对表达条件进行了摸索，最终解决了表达的问题。顺利的进行了后续的实验工作。

随着课题的深入，我需要构建一个点突变体来观察这一位点对于钙调磷酸酶的结构和折叠的作用。由于有在分子生物学实验课中打下的基础，我利用Primer premier设计了点突变的引物，运用PCR技术对钙调磷酸酶进行点突变：质粒DNA的提取和酶切、E.coli感受态细胞的制备，转化。每一步实验都能够得到理想的结果。我想正是以前学到的知识和经验使我能够顺利的完成设计的实验。

通过一年多来的实验工作，我更加深切的体会到坚实的理论基础和良好的实验技能对于科研工作的重要性。在我本科的课程中，分子生物学实验课是一门尤其重要的课程，在这门课程的学习过程中，我和我的同学们都打下了很好的基础。整个课程的安排十分合理，给我们许多亲自动手实践的机会；在遇到问题时，老师鼓励我们积极思考，和我们一起讨论，帮助我们解决问题。每一个小实验的成功，对于我们这些“初生之犊”来说，都是一种莫大的鼓励，鼓励我们在科学研究中前进。

与此同时，我们在这门实验课的学习中还培养了良好的合作意识和团队精神。同学们齐心协力，一起动脑筋解决实验中的问题。在今天的科研工作中，这些品质让我们能够更好的融入到课题组这一个大家庭中，大家互相帮助，谁遇到了问题，大家一起讨论，出谋划策。同时，在讨论的过程中，大家也能学到更多的知识。

生命科学学院 2002硕 细胞生物学专业

王利敏

作为一名细胞所的二年级研究生，一年级所选修的分子生物学实验课程对我的帮助是不可忽视的。在这个课程上，让我初次接触到了许多进行生物研究时必须具备的实验技术以及一些基本技能，象电泳，蛋白质印迹，PCR等等，这些实验在几乎每个人以后的工作中都会用到，我也不例外。而且这些实验又不同于本科时，它不但是更复杂，还给了更多我们自己动手的空间和时间，一来能锻炼大家的思考能力，比如我们自己设计引物来合成目的基因；还能锻炼我们自己安排时间和一个实验进度的能力，分子实验一般周期比较长，学习如何合理地安排时间使之更有效的确对于今后自己实验地安排大有裨益。总之，分子生物学实验课程的确是一门对今后实验很有帮助地课程。

分子生物学实验课程学习随感

陈晖

时光荏苒，不知不觉中研究生生活已过去一年，进入实验室也有快一年的时间了。大学时专业课的学习为我的科研工作打下的坚实基础，而实验课程尤其是分子生物学实验的学习更让我获益匪浅。

分子生物学课程的学习让我们初步建立了分子的概念，但核酸到底是什么样子的，什么是PCR，什么是质粒，什么是转化，这些概念对于我们始终很抽象。是分子生物学试验让我们真正接触了分子生物学，将那些抽象的概念变得具体，而不再是纸上谈兵。

在分子生物学试验中我们学习到了分子生物学最基本的实验技能，如感受态细胞的制备及转化，质粒DNA的提取及酶切，植物总RNA的提取等等。这些技能的学习让我在科研工作中很快能进入角色。在开始进入实验室时，常会有种手足无措的感觉。但当看到那些熟悉的仪器，如微量移液器，培养箱，PCR仪等时，真有他乡遇故知的感觉。而不需别人指导，运用实验课上学到的知识成功地完成实验，那种满足感更是无法形容。至今还记得独立提出要用的质粒时的情形，师兄在夸奖之余将更多的工作放心地交给我，让我们实验的进展顺利很多。

不过最重要的是在分子生物学实验学习的过程中，我们建立了整体大实验的概念，这是在以往的实验训练中没有的。以往的实验如无机化学，有机化学等等，所涉及的通常只是某个数据的测定或某种物质的提取，实验持续的时间通常也就两三个小时;而分子生物学实验，每次会持续一天时间。实验设计得与科研比较相似，毫不夸张的讲，每个实验都可以直接用于科研。在这里我们学到了实验设计的概念，不是单纯的实验技术的堆砌，而是根据自己的目的，有机的将各种方法组合起来。所有这些都是我们进入科研工作所必须的素质。

而老师的讲解不会局限于某种技术，而是更偏重开拓思路，引导我们思考，从而达到举一反三的目的。如在讲解植物总RNA的提取时，采用的是白化的玉米叶子，所含糖类脂类比较少，此时老师会提出问题如果糖类多时又该如何改进提取的方法;书上所讲的只是其中一种提取方法，是否还有其他的方法可以提纯RNA。老师并不会直接给出这些问题的答案，而是要我们在课后自己查阅资料。这一方面锻炼了我们查阅文献的能力，另一方面这些资料的积累成为科研工作时宝贵的一手材料，可以直接应用于科研。“授人以鱼不如授人以渔”，老师们精心的讲解常会给我们豁然开朗的感觉，学习到的不是单纯的技术而是一种思路。

感谢分子生物学实验，感谢给予我们悉心教导的老师，是他们的工作使我们真正接触到了分子实验，并为将来进入科研工作打下了良好的基础。

分子生物学实验小结 2001级生物科学专业 张皓彬

做完半年的分子生物学实验，感到它是一门非常好的课，在我们学习生物学的过程中占据着很大的分量。

首先，分子生物学是一门技术性很强的实验，在实验的过程中，某些小的失误可能会对结果产生很大的影响。所以对实验中的操作是比较严格的，特别象无菌操作过程。在实验中从仪器上来说我们接触了大量的仪器，而且也学到了一些基本的实验技术，这对我们将来从事相关工作有着非常大的帮助。

其次，分子生物学实验中所含的知识和技术与理论知识结合的比较好，先学习了理论知识再去做实验，这样结合很好，而且我感觉分子生物学实验是我们所做的实验中一门设计到比较“高深”知识或新问题的实验，能激发出我们对学习分子生物学理论与实践的兴趣。

最后，我认为最重要的是它给了我们学生一次自己设计实验的机会。这是我们所做的实验中唯一能给我们自己设计实验机会的课。第一，整个过程中，我们在做完前面一些基本实验后，再去设计一个用自己所学到的知识技术的实验，有了一个整体的了解，也是对一整套技术的回顾与应用。从设计中所要用到的试剂、仪器，到实验中试剂的具体用量，仪器使用的具体参数，以及引物的设计和整个实验的时间安排等等都要有明确的概念，可以说是给了我一次科学探究的机会。第二，设计实验后我们自己去操作检验它的可行性，检验自己设计的实验能不能够成功，更重要的是整个过程对我们以后从事相关工作有着非常重要的帮助，所以这是非常有意义的。

总的来说，分子生物学实验是一门非常好的实验课程。

设计实验和具体操作的感想 生物科学2001级谷波

2003.12.22

设计阶段：

我们组原本的想法有点不切实际。我们打算在瑞士的一个酶库网站上找到一种酶，再从genenbank中找到这种酶的全序列，再自行设计引物。我们甚至下载了引物设计软件。然而我们输入某种酶某段功能片段的名称却从genebank中得到了成百上千序列，我们放弃了。只是从多篇文献中找到一种酶的某段基因把它的引物和表达载体进行改造和改换，以符合老师提供的限制性内切酶。而PCR的温度与循环次数，及其余的各种步骤，仅仅是把是实验书上的串联在一起，并没有考虑任何改动，更别提摸索实验条件的部分了。当我们的老师讲评时，我才了解到，我们的设计是多么的不充分，成功率有多低。

操作阶段：

通过实验设计，我最大的收获是有了串起已经做过的实验的思路，也明白了做重组的各个步骤的原理。所以，当我拿到老师给的设计方案时，我的思路很清晰。然而具体的操作又暴漏出许多问题。首先是操作时不能做到提前思考，大家往往只会照方抓药，不能事先想清楚为何要这样做。这使我们常常忽略细节的地方，造成时间的浪费甚至结果不理想。比如我们把第二次回收时的重要数据遗失。特别是写报告时，更会感觉到中间结果记录的不详细，以至分析原因时没有具体的可依赖的结果做支持。还有就是中间各个步骤的现象，如果我们能从最基本的实验时就观察现象，之后再做重复或类似的实验时，就能及时判断实验每一步的正确与否，便于及时纠正错误。最后是我们实验时心态不够正确，实验就是要历经失败和重复，不能面对不良结果时就急噪起来，不能心平气和的继续下去，甚至失去探索的动力。每当我们进度落后时，大家常常焦急的追赶其它组，往往造成不该出现的错误或遗漏。

实际操作不同于理论学习，它要求我们事事亲临，面面俱到，并且积累经验，这样才能从细微处窥探整个实验的成败。这正应了老师所说：“我们需要心灵，手巧，兼肯干的学生”心灵有赖于勤思考，手巧还需要多实践总结，肯干则要求我们持之以恒，脚踏实地我们会朝这个方向努力的。

生命科学学院2002硕 神经生物学专业

马骏

我是神经生物学专业研二的学生。我在研一时选修了分子生物学实验课，在一个学期的学习中所获甚多。分子生物学实验我们主要做的大实验包括感受态的制备、质粒的提取及鉴定、蛋白在大肠杆菌中的表达。我们在本科和研一的时候学习了分子生物学的理论知识，但通过大实验亲身实践后才更深刻的理解了这些理论知识，并且在遇到问题－解决问题的过程中，了解了这些知识用于实验时应注意的细节。通过系统科学的实验，我还了解了实验规划和实验安排的重性。分子生物学大实验锻炼了我的实验操作技能，培养了我耐心细致的实验习惯，这都有益于我现在所进行的课题研究，避免了走弯路，提高了实验效率。所以我认为在进行正式的课题研究之前进行分子生物学大实验的学习是很必要的。师弟师妹们请认真学习：）

实验心得

我是北京师范大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2002级的硕士研究生，在研一第一学期参加了分子生物学实验课程。这门课程将分子生物学实验操作的理论与实践相结合，不仅使我在分子生物学实验技能方面得到系统的训练，而且让我对具体实验操作的原理有了清晰地认识。尤为难得的是，作为一门实验课，它还锻炼了我运用已学到的理论知识和已掌握的实验技能综合解决科学问题的能力。这些都为我之后研究生阶段的工作做了必要的准备，打下了良好的基础。

这门课程开设的实验以综合性为主，涵盖面广，几乎包括一般分子生物学研究会涉及的所有内容：最基本实验技术，如琼脂糖凝胶电泳检测DNA；基因克隆所要用到的技术，如质粒提取、DNA重组及重组子筛选、细菌感受态的制备及转化、外源基因的诱导表达等；还有一些其他的常用技术，如动、植物基因组DNA的提取、植物总RNA的提取、PCR扩增、蛋白质印迹、Southern杂交等。

我研究生阶段的一部分工作是要将外源基因通过农杆菌介导的方法转入植物中，并鉴定转化是否成功。首先要用到质粒提取、DNA重组等技术来构建插入有外源基因的表达载体。转化植物成功后，就需要提取植物基因组DNA及总RNA，利用PCR扩增、Southern杂交、RT-PCR、蛋白质印迹等技术，对外源基因进行不同水平的鉴定。

正是因为分子生物学实验课对基本原理的详细讲解、对实验技能的系统训练，使我在工作中比较容易上手，工作进度也有了保证。另外，通过在这门课上系统地、全面的学习，也使我在工作需要学习新的实验技术时，触类旁通，比较容易理解消化。

分子生物学实验课程如何应用于科研之我见

生命科学学院 生物化学与分子生物学专业 2003研 李彦杰

作为一名生物化学与分子生物学专业一年级的研究生，在生命科学领域5年的求知探索中，我深切体会到这期间学习的各门课程，包括生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、生理学，尤其是分子生物学实验课程，对培养我今后独立进行科研，及提高科研能力、拓宽科研思路是不可或缺的。由于它所包含的内容与科研连接最直接，最紧密，不仅教给我们实验的技术方法，还教给我们设计实验的思路及科研中必不可少的合作精神，可以说是生物科研最重要的基础课之一。

生物学方面的科研离不开我们在分子生物学实验课程中学到的技术和方法，而为了达到同一个实验目的可用的技术与方法常常不止一种，如何选择最合适的方法以取得最佳实验结果其实就是灵活应用分子生物学实验所学于科研的过程。以下是结合我的课题的一点粗浅体会。

我的科研课题是小鼠脑红蛋白及突变体的设计、融合表达、蛋白纯化及结构、性质测定，基本的流程是从小鼠脑组织中提取总RNA，设计带有合适酶切位点的引物，利用RT-PCR技术获得双链cDNA，再将双链cDNA双酶切的产物与同样经双酶切的GST融合表达载体pGEX-4T-3相连，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在2YT培养基中表达，过GST亲和层析柱初纯蛋白，凝血酶酶切获脑红蛋白和谷胱苷肽硫转酶，再经Sephadex-G75分子筛层析柱分离，得到电泳纯的脑红蛋白，冷干保存。

从第一步提取总RNA到转化感受态细胞，这些步骤全都是分子生物学实验课上学习过的基本实验方法，比如核酸电泳、蛋白电泳、PCR、构建载体、感受态制备、转化等，由于这些技术已经在分子生物学实验课上系统学习并亲身操作，因此在科研中使用这些技术时就能驾轻就熟。

但又不能完全照搬课本，有时需要根据实验过程中出现的具体问题对方法进行改良，添加适合的步骤或删减不需要的步骤。例如分子生物学实验中检验总RNA提取效果采用的是甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法，甲醛的作用是使RNA酶变性，阻止其降解RNA，电泳结果能否出现18S和28S的条带能说明RNA 的主要成分rRNA是否完整，而我的课题中提总RNA的目的是需要其中的mRNA作为模板进行逆转录PCR，因此电泳检测只有相对意义，所以只用一般的电泳采用稍高的电压即可。设计RT-PCR引物过程中，严格按照分子生物学实验课程所学的PCR原理部分进行设计，设计出的引物满足引物长度15－30bp、G+C含量40％－50％、碱基随机分布和引物3'端与模板严格配对这几个基本要求。但实验结果表明用oligodT做第一轮引物能扩增成功，而用特异性引物则扩增失败，分析原因可能是RNA二级结构严重，因此需要消除RNA二级结构，使特异性引物能与模板紧密结合，采用扩增前将模板在65℃保温10分钟的方法成功解决了这一问题。

目前我的课题已经进行到蛋白纯化步骤，分子生物学实验课上所学帮助我顺利完成实验的上游即分子生物学阶段的初步工作。

分子生物学实验课的收获及其在实际科研中的应用 生命科学学院生物化学与分子生物学专业03级硕研 白 巍

“对一名生物化学与分子生物学专业的研究生来说，分子生物学实验技术是必须掌握的基本功。熟练的掌握基本的分子生物学实验技术是开展实际研究工作的前提。”这是我在一年实验工作中的最大体会。因此，更加体会到，分子生物学实验课对我的帮助有多大!

在这门课中，老师将分子生物学实验的一些基本方法和理论，包括：载体；分子生物学中常用的工具酶；电泳；PCR基因扩增；基因表达；印迹法及分子检测；克隆化定点诱变等等贯穿在感受态细胞的制备和转化；质粒的提取和酶切；哺乳动物基因组DNA的分离和提取；植物中总RNA的提取等十几个实验中讲授，让我们不但掌握了实验技术，更重要的是使我们弄懂这些实验的原理，为在自己的实际科研中运用这些方法设计实验更好的完成科研工作打下基础。

我自己在前一段时间的实验中就应用了许多分之生物学实验课中学到的知识.我在做真核细胞转染实验中需要用一种无关基因作对照,我们选择的是pKSgp120基因.为了转染真核细胞我们需将其克隆于真核载体PIRES1neo中.我们先将空载体PIRES1neo和带有pKSgp120基因的PUC19分别预转化在大肠杆菌DH5α的感受态细胞中,然后从中大量提取质粒.为免去设计定做引物在时间和费用上的浪费,我们设计了一个平端连接方法:将空载体PIRES1neo用EcoRV酶切,再用CIAP(碱性磷酸酶)去磷;将PUC19/ pKSgp120用EcoRI和HindⅢ双酶切,然后将两者用T4DNA连接酶连接酶连接后转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中在从中提取质粒进行酶切鉴定.可见,没有分子生物学实验课上对于实验基本方法理论的学习和对一些基础实验的操作训练,是很难完成上述实验工作的!

此外,在分子生物学实验课中,老师结合实际,由浅入深的给我们讲解了许多实验的原理和设计实验的方法思路,更是对我以后的实验工作有很大的指导作用,使我受益费浅!

中国协和医科大学基础医学院 2003级研究生 马艳妮

半年分子生物学实验课的学习，使我掌握了很多分子生物学的基本方法和技术，如核酸提取、纯化、鉴定的方法，克隆、表达载体的构建，PCR技术等，这些基本方法的学习及实验技能的训练，为我现阶段的实验工作奠定了基础。课程中所开设的很多实验，如蓝白斑筛选、Southern杂交等，均是很多高校本科教学中所不曾涉及的，为我们研究生阶段的学习提供了竞争优势。在课堂中所培养的良好实验习惯及对待实验科学、认真的态度也使我收益匪浅，并在今后的实验中继续坚持。在此感谢所有为这门课程认真工作的老师和同学们，谢谢你们！

第五篇：分子生物学实验讲义

实验 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

二、实验试剂

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。

三、实验操作

1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

2、取1.0ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀,4℃离心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量离心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.0倍体积（1ml）预冷的无水乙醇，混匀，室温放置５min，4℃离心12000g×10min，弃上清。

8、加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干或吹干（不能过于干燥，造成溶解困难）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存备用。

四、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

五、注意事项

本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

六、习题：

1、什么是质粒？质粒有什么主要用途？

2、分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？

3、制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？

实验 琼脂糖凝胶电泳实验

一、实验目的

（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：

（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。

（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。

常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。

三、试剂与器材

（一）材料

电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等

（二）试剂 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。

3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量标准

四、操作方法

常规的水平式琼脂糖电泳：

制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：

琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

2、胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

3、加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。

4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板中央时，停止电泳。

5、观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。

五、注意事项

1、EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。

2、由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、实验报告要求与思考题

1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）

M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？

4、为什么分子生物学实施时要担心EB？

5、琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？

电泳流程图：

实验 PCR扩增eGFP基因

一、PCR技术的基本原理

PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。

1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。

2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。

4、引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。

5、引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退

二、实验试剂

（一）仪器与器皿

PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性eppendorf管，凝胶成像仪

（二）试剂与材料

1、琼脂糖凝胶电泳试剂

1）电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖

3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水

4）琼脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5´反应缓冲液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、无菌水

三、实验步骤

1、按顺序在200μl 指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP质粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）总体积共50μl

2、在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数。）

1)预变性 94℃ 3 分种

2)循环条件（30 次）

变性 94℃ 30 秒

复性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延长延伸 72℃ 7 分钟

编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。

3、PCR 扩增完毕，配1.5%琼脂糖凝胶，电泳观察结果。

4、凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段

四、习题

1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？

2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？

3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？

实验 从动物组织（猪肝）中提取DNA

一、实验内容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法从猪肝中提取DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法从猪肝中的原理和方法；(2)巩固DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验。

二、实验原理

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。

三、实验材料

新鲜猪肝

TES 缓冲液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、实验步骤

1、剪取约0.5g肝脏组织，放入到研钵中磨碎；

2、向研钵中再加入1 ml TES轻轻研磨，将TES与破碎的组织混匀；

3、吸取535 µl组织匀浆液于2 ml EP管中，再加入60 µl SDS（10%），5.0 µl蛋白酶K，充分混匀后，于56°C保温1 h，每30分钟轻摇1次；

4、放置到室温，加入等体积饱和酚（600µl），颠倒混匀，11000 rpm，离心10 min，吸取400 µl水相，并转移至一个新的1.5 ml离心管中；

5、加入2倍体积（1000 µl）的无水乙醇和1/10倍体积（40 µl）3 M 醋酸钠沉淀DNA，12000 rpm离心10 min，弃乙醇；

6、加入适量TE溶解DNA和RNAse A（具体依DNA的多少而定），并利用0.7%的琼 脂溏进行电泳分析。

五、注意事项

1、在将猪肝剪碎前要将猪肝清洗干净，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。

3、取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。

4、乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

5、离心后，不要晃动离心管，拿管要稳。

6、在乙醇沉淀后，经离心要观察留在EP管中的小白点，其主要成分就是DNA，在以后的实验中都要细心观察，防止因将小白点丢失。

六、习题

1、为了获得高质量的肝脏DNA，在实验过程中应注意什么。

2、结合本人操作体会，总结在提取过程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白质的方法有哪些？ 实验 限制性内切酶切割DNA

一、实验目的

1． 通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子； 2． 根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶； 3． 掌握DNA的酶切技术。

二、实验原理

限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的 EcoR I识别„GAATTC„ 切割后产生„CTTAAG„、„G 和

AATTC„的末端，„CTTAAG„该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团，即„G-OH和„CTTAA-P。

有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如 San3A识别„GATC „；有的识别六

碱基对，如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I„GCGGCCGC„、„CGCCGGCG„ 则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。

＋

限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、实验材料

待酶切的DNA样品

四、实验仪器、器皿及试剂

1、仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯

2、器皿：Eppendorf管、Tip、试管架

3、试剂：标准DNA(Marker)

EcoRI限制性内切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫苏糖醇）

五、实验步骤

1、将DNA样品8.5μl(质粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由厂家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性内切酶EcoRI（限制性酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱）。

4、混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育１小时。

5、进行电泳检查酶切结果，100V 25分钟。

6、紫外灯下观察消化效果。

六、注意事项

1、分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方法：

(1)吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的样品，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。

(2)用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取0.2~0.5μl的样量。

(3)目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。

2、限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要求每次吸酶时要用新的无菌Tip。另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能快，以使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。

若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量（可稍多计一点），取出此量的酶与1×缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩短操作过程、减少污染机会。

3、开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酶污染。

4、样品在37℃与65℃保温时，要注意将Eppendorf管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

5、无实验必要应尽量避免长时间酶消化样品。因长时间消化，限制酶溶液中可能存在的杂酶会影响试验结果。

七、习题

1、限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？

2、什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？

3、限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？

4、限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？

5、酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？ 6、1个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？

实验 质粒的转化

一、实验目的

掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：质粒DNA；大肠杆菌感受态细胞。

二、实验原理

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。

三、实验步骤

1、制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；

2、取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；

4、热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；

5、冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；

6、复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；

7、布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。

四、结果与分析

计算转化效率

菌落数/DNA质量（μg）*稀释倍数

五、习题

1、制备感受态细胞的关键是什么？

2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。

3、如何提高转化效率？