分子生物学与基因工程结课论文

第一篇：分子生物学与基因工程结课论文

《分子生物学与基因工程》

结课论文

Real-Time PCR在分子生物学中的应用

姓

名：XXX 学

号：AXXXXXXX 院

系：生命科学学院 班

级：生科XXX班 任课教师：XXX

二零一二年十二月 Real-Time PCR在分子生物学中的应用

XXX XXX大学生命科学学院 黑龙江哈尔滨 150xxx

摘 要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于分子生物学领域中获取特定基因或基因片段。定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，且与常规PCR相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，成为了分子生物学研究中的重要工具。关键词：实时定量PCR；基因扩增；分子生物学

1971年Khorana等最早提出PCR理论：―DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA 基因‖。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶 ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。

自从PCR技术问世便很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，上述问题才得到较好的解决[1]。实时荧光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，FQ-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。

1.实时荧光定量PCR技术概述

1.1 实时荧光定量PCR原理

1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。在探针5’端标记一个报告基团（R），在3’端标记一个淬灭基团（quencher，Q），两者距离很近时（7-10nm），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收，并依赖其较高的S/N比值（信-噪比, signal-to-noise ratio）和良好的辨别能力进行定量检测。

荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[4][3]1.2 常用实时荧光定量PCR分类

1.2.1 实时荧光定量PCR荧光染料法

实时荧光定量PCR荧光染料法包括非饱和染料SYBR Green法和饱和染料LC Green法[5]。非饱和染料SYBR Green染料法定量成本低，方法简便，不需要设计探针，但是特异性低。荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。饱和染料LC Green法与SYBR染料法工作原理是一样的，但与传统的荧光染料SYBR Green相比有如下优点：LC Green染料在进行PCR 时可以以饱和的浓度加入，不会抑制PCR反应，而Sybr Green 染料浓度过高会抑制PCR反应。从而，利用LC Green染料可以进行高分辨率熔解曲线分析。在进行HRM分析时，由于饱和染料占据了DNA双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。除LC Green染料外，常用的染料还有Reso Light、Ever Green等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。

1.2.1 实时荧光定量PCR探针法

实时荧光定量PCR寡核苷酸探针法包括TaqMan探针法和TaqMan-MGB探针法。TaqMan 探针法技术原理是利用Taq酶的5’—3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。探针的5’端标以荧光报告基团，3’端标以荧光淬灭基团。在PCR退火复性期，探针与DNA模板特异性结合。在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’—3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。因此，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。荧光信号强度与PCR产物量相对应。

MGB探针与传统的TaqMan探针比较，有很大的优势。它可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列的 MGB探针的设计有很大的帮助；同时可以提高配对与非配对模板间的Tm值差异； 由于在探针的3’端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高，可 以进行SNP分析。MGB探针实验步骤简单，使杂交的重复性大大提高。

1.3 实时荧光定量PCR定量方法

在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。由于每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA浓度的标准品可做出标准曲线。

1.3.1 绝对定量法

该方法是利用标准品作一条标准曲线，通过标准曲线对样本进行定量。绝对定量标准品一般是用质粒DNA或是PCR扩增产物等制备的。标准品的量根据260nm的吸光度值计算得出。由于样本的浓度完全是通过标准曲线来确定，所以合适的标准品是定量准确的关键。一方面标准品与未知样本应具有一致的扩增效率，另一方面标准品的定量必须准确。这就要求标准品的扩增序列与样本完全一致，制备的标准品纯度要高，不应含有影响定量的因素如Dnase、标准品与未知样本各自反应体系内的干扰因素要一致等。该方法的优点就是测定范围很广（10～1010拷贝），结果可直接通过软件得出，不需额外计算。1.3.2 相对定量法

相相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常选用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA。使用的β-actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样品的量来自于标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基因是1×的样本，其他的样本为参照基因的n倍。由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用管家基因的量来作为标准，以比较来源不同的样本，目的基因表达量的差异，此即相对定量。这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致；此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PCR反应，存在两种模板相互的干扰和竞争[7]。

1.3.3 相对定量反应循环值（Ct）比较法

[6]即ΔCT值法，该方法是同时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的基因片段，一般是一个内源性管家基因片段。这两个扩增反应可在2管中分别进行，也可在同一反应管中进行，测得两者的CT值之差，即ΔCT。该方法不需要标准曲线。它是根据PCR扩增反应的原理，假设每个循环增加倍的产物数量PCR反应的指数期得到扩增产物的值来反映起始模板的量通过数学公式来计算相对量。比较Ct法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。比较不同待测标本DNA的ΔCT值与正常标本DNA的ΔCT值的变化，即可对未知标本靶基因的原始拷贝数作出判断，从而对病理状态进行判断或诊断。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计[8]。最终结果也是靶序列和参考品的相对比值。该方法需确定靶序列和参考品的扩增效率是否一致；如不一致，则会影响结果的准确性。

2.实时荧光定量PCR技术的应用

实时定量PCR的应用非常广泛。在科研方面，可定量分析各种基因的表达[ 9 ]、分析基因变和多态性[ 10 ]、分析细胞因子的表达

[ 11 ]、单核苷酸多态性（SNP）

[ 12 ]

测定及易位基因的检测

[ 15 ]

[ 13 ]

等；在医疗方面，可用于免疫组分分析

[ 14 ]、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析

[ 16 ]、肿瘤研究[ 17 ]和微小残留病变（MRD）[ 18 ]检测等。

以下就其在基因工程研究、病原体的检测和肿瘤分子诊断等方面的应用及其新进展作一简述。2.1 基因工程研究领域

实时荧光定量技术的出现不仅加强了有关对基因的量的研究方法，而且也加强了对基因的质所发生变化的研究。它可以检测基因突变和基因组的不稳定性，已经被广泛应用于遗传分析[19]。

2.1.1

基因表达研究

由不同的荧光报告基团标记的探针分别与野生型和突变基因杂交，探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种，说明它是一个纯合子，如果荧光信号都增加则表明是一个杂合子。从使用范围来看，它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变和缺失及表达量的异常，从灵敏度方面看，它能从单细胞进行特异基因扩增，实现植入前基因诊断。PCR技术还可用于端粒酶的检测。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症（β地贫）患者β与γ球蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地贫的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴出生[20]

。因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和产前基因诊断。

2.1.2

单核苷酸多态性（SNP）及突变分析

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性[21]。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。

2.1.3

转基因研究

Tesson等确定了实时定量PCR的技术条件，利用两种发光探针及适当的循环域值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因鼠的接合性[22]。同型结合的和异质接合的动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律，通过实时定量PCR检测，该方法为转基因动物的同型结合及异质接合提供了明确的鉴定结果。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大用途。

2.2 肿瘤的分子诊断

肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认[23]。癌基因的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据[24]。目前，肿瘤患者的生存期已有所延长，但是缓解期的患者仍存在复发的危险，因此，微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案至关重要。实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具[25]。Eckert等提出采用实时荧光PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治疗有重要指导意义。

2.3 病原体的分子检测

目前，用此方法还进行了对人类结核杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒等病原体的检测[26]。同样在国内，2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得荧光定量PCR技术得以应用和发展。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。目前, 实时荧光PCR技术已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒（HIV）等各种病原体的临床诊断，为实现快速准确诊断提供了有效的检测方法。

3.小结

时荧光定量PCR与其他一些技术的结合应用，是今后发展的方向，如与高级微型解剖技术结合后，能提高形态学损伤所至低水平扩增的检测能力[ 27 ]、可定量分析石蜡包埋储存样本中的核酸[ 28]及少量细胞中的全部转录产物[ 29 ]等。此外，微阵列实验中所选基因表达水平的测定仍需使用实时PCR技术[ 30 ,31 ]，利用该技术还可使等位基因特异表达分析以及生化武器证据甄别成为可能。

通过设计针对目的基因的特异性引物和探针，并优化反应体系和反应循环参数，已成功地建立了快速、灵敏、特异的Q-PCR检测方法。可实现大量样本同时检测，并节省大量试验时间和反应成本，为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供了有效的技术手段；同时实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型，以及对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断[32]。因此Q-PCR技术将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具，在临床上将有更加广阔的应用前景。

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第二篇：《分子生物学与基因工程》课程论文

植物基因工程研究进展

摘要：自1983年美国人首先成功地获得抗卡那霉素的烟草再生植株开始，人类就开始了植物基因工程的研究。至今已在逾200种植物中成功地获得了转基因植株,并有近1000例转基因植物获准进行田间试验,更有十余种转基因植物(如转基因棉花.大豆)已进入商业化种植.转基因产品已进入人们日常生活。植物基因工程的应用已进入蓬勃发展阶段。下面是我从植物基因工程改善生物质能利用的研究进展做一说明。

关键词：木质纤维素 细胞壁 水解酶

近几年来全世界对能源的需求量急剧增加加速了对有限的不可再生矿物质 能源的消耗资源的利用也增加了CO2及粉尘的排放,造成环境破坏和全球气候变 化[1]可再生的清洁的生物质能成为人们关注的热点。其中的燃料乙醇工业,近年来在世界范围内得到了广泛的发展,我国也大力支持发酵乙醇用作能源[2]。目前,绝大部分乙醇来源于玉米淀粉发酵生产。但是由于淀粉本身又作为食品和饲料,产量有限,成本较高,阻碍了乙醇工业的发展。于是,人们把注意力转移到谷物秸秆等廉价 的含有大量 的木质 纤维素 的生物质 材料上希望 能够被 充分利用 [3]。但由于木质纤维素本身难以分解,许多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生产生的多糖资源更利于降解,用于发酵产乙醇。1.木质纤维素发酵生产乙醇发展现状

在中国,大约每年会产生10t亿农林业废弃物这些资源用于造纸、纺织或者直接作为燃料这些占到很少一部分。绝大部分被废弃了木质纤维素是光合作用的基本产物 , 也是生物圈产生的最充足的可再 生生物资源被认为是地球上最丰富的生物高分子聚合[4]。

大部分的高等植物细胞壁由胶联多糖、糖蛋白和木质素组成双 子 叶植物 , 如拟南芥等,细胞壁多糖主要有三种:纤维素半、纤维素和果胶质,包埋在非 纤 维多糖基质(半纤维素和果胶)中的纤维素网络,与木质素和结构蛋白共同构成植物细胞壁的聚合液晶结构[5]天然状态下由于木质素的保护作用,阻碍了水解 纤维素酶与纤维素的接触并发挥作用,成为影响纤维素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人发酵降解实验证明,虽然半纤维素对纤维素。也有一定保护作用 , 但木质素的去除对于纤维素有效降解是最关键的[6]。一般对木质纤维素材料 的利用,首先要进行粉碎,然后预处理(酸碱处理等),最后 添 加 微 生物 来源 的纤维素复合水解酶类,使之与处理过的木质纤维充分接触,将其降解为单糖 , 从而用于乙醇发酵。现在虽然前期的粉碎和预处理工艺研究取得了很大进展但成本仍然较高，而且后期发酵分解处理。要添加来源于微生物的纤维素水解复合酶,价格仍十分昂贵[7]。这些因素导致目前用木质纤维素作为这些因素 导致 目前用木质纤维素作为原料发酵产乙醇,成本较高发展缓慢因此,现在对木质纤维素进行高效降解使用,仍然是个很大的难题。2.植物基因工程与植物木质纤维素利用

近年来随着生物技术的不断进步,人们开始尝试利用植物基因工程方法来 解决植物木质纤维素有效利用问题研究主要集中在改善植物细胞壁木质纤维素结构和含量比例等方面,使植物多糖资源利于降解使用，或者利用植物作为生物反应器,在植物内表达微生物来源的强活性纤维素降解酶,使植物自身表达高活性纤维素水解 酶类等研究。2.1 改善植物细胞壁的结构与组成

过去几十年的研究,改善木质素含量及细胞壁已成为可能。利用基 因工程方法,控制植物内木质素合成相关基因的表达,可以改变木质素结构和含量木质素对纤维素形成的保护作用是导致 纤维素资源利用 的主要障碍,降低木质素含量或改变其结构,将利于纤维素 的分解[8]。虽然植物体木质素的合成过程还不是十分清楚,但近几年的研究,已使大量降低木质素含量成为可能。

在玉米和苜蓿的研究中发现,木质素合成单体之一的芥子醇, 其前体的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表达,芥子单体含量会明显减少,可导致木质素含量降低 [9, 10]但是在杨树中抑制这种酶的表达却不能够改善材质,木质素含量反而增加[11]。Li L等人在杨树中研究发现,通过反义表达4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)时,木质素含量了减少了约40%,并且导致10%的纤维素含量的增加，如果正义表达控制木质素组成单体紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈疮木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可导致紫丁香基丙烷的量明显增 高,但木质素含量没有变化[12]。当两基因同时转化时,木质素含量减少可达53%,紫丁香基丙烷含量进一步增加,而纤维素含量能够增加30%。Cano-Delgado A等人研究拟南芥CESA3突变体发现,纤维素合成酶受损时,导致了木质素大量合成[13]这表明在植物木质部细胞中可能存在一种调控机制,当木质素含量减少时,为了维持支撑作用,纤维素含量会相应增加。Chabannes M等人在烟草中研究发现,同时抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表达,可大量减少木质素含量,但非预期 的还引起了细胞壁多糖酚类物质及可溶性酚类物质含量的变化[14]等人在番茄中抑制表达木质素合成相关的CCR基因,导致木质素含量降低,同时与木质素形成具有共同前体的酚类复合物增加[15]。Boudet AM等人通过抑制杨树木质素合成酶基因CCR,可导致植物细胞壁纤维 素成分更容易被纤维素分解菌Clostridium产糖量达到原来的2倍[16]这表明,降低木质素等物质含量后,非常利于纤维资源的利用。Li Y等人研究发现,过氧化酶影响了木质化过程[17]。Blee KA等人在烟草中反义抑制过氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表达,在不影响植物生长发育的情况下,使木质素含量降低了40%~50% [18]。通过基因工程方法,改变木质素结构与含量的方法改善植物细胞壁结构,利于作为能源植物,具有重要的研究价值。

2.2 植物体内表达木质纤维素水解酶

过去几十年的发展,植物已成功的作为重组蛋白表达的生物反应器,它相对于微生物和动物表达的优势是具有较低的成本已在多种植物里面进行了异源重组蛋白的表达研究(如疫苗和工业用酶等),蛋白表达量高且保持了很好的生物学活性[19]。近几年,人们开始在植物体内进行微生物来源的研究,希望这些植物作为生物反应器,大量表达并在细胞内积累纤维素酶。收获的植物,经过粉碎和预处理(酸碱处理等)后,在分解过程中能利用自身表达的酶,不添加加来源于微生物的酶,就可以将纤维素充分分解为单糖, 进一步用于生产乙醇,降低生产成本(Sticklen M,2006)[20]。考虑到细胞质表达对植物生长影响较大,一般采用定向胞外或细胞器积累表达（如定向质外体叶绿体溶酶体等）Ziegler MT等人在拟南芥中,定向质外体,积累表达了来源于Acidothermus cellulolyticus的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表达量约达到叶子总可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同样是在拟南芥中,Hyunjong B等人定向叶绿体和过氧化酶体,积累表达来源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),达到了总可溶性蛋白的4.6%,明显 高于细胞质表达和单一细胞器定向表达[22]在烟草中Dai Z等人定向叶绿体,积累表达了A.cellulolyticu 的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到总可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同样的酶,比较了定向不同细胞器积累表达的差异,发现定向质外体表达蛋 白量最高,且保持了较好的活性[24]。在其它的植物中,也进行了相关的研究, Xue GP等人在大麦的胚乳中,特异表达来源于Neocallimastix patriciarum 的内切-β-1,4-葡聚糖酶,约达到了总种子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向质外体积累表达了A.cellulolyticu耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到了叶子总可溶性蛋白的 4.9%。

目前的研究集中于将植物作为生物反应器,尽可能多的表达并积累纤维素酶,用于后期的处理。在发酵分解过程可以利用植物自身表达的异源纤维素水解酶,节省了额外添加酶的量。表达 的大都是内切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,为了预处理后还 能保持较好活性,多采用稳定性强的耐高温酶。由于纤维素有效降解需要复合水解酶,并且木质素对其具有很强的保护作用,这些植物不会发生自身降解。3.前景与展望

利用不断发展的植物基因工程技术,在能源植物研究方面已经取得了不错的研究进展。但是,目前要实现廉价充分的利用纤维资源,还有一定的困难。通过对植物细胞壁合成 代谢研究的不断深入,应该能够获得对自身生长发育不影响的低木质素植物细胞壁木质素结构及含量改善纤维素含量增加,利于降解发酵产乙醇。还希望最终能够获得一种能源植物,这种植物通过自身表达异源的高活性木质纤维水解复合酶,酶的表达受到诱导调控,收获前诱导表达,收获后送往生物能源发酵工厂。这期间,木质纤维素多糖在植物体内也可进行持续降解,在发酵工厂只需添加一些简单的辅助分解酶就可以彻底降解掉,使木质纤维资源产乙醇变得十分简单 参 考 文 献: 1.Dorian JP, Franssen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.

第三篇：基因工程论文

基因工程论文

一． 定义

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段

二，基本操作步骤：

1．提取目的基因：一条是从供体，的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因（1）直接分离基因：最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。

（2）工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。

2.目的基因与载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。

3.将目的基因导入受体细胞：目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。

4.目的基因检测与表达：在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

三．基因工程应用：

1．与医药卫生

（1）生产基因工程药品（2）基因诊断（3）基因治疗

2．与农牧业、食品工业

（1）农业：培育高产、优质或具特殊用途的动植物新品种。

（2）畜牧养殖业：培育体型巨大、品质优良的转基因动物；利用外源基因在哺乳动物体内的表达获得人类所需要的各种物质，如激素、抗体及酶类等。（3）食品工业：为人类开辟新的食物来源。

3．与环境保护

（1）用于环境监测：用DNA探针可检测饮水中病毒的含量

（2）用于被污染环境的净化：分解石油的“超级细菌”；“吞噬”汞和降解土壤中DDT的细菌；能够净化镉污染的植物；构建新的杀虫剂；回收、利用工业废物等。

生物081 马明臣 0802030119

第四篇：基因工程论文

浅谈基因工程的应用

及发展前景

姓名：**** 课堂编号：*** 学号：******** 专业年级：******** 指导老师：*** 摘要：20世纪70年代以来基因工程技术在世界范围内迅速兴起，为揭开生命世界的奥秘打开了一条通道，它被人们寄予着缓解饥饿与贫困的期待，也凝聚这人们改善生活质量，提高生活水平的美好憧憬，这就是基因工程赖以存在与发展的意义所在。

关键词：基因工程 农业 医学 环保 前景

Abstract：70 years since the 20th century，genetic engineering technology in the world is rising rapidly，to uncover the mysteries of life and the world opens up a channel，it is the people sent to the expectations of hunger and poverty relief，but also unite the people improve their quality of life，improve living standards good vision，and this is genetic engineering which the meaning of existence and development.基因工程，又称DNA 重组技术，是指在基因水平上，以人工的方法取得目的基因，在体外重组于载体上，形成重组DNA分子，然后将重组DNA 分子转入受体细胞进行复制、转录和翻译，从而产生人们所需要的目的基因的产物。基因工程技术打破了天然物种屏障，人们可以按照主观愿望，将来自不同生物体的DNA 片段组合到一起，并获得新的表达产物。

基因工程技术的不断发展使其在农业、医学、环保等方面取得了广泛的应用，带来了巨大的科学价值和经济效益。基因工程通过基因重组实现产品的改良，例如获得杀虫或抗病活性，产生更多的代谢产物，或产生新型代谢产物等。通过基因工程技术产生的基因工程体一般可以产生经济或社会效益，或具有明显的产生经济或社会效益的潜力。以下通过基因工程在农业、医学和环保三个方面来说明基因工程的应用及发展前景。基因工程用于农业方面

农业是目前基因工程技术引用最广泛的领域之一，农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。例如：中国科学院把抗病毒基因转到了水稻的细胞里，由此培育出的植株可以抵抗水稻常见的一些病害，并能稳定遗传抗虫。同时，植物基因工程技术的兴起为创造植物雄性不育系提供了新的策略和可能[1]。人们采用特异性启动子与RNA酶基因构建嵌合基因这一策略来实现创造雄性不育系。事实证明，这在烟草、油菜、小麦、水稻和一些果树雨中中取得了成功。

另一方面，转基因技术的实现也为农业创造高质量、高产量的新品种。转基因技术能培养出多种快速生长的转基因鱼、转基因羊、产奶量高的转基因牛等[2]。随着生活水平的提高，人们越来越关注农业产品的口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以很好地改善植物的品质，在人们的不断努力下，越来越多的基因工程农业产品进入了市场，利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国Florida Gainesville大学的科学家将外源高分子量面筋蛋白基因导入普通小麦中，获得了含量更多的高分子量面筋蛋白质的小麦，这样的小麦面筋蛋白具有良好的延伸性和弹性[3]。基因工程用于医学方面

目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我国科学家应用安福隆治疗慢性乙型病毒性肝炎患者45 例，第1个月每天肌肉注射1 次安福隆500 万u，后改为隔天肌肉注射1次，疗程为6个月；与给予甘利欣、维生素C等保肝药物治疗的对照组47例进行了比较。结果治疗组肝功能复常率、HBVDNA 阴转率、HBeAg 阴转率、HBeAb 阳转率均明显高于对照组并有显著统计学意义。该临床研究证明安福隆治疗慢性乙型病毒性肝炎疗效确切[4]。

同时了，基因工程的发展使得基因诊断得到广泛的应用。一些遗传病和癌症的发病与基因的突变有关，在基因水平可以做出正确的诊断。常用的方法有DNA分子杂交，检测基因的缺失、重排、基因拷贝数扩增等。在多聚酶链式反应技术发明后，使基因诊断方法趋于简便。可以不必做DNA分子杂交，而直接从扩增的DNA分子做酶切分析。有的不需做酶切而从扩增片段的长度就可作为找诊断指标。用PCR法扩增片段做RFLP分析，又成俄日扩增片段长度多态性——AmpFLP [5]。

基因工程用于环保方面

工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的超级细菌，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2 /3烃类降解完，而天然菌株需1年之久。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。

生物柴油作为一种新型可再生能源，其生产原料主要为含油植物，如大豆、油菜、棕榈和蓖麻等。此外，将含油微藻作为生物柴油原料，也在逐渐成为一个新的研究领域。用微藻生产生物柴油具有更多优势，科学家利用小球藻生产的生物柴油，不仅具有传统化石柴油相当的密度、粘度和热值，而且具有更低的冷滤点和良好的发动机低温启动性能[6]。

目前国外已有许多公司开始利用基因工程研究生物柴油及其他生物燃料，圣地亚哥蓝宝石能源生物科技公司称，他们有望在2011年前销售由藻类生产出的“汽油”；科罗拉多州的Solix 生物燃料公司的第一个试点工厂，计划于今年夏天正式投产营运[7]。鉴于基因工程所开发的生物燃料是能源发展的大势所趋，致力于开发并大量生产生物燃料的公司，最后获得的不仅仅是可观的利润，他们还将创造历史。基因工程的发展前景

由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。

但是，任何科学技术都是一把双刃剑，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。基因工程这一生物技术最大的特征就在于它与人类的生命健康和生活质量息息相关，而且这种相关性要强于其他任何科学技术。在解决这些伦理问题之前，我们必须要先确立解决这些伦理问题的基本思路。只有把基本思路规划好，才能有针对性的解决问题，避免走弯路。解决基因工程伦理问题的基本思路可以概括为四个基本原则，即不伤害原则、有利原则、尊重原则以及公正原则[8]。

还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。

基因工程技术还在发展阶段，它的许多用途和功能仍有待我们去发掘，趋利避害是我们发展基因工程技术的基本原则，让基因工程技术成为社会发展与人们生活水平提高的福音。

参考文献：

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第五篇：基因工程论文

学号：13054107

基因工程结课论文

靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体构建

院（系）名

称： 理学院 专业

名

称： 生物科学 学

生

姓名： 姜己玉 所

在班

级： 13-1

目录

摘要............................................................................................................................................2 第一章 绪论..............................................................3 1..1RNAi的研究进展....................................................3 1.1.1RNAi的分子作用机制...........................................3 1.1.2 RNAi 的特点..................................................3 1.1.3 siRNA简介.........................................................3 1.1.4 s iRNA 的设计原则..........................................3 1.2 用于 RNA i 的载体....................................................4 1.2.1 载体的选择..................................................4 1.2.2 质粒人工构建的目的.................................................4 1.3 MRP1 的研究进展......................................................4 第二章 实验材料与方法.....................................................5 2.1 实验材料.............................................................5 2.1.1 宿主菌.............................................................5 2.1.3 载体通用引物................................................5 2.1.5 主要仪器..........................................................5 2.2 试验方法.........................................................5 2.2.1 shRNA 的设计与退火..................................................5 2.2.2 合成干涉片段的退火..........................................6 2.2.3 重组载体的构建..............................................6 2.2.4 菌落PCR初步筛选阳性重组子..................................7 2.2.5 测序鉴定重组载体...............................................7 第三章 结果与分析.........................................................8 3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果...........................8 3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果.............................8 3.1.2 目的片段的回收................................................8 3.2 重组质粒的菌落PCR...................................................8 3.3 重组质粒大量提取......................................................8 3.4 重组质粒测序结果.................................................8 参考文献..................................................................9

摘 要

癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。

目的：本课题选用pRNAT-H1.1/shuttle-RFP表达穿梭载体。构建针对mrp1 mRNA的RNA干扰表达载体。

方法：将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1 siRNA重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α后大量提取重组质粒，经菌落 PCR和 DNA测序分析检测重组载体构建结果。

结果：成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。

关键词：RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒；穿梭载体

第1章 绪 论

1.1 RNAi的研究进展

RNA干扰(RNA interference , RNAi)是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA 水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。

1.1.1 RNAi的分子作用机制

RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：特异效应作用机制与非特异效应作用机制。特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。

1.1.2 RNAi的特点

RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，RNAi也具有高特异性，小干扰RNA由dsRNA降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3′端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。

1.1.3 siRNA简介

RNA干扰作用是通过siRNA（small interfering RNA，siRNA）这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。通过对植物的研究证明，双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合，进而降解mRNA。

1.1.4 siRNA的设计原则

RNAi 作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构，不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大，2001年，Elbashir S M等[应用化学合成法合成了siRNA，并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi，他们进而据此提出了siRNA 设计方法：1)从起始密码下游50~100nt开始搜索siRNA以避免出现于5′或3′端的UTRs 的蛋白结合位点，；

2)搜索5′AA(N19)UU序列，如果没有相应序列，可以选择5′AA(N21)或5′NA(N21)；3)G/C含量在32%~79%之间[16]； 4)要确定siRNA对靶基因的特异性，可以利用Blast软件在基因组中进行比对，；5)设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。但是，Elbashir S M等的设计方法siRNA 筛选效率仍然很低，要更好的掌握RNAi。

1.2 用于RNAi的载体

基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。是指能够运载外源DNA片段进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体具有以下的功能：（1）运送外源基因高效转入受体细胞；（2）为外源基因提供复制能力或整合能力；（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。

1.2.1载体的选择

质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。

1.2.2 质粒人工构建的目的

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建

1.3 MRP1的研究进展

MRP1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，MRP1的组织分布 MRP1在体内的表达可以说是无所不在。

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 宿主菌

E.coli DH5α：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。

2.1.2 质粒载体

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒特性如下：pRNAT-H1.1/shuttle 是一种腺病毒siRNA穿梭质粒，shRNA的表达由人的转录启动子H1 Promoter启动，H1启动子属于PolⅢ启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成RNA，转录过程遇到4~5个连续的U即终止，非常精确；同时CMV Promoter为真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白的表达；MCS为多克隆位点。

2.1.3 载体通用引物

正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′

2.1.4 主要试剂、具酶及仪器

质粒快速提取试剂盒，Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒，10×PCR buffer，dNTP，Marker(1kb,100bp)，Goldview DNA染料，EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶，LiCl Amresco RNase Sigma bacto-typtone Bio Basic Inc bacto-yeast extract Bio Basic Inc PEG8000，HindⅢ NEB，BamHI NEB，T4DNA连接酶 NEB，Taq酶，微量振荡器（MM-2型），微量振荡器（MM-2型），恒温空气摇床，电子天平，紫外分析仪（ZF型），低温离心机（SK18），低温离心机（SK18），PCR仪（9600型），ABI 恒温磁力搅拌器（2003-16），恒温水浴锅，自动双重纯水仪

2.2 实验方法

2.2.1 shRNA的设计与退火

根据siRNA设计原则[34]，根据MRP1靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔9nt茎环序列(TTCAAGAGA)，5′端带有BamHⅠ酶切位点，3′端带有HindⅢ酶切位点，用BLAST进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。shRNA的 5

DNA模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。根据2个靶序列设计的2对DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2。

2.2.2 合成干涉片段的退火

合成片段的退火体系：各管混匀后90℃保温3分钟，37℃保温1h，再取5μL退火溶液加45μL 灭菌双蒸水混匀，使干涉片段终浓度为8ng/μL。

2.2.3 重组载体的构建

（1）将含有pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大肠杆菌接种入盛有200mL LB培养基（含2μg/mL氨苄青霉素）的500mL三角瓶中，置37℃振荡培养过夜（置摇床中160r/min）。（2）实验前预先配制溶液Ⅱ，溶菌酶。预冷溶菌酶、溶液Ⅰ和溶液Ⅲ。取出菌悬液，观察菌体生长状况，将菌悬液分装于两个250ml离心桶中，调平。预冷离心机至4℃，4℃下8000r/min离心5min，弃上清，得菌体。（3）加预冷的溶液Ⅰ50ml于每离心桶，混匀，洗涤沉淀。8000r/min离心5min，弃上清，得沉淀。此步骤的目的为出去培养基，以获得更纯的细菌沉淀物。（4）用17ml溶液Ⅰ吹散重悬细菌沉淀物，加3ml新配制的溶菌酶溶液，温和混匀，室温放置10min，裂解大肠杆菌。（5）加40ml新配制的溶液Ⅱ，以使菌体破碎，释放质粒DNA等内容物。缓慢颠倒数次，防止破坏基因组DNA，室温放置3min。（6）加30ml预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒数次，防止SDS破坏基因组DNA，冰浴放置15min。4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液全部倒入新离心桶中。（7）将上清液在4℃下以10000r/min离心10min，然后将上清液经8层纱布过滤至新离心桶中。（8）加0.6倍体积（约54ml）的异丙醇，充分混匀，室温放置15min，以沉淀核酸。8000r/min离心15min，小心倒掉上清，敞开瓶口倒置于纸巾上，使残余上清液流尽，晾干。（9）加15ml水再加15ml LiCl（预冷）混匀，静置沉淀15min，4℃下10000r/min离心15min，以出去蛋白质和RNA。（10）倒上清于新的离心桶中，加30ml异丙醇，剧烈震荡，静置沉淀15min，在4℃下以10000r/min离心15min。再次沉淀核酸。（11）弃上清，得到沉淀的核酸。敞开瓶口倒置于纸巾上使残余上清液流尽。（12）用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下以10000r/min离心5min，弃去乙醇，离心桶敞口倒置于纸巾上，使乙醇挥发殆尽。此步骤可以沉淀DNA。（13）加2ml无菌水溶解沉淀，将液体吸到10ml离心管中，再吸2ml ddH2O冲洗瓶壁，随后将洗液加到同一10ml离心管中，随后加100µl RNaseA，37℃，水浴30min。以使RNA彻底分解。（14）加等体积含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于4℃以12000转/分，离心15分钟，以回收质粒DNA。（15）沉淀用3ml70%乙醇重悬清洗，以除去PEG，12000r/min离心8min。（16）重复上步操作，将离心管倒扣于纸巾上10min，加1ml H2O溶解，用等体积酚/氯仿/异戊醇再抽提一次蛋白质，室温下8000r/miin离心10min。（17）小心吸上清与另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，再加0.1体积的NaAC（3mol，pH5.2），冰上沉淀20min，4℃下10000r/min离心15min，使DNA沉淀出来。（18）去上清加入3ml 70%乙醇重悬清洗，10000r/min 离心15min，晾干，用500µl无菌水溶解沉淀。

2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子

灭菌牙签挑取LB筛选平板上圆滑单菌落，先在预先分隔并标记的另一LB平皿上划板，然后点入制备好的PCR反应混合液，开始扩增。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环；72℃ 延伸1分钟，4℃保存，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。划板的平皿于37℃培养12-16h。

2.2.5 测序鉴定重组载体

将小提鉴定结果正确的质粒送交上海生工生物工程技术服务有限司，以载体反向引物为测序引物。将经鉴定后未发生突变的H1.1-

1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重组质粒的宿主菌摇瓶扩大培养后，进行质粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。

第3章 结果与分析

3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果

3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒经HindⅢ和BamHI双酶切，结果显示单酶切产物大小约为6200bp，双酶切产物略小于单酶切产物，与预期结果相符。

3.1.2 目的片段的回收

目的片段回收 ,结果显示回收产物大小约为6Kb，与预期结果相符。

3.2 重组载体的菌落PCR 重组载体菌落 PCR电泳，结果显示PCR扩增产物,电泳分析发现阳性产物可以扩增出560bp大小的条带，假阳性产物不能扩增出560bp大小的条带,与预期结果相符，可以初步筛选出阳性产物。

3.3 重组质粒大量提取

重组质粒大量提取后的电泳，结果显示pRNAT-H1.1/shuttle-RFP 重组质粒大小约为6.2kb，与预期结果相符。

重组质粒大提并稀释50倍以后在紫外分光光度仪Genespec上测其OD值。

3.4 重组质粒测序结果

pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒测序鉴定，结果显示重组质粒的碱基序列与预期结果一致，未发生碱基突变，说明pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒构建成功。

参考文献

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